RU2694396C1 - РНК-проводник St10 для использования в высокоспецифической системе нуклеаз Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas9 (StCas9) и применение указанного РНК-проводника и белка StCas9 для подавления экспрессии вируса гепатита B в клетке-хозяине и для элиминации вирусной ДНК из клетки-хозяина - Google Patents
РНК-проводник St10 для использования в высокоспецифической системе нуклеаз Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas9 (StCas9) и применение указанного РНК-проводника и белка StCas9 для подавления экспрессии вируса гепатита B в клетке-хозяине и для элиминации вирусной ДНК из клетки-хозяина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2694396C1 RU2694396C1 RU2018144265A RU2018144265A RU2694396C1 RU 2694396 C1 RU2694396 C1 RU 2694396C1 RU 2018144265 A RU2018144265 A RU 2018144265A RU 2018144265 A RU2018144265 A RU 2018144265A RU 2694396 C1 RU2694396 C1 RU 2694396C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rna
- hepatitis
- virus
- dna
- conductor
- Prior art date
Links
- 239000004020 conductor Substances 0.000 title claims abstract description 177
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 title claims abstract description 114
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title claims abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 title claims abstract description 20
- 230000008030 elimination Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 title claims description 35
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title abstract description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 80
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 59
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 58
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 123
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 26
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims description 25
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 9
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 8
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 claims description 7
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 31
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 abstract description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 21
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 20
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 19
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 18
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 10
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 10
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 6
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 6
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 6
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 101100166144 Staphylococcus aureus cas9 gene Proteins 0.000 description 5
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000028964 Congenital reticular ichthyosiform erythroderma Diseases 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 3
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 3
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010046914 Exodeoxyribonuclease V Proteins 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000001553 hepatotropic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical group C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- 206010059193 Acute hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 1
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 1
- 241000958487 Adeno-associated virus 3B Species 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012110 Alexa Fluor 594 Substances 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091036055 CccDNA Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 241000700739 Hepadnaviridae Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 241000700732 Orthohepadnavirus Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091006611 SLC10A1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102100021988 Sodium/bile acid cotransporter Human genes 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000037628 acute hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 1
- 208000016350 chronic hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 150000002343 gold Chemical class 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000003408 pro-mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и генной инженерии. Описан комплекс StCas9 белка и нового РНК-проводника для подавления экспрессии вируса гепатита B в клетке-хозяине и для элиминации ДНК вируса гепатита В из клетки-хозяина, такой как клетка млекопитающего. Также описано применение белка StCas9 в комплексе с РНК-проводником для подавления экспрессии вируса гепатита B в клетке-хозяине и для деградации ДНК вируса гепатита В и ее элиминации из клетки-хозяина, включая кольцевую ковалентно замкнутую ДНК, из указанной клетки-хозяина. Указанный РНК-проводник образован первой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (AGAAAGGCCTTGTAAGTTGG) и второй нуклеотидной последовательностью, представляющей собой РНК-шпильку, фланкирующей указанную первую последовательность с 3´-конца и характеризующейся последовательностью SEQ ID NO: 2 (AACGCGGUCGCCAAAGAGAUGUUUUUGUACUCUGGUACCAGAAGCUACAAAGAUAAGGCUUCAUGCCGAAAUCAACA CCCUGUCAUUUUAUGGCAGGGUGUUUU) и структурой, представленной на фиг. 1. Указанная первая последовательность способна связываться с целевым высококонсервативным участком ДНК вируса гепатита В. Указанная вторая последовательность способна привлекать белок-эндонуклеазу Cas9 Streptococcus thermophilus (StCas9) к указанному целевому высококонсервативному участку вирусной ДНК с обеспечением деградации указанной ДНК вируса гепатита В под действием указанной белка-эндонуклеазы StCas9 без образования внецелевых разрывов в геноме человека. Изобретение обеспечивает новое средство воздействия на ДНК вируса гепатита В – РНК-проводник St10 в комплексе с белком StCas9, позволяющее воздействовать на ДНК вируса гепатита В, причем мишень указанного РНК-проводника консервативна во многих клинически значимых генотипах вируса гепатита В (генотипы А, B, C, D, E и H), обеспечивая, таким образом, деградацию указанной ДНК и ее элиминацию из клетки-хозяина. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл.
Description
РНК-проводник St10 для использования в высокоспецифической системе нуклеаз Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas9 (StCas9), и применение указанного РНК-проводника и белка StCas9 для подавления экспрессии вируса гепатита B в клетке-хозяине и для элиминации вирусной ДНК из клетки-хозяина
Область техники
Изобретение относится к области медицины и генной инженерии, более конкретно, к новому РНК-проводнику, предназначенному для использования в системах CRISPR-StCas9, включающих эндонуклеазу Cas9 Streptococcus thermophilus, обеспечивающему привлечение указанной эндонуклеазы к высоко консервативным областям ДНК вируса гепатита В с последующим разрезанием указанной ДНК, и к применению такого РНК-проводника в системе CRISPR-Cas9 Streptococcus thermophilus (StCas9) для воздействия на вирусную ДНК и ее элиминацию под действием эндонуклеазы Cas9 Streptococcus thermophilus из клетки-хозяина.
Уровень техники
Инфицирование гепатоцитов человека вирусом гепатита В (далее указывается как ВГВ или просто "вирус") – ДНК-содержащим вирусом, принадлежащим к роду ортогепаднавирусов (Orthohepadnaviridae) семейства гепаднавирусов (Hepadnaviridae), вызывает острый или хронический гепатит В (далее – ХГВ) (Schweitzer, A., Horn, J., et al., Lancet (2015) 386, 1546–1555). В настоящее время ВГВ хронически инфицированы более 250 миллионов человек, и более 1 миллиона в год погибают из-за последствий ХГВ: цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (Ganem, D. & Prince, A. M., N. Engl. J. Med. (2004) 350, 1118–1129). ВГВ представляет собой ДНК-содержащий вирус, причем исследователи выделяют 8 генотипов ВГВ, включая генотипы А, B, C, D, E, F, G и H (некоторые авторы выделяют еще два генотипа, I и J). Генотипы А-Н различаются между собой как географией распространения на земном шаре, так и особенностями течения заболевания, ответом на антивирусную терапию и прогнозом заболевания; также выделяется ряд субгенотипов вируса. Различия между ДНК ВГВ разных генотипов составляют более 8% генома вируса. ВГВ реплицируется в клетках печени и поддерживает персистентную инфекцию за счет особой, стабильной формы генома – кольцевой ковалентно замкнутой ДНК, далее также указываемой как ккзДНК (Glebe, D. & Bremer, C. M., Semin. Liver Dis. (2013) 33, 103–112). Далее для целей настоящего описания термины "вирусная ДНК", "ДНК вируса гепатита В", "ДНК ВГВ" и "ДНК HBV" являются синонимами и включают как ккзДНК, так и другие указанные ниже формы, в которых ДНК вируса гепатита В может персистировать в клетке-хозяине. КкзДНК является матрицей для синтеза вирусных мРНК и прегеномной РНК, далее указываемой как пгРНК и являющейся коррелятом активной репликации вируса. В свою очередь, в результате обратной транскрипции пгРНК может образовываться двуцепочечная линейная форма ДНК ВГВ или релаксированная кольцевая ДНК ВГВ (далее также указывается как ркДНК), последняя может впоследствии реимпортироваться в ядро инфицированной клетки, где из нее в результате многоступенчатого процесса образуется ккзДНК. В процессе инфекции в культурах клеток и в гепатоцитах пациентов с хроническим гепатитом В часто происходят интеграции участков ДНК ВГВ в геном, которые могут участвовать в продукции вирусных белков или способствовать развитию рака (Tu T. et al., Viruses (2017), 9, 75). Несмотря на то, что современные противовирусные препараты (интерфероны, аналоги нуклеозидов/нуклеотидов) подавляют транскрипцию и репликацию вируса ВГВ, ккзДНК поддерживает хроническую инфекцию и не элиминируется из ядер гепатоцитов даже при продолжительной (в течение многих лет или десятилетий) терапии современными противовирусными средствами. При прекращении приема противовирусных препаратов происходит реактивация полноценной инфекции ВГВ за счет внутриядерного пула ккзДНК (Hoofnagle, J. H., Hepatology (2009) 49, S156-65). Одним из экспериментальных терапевтических подходов, направленных напрямую на ккзДНК, является использование системы сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9 (Ramanan, V. et al., Sci. Rep (2015) 5, 10833; Seeger, C. & Sohn, J. A., Mol. Ther. (2016) 24, 1258–1266; Seeger, C. & Sohn, J. A., Mol. Ther. Nucleic Acids (2014) 3, e216; Bannikov, A. V & Lavrov, A. V., Mol. Biol. (Mosk) (2017) 51, 582–594; Mali, P. et al., Science (2013) 339, 823–826). Элементами CRISPR/Cas9 систем являются белки Cas9, обладающие нуклеолитической активностью, и РНК-проводники, направляющие белок Cas9 к заданной позиции в вирусном геноме. Cas9 содержит каталитические домены RuvC и HNH, отвечающие за разрезание цепей ДНК. Узнавание мишени происходит за счет взаимодействия РНК-проводника, представляющего собой химерный конструкт с элементами распознавания соответствующего Cas9 белка и целевой мишени, с комплементарным целевым участком ДНК. Разрезание целевой мишени возможно только при условии совпадения мишени (19-20 нуклеотидов) и наличия проксимального участка 5′ мотива, прилегающего к протоспейсеру (РАМ-мотива; также указывается как PAM-последовательность или последовательность PAM) (Koonin, E. V., Makarova, K. S. & Zhang, F., Curr. Opin. Microbiol. (2017) 37, 67–78).
CRISPR/Cas9 система II типа от организма Streptococcus pyogenes (далее указывается как SpCas9) (последовательность PAM – NGG) является одной из самых часто используемых систем для генетического редактирования и разрезания геномов вирусов (Hsu, P. D. et al., Nature biotechnology (2013) 31, 827–832). (Здесь и далее все нуклеотидные последовательности указываются в направлении от 5′-конца к 3′-концу). Преимуществами системы SpCas9 являются простота поиска целевой последовательности, необходимость наличия всего двух компонентов системы (белка Cas9 и РНК-проводника) и высокий уровень разрезания целевой мишени.
В работе Kennedy E.M., et al., Virology (2015), 476, 196-205, доступной в сети Интернет по адресу (URL): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4323668, показано, что использование РНК-проводников совместно с белками Cas9 Streptococcus pyogenes (SpCas9) позволяет воздействовать на различные стадии жизненного цикла вируса гепатита В, что позволяет не только уменьшить общий уровень вирусной ДНК HBV примерно в 1000 раз, но и снизить уровень ккзДНК HBV примерно в 10 раз; использование РНК-проводников совместно с белками Cas9 позволяет также инактивировать остаточную ккзДНК HBV.
Было показано, однако, что, несмотря на их высокую эффективность, системы SpCas9, использующие PAM-мотив NGG, характеризуются высокой частотой внецелевых эффектов (Zhang, X. H., Tee, L. Y., et al., Mol. Ther. - Nucleic Acids (2015) 4, e264; Fu, Y. et al., Nat Biotech (2013) 31, 822–826). Показано, что SpCas9 вносит разрывы в ДНК, даже если между РНК-проводником и потенциальной внецелевой мишенью присутствует до 6 несовпадений нуклеотидов (Zhang, X. H., Tee, L. Y., et al., 2015; Fu, Y. et al., 2013; Cho S.W., et al., Genome Research (2014), 24, 132–141). Таким образом, SpCas9 может разрезать внецелевые области в геноме клеток человека, приводить к образованию делеций, хромосомных аберраций, трансформации или гибели клеток и способствовать развитию онкологических заболеваний. В частности, в недавнем исследовании подтвердилось образование многочисленных мутаций, связанных с нуклеолитической активностью SpCas9 in vivo (Akcakaya, P. et al., Nature (2018) 561, 416–419).
Ранее в работах Kleinstiver, B. P. et al. и Dang, Y. et al. было предпринято несколько попыток улучшить специфичность классической системы SpCas9 (Kleinstiver, B. P. et al., Nature (2016) 529, 490–495; Dang, Y. et al., Genome Biol. (2015) 16, 280). Замена положительно заряженных аминокислот на нейтральные в полости Cas9 белка, которая участвует в стабилизации цепи ДНК при гибридизации РНК-проводника с мишенью ДНК, практически блокировала внецелевую активность SpCas9, однако противовирусная активность подобной системы была существенно снижена. Из этого следует, что необходим поиск более специфичных систем нуклеаз CRISPR/Cas9 с отсутствием внецелевой активности или минимальной внецелевой активностью.
Müller et al. (Müller, M. et al., Mol. Ther. (2016) 24, 636–644) и Lee et al. (Lee, C. M., Cradick, T. J. & Bao, G., Mol. Ther. (2016) 24, 645–654) выяснили, что ортологичные системы CRISPR/Cas9 с длинной PAM-последовательностью представляют собой более безопасную альтернативу классической системе SpCas9. Более длинная РАМ-последовательность таких CRISPR/Cas9 систем обусловливает очень низкую встречаемость потенциальных внецелевых эффектов в геноме человека. Помимо этого, для этих белков характерна более слабая способность расплетать нити ДНК при наличии неспаренных нуклеотидов между РНК-проводником и ДНК-мишенью.
Одна из ортологичных систем Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) (последовательность PAM NNGRRT, где N представляет собой любой нуклеотид, выбранный из A, T, G и C, а R представляет собой A или G) продемонстрировала высокий уровень деградации и мутации ккзДНК, при этом частота внецелевых эффектов была ниже 0,1%20. Ортологичные системы Cas9 Neisseria meningitidis (NmCas9; PAM: NNNNGATT) и Streptococcus thermophilus (StCas9; PAM: NNAGAAW и NGGNG-, локусы CRISPR1 и CRISPR3, соответственно) показали свою эффективность и низкую частоту внецелевых эффектов в клетках человека.
Среди всех известных ортологичных белков Cas9 самой длинной последовательностью РАМ с наибольшим количеством значимых нуклеотидов, а значит, самой редкой встречаемостью внецелевых мишеней в геноме человека, обладает белок StCas9 CRISPR1 (NNAGAAW). В полученном ранее авторами настоящего изобретения патенте RU 2652899 C1, опубликованном 03.05.2018 (МПК: C12N 15/00, C12N 15/11, C12N 15/113, C12N 15/51), была впервые продемонстрирована высокая эффективность системы StCas9, аналогичная таковой эффективности системы SpCas9. В рамках настоящего изобретения в результате исчерпывающего поиска и анализа последовательностей консервативных областей в геноме ВГВ в дополнение к ранее запатентованным РНК-проводникам St3 и St4 согласно патенту RU 2652899 C1 в рамках настоящего изобретения был синтезирован РНК-проводник St10, снижающий транскрипцию и репликацию ВГВ >90%. Целевой регион в геноме ВГВ РНК-проводника St10 консервативен на 69-98% среди основных генотипов ВГВ A-D, что позволяет использовать его для лечения большей части пациентов с хроническим гепатитом В. В то же время, целевой регион в геноме ВГВ созданного в рамках настоящего изобретения РНК-проводника консервативен также и в геномах ВГВ некоторых других имеющих клиническое значение генотипов, в частности, генотипа Н, распространенного во многих странах и регионах. В уровне техники было показано, что система CRISPR3 Cas9 Streptococcus thermophilus (далее - CRISPR3 StCas9) более специфична в сравнении с SpCas9 (Müller, M. et al. Mol. Ther. (2016) 24, 636–644), однако самой длинной РАМ-последовательностью, характеризуемой мотивом NNAGAAW, где N – любой нуклеотид, выбранный из A, T, G, C, а W – А или Т, обладает CRISPR1 StCas9. В рамках настоящей работы авторы изобретения изучили специфичность и, соответственно, безопасность StCas9 белка как способность игнорировать неспаренные нуклеотиды и вносить внецелевые разрывы в двуцепочечную ДНК. Кроме того, прямой анализ потенциальных внецелевых мишеней методом секвенирования нового поколения показал отсутствие внецелевой активности системы CRISPR1 StCas9. Из данных литературы известно, что использование CRISPR/Cas9 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов (комплексов белка Cas9 и РНК-проводника, далее также обозначаемых как РНП) позволяет дозировать эффект действия нуклеаз и характеризуется меньшей вероятностью внесения внецелевых разрывов в геноме человека (Chen Y. et al., Mol. Ther. (2016) 24, 1508-1510). В рамках настоящей работы авторами показано, что доставка StCas9 белка в комплексе с РНК-проводниками приводит к полному исчезновению транскриптов вируса к 3 суткам после внесения белков в клетки, и снижению вирусной нагрузки на 75-80% в экспериментах на модельных мышах in vivo.
В опубликованной заявке США US 2016/0317677 A1, совместно поданной The Broad Institute Inc. (US), Massachusetts Institute of Technology (US) и The Rockefeller University (US), опубликованной 03.11.2016 (МПК: A61K 38/46, A61K 48/00), раскрыт ряд РНК-проводников, нацеленных на высоко консервативные участки генома ВГВ и предназначенных для использования в системах Cas9 Staphylococcus aureus (SaCas9) и Streptococcus pyogenes (SpCas9) — в общей сложности, более полутора тысяч РНК-проводников, нацеленных на те или иные высоко консервативные участки генома ВГВ.
Среди более чем полутора тысяч перечисленных в US 2016/0317677 A1 последовательностей РНК-проводников, для которых активность в отношении ДНК ВГВ декларирована, указанная активность фактически подтверждена только для трех РНК-проводников, а именно, для РНК-проводников последовательностей SEQ ID NO: 1565 (GGGGCGCACCTCTCTTTACG), SEQ ID NO: 1566 (TAAAGAATTTGGAGCTACTG) и SEQ ID NO: 1567 (TCCTCTGCCGATCCATACTG), используемых в системах SpCas9. Все три указанных РНК-проводника, как и вообще все РНК-проводники, предназначенные для использования в системах SpCas9, используют PAM-мотив NGG. Ввиду малой длины PAM-мотива, используемого системами SpCas9, для РНК-проводников SEQ ID NO: 1565, SEQ ID NO: 1566 и SEQ ID NO: 1567 согласно US 2016/0317677 A1 также существует весьма высокая вероятность внецелевых эффектов.
US 2016/0317677 A1, кроме того, не раскрывает степень консервативности мишеней тех или иных РНК-проводников в геномах ВГВ различных генотипов и в принципе не рассматривает проблему, связанную с варьированием указанной величины от генотипа к генотипу. Иными словами, способность РНК-проводников SEQ ID NO: 1565, SEQ ID NO: 1566 и SEQ ID NO: 1567 привлекать эндонуклеазу Cas9 к ДНК ВГВ различных генотипов, обеспечивая деградацию указанной ДНК, в US 2016/0317677 A1 не рассматривается, и сама проблема различной консервативности мишеней тех или иных РНК-проводников в геномах ВГВ различных генотипов в US 2016/0317677 A1 не ставится на рассмотрение.
Авторами настоящего изобретения ранее уже был создан ряд РНК-проводников для использования с системами SpCas9 и CRISPR1 StCas9, нацеленных на консервативные регионы генома ВГВ (Таблица 1), включая РНК-проводники Sp20 и Sp37, предназначенные для использования в системах SpCas9, и РНК-проводники St3 и St4, предназначенные для использования в системах StCas9 (патент RU 2652899 C1, опубликован 03.05.2018, МПК: C12N 15/00, C12N 15/11, C12N 15/113, C12N 15/51). РНК-проводники St3 и St4 по патенту RU 2652899 C1, предназначенные для использования в системах StCas9 и использующие PAM-мотив NNAGAAW, можно рассматривать в качестве ближайшего аналога заявляемого технического решения.
В патенте RU 2652899 C1 показано, что РНК-проводник St3 консервативен в геномах ВГВ генотипов A, C, D и G, тогда как РНК-проводник St4 консервативен в геномах ВГВ генотипов A, B, C, D, E и G (см. таблицу 1 на стр. 9 описания указанного патента). Также в патенте RU 2652899 C1 показано, что при использовании РНК-проводника St3 уровень прегеномной РНК (пгРНК) – коррелята репликации ВГВ – снижался на 69,8%, а при использовании РНК-проводника St4 – на 86,6% (там же).
В связи с тем, что РНК-проводники, раскрытые в патенте RU 2652899 C1, либо обладают недостатками, принципиально присущими системам SpCas9 (в случае РНК-проводников Sp20 и Sp37), либо, будучи лишенными этих недостатков, оставляют неохваченными некоторые генотипы ВГВ, имеющие важное клиническое значение, в частности, распространенный во многих регионах земного шара генотип H (в случае РНК-проводников St3 и St4), существует потребность в расширении арсенала средств на основе РНК-проводников, использующих систему StCas9, нацеленных на высоко консервативные регионы генома ВГВ других генотипов и позволяющие, таким образом, привлекать к ДНК ВГВ указанных генотипов эндонуклеазу Cas9 Streptococcus thermophilus, обеспечивая деградацию указанной ДНК и предотвращая, таким образом, развитие цирроза печени и/или гепатоцеллюлярной карциномы.
Следует также отметить задачи, связанные с повышением степени элиминации прегеномной РНК (пгРНК, pgRNA) вируса ВГВ – коррелята активной транскрипции при вирусном гепатите В, с сокращением продолжительности курса терапии, необходимого для элиминации ккзДНК ВГВ, с повышением степени элиминации ккзДНК ВГВ – коррелята хронической персистенции ВГВ в организме хозяина, имеющей исход в гепатоцеллюлярную карциному и/или в цирроз печени, сокращение сроков элиминации ккзДНК ВГВ из гепатоцитов, уменьшение уровня секретируемой ДНК ВГВ, уменьшение уровня поверхностного антигена ВГВ (HBsAg), уменьшение уровня кор-белка (HBcAg), компонента вирионов и регулятора транскрипции ккзДНК и, наконец, уменьшение уровня Х белка ВГВ (HBxAg), основного про-онкогенного фактора, одного из ключевых компонентов развития фиброза и гепатоцеллюлярной карциномы.
Указанные задачи в рамках настоящего изобретения решаются, а технические результаты – достигаются за счет создания нового РНК-проводника, далее обозначаемого как St10, образованного нуклеотидной последовательностью AGAAAGGCCTTGTAAGTTGG (SEQ ID NO: 1), и РНК-шпилькой, фланкирующей последовательность SEQ ID NO: 1 с 3´-конца и характеризующейся последовательностью SEQ ID NO: 2
(AACGCGGUCGCCAAAGAGAUGUUUUUGUACUCUGGUACCAGAAGCUACAAA GAUAAGGCUUCAUGCCGAAAUCAACACCCUGUCAUUUUAUGGCAGGGUGUUUU) и структурой, представленной на Фигуре 1, причем указанная первая последовательность способна связываться с целевым высоко консервативным участком вирусной ДНК, а указанная вторая последовательность способна привлекать белок-эндонуклеазу Cas9 Streptococcus thermophilus (StCas9) к указанному целевому высоко консервативному участку вирусной ДНК. Также указанные задачи решаются, а технические результаты – достигаются за счет применения указанного РНК-проводника для воздействия на ДНК вируса гепатита В и, в частности, на ккзДНК вируса гепатита В различных генотипов, таких, без ограничения, как генотип A, генотип B, генотип C, генотип D, генотип E и генотип H, включая также комбинацию двух или более из указанных генотипов. Также указанные задачи решаются, а технические результаты – достигаются за счет применения указанного РНК-проводника вместе с белком StCas9 в составе рибонуклеопротеинового комплекса, доставляемого в организм, без ограничения, при помощи вирусных и невирусных методов доставки, раскрытых в перечисленных ниже в настоящем описании работах, включенных в настоящее описание посредством ссылки.
Таким образом, настоящее изобретение относится, во-первых, к самому РНК-проводнику St10, образованному нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 и фланкирующей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 с 3´-конца РНК-шпилькой последовательности SEQ ID NO: 2, представленной на Фигуре 1, и, во-вторых, к применению указанного РНК-проводника для подавления экспрессии вируса гепатита B в клетке-хозяине и для элиминации ДНК вируса гепатита В, включая ккзДНК, из клетки-хозяина. В предпочтительных неограничивающих воплощениях изобретения указанный РНК-проводник применяют вместе с белком StCas9 в составе рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего эквимолярные количества указанного РНК-проводника и белка StCas9. В отдельных воплощениях изобретения указанный РНК-проводник применяют отдельно от других РНК-проводников, известных из уровня техники. В других воплощениях изобретения указанный РНК-проводник применяют совместно с одним или несколькими другими РНК-проводниками, известными из уровня техники, предназначенными для использования в системах CRISPR-Cas9 и обеспечивающими привлечение эндонуклеазы Cas9, например, такой как эндонуклеаза Cas9 Streptococcus pyogenes или эндонуклеаза Cas9 Streptococcus thermophilus, к высоко консервативным областям ДНК вируса гепатита В. В качестве иллюстративных примеров таких РНК-проводников могут использоваться, без ограничения, РНК-проводники St3, St4, Sp20 и Sp37 согласно патенту RU 2652899 C1, при этом совместное использование РНК-проводника по изобретению с одним или несколькими другими РНК-проводниками, известными из уровня техники, позволяет охватить иные генотипы ВГВ, чем те генотипы ВГВ, в которых мишень РНК-проводника по настоящему изобретению консервативна; таким образом, обеспечивается воздействие и на ДНК ВГВ других генотипов. В качестве наиболее предпочтительных (неисчерпывающих) примеров совместного применения РНК-проводника по изобретению с другими РНК-проводниками следует отметить совместное применение РНК-проводника по изобретению с РНК-проводником St4 или с комбинацией РНК-проводников St3 и St4, обеспечивающее деградацию ДНК всех основных генотипов ВГВ, за исключением генотипа F.
В других предпочтительных (неограничивающих) воплощениях изобретения, указанный РНК-проводник применяют в составе экспрессирующих векторов. В более предпочтительных неограничивающих воплощениях изобретения, рибонуклеопротеиновый комплекс РНК-проводника с белком StCas9 упаковывается в липосомы. В наиболее предпочтительных неограничивающих воплощениях изобретения, липосомы представляют собой катионные липиды с функционально модифицированными группами для гепатотропной доставки, например, содержащих галактозные группы, которые взаимодействуют с асиалогликопротеиновыми рецепторами печени либо остатками желчных кислот, которые взаимодействуют с остатками NTCP; либо без гепатотропной доставки, например, с помощью липофектамина либо полиэтиленимина) и доставляется в организм хозяина. Менее предпочтительно, рибонуклеопротеиновый комплекс может упаковываться в золотые наночастицы, включая, без ограничения или, активированные наночастицы золота с биодеградируемыми полимерными носителями, например, такими как PASp(DET) (Lee K. et al., Nature Biomedical Engineering (2017), 1, 889-901), энкапсулированные частицы золота с регулируемым высвобождением (Wang P. et al., Angewandte Chemie International Edition (2018), 57, 1491-1496)), полимерные носители (например, биодеградируемые спиральные полипептиды (Wang H-X. et al., PNAS (2018), 115, 4903-4908), полилактогликолевую кислоту (Jyuthi K. et al., International Journal of Nanomedicine (2015), 10, 903-921), хитозаны (Cheng M. et al., International Journal of Nanomedicine (2013), 8, 4265-4276) и пр.). В альтернативных воплощениях изобретения, или указанный рибонуклеопротеиновый комплекс, содержащий эквимолярные количества указанного РНК-проводника и белка StCas9, может не упаковываться. В других альтернативных предпочтительных воплощениях изобретения, доставка указанного РНК-проводника вместе с белком StCas9 может происходить другими невирусными или вирусными методами. В наиболее предпочтительных неограничивающих воплощениях изобретения, предусматривающих доставку указанного РНК-проводника вместе с белком StCas9 невирусными методами, указанная доставка может осуществляться, без ограничения, в виде кодирующей Cas9 мРНК с РНК-проводником либо кодирующих Cas9 белок и/или РНК-проводник ДНК-последовательностей либо векторов (Finn J.D. et al., Cell Reports (2018), 22, 2227-2235). В наиболее предпочтительных неограничивающих воплощениях изобретения, предусматривающих доставку указанного РНК-проводника вместе с белком StCas9 вирусными методами, указанная доставка может осуществляться, без ограничения, с помощью адено-ассоциированных векторов (например, AAV8, AAV7, AAV6.2, AAVrh64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAV2, AAV3B, AAVrh.32.33 либо других модификаций AAV или их смесей (Kattenhorn L.M. et al., Human Gene Therapy (2016), 27, 947-961)), векторов на основе аденовирусов, лентивекторов (включая интегрируемые и не интегрируемые лентивекторы (Karwacz K. et al., Journal of Virology (2009), 83, 3094-3103) либо иных генетических конструктов на их основе. Также для доставки указанного РНК-проводника вместе с белком StCas9 могут использоваться другие невирусные или вирусные методы доставки, известные специалисту в данной области, но не указанные выше.
Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, например, человека. Наиболее предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой гепатоцит млекопитающего, например, человека. Менее предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой любую другую клетку млекопитающего, например, человека, в которой может персистировать вирус гепатита В. В качестве примера такой клетки, без ограничения, можно указать моноциты, T- и B-лимфоциты, NK-клетки и гранулоциты указанного млекопитающего.
Технический результат достигается тем, что РНК-направляемая ДНК-эндонуклеаза Cas9 Streptococcus thermophilus распознаёт целевую последовательность ДНК ВГВ, содержащую PAM-мотив NNAGAAW, где N представляет собой любой нуклеотид, выбранный из A, T, G и C, а W представляет собой А или Т;
В предпочтительных (неограничивающих) вариантах осуществления изобретения, клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, например, человека, инфицированную вирусом гепатита В, или клетку млекопитающего, в которой персистирует вируc гепатита В. Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой гепатоцит млекопитающего, например, человека. Менее предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой моноцит, Т- или В-лимфоцит, NK-клетку или гранулоцит млекопитающего, например, человека, в котором персистирует вирус гепатита В;
Предпочтительно, ДНК вируса гепатита B представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую ДНК (ккзДНК). В альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения, ДНК вируса гепатита В представляет собой релаксированную ДНК (ркДНК), линейную двуцепочечную ДНК или вставку генома вируса в геном человека.
Предпочтительно, но без ограничения, вирус гепатита В имеет генотип, выбранный из генотипа А, генотипа В, генотипа С, генотипа D, генотипа E или генотипа H. В альтернативном варианте осуществления изобретения, может иметь место комбинация двух или более генотипов вируса гепатита В, где указанные генотипы выбраны из генотипов A, B, C, D, E и H.
Изобретение иллюстрируется фигурами, перечень которых приведен ниже, а также примерами, приведенными ниже, подтверждающими возможность осуществления изобретения и реализации заявленного назначения.
Перечень фигур:
Фигура 1: Структура шпильки РНК-проводника для белка Cas9 Streptococcus thermophilus.
Фигура 2: Противовирусная активность ортологичной системы StCas9. (А) Мишени StCas9 в геноме ВГВ. (Б) Консервативность мишеней РНК-проводников StCas9 среди генотипов ВГВ А-Н. Интенсивность красных и зеленых цветов указывает на низкую и высокую консервативность мишени в каждом отдельном генотипе ВГВ. (В) Анти-ВГВ активность различных РНК-проводников системы StCas9. Противовирусную активность определяли по снижению уровней пгРНК и S-РНК ВГВ, уровни РНК ВГВ нормализовали на мРНК Cas9 белка. Обозначения: Mock, контрольный образец. +p < 0.05, #p < 0.01, ~p < 0.001, *p < 0.0001.
Фигура 3: Подавление продукции белков ВГВ системами SpCas9 и StCas9. Уровни HBsAg определяли в культуральной среде после трансфекции систем (А) SpCas9 или (Б) StCas9. (В) Снижение экспрессии НВсAg различными системами CRISPR/Cas9 к 5 суткам после трансфекции. Клетки HepG2 трансфицировали плазмидой, экспрессирующей ВГВ и указанными системами CRISPR/Cas9, окрашивали на НВсAg (зеленое окрашивание) и SpCas9 (красное окрашивание). Ядра клеток маркировали красителем Hoechst33342 (голубое окрашивание). Количественный анализ HBcAg-позитивных и SpCas9-позитивных клеток после трансфекции (Г) SpCas9 или (Д) StCas9 CRISPR/Cas9 систем из экспериментов, описанных в пункте (В). Обозначения: Mock, контрольный образец. NT, не трансфицированные клетки.
Фигура 4: Подавление репликации ВГВ системами CRISPR/Cas9 на стабильных линиях клеток. Дизайн экспериментов на клетках (А) HepG2-1.1merHBV и (Б) HepG2-1.5merHBV. Подавление транскрипции ВГВ (В) при трансфекции синтезированной ккзДНК ВГВ, (Д) на клетках HepG2-1.1merHBV и (Е) клетках HepG2-1.5merHBV. Изменение уровней ДНК ВГВ и ккзДНК (относительно уровней β-глобина) после трансфекции StCas9 системы на (Г) синтезированной ккзДНК, (Ж) клетках HepG2-1.1merHBV и (З) клетках HepG2-1.5merHBV. Звездочками указаны статистически значимые отличия: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Обозначения: Mock – контрольный образец.
Фигура 5: Глубокое секвенирование целевых регионов StCas9 в ккз ДНК ВГВ. (А) Сайты вставок/делеций (на 1000 прочтений) после трансфекции РНК-проводников St3, St4, St10. (Б) Распределение делеций (на 1000 прочтений) после трансфекции РНК-проводников St3, St4, St10. Распределение делеций подсчитывали как частоту делетированного нуклеотида в каждой указанной позиции. Ось Х указывает на целевой регион в геноме ВГВ. Обозначения: Mock – контрольный образец; РАМ – мотив, прилежащий к протоспейсеру.
Фигура 6: Анализ влияния нуклеотидных несовпадений на активность системы StCas9 (А, Д) Схематическое изображение нуклеотидных несовпадений между РНК-проводником St4 и мишенью в указанных позициях. Во всех случаях, нуклеотиды были заменены на комплементарный с сохранением состава CG. Эффекты нуклеотидных несовпадений на анти-ВГВ активность анализировали методом ПЦР, измеряя (Б, Е, Ж) уровни пгРНК и S-РНК ВГВ, либо (В, Г, З) ДНК ВГВ и ккзДНК. Уровни пгРНК/S-РНК нормализовали на мРНК StCas9, уровни ДНК ВГВ/ккзДНК нормализовали на уровни β-глобина. Символами отмечены статистически значимые отличия: +p < 0.05, #p < 0.01, ~p < 0.001, *p < 0.0001.
Фигура 7: Глубокое секвенирование целевых регионов в ккзДНК ВГВ после трансфекции РНК-проводников St4 с 3 нуклеотидными несовпадениями. (А) Сайты вставок/делеций (на 1000 прочтений) после трансфекции РНК-проводников St4 с 3 нуклеотидными несовпадениями. (Б) Распределение делеций (на 1000 прочтений) после трансфекции РНК-проводников St4 с 3 нуклеотидными несовпадениями. Распределение делеций подсчитывали как частоту делетированного нуклеотида в каждой указанной позиции. Ось Х указывает на целевой регион в геноме ВГВ, РАМ – мотив, прилежащий к протоспейсеру.
Фигура 8: Глубокое секвенирование потенциальных внецелевых регионов в геноме человека для StCas9 и SpCas9. (A) Описание внецелевых мишеней для РНК-проводников St4 и Sp20. Красным обозначены несовпадающие нуклеотиды между мишенью и РНК-проводником. ING – межгенный регион, I – интрон. (Б) Частота мутаций во внецелевых регионах при использовании Sp20 и St4. (В) Анализ распределения вставок/делеций и распределения делеций во внецелевых регионах. Mock – контрольный образец; РАМ – мотив, прилежащий к протоспейсеру.
Фигура 9: Противовирусное действие рибонуклеопротеиновых комплексов StCas9 с РНК-проводниками и их комбинациями на моделях гепатита В in vitro и in vivo. (A) Подавление транскрипции ВГВ с помощью комплексов StCas9-РНК-проводник. (Б) Разрушение ДНК и ккзДНК ВГВ при трансфекции рибонуклеопротеиновых комплексов StCas9-РНК-проводник. (В) Снижение вирусной нагрузки ВГВ после инъекции рибонуклеопротеиновых комплексов StCas9-РНК-проводник в составе липосом. Обозначения: Stnc – контрольный образец с нецелевым РНК-проводником; St3, St4, St10 – комплексы с одиночными РНК-проводниками; St4-10, St3-4-10 – комплексы с комбинацией РНК-проводников St4+St10 и St3+St4+St10, соответственно. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001.
С использованием различных моделей гепатита В, включая: (1) ко-трансфекцию клеток HepG2 системой CRISPR1 StCas9 и плазмидой, запускающей цикл ВГВ; (2) ко-трансфекцию клеток синтезированной ккзДНК ВГВ и системой CRISPR1 StCas9; (3) липофекцию стабильной линии клеток HepG2-1.1merHBV с индуцибельной tet-on регулируемой продукцией ВГВ системой CRISPR1 StCas9; (4) липофекцию стабильной линии клеток HepG2-1.5merHBV с продукцией HBV под промотором дикого типа системой CRISPR1 StCas9, был проведен анализ РНК-проводников St3 и St4, известных из патента RU 2652899 C1, а также ряда других РНК-проводников системы CRISPR1 StCas9 (всего 10 РНК-проводников), нацеленных на высоко консервативные регионы генома HBV, и показано, что из 10 проанализированных РНК-проводников системы CRISPR1 StCas9 три созданных авторами настоящего изобретения РНК-проводника, включая запатентованные ранее РНК-проводники St3 и St4 по патенту RU 2652899 C1, а также созданный в рамках настоящего изобретения новый РНК-проводник (St10), специфичный к регионам генома HBV, консервативным во многих генотипах ВГВ, обладали наиболее выраженной противовирусной активностью;
(I) Был проведен анализ вырожденности мишеней St10, т.е. была выполнена оценка частоты единичных, двойных и тройных несовпадений нуклеотидов в целевых областях генома HBV;
(II) Был создан набор мутантных РНК-проводников с единичными (в количестве 20 шт), двойными и тройными несовпадениями между мишенью (геномом HBV) и РНК-проводником (в количестве 21 шт), и проведена оценка влияния несовпадений нуклеотидов на противовирусную активность РНК-проводников на двух моделях (ко-трансфекция синтезированной ккзДНК ВГВ с системой StCas9). Влияние несовпадений нуклеотидов (mismatch tolerance) на возможность разрезания целевой последовательности в синтезированной ккзДНК ВГВ была проанализирована методом оценки частоты вносимых единичных полиморфизмов и частоты вставок/делеций с помощью NGS;
(III) Для выбранных высококонсервативных и высокоэффективных РНК-проводников St10 был осуществлен поиск возможных внецелевых мишеней в геноме человека;
(IV) Методом глубокого NGS секвенирования была изучена возможность внецелевого действия StCas9 на геном человека в сравнении с ранее запатентованным РНК-проводником Sp20 системы Streptococcus pyogenes (РНК-проводник согласно патенту RU 2652899 C1);
(V) С помощью доставки рибонуклеопротеиновых комплексов StCas9 с РНК-проводниками в культуры клеток показано полное исчезновение транскриптов ВГВ на 3 сутки после трансфекции. Доставка рибонуклеопротеиновых комплексов StCas9 с РНК-проводниками в составе липосом модельным мышам in vivo снижает вирусную нагрузку на 75-80% на 1-2 сутки после инъекции.
Материалы и методы
Культуры клеток и трансфекция. Клетки гепатомы человека HepG2 культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мкМ L-глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина. Клетки HepG2 трансфицировали с помощью 7.5 мМ полиэтиленимина. Смесь ДНК, содержащую 0.625 мкг 1.1-merHBV-кодирующей плазмиды (предоставлено проф. Dieter Glebe, University of Giessen) генотипа D или 100 нг синтезированной ккзДНК ВГВ, 0.625 мкг плазмиды, кодирующей Cas9 белок (SpCas9-EGFP, StCas9), и 10 нг ПЦР-продукта, транскрибирующего специфический РНК-проводник, по каплям добавляли в 35 мкл раствора NaCl. Одновременно с этим, готовили раствор полиэтиленимина (5.7 мкл/лунку 12-луночного планшета) в NaCl (29.8 мкл/лунку 12-луночного планшета), и оставляли на 10 минут, после чего два раствора аккуратно смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут перед добавлением к культуре клеток. После 24 часов, культуральную жидкость отбрасывали, клетки промывали дважды в фосфатном буфере и культивировали в полной среде в последующие 72 часа. В другом случае, клетки HepG2 трансфицировали с помощью Lipofectamine 2000 в соответствии с инструкциями фирмы-производителя (Thermo Fisher Scientific). Все результаты воспроизводили по крайней мере 5 раз. Для того, чтобы предотвратить деградацию ккзДНК ВГВ, клетки HepG2-1.1merHBV обрабатывали раствором низкомолекулярного соединения NU7026 (7,5 мкМ, растворенный в диметилсульфоксиде; Sigma) в течение 72 часов. Диметилсульфоксид (ДМСО) добавляли в группу контроля.
Получение синтезированной ккзДНК. 1.0-mer линейный геном ВГВ высвобождали из плазмиды pCH-HBV, кодирующей ВГВ, инкубируя плазмиду с ферментами рестрикции PsiI и PstI в буфере Y (Sibenzyme) в течение ночи. Геном ВГВ (3182 п.н.) очищали методом электрофореза в геле, и выделяли с помощью набора для экстракции из геля Qiagen gel extraction kit. Линейный геном ВГВ религировали, используя Т4 ДНК-лигазу (Thermo Fisher Scientific), в течение ночи при комнатной температуре. Общую ДНК выделяли с помощью преципитации изопропанолом. Продукты лигирования очищали с помощью электрофореза в геле, и фрагменты кольцевого, полноразмерного генома ВГВ вырезали и выделяли с помощью Qiagen gel extraction kit. В другом случае, синтезированную ккзДНК ВГВ получали с помощью технологии minicircle(System Biosciences).
In vitro транскрипция РНК-проводников CRISPR/Cas9. Кодирующие РНК-проводники ПЦР-продукты с U6-промотором были клонированы под Т7-промотор с помощью двухэтапного ПЦР и очисткой ПЦР-продуктов в агарозном геле. РНК нарабатывали in vitro при помощи Т7 РНК-полимеразы (NEB), инкубируя реакционную смесь в течение ночи при 37°C. Матрицы ДНК удаляли из реакционной смеси инкубацией с ДНКазой I типа без РНКазной активности (NEB). РНК осаждали и очищали, смешивая реакционную смесь с изопропанолом в отношении 1:1 и NaCl (до 200 мМ) и центрифугируя 20 минут при 13,400Чrpm. Полученный осадок промывали 70% и, далее, абсолютным этанолом. Высушенный осадок растворяли в растворе фосфатного буфера в стерильных условиях.
Доставка Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas9 в виде рибонуклеопротеиновых комплексов (РНП) in vitro и in vivo. Комплексы РНП доставляли в клетки с помощью метода нуклеофекции. В экспериментах in vivo мышам линии BALB/C мужского пола, весом 21-25 грамм, возраста 6-8 недель вводили плазмиду, экспрессирующую геном HBV методом гидродинамической инъекции в хвостовую вену. Введение РНП мышам BALB/C проводили после упаковки РНП в липосомы методом гидродинамической инъекции в хвостовую вену. Перед введением РНК-проводник прогревали при 37°C в течение 10 минут, затем остужали пробирки с РНК при комнатной температуре в течение 10 минут. Белок Cas9 и РНК-проводники смешивали в эквимолярных соотношениях. Доза РНП на одну мышь составляла 150 мкг белка и 150 мкг РНК-проводника.
Нуклеофекция систем CRISPR/Cas9. Нуклеофекцию клеток HepG2-1.1mer/1.5merHBV (предоставлены проф. Dieter Glebe, University of Giessen) проводили в соответствии с инструкциями фирмы-производителя (Lonza). Вкратце, 1 миллион клеток снимали с культуральных планшетов с помощью раствора трипсин/ЭДТА, центрифугировали, промывали фосфатным буфером и ресуспендировали в смеси ДНК, SF Nucleofector solution и Supplement 1, содержащих 200 нг ПЦР-продуктов, 4 мкг Cas9-кодирующей плазмиды и 800 ng pMAX-GFP. Нуклеофекцию проводили с помощью прибора LONZA Nucleofector со стандартными параметрами для клеток HepG2. Клетки рассаживали в 6-луночные планшеты с полной средой с/без доксициклина. По прошествии 24 часов, среду отбрасывали, клетки промывали дважды в фосфатном буфере, и добавляли полную среду с бластицидином (15 нг/мл) на следующие 120 часов. Все результаты воспроизводили как минимум три раза.
Конструкты CRISPR/Cas9. Мишени в геноме ВГВ и потенциальные внецелевые сайты оценивали и подбирали РНК-проводники с помощью ресурсов Broad Institute Genetic Perturbation Platform и CCTop CRISPR/Cas9 target online calculator. Консервативность последовательностей РНК-проводников среди генотипов ВГВ оценивали в программе Geneious с использованием опубликованных полногеномных последовательностей генотипов ВГВ из GenBank. ПЦР-продукты, содержащие промотор U6 и РНК-проводник, специфичный для каждого типа белков Cas9, синтезировали с помощью двухэтапного мутагенного ПЦР с использованием полимеразы Q5 и очистки с помощью набора Qiagen gel extraction kit. Мутантные формы РНК-проводников с нуклеотидными заменами получали схожим образом с праймерами, содержащими замены нуклеотидов в указанных позициях. Результаты экспериментов с мутантными формами РНК-проводников воспроизводили по крайней мере 3 раза. В исследованиях были использованы следующие плазмиды: M-NMcas (AddGene plasmid #48670), M-NM-sgRNA (AddGene plasmid #48673), M-ST1cas9 (AddGene plasmid #48669) и M-ST1-sgRNA (AddGene plasmid #48672) были предоставлены George Church; Lenti-Cas9-2A-Blast (AddGene plasmid #73310) была предоставлена Jason Moffat; pLX-sgRNA (AddGene plasmid #60662) была предоставлена Eric Lander и David Sabatini; плазмида PX408 Francisella tularensis subsp. Novicida Cas9 (AddGene plasmid #68705) была предоставлена Feng Zhang. Lenti-ST1cas9-2A-Blast была получена путем клонирования ST1cas9 в плазмиду AddGene plasmid #73310.
Выделение нуклеиновых кислот. В день выделения нуклеиновых кислот, культуральную среду отбирали, клетки промывали дважды фосфатным буфером и лизировали с помощью буфера AmpliSens РИБОПРЕП (ЦНИИ Э). Нуклеиновые кислоты выделяли с помощью набора AmpliSens РИБОПРЕП (ЦНИИ Э) в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения РНК, нуклеиновые кислоты обрабатывали ДНКазой I типа без РНКазной активности (NEB) в течение 30 минут при 37°C, очищали с помощью набора AmpliSense РИБОПРЕП (ЦНИИ Э), и ставили реакцию обратной транскрипции с помощью набора AmpliSens РЕВЕРТА-FL (ЦНИИ Э). ккзДНК ВГВ выделяли с помощью процедуры Hirt, как описано ранее Cai и др., с последующей обработкой ферментом plasmid-safe ATP-dependent DNase (Epicentre) в течение 12 часов при 37°C и инактивацией фермента при 72°C в течение 15 минут.
ПЦР анализ. В экспериментах по трансфекции клеток HepG2, экспрессию пгРНК и S-РНК ВГВ нормализовали на уровни экспрессии мРНК Cas9. В экспериментах по нуклеофекции, пгРНК и S-РНК ВГВ измеряли относительно мРНК GAPDH. Общие уровни внутриклеточной ДНК ВГВ и ккзДНК нормализовали на уровни β-глобина генома. Все ПЦР-реакции были проведены с соответствующими праймерами и зондами. Относительные уровни рассчитывали с помощью метода ΔΔCt.
Иммунофлуоресценция. Клетки рассаживали на покровные стекла, трансфицировали с помощью полиэтиленимина, фиксировали в 4% параформальдегиде на 10 минут до снятия. Затем покровные стекла промывали 3 раза в буфере Tris-HCl (50 мМ, pH 8.0) и инкубировали в течение 30 минут в блокирующем буфере (0.02% Triton X-100, 10% лошадиной сыворотки и 150 мМ NaCl в Tris-HCl [50 мМ, pH 8.0]). Покровные стекла затем инкубировали с первичными кроличьими анти-НВс антителами (ab115192) и мышиными анти-Cas9 антителами (ab191468) при комнатной температуре в течение 1 часа, промывали 3 раза в течение 5 минут в промывочном буфере (0.02% Triton X-100 и 200 mM NaCl в Tris-HCl [50 мМ, pH 8.0]) и инкубировали со вторичными Alexa Fluor 488 анти-кроличьими IgG антителами козла (ab150077) и Alexa Fluor 594 анти-мышиными IgG H & L антителами (ab150116) с ядерным красителем Hoechst33342 (1:10,000) (ab145597) при комнатной температуре в течение 1 часа. Стекла промывали 3 раза в течение 5 минут в промывочном буфере и фиксировали реагентом Fluoroshield (ab104135). Изображения получали на микроскопе Leica DMI6000 с 20× иммерсионным объективом.
Флуоресцентная микроскопия и FACS анализ. Эффективность трансфекции и нуклеофекции определяли с помощью флуоресцентной микроскопии EGFP-экспрессирующих клеток на канале FITC с использованием микроскопа Olympus IX73. Для определения эффективности трансфекции и нуклеофекции методом FACS-анализа, клетки промывали дважды в фосфатном буфере и снимали с планшетов с помощью раствора трипсин/ЭДТА. Открепившиеся клетки ресуспендировали в полной среде и центрифугировали при 500 × g в течение 5 минут. Супернатант отбрасывали, клеточный осадок ресуспендировали в фосфатном буфере и центрифугировали вновь, как описано выше. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 300 мкл фосфатного буфера и использовали для анализа FACS на канале FITC. FACS-анализ проводили на приборе Novocyte3000 (ACEA Biosciences, Inc). Результаты анализировали с помощью программного обеспечения Novocyte.
NGS секвенирование. Целевые и потенциальные внецелевые мишени амплифицировали с парами специфических праймеров с использованием высокоточной полимеразы Q5. Ампликоны очищали методом гель-электрофореза, экстрагировали с помощью набора Qiagen gel extraction kit, подсчитывали концентрации на приборе Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies), получали пулы образцов в эквимолярных соотношениях. После прикрепления адаптеров для Illumina, библиотеки секвенировали с помощью инструмента MiSeq (Illumina), при длине прочтений 250 нуклеотидов. Программное обеспечение FASTQC и Geneious использовали для количественной оценки, построения референсного выравнивания, отбраковывания низкокачественных прочтений и нуклеотидов, подсчета инсерций/делеций.
Статистика. Представлены средние значения данных ± стандартные отклонения (SD) трех экспериментов в программе SPSS software (SPSS 21.0.0.0). Результаты трансфекции клеток HepG2 были воспроизведены по крайней мере в 5 независимых экспериментах. Результаты на стабильных линиях клеток и данные по влиянию несовпадений нуклеотидов воспроизведены по крайней мере 3 раза. Для определения значимых отличий использовали однофакторный дисперсионный анализ или T-критерий Стьюдента с попарными апостериорными сравнениями (где применимо).
Результаты
1. Последовательность РНК-проводника для CRISPR1 Cas9 S.thermophilus
Модель ко-трансфекции клеток HepG2 плазмидой, кодирующей геном ВГВ, плазмидой с StCas9 и ПЦР-продуктом, кодирующим один из РНК-проводников StCas9 (St1-St10), использовали для первичной оценки противовирусного действия системы StCas9. Мишенями РНК-проводников были ключевые элементы генома ВГВ (Рис. 1А). В результате, четыре РНК-проводника (St1, St3, St4, St10) снижали уровни пгРНК и S-РНК ВГВ >50% (Рис. 1В). Наиболее существенным снижение транскрипции ВГВ наблюдалось для РНК-проводников St1 и St10, при этом St3, St4 и St10 ложились на высококонсервативные области генома ВГВ (Рис. 1Б). Мишень РНК-проводника St10 была консервативна в геномах ВГВ генотипов А, В, С, D, E и Н.
Для подтверждения результатов на уровне экспрессии вирусных белков, был проведен сравнительный анализ подавления репликации ВГВ с системами SpCas9 и StCas9 (Рис. 2А-Д). Как и ожидалось, результаты по снижению S-РНК ВГВ коррелировали со снижением продукции поверхностного HBsAg ВГВ. Из ранее описанных нами РНК-проводников SpCas9, Sp20 снижал продукцию HBsAg >80%, в то время как Sp42, не влияющий на экспрессию S-РНК, также не оказывал значительного влияния на уровни HBsAg (Рис. 2А). В свою очередь, StCas9 с РНК-проводниками St3 и St4 подавлял продукцию HBsAg примерно в 2 раза, а с РНК-проводником St10 >70% (Рис. 2Б). При оценке влияния CRISPR/Cas9 систем на экспрессию кор-белка (HBcAg), основного продукта пгРНК ВГВ, были использованы РНК-проводники систем SpCas9 (Sp20, Sp39, Sp40) и StCas9 (St3, St4, St10) (Рис. 2В-Д). В позитивных контролях имммуноцитохимическое окрашивание клеток HepG2 выявляется сигнал ВГВ (зеленое окрашивание для образцов SpCas9 и StCas9) и SpCas9 (красное окрашивание для образца SpCas9; StCas9 не определяется анти-SpCas9 антителами), тогда как в негативном контроле (Mock) сигналы не детектируются (Рис. 2В). Процент HBcAg-позитивных и SpCas9-позитивных клеток в позитивных образцах колеблется в пределах 5-20%. При трансфекции SpCas9 и StCas9 с указанными на Рис. 2В РНК-проводниками, происходит значительное снижение экспрессии НВсAg (исчезновение зеленого окрашивания). При подсчете детектируются редкие слабо светящиеся HBcAg-позитивные клетки (Sp39, St4), либо HBcAg-позитивные клетки практически не детектируются (Sp20, Sp40, St3, St10) (Рис. 2Г, Д).
Особенность модели ко-трансфекции клеток HepG2 плазмидой, кодирующей геном ВГВ, является невозможность определения ккзДНК ВГВ вследствие технических особенностей (кольцевую плазмиду невозможно отделить от кольцевого генома ВГВ с помощью фермента plasmid-safe ATP-dependent DNase). Для анализа эффектов StCas9 на ккзДНК ВГВ, были использованы три модели ВГВ: ко-трансфекция с синтезированной in vitro ккзДНК ВГВ и две стабильные модели ВГВ (HepG2-1.1merHBV и HepG2-1.5merHBV). Схемы экспериментов на стабильных линиях клеток представлены на Рис. 3А, Б, схема эксперимента по ко-трансфекции синтезированной ккзДНК ВГВ идентична ко-трансфекции ВГВ-кодирующей плазмиды. Во всех случаях StCas9 с РНК-проводниками St3, St4 и St10 оказывал мощное противовирусное действие, снижая уровни пгРНК/S-РНК >50%, и уровни ккзДНК ВГВ >70%. Наиболее выраженное действие было выявлено на модели HepG2-1.5merHBV, где происходило практически полное прекращение транскрипции вируса с РНК-проводниками St4 и St10. На всех трех моделях по разным показателям St10 продемонстрировал более выраженную противовирусную активность, чем запатентованные ранее St3 и St4.
Анализ методом глубокого секвенирования NGS выявил мутации, вносимые StCas9 с каждым РНК-проводником, при этом наиболее высокие уровни мутаций в целевом регионе детектировались при использовании РНК-проводника St10 (Рис. 4). В контрольных образцах уровень мутаций варьировал от 0,13 до 0,25 на 1000 прочтений, в то время как при использовании CRISPR/Cas9 частота мутаций St3 и St4 составляла от 0,89 до 10,9 на 1000 прочтений. Частота мутаций в геноме ВГВ при использовании St10 достигала 19,3 на 1000 прочтений.
Исходя из полученных данных, система StCas9 с РНК-проводником St10 оказывает наиболее выраженное противовирусное действие на уровне транскрипции (пгРНК/S-РНК), ккзДНК/ДНК ВГВ и экспрессии HBsAg. Следовательно, целесообразно его использование для создания анти-ВГВ препаратов на основе StCas9.
2. Специфичность системы CRISPR1 Cas9 S. thermophilus
Исходя из данных литературы, известно, что SpCas9 вносит нуклеолитические разрывы в мишень ДНК при наличии 1-6 несовпадений нуклеотидов между мишенью и РНК-проводником (Zhang X.H., Tee L.Y. et al., 2015; Fu Y. et al., 2014; Cho S.W. et al., 2014). In silico анализ РНК-проводников SpCas9 и StCas9 показал, что большая часть РНК-проводников SpCas9 содержит хотя бы несколько потенциальных мишеней с 1-3 несовпадениями нуклеотидов (Таблица 2). Напротив, из РНК-проводников StCas9 только у St3 есть потенциальная внецелевая мишень с 3 несовпадениями нуклеотидов, в то время как для St4 и St10 потенциальные внецелевые мишени выявляются при наличии как минимум 4 несовпадений нуклеотидов.
Способность CRISPR1 StCas9 игнорировать несовпадения нуклеотидов ранее не была описана, хотя опубликованные данные свидетельствуют о большей специфичности систем CRISPR1 и CRISPR3 StCas9 в сравнении с классической системой SpCas918. Для полуколичественного анализа способности StCas9 разрезать мишень при наличии несовпадений нуклеотидов, были синтезированы РНК-проводники St4 с заменами нуклеотидов на комплементарный в указанных позициях (Рис. 4А, Д), включая однонуклеотидные замены, 2- и 3-нуклеотидные замены. Для полуколичественного анализа влияния несовпадений нуклеотидов на активность StCas9 была использована хорошо отработанная система по оценке противовирусного действия на модели ко-трансфекции клеток HepG2 синтезированной ккзДНК с системой StCas9. По результатам анализа однонуклеотидные замены не снижали, и даже в некоторых случаях усиливали противовирусное действие StCas9 (Рис. 4Б, В). Во всех случаях (М1-М20) секвенирование целевого региона выявляло частые мутации, вносимые StCas9 (Рис. 5; Табл. 3). Два и три несовпадения нуклеотидов практически полностью блокировали эффекты StCas9 на ВГВ (Рис. 4 Г-З). Секвенирование целевого региона выявляло мутации, характерные для разрезания StCas9 белком только в отдельных позициях (М1-2, М3-4, М5-6, М10-11, М11-17, М12-13, М1-2-3, М5-6-7, М17-18-19), тогда как в большинстве случаев про-мутагенная активность StCas9 не выявлялась (Рис. 5; Рис. 6; Табл. 3).
Для прямого анализа и сравнения внецелевого действия SpCas9 и StCas9, было проведено глубокое секвенирование двух внецелевых регионов с 4 несовпадениями нуклеотидов для РНК-проводников Sp20 и St4 (Рис. 8). В случае с Sp20 были обнаружены частые мутации, типичные для нуклеолитического разрезания белками Cas9 в районе 3-4 нуклеотида от РАМ. Напротив, общая частота мутаций во внецелевых регионах практически не отличалась при использовании StCas9, в то же время не наблюдалось формирование типичного паттерна мутаций, характерных для разрезания системами CRISPR/Cas9.
В результате, можно сделать вывод о том, что единичные несовпадения нуклеотидов не снижают разрезание мишеней белком StCas9, двойные и тройные несовпадения блокируют активность StCas9, хотя разрезание все же происходит при отдельных сочетаниях несовпадений нуклеотидов. Анализ внецелевого разрезания при наличии четырех несовпадений нуклеотидов не выявил мутаций при использовании StCas9, в то время как SpCas9 индуцировал образование частых мутаций во внецелевых регионах.
В целом, описанные исследования характеризуют StCas9 систему как более специфичную систему CRISPR/Cas9, которую можно использовать для эффективного удаления ВГВ из клеток без или с минимальным риском разрезания внецелевых мишеней.
3. Противовирусная активность рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR1 Cas9 S.thermophilus с РНК-проводниками
Доставка систем CRISPR/Cas9 в организм человека и клетки млекопитающих и человека может осуществляться с помощью ряда вирусных (на основе экспрессирующих векторов) и невирусных методов, включая доставку CRISPR/Cas9 в составе кодирующих плазмид, мРНК или рибонуклеопротеиновых комплексов. Из невирусных методов доставки явными преимуществами рибонуклеопротеиновых комплексов являются стабильность комплекса белка-РНК, быстрое выведение (белок Cas9 короткоживущий, существует в клетках около 24 часов), меньшая вероятность внецелевого действия и возможность четкого дозирования действия систем нуклеаз. Трансфекция системы CRISPR1 Streptococcus thermophilus в составе рибонуклеопротеинового комплекса в клетки вызывала подавление транскрипции ВГВ ко 2 суткам после трансфекции, в то время как на 3 сутки вирусные транскрипты не детектировались и вовсе, а уровни ДНК ВГВ и ккзДНК снижались в отдельных образцах (St10; St3-4-10) более, чем на 99% (Фиг. 9А). Таким образом, внесение достаточных количеств быстродействующих рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas9 позволяет полностью элиминировать ВГВ из инфицированных клеток всего за 3 суток (Фиг. 9А). Вместе с этим, инъекция рибонуклеопротеиновых комплексов StCas9 с РНК-проводниками в составе липосом обеспечивает снижение вирусной нагрузки на 75-80% уже на 1-2 сутки после введения модельным мышам (Фиг. 9Б). Полученные данные свидетельствуют о возможности эффективного удаления вируса из инфицированных клеток за очень ограниченный (вплоть до 2-3 суток) период времени с помощью дозированной доставки системы CRISPR1 StCas9 с РНК-проводниками в составе рибонуклеопротеиновых комплексов.
Таблица 1. Описание ортологичной системы CRISPR/Cas9 St. Всего существует 20 мишеней StCas9 в геноме ВГВ генотипа D, при этом в наших исследованиях был проведен анализ 10 мишеней, который включал все возможные высококонсервативные участки. StCas9 обладает самой длинной последовательностью PAM, и может разрезать двуцепочечную ДНК, но не РНК.
Свойство | |
StCas9 | |
*Общее число мишеней | 20 |
*Изученные мишени | 10 |
Последовательность PAM |
NNAGAAW |
Разрезание DNA | + |
Разрезание RNA | - |
Таблица 2. Сравнительный анализ потенциальных внецелевых мишеней РНК-проводников SpCas9 и StCas9. Наиболее вероятные внецелевые мишени включают мишени с наиболее высокими показателями расчетного разрезания по данным программы CTop – ("CRISPR/Cas9 target online predictor"), совокупные показатели внецелевых мишеней включают все возможные внецелевые мишени РНК-проводников в геноме человека. Числа в столбцах (1-5) обозначают число несовпадений нуклеотидов между мишенью в геноме и последовательностью РНК-проводников.
Таблица 3. Частота мутаций в геноме ВГВ при использовании мутантных форм РНК-проводника St4 с несовпадениями нуклеотидов. Частота мутаций характеризует число мутаций на 1000 прочтений. М – мутантная форма РНК-проводника, числа – позиции с несовпадениями нуклеотидов.
РНК-проводник | Вставки-делеции/1000 н.т. | Прочтений |
Mock | 0,63 | 554 935 |
St4 | 4,22 | 25 133 |
M1 | 1,13 | 291 349 |
М2 | 3,72 | 33 223 |
M3 | 0,88 | 229 441 |
M4 | 0,63 | 195 894 |
М5 | 2,49 | 35 383 |
M6 | 0,23 | 232 988 |
М7 | 3,09 | 25 232 |
M8 | 0,57 | 212 732 |
M9 | 1,48 | 231 264 |
М10 | 3,76 | 29 965 |
М11 | 2,63 | 28 952 |
M12 | 2,61 | 238 011 |
M13 | 2,63 | 280 092 |
М14 | 4,69 | 39 875 |
М15 | 3,99 | 36 253 |
М16 | 4,69 | 315 501 |
М17 | 4,81 | 33 818 |
M18 | 1,81 | 281 755 |
M19 | 1,98 | 284 489 |
М20 | 2,18 | 10 553 |
M1-2 | 0,83 | 206 568 |
М3-4 | 2,08 | 17 971 |
М5-6 | 1,07 | 32 588 |
М6-7 | 0,50 | 246 396 |
M8-9 | 0,28 | 46 016 |
M10-11 | 0,91 | 46 073 |
M12-13 | 0,85 | 51 849 |
M14-15 | 0,36 | 45 063 |
M16-17 | 0,44 | 63 020 |
M18-19 | 0,38 | 55 676 |
M19-20 | 0,30 | 51 561 |
M8-20 | 0,46 | 63 372 |
M11-17 | 0,40 | 55 792 |
М1-2-3 | 0,78 | 29 497 |
M4-5-6 | 0,53 | 347 293 |
М5-6-7 | 1,53 | 31 080 |
M8-9-10 | 0,34 | 38 268 |
M11-12-13 | 0,37 | 37 979 |
M14-15-16 | 0,41 | 52 703 |
M17-18-19 | 1,48 | 59 127 |
M18-19-20 | 0,47 | 49 459 |
Таблица 4. Праймеры и зонды, использованные в работе.
№ | Название | Последовательность нуклеотидов |
1 | fGAPDH | CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT |
2 | rGAPDH | GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT |
3 | FA_Gapdh | FAM-AACAGCGACACCCACTCCTCCACC-BHQ1 |
4 | ultramerST1_r | TATATAGCTAGCAAAAAAACACCCTGCCATAAAATGAC |
5 | ultramerNM1_r | TATATAGCTAGCAAAAAAAGCCCGTTAAAGCAGAAGC |
6 | ultramerSP1_r | TATATAGCTAGCAAAAAAAGCACCGACTCGG |
7 | ultramerU6_f | TATATAGGATCCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTG |
8 | Sp20_f | TCCGCAGTATGGATCGGCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG |
9 | Sp39_f | GAGGTGAAGCGAAGTGCACAGTTTTAGAGCTAGAAATAG |
10 | Sp40_f | GGTCTCCATGCGACGTGCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG |
11 | Sp42_f | CTTCACCTCTGCACGTCGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAG |
12 | Sp20_r | CTGCCGATCCATACTGCGGACGGTGTTTCGTCCTTTC |
13 | Sp39_r | TGTGCACTTCGCTTCACCTCCGGTGTTTCGTCCTTTC |
14 | Sp40_r | CTGCACGTCGCATGGAGACCCGGTGTTTCGTCCTTTC |
15 | Sp42_r | TGCGACGTGCAGAGGTGAAGCGGTGTTTCGTCCTTTC |
16 | St1_f | GATTAAAGACAGGTACAGTAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
17 | St1_r | TACTGTACCTGTCTTTAATCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
18 | St2_f | GGATCCAACTGGTGGTCGGGGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
19 | St2_r | CCCGACCACCAGTTGGATCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
20 | St3_f | GGCGGGGTTTTTCTTGTTGAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
21 | St3_r | TCAACAAGAAAAACCCCGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
22 | St4_f | GGCACTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
23 | St4_r | TGGCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
24 | St5_f | AAGGTTCAGGTATTGTTTACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
25 | St5_r | GTAAACAATACCTGAACCTTCGGTGTTTCGTCCTTCC |
26 | St6_f | GCATGGACATCGACCCTTATGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
27 | St6_r | ATAAGGGTCGATGTCCATGCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
28 | St7_f | AGGCGGGTATATTATATAAGGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
29 | St7_r | CTTATATAATATACCCGCCTCGGTGTTTCGTCCTTCC |
30 | St8_f | TAAATGTATACCCAAAGACAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
31 | St8_r | TGTCTTTGGGTATACATTTACGGTGTTTCGTCCTTCC |
32 | St9_f | ATTGTGAGGATTCTTGTCAAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
33 | St9_r | TTGACAAGAATCCTCACAATCGGTGTTTCGTCCTTCC |
34 | St10_f | AGAAAGGCCTTGTAAGTTGGGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
35 | St10_r | CCAACTTACAAGGCCTTTCTCGGTGTTTCGTCCTTCC |
36 | cссDNA_f | CCGTGTGCACTTCGCTTCA |
37 | cссDNA_r | GCACAGCTTGGAGGCTTGA |
38 | cccDNA_probe | FAM-CATGGAGACCACCGTGAACGCCC-BHQ1 |
39 | pgrna_f | GGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCT |
40 | pgrna_r | CATTGAGATTCCCGAGATTGAGAT |
41 | pgrna_probe | FAM-TCTCAATCGCCGCGTCGCAGA-BHQ1 |
42 | srna_f | TCCTCCAAСTTGTCCTGGTTATC |
43 | srna_r | AGATGAGGCATAGCAGCAGGAT |
44 | srna_probe | FAM-ATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGC-BHQ1 |
45 | St4_seq_f | ACTACTGCTCAAGGAACCTCT |
46 | St4_seq_r | ACAAAAGAAAATTGGTAACAGCGG |
47 | off-st4-1_f | GGAATGGGTGCTAGGCTGG |
48 | off-st4-1_r | CCCCATTTGTAGCACTCTGG |
49 | off-st4-4_f | AGAGCTGATTACAGCACACCATT |
50 | off-st4-4_r | CACTTACAGAGGAGGGCAACTG |
51 | off-sp20-1_f | CCCACCAATCTTGGGAGCAT |
52 | off-sp20-1_r | GTGCCCTCTTGAACCAAGGA |
53 | off-sp20-2_f | GAGTGACAGTTGGGGTAGGC |
54 | off-sp20-2_f | CATCTTCCAAGGAGCTGCCA |
55 | SPCas9_f | TCCTGCTGAGCGACATCCTG |
56 | SPCas9_r | GCGTAGCCGTTCTTGCTCTG |
57 | SPCas9_qpcr | FAM-TCAGGCAGCTGCTGCCGCACGA-BHQ1 |
58 | STCas9_probe | FAM-GCAGGAGCACTTCCGCGCCC-BHQ1 |
59 | STCas9_f | GAAGTTCATCGAGCGCAAC |
60 | STCas9_r | TGGCTAGAAGCCGCAATGAT |
61 | bglobin_f | V31-FEP-CE - АMPLISENS® HPV HCR-SCREEN (CRIE) |
62 | bglobin_r | V31-FEP-CE - АMPLISENS® HPV HCR-SCREEN (CRIE) |
63 | bglobin_probe | V31-FEP-CE - АMPLISENS® HPV HCR-SCREEN (CRIE) |
64 | ST4_M11_f | GGCACTAGTTAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
65 | ST4_M12_f | GGCACTAGAAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
66 | ST4_M13_f | GGCACTACTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
67 | ST4_M14_f | GGCACTTGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
68 | ST4_M15_f | GGCACAAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
69 | ST4_M16_f | GGCAGTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
70 | ST4_M17_f | GGCTCTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
71 | ST4_M18_f | GGGACTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
72 | ST4_M19_f | GCCACTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
73 | ST4_M20_f | CGCACTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
74 | ST4_M1M2_f | GGCACTAGTAAACTGAGCGTGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
75 | ST4_M3M4_f | GGCACTAGTAAACTGACGCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
76 | ST4_M5M6_f | GGCACTAGTAAACTCTGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
77 | ST4_M6M7_f | GGCACTAGTAAACACAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
78 | ST4_M1M2M3_f | GGCACTAGTAAACTGAGGGTGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
79 | ST4_M4M5M6_f | GGCACTAGTAAACTCTCCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
80 | ST4_M5M6M7_f | GGCACTAGTAAACAGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
81 | ST4_M11_r | TGGCTCAGTTAACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
82 | ST4_M12_r | TGGCTCAGTTTTCTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
83 | ST4_M13_r | TGGCTCAGTTTAGTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
84 | ST4_M14_r | TGGCTCAGTTTACAAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
85 | ST4_M15_r | TGGCTCAGTTTACTTGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
86 | ST4_M16_r | TGGCTCAGTTTACTACTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
87 | ST4_M17_r | TGGCTCAGTTTACTAGAGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
88 | ST4_M18_r | TGGCTCAGTTTACTAGTCCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
89 | ST4_M19_r | TGGCTCAGTTTACTAGTGGCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
90 | ST4_M20_r | TGGCTCAGTTTACTAGTGCGCGGTGTTTCGTCCTTCC |
91 | ST4_M1M2_r | ACGCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
92 | ST4_M3M4_r | TGCGTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
93 | ST4_M5M6_r | TGGCAGAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
94 | ST4_M6M7_r | TGGCTGTGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
95 | ST4_M1M2M3_r | ACCCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
96 | ST4_M4M5M6_r | TGGGAGAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
97 | ST4_M5M6M7_r | TGGCTCTGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
98 | ST4_M1_f | GGCACTAGTAAACTGAGCCTGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
99 | ST4_M2_f | GGCACTAGTAAACTGAGCGAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
100 | ST4_M3_f | GGCACTAGTAAACTGAGGCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
101 | ST4_M4_f | GGCACTAGTAAACTGACCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
102 | ST4_M5_f | GGCACTAGTAAACTGTGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
103 | ST4_M6_f | GGCACTAGTAAACTCAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
104 | ST4_M7_f | GGCACTAGTAAACAGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
105 | ST4_M8_f | GGCACTAGTAAAGTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
106 | ST4_M9_f | GGCACTAGTAATCTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
107 | ST4_M10_f | GGCACTAGTATACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
108 | ST4_M1_r | AGGCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
109 | ST4_M2_r | TCGCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
110 | ST4_M3_r | TGCCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
111 | ST4_M4_r | TGGGTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
112 | ST4_M5_r | TGGCACAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
113 | ST4_M6_r | TGGCTGAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
114 | ST4_M7_r | TGGCTCTGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
115 | ST4_M8_r | TGGCTCACTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
116 | ST4_M9_r | TGGCTCAGATTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
117 | ST4_M10_r | TGGCTCAGTATACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
118 | ST4_M1_f | GGCACTAGTAAACTGAGCCTGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
119 | ST4_M2_f | GGCACTAGTAAACTGAGCGAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
120 | ST4_M3_f | GGCACTAGTAAACTGAGGCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
121 | ST4_M4_f | GGCACTAGTAAACTGACCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
122 | ST4_M5_f | GGCACTAGTAAACTGTGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
123 | ST4_M6_f | GGCACTAGTAAACTCAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
124 | ST4_M7_f | GGCACTAGTAAACAGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
125 | ST4_M8_f | GGCACTAGTAAAGTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
126 | ST4_M9_f | GGCACTAGTAATCTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
127 | ST4_M10_f | GGCACTAGTATACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
128 | ST4_M1_r | AGGCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
129 | ST4_M2_r | TCGCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
130 | ST4_M3_r | TGCCTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
131 | ST4_M4_r | TGGGTCAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
132 | ST4_M5_r | TGGCACAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
133 | ST4_M6_r | TGGCTGAGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
134 | ST4_M7_r | TGGCTCTGTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
135 | ST4_M8_r | TGGCTCACTTTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
136 | ST4_M9_r | TGGCTCAGATTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
137 | ST4_M10_r | TGGCTCAGTATACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
138 | ST4_M8M9_r | TGGCTCACATTACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
139 | ST4_M10M11_r | TGGCTCAGTAAACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
140 | ST4_M12M13_r | TGGCTCAGTTTTGTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
141 | ST4_M14M15_r | TGGCTCAGTTTACATGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
142 | ST4_M16M17_r | TGGCTCAGTTTACTACAGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
143 | ST4_M18M19_r | TGGCTCAGTTTACTAGTCGCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
144 | ST4_M19M20_r | TGGCTCAGTTTACTAGTGGGCGGTGTTTCGTCCTTCC |
145 | ST4_M8M9M10_r | TGGCTCACAATACTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
146 | ST4_M11M12M13_r | TGGCTCAGTTATGTAGTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
147 | ST4_M14M15M16_r | TGGCTCAGTTTACATCTGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
148 | ST4_M17M18M19_r | TGGCTCAGTTTACTAGACGCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
149 | ST4_M18M19M20_r | TGGCTCAGTTTACTAGTCGGCGGTGTTTCGTCCTTCC |
150 | ST4_M8M20_r | TGGCTCAATTTACTAGTGCACGGTGTTTCGTCCTTCC |
151 | ST4_M11M17_r | TGGCTCAGTTCACTAGCGCCCGGTGTTTCGTCCTTCC |
152 | ST4_M8M9_f | GGCACTAGTAATGTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
153 | ST4_M10M11_f | GGCACTAGTTTACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
154 | ST4_M12M13_f | GGCACTACAAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
155 | ST4_M14M15_f | TGGCTCAGTTTACATGTGCCGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
156 | ST4_M16M17_f | GGCTGTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
157 | ST4_M18M19_f | GCGACTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
158 | ST4_M19M20_f | CCCACTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
159 | ST4_M8M9M10_f | GGCACTAGTATTGTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
160 | ST4_M11M12M13_f | GGCACTACATAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
161 | ST4_M14M15M16_f | GGCAGATGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
162 | ST4_M17M18M19_f | GCGTCTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
163 | ST4_M18M19M20_f | CCGACTAGTAAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
164 | ST4_M8M20_f | TGCACTAGTAAATTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
165 | ST4_M11M17_f | GGCGCTAGTGAACTGAGCCAGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAG |
166 | STcas9BamHI_f | TATATAGGATCCATGGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGAGCGACCTGGTGC |
167 | mSTcas_r | TATATAGCTAGCCACCTTCCTCTTCTTCTTGG |
168 | MST_seq_1 | CAGCAGGAGTTCAACCCCCAG |
169 | MST_seq_2 | GAGCTGGTGCAGTTCCGCAAG |
170 | MST_seq_3 | CGCCACCGCCAACCAGGAGAAG |
171 | MST_seq_4 | GCCACCATCTACGCCACCCGC |
172 | ST1-seq-rev | GGATGCCGAAGATGTTGTCCAGG |
Последовательность РНК-проводника CRISPR1 StCas9 St10 имеет преимущества в сравнении с известными РНК-проводниками Sp20 и Sp37, известными из патента RU 2652899 C1, 03.05.2018, выданного Федеральному бюджетному учреждению науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии", поскольку шпилька РНК-проводника St10 специфична только для CRISPR1 StCas9. Исходя из этого, основные преимущества St10 проистекают из специфичности St10 РНК-проводника к белку CRISPR1 StCas9. Как показано ранее, белки Cas9 от разных видов организмов ортологичны по отношению друг к другу, т.е. белки Cas9 от разных видов организмов не будут связываться с РНК-проводником, шпилька которого соответствует белку другого организма22. Таким образом, в случае с опубликованным РНК-проводником, StCas9 не будет связываться с указанной мишенью ввиду иной шпильки SaCas9, несмотря на наличие РАМ-последовательности StCas9 (NNAGAAW) в области, прилежащей к мишени. В сравнении с S.aureus Cas9 (также указывается как SaCas9), StCas9 имеет более длинную последовательность РАМ, что определяет его более высокую специфичность (меньшую вероятность встречаемости внецелевой мишени). РНК-проводник St10 оказывает мощное противовирусное действие, что было показано на нескольких моделях in vitro, как на уровне транскрипции, так и на уровне репликации вируса. Мишень St10 высококонсервативна среди разных генотипов ВГВ. Следовательно, St10 обладает всеми необходимыми характеристиками для разработки на его основе противовирусного препарата для полной элиминации ВГВ из инфицированных клеток.
В дополнение к этому, более высокая специфичность StCas9, связанная с длинной РАМ-последовательностью (определяет низкую частоту внецелевых эффектов) и с особенностями строения белка, характеризует StCas9 как более безопасную альтернативу другим ортологам Cas9 для создания противовирусных препаратов. Образование двуцепочечных разрывов в геноме и внецелевой мутагенез – одно из основных препятствий на пути создания противовирусных препаратов на основе CRISPR/Cas9 систем. Таким образом, ключевым свойством CRISPR/Cas9 систем является не только эффективность противовирусного действия, но и специфичность внесения нуклеолитических разрывов исключительно по целевым (заданным РНК-проводником) сайтам в геноме вируса, но не генома человека.
В наших работах было показано, что 2 и более несовпадения нуклеотидов между РНК-проводником StCas9 и потенциальной внецелевой мишенью в геноме значительно снижает или полностью блокирует нуклеолитическую активность StCas9. При прямом сравнительном анализе внецелевого разрезания SpCas9 и StCas9 было показано, что система StCas9 гораздо более специфична и не вносит мутаций во внецелевых регионах, тогда как SpCas9 индуцировал образование многочисленных мутаций в геноме человека.
Вместе с этим, использование рибонуклеопротеиновых комплексов белка CRISPR1 StCas9 с РНК-проводником или их комбинациями позволяет полностью элиминировать транскрипты ВГВ из инфицированных клеток и разрушить до 99% всех форм генома ВГВ, включая ккзДНК (Фиг. 9А). Исследования in vivo на модельных мышах также показали, что дозированное введение рибонуклеопротеиновых комплексов StCas9 с РНК-проводником позволяет снизить вирусную нагрузку на 75-80% всего ко 2 суткам после инъекции (Фиг. 9Б).
Таким образом, в рамках настоящей работы: (а) впервые было изучено действие StCas9 на моделях гепатита В; (б) создали и оценили противовирусное действие РНК-проводников системы StCas9 в наиболее консервативных регионах HBV; (в) изучили вырожденность целевых участков St3, St4 и St10 в геноме HBV; (г) оценили влияние несовпадений нуклеотидов, встречаемых в субгенотипах HBV всех генотипов (А-Н) с известными полногеномными последовательностями на противовирусное действие системы CRISPR1 StCas9; (д) провели анализ возможных внецелевых эффектов методом in situ, в экспериментах по ко-трансфекции линий клеток HepG2 и методом глубокого секвенирования и (е) добились полной элиминации транскриптом вируса и разрушения до 99% всех форм генома вируса с помощью трансфекции рибонуклеопротеиновых комплексов StCas9 с РНК-проводниками. В результате, система StCas9 оказалась гораздо более специфичной и чувствительной к несовпадениям нуклеотидов. При наличии двух и более мутаций нуклеолитическая активность StCas9 значительно снижалась или полностью отсутствовала. При анализе внецелевого действия StCas9 и SpCas9 на мишенях с 4 несовпадениями нуклеотидов было показано, что SpCas9 вносит мутации, тогда как StCas9 не показал мутагенной активности. Следовательно, StCas9 можно считать более специфичной и безопасной альтернативой классической системе SpCas9 и другим ортологичным системам.
Cозданный в рамках настоящего изобретения новый РНК-проводник St10, таким образом, может быть успешно использован с системой Cas9 Streptococcus thermophilus (StCas9) для разрушения ДНК ВГВ многих генотипов, имеющих важное клиническое значение, и для уничтожения пула персистирующей в инфицированных клетках ккзДНК ВГВ указанных генотипов. Вместе с ранее запатентованными РНК-проводниками St3 и St4, использующими систему StCas9, новый РНК-проводник позволяет охватить все имеющие наибольшее клиническое значение генотипы ВГВ, вместе с тем отличаясь минимальным риском внецелевых эффектов. Использование рибонуклеопротеиновых комплексов StCas9 белка и РНК-проводников к последовательностям генома ВГВ позволяет добиться полной элиминации инфекции в течение 3 суток после введения системы нуклеаз и, как известно из данных литературы, увеличивает безопасность системы за счет снижение возможности внецелевого разрезания генома человека (Chen Y. et al., Mol. Ther. (2016) 24, 1508-1510).
Литература
1. Schweitzer, A., Horn, J., Mikolajczyk, R. T., Krause, G. & Ott, J. J. Estimations of worldwide prevalence of chronic hepatitis B virus infection: A systematic review of data published between 1965 and 2013. Lancet 386, 1546–1555 (2015).
2. Ganem, D. & Prince, A. M. Hepatitis B virus infection--natural history and clinical consequences. N. Engl. J. Med. 350, 1118–1129 (2004).
3. Glebe, D. & Bremer, C. M. The molecular virology of hepatitis B virus. Semin. Liver Dis. 33, 103–112 (2013).
4. Hoofnagle, J. H. Reactivation of hepatitis B. Hepatology 49, S156-65 (2009).
5. Ramanan, V. et al. CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus. Sci. Rep. 5, 10833 (2015).
6. Seeger, C. & Sohn, J. A. Complete Spectrum of CRISPR/Cas9-induced Mutations on HBV cccDNA. Mol. Ther. 24, 1258–1266 (2016).
7. Seeger, C. & Sohn, J. A. Targeting Hepatitis B Virus With CRISPR/Cas9. Mol. Ther. Nucleic Acids 3, e216 (2014).
8. Bannikov, A. V & Lavrov, A. V. [CRISPR/CAS9, the King of Genome Editing Tools]. Mol. Biol. (Mosk). 51, 582–594 (2017).
9. Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science (80-. ). 339, 823–826 (2013).
10. Koonin, E. V., Makarova, K. S. & Zhang, F. Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems. Curr. Opin. Microbiol. 37, 67–78 (2017).
11. Hsu, P. D. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology 31, 827–832 (2013).
12. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S. & Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol. Ther. - Nucleic Acids 4, e264 (2015).
13. Fu, Y. et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotech 31, 822–826 (2013).
14. Akcakaya, P. et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature 561, 416–419 (2018). doi:10.1038/s41586-018-0500-9
15. Kleinstiver, B. P. et al. High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature 529, 490–495 (2016).
16. Dang, Y. et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biol. 16, 280 (2015).
17. Müller, M. et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol. Ther. 24, 636–644 (2016).
18. Lee, C. M., Cradick, T. J. & Bao, G. The Neisseria meningitidis CRISPR-Cas9 System Enables Specific Genome Editing in Mammalian Cells. Mol. Ther. 24, 645–654 (2016).
19. Ran, F. A. et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186–191 (2015).
20. RU 2652899 C1, "РНК-проводники для подавления репликации вируса гепатита B и для элиминации вируса гепатита B из клетки-хозяина", опубликован 03.05.2018, МПК: C12N 15/00, C12N 15/11, C12N 15/113, C12N 15/51, выдан Федеральному бюджетному учреждению науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) (RU).
21. Cho, S. W. et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24, 132–141 (2014).
22. Najm, F. J. et al. Orthologous CRISPR-Cas9 enzymes for combinatorial genetic screens. Nat. Biotechnol. 36, 179–189 (2018).
23. Chen, Y. et al. A self-restricted CRISPR system to reduce off-target effects. Mol Ther. 24, 1508-10 (2016).
24. Lee K. et al. Nanoparticle delivery of Cas9 ribonucleoprotein and donor DNA in vivo induces homology-directed DNA repair. Nat Biomed Eng. 1, 889-901 (2017).
25. Wang P. et al. Thermo-triggered release of CRISPR-Cas9 system by lipid-encapsulated gold nanoparticles for tumor therapy. Angew Chem Int Ed Engl. 57, 1491-1496 (2018).
26. Wang H-X. et al. Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide. PNAS. 115, 4903-4908 (2018).
27. Jyothi K. et al. Liver-targeted cyclosporine A-encapsulated poly (lactic-co-glycolic) acid nanoparticles inhibit hepatitis C virus replication. Int J Nanomedicine. 10, 903-921 (2015).
28. Finn J.D. et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Rep. 22, 2227-2235 (2018).
29. Kattenhorn L.M. et al. Adeno-associated virus gene therapy for liver disease. Hum Gene Ther. 27, 947-961 (2016).
30. Karwacz K. et al. Nonintegrating lentivector vaccines stimulate prolonged T cell and antibody responses and are effective in tumor therapy. Journal of Virology. 83, 3094-3103 (2009).
31. Cheng M. et al. Synthesis of liver-targeting dual-ligand modified GCGA/5-FU nanoparticles and their characteristics in vitro and in vivo. Int J Nanomedicine. 8, 4265-4276 (2013).
Claims (20)
1. Молекула РНК-проводника для подавления экспрессии вируса гепатита B в клетке-хозяине и для элиминации ДНК вируса гепатита В из клетки-хозяина, где указанный РНК-проводник образован первой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (AGAAAGGCCTTGTAAGTTGG), и второй нуклеотидной последовательностью, представляющей собой РНК-шпильку, фланкирующей указанную первую последовательность с 3r´-конца и характеризующейся последовательностью SEQ ID NO: 2 (AACGCGGUCGCCAAAGAGAUGUUUUUGUACUCUGGUACCAGAAGCUACAAAG AUAAGGCUUCAUGCCGAAAUCAACACCCUGUCAUUUUAUGGCAGGGUGUUUU) и структурой, представленной на фиг. 1, причем указанная первая последовательность способна связываться с целевым высококонсервативным участком ДНК вируса гепатита В, а указанная вторая последовательность способна привлекать белок-эндонуклеазу Cas9 Streptococcus thermophilus (StCas9) к указанному целевому высококонсервативному участку вирусной ДНК с обеспечением деградации указанной ДНК вируса гепатита В под действием указанной эндонуклеазы StCas9.
2. Молекула РНК-проводника по п. 1, отличающаяся тем, что РНК-направляемая ДНК-эндонуклеаза Cas9 Streptococcus thermophilus распознаёт последовательность ДНК вируса гепатита В, содержащую PAM-мотив NNAGAAW, где N представляет собой A, T, G или С, а W представляет собой А или Т.
3. Молекула РНК-проводника по п. 1, отличающаяся тем, что клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, инфицированную вирусом гепатита В, или клетку млекопитающего, в которой персистирует вирус гепатита В.
4. Молекула РНК-проводника по п. 3, отличающаяся тем, что клетка млекопитающего, инфицированная вирусом гепатита В, или клетка млекопитающего, в которой персистирует вирус гепатита В, представляет собой гепатоцит млекопитающего.
5. Молекула РНК-проводника по п. 1, отличающаяся тем, что ДНК вируса гепатита B представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую ДНК (ккзДНК).
6. Молекула РНК-проводника по п. 1, отличающаяся тем, что ДНК вируса гепатита B представляет собой релаксированную кольцевую ДНК (ркДНК).
7. Молекула РНК-проводника по п. 1, отличающаяся тем, что ДНК вируса гепатита B представляет собой линейную двуцепочечную ДНК ВГВ.
8. Молекула РНК-проводника по п. 1, отличающаяся тем, что ДНК вируса гепатита B представляет собой вставку ДНК вируса в геном человека.
9. Молекула РНК-проводника по п. 1, отличающаяся тем, что вирус гепатита B представляет собой вирус гепатита B генотипа, выбранного из генотипов A, В, С, D, Е или H или сочетания двух или более из указанных генотипов.
10. Применение молекулы РНК-проводника по любому из пп. 1-9 для подавления экспрессии вируса гепатита B в клетке-хозяине и для деградации ДНК вируса гепатита В и ее элиминации из клетки-хозяина.
11. Применение по п. 10, где CRISPR/Cas9 представлена рибонуклеопротеиновым комплексом, состоящим из белка CRISPR1 StCas9 c РНК-проводником или их комбинацией.
12. Применение по п. 10, где доставка CRISPR/Cas9 в инфицированные клетки или организм осуществляется невирусными способами доставки.
13. Применение по п. 12, где невирусные способы доставки включают в себя доставку рибонуклеопротеиновых комплексов, кодирующих CRISPR/Cas9 мРНК, кодирующих CRISPR/Cas9 ДНК или плазмид с помощью золотых наночастиц, полимерных наночастиц, с помощью липосом и др.
14. Применение по п. 10, где доставка в инфицированные клетки или организм осуществляется вирусными способами доставки.
15. Применение по п. 14, где вирусные способы доставки включают в себя доставку с помощью лентивирусных векторов, доставку с помощью адено-ассоциированных векторов, доставку с помощью векторов на основе аденовирусов и др.
16. Применение по п. 10, где клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, инфицированную вирусом гепатита В, или клетку млекопитающего, в которой персистирует вирус гепатита В.
17. Применение по пп. 12 и 14, где клетка млекопитающего, инфицированная вирусом гепатита В, или клетка млекопитающего, в которой персистирует вирус гепатита В, представляет собой гепатоцит млекопитающего.
18. Применение по п. 10, где ДНК вируса гепатита B представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую ДНК (ккзДНК).
19. Применение по п. 10, где ДНК вируса гепатита B представляет собой релаксированную кольцевую ДНК (ркДНК).
20. Применение по п. 10, где вирус гепатита B представляет собой вирус гепатита B генотипа, выбранного из генотипов A, В, С, D, Е или H или сочетания двух или более из указанных генотипов.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018144265A RU2694396C1 (ru) | 2018-12-14 | 2018-12-14 | РНК-проводник St10 для использования в высокоспецифической системе нуклеаз Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas9 (StCas9) и применение указанного РНК-проводника и белка StCas9 для подавления экспрессии вируса гепатита B в клетке-хозяине и для элиминации вирусной ДНК из клетки-хозяина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018144265A RU2694396C1 (ru) | 2018-12-14 | 2018-12-14 | РНК-проводник St10 для использования в высокоспецифической системе нуклеаз Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas9 (StCas9) и применение указанного РНК-проводника и белка StCas9 для подавления экспрессии вируса гепатита B в клетке-хозяине и для элиминации вирусной ДНК из клетки-хозяина |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2694396C1 true RU2694396C1 (ru) | 2019-07-12 |
Family
ID=67309135
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018144265A RU2694396C1 (ru) | 2018-12-14 | 2018-12-14 | РНК-проводник St10 для использования в высокоспецифической системе нуклеаз Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas9 (StCas9) и применение указанного РНК-проводника и белка StCas9 для подавления экспрессии вируса гепатита B в клетке-хозяине и для элиминации вирусной ДНК из клетки-хозяина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2694396C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2792891C1 (ru) * | 2021-12-27 | 2023-03-28 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas12 и препарат для выявления ДНК вируса гепатита B в ультранизких концентрациях |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017091630A1 (en) * | 2015-11-23 | 2017-06-01 | The Regents Of The University Of California | Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9 |
RU2652899C1 (ru) * | 2017-12-28 | 2018-05-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | РНК-проводники для подавления репликации вируса гепатита B и для элиминации вируса гепатита B из клетки-хозяина |
-
2018
- 2018-12-14 RU RU2018144265A patent/RU2694396C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017091630A1 (en) * | 2015-11-23 | 2017-06-01 | The Regents Of The University Of California | Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9 |
RU2652899C1 (ru) * | 2017-12-28 | 2018-05-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | РНК-проводники для подавления репликации вируса гепатита B и для элиминации вируса гепатита B из клетки-хозяина |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2792891C1 (ru) * | 2021-12-27 | 2023-03-28 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas12 и препарат для выявления ДНК вируса гепатита B в ультранизких концентрациях |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20240110179A1 (en) | Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency | |
US11624078B2 (en) | Protected guide RNAS (pgRNAS) | |
Lim et al. | Treatment of a mouse model of ALS by in vivo base editing | |
US20240093193A1 (en) | Dead guides for crispr transcription factors | |
US10954514B2 (en) | Escorted and functionalized guides for CRISPR-Cas systems | |
US20230126434A1 (en) | Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells | |
KR102501980B1 (ko) | 화학적으로 변형된 단일 가닥 rna-편집 올리고뉴클레오타이드 | |
EP3353296B1 (en) | Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing | |
EP3274453B1 (en) | Crispr/cas-mediated gene conversion | |
EP3237615B1 (en) | Crispr having or associated with destabilization domains | |
EP3498845B1 (en) | Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 1 (hsv-1) | |
CN105899658B (zh) | 针对hbv和病毒性疾病以及障碍的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用 | |
EP4332224A2 (en) | Rna and dna base editing via engineered adar recruitment | |
AU2016381313A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies | |
CN110872583A (zh) | 用于序列操纵和治疗应用的系统、方法和组合物的递送、工程化和优化 | |
KR20220119129A (ko) | Leaper 기술에 기반한 mps ih 치료 방법 및 조성물 | |
RU2694396C1 (ru) | РНК-проводник St10 для использования в высокоспецифической системе нуклеаз Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas9 (StCas9) и применение указанного РНК-проводника и белка StCas9 для подавления экспрессии вируса гепатита B в клетке-хозяине и для элиминации вирусной ДНК из клетки-хозяина | |
US20240167008A1 (en) | Novel crispr enzymes, methods, systems and uses thereof | |
US20210139870A1 (en) | Anti-hbv combination therapies involving specific endonucleases | |
WO2024061296A2 (en) | Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease | |
Rathbone | Nonviral Approaches for Delivery of CRISPR-Cas9 Into Hepatocytes for Treatment of Inherited Metabolic Disease | |
WO2023166292A1 (en) | Cho (chinese hamster ovary) cells for bioproduction with akr1 knock-out or suppression | |
WO2023166297A1 (en) | Cho (chinese hamster ovary) cells for bioproduction with bok knock-out or suppression | |
CN114533901A (zh) | 一种同时靶向rna与dna病毒的药物及应用 | |
Borchardt | MOLECULAR APPROACHES FOR CONTROLLING RNA STABILITY |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HE4A | Change of address of a patent owner |
Effective date: 20200818 |