RU2693829C1 - Method for determining minimum effective concentration of antitumour drug which inhibits cytoprotective autophagy in vitro - Google Patents
Method for determining minimum effective concentration of antitumour drug which inhibits cytoprotective autophagy in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- RU2693829C1 RU2693829C1 RU2018105465A RU2018105465A RU2693829C1 RU 2693829 C1 RU2693829 C1 RU 2693829C1 RU 2018105465 A RU2018105465 A RU 2018105465A RU 2018105465 A RU2018105465 A RU 2018105465A RU 2693829 C1 RU2693829 C1 RU 2693829C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- autophagosomes
- concentration
- percentage
- extract
- Prior art date
Links
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 title claims abstract description 16
- 230000006637 cytoprotective autophagy Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 36
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 85
- 210000004957 autophagosome Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 9
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 35
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 3
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 3
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 240000007316 Xerochrysum bracteatum Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000002886 autophagic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- FBFNMTGUOBUGFQ-UHFFFAOYSA-M 2-(2,5-diphenyltetrazol-1-ium-1-yl)-4,5-dimethyl-1,3-thiazole;bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=C(C=2C=CC=CC=2)N=NN1C1=CC=CC=C1 FBFNMTGUOBUGFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PWJFNRJRHXWEPT-UHFFFAOYSA-N ADP ribose Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(O)C(O)C(O)C=O)C(O)C1O PWJFNRJRHXWEPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRNWOUGRCWSEMX-KEOHHSTQSA-N ADP-beta-D-ribose Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SRNWOUGRCWSEMX-KEOHHSTQSA-N 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000011226 adjuvant chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 229940093797 bioflavonoids Drugs 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000035572 chemosensitivity Effects 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 238000011227 neoadjuvant chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000015629 regulation of autophagy Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, а также к фармации и может быть использовано в доклинических испытаниях противоопухолевых лекарственных средств посредством оценки их влияния на процесс образования аутофагосом опухолевых клеток в культуре.The invention relates to medicine, in particular to experimental studies in oncology, as well as to pharmacy and can be used in preclinical trials of anticancer drugs by assessing their influence on the formation of autophagosome tumor cells in culture.
Поиск и разработка новых способов оценки эффективности противоопухолевых лекарственных средств в медицине и фармации обусловлены необходимостью их всестороннего испытания, направленного на определение механизмов, за счет которых реализуется противоопухолевый эффект.Search and development of new methods for evaluating the effectiveness of anticancer drugs in medicine and pharmacy due to the need for their comprehensive testing aimed at identifying the mechanisms by which the antitumor effect is realized.
После Нобелевской премии 2016 г., полученной Ёсинори Осуми, исследовавшим аутофагию в дрожжевых клетках с помощью генетического подхода, и выяснения молекулярных механизмов индукции, протекания и регуляции аутофагии, стало очевидно, что индукцию аутофагии можно генетически контролировать, что, в свою очередь, открыло другой подход к созданию эффективных противоопухолевых средств, а именно: разработке лекарственных средств, ингибирующих цитопротекторную аутофагию.After the 2016 Nobel Prize, obtained by Yoshinori Osumi, who investigated autophagy in yeast cells using a genetic approach and elucidated the molecular mechanisms of induction, course and regulation of autophagy, it became obvious that induction of autophagy can be genetically controlled, which in turn revealed another approach to the creation of effective anticancer drugs, namely the development of drugs that inhibit cytoprotective autophagy.
Как известно, аутофагия (как один из возможных путей программируемой клеточной гибели) - это процесс, при котором внутренние компоненты клетки доставляются внутрь ее лизосом или вакуолей и подвергаются в них деградации. В неопухолевых клетках аутофагия инициируется, например, токсическим стрессом или в условиях обеднения среды питательными веществами и направлена на избавление клеток от ненужных органелл, а также и организма от ненужных клеток (Farrugia G, Balzan R. Oxidative stress and programmed cell death in yeast (Front Oncol.). - 2012. - T. 2, вып. 64. - DOI: 10.3389/fonc. 2012.00064). В то время, как в опухолевых клетках на определенном этапе аутофагия может стать цитопротекторной и способствовать формированию их резистентности к химиотерапии за счет деградации поврежденных в результате воздействия органелл и других компонентов клетки, что приводит к быстрой прогрессии заболевания. Следовательно, при лечении онкологических заболеваний важна разработка лекарственных средств, ингибирующих цитопротекторную аутофагию. Такой способностью могут обладать и уже известные противоопухолевые средства.As is known, autophagy (as one of the possible paths of programmed cell death) is the process by which the internal components of a cell are delivered inside its lysosomes or vacuoles and are degraded in them. In non-neoplastic cells, autophagy is initiated, for example, by toxic stress or in conditions of depletion of the environment with nutrients and is aimed at ridding the cells of unnecessary organelles, as well as of the body from unnecessary cells (Farrugia G, Balzan R. Oxidative stress). Oncol.). - 2012. - T. 2, issue 64. - DOI: 10.3389 / fonc. 2012.00064). At the same time, in tumor cells, at a certain stage, autophagy can become cytoprotective and contribute to their resistance to chemotherapy due to degradation of organelles and other cell components damaged by the action, which leads to a rapid progression of the disease. Therefore, in the treatment of cancer diseases, the development of drugs that inhibit cytoprotective autophagy is important. Already known anticancer drugs may also possess this ability.
Так, например, нами установлено, что экстракт аврана лекарственного, обладающий противоопухолевым действием (Патент на изобретение RUS 2519769 21.03.2013. Средство, обладающее противоопухолевым и иммуномодулирующим действием. Полуконова Н.В., Наволокин Н.А., Дурнова Н.А., Маслякова Г.Н., Бучарская А.Б.) относится также и к средствам, обладающим избирательным действием на опухолевые клетки, активирующим их апоптоз и препятствующим формированию их резистентности за счет ингибирования цитопротекторной аутофагии (направлена заявка на изобретение. Средство, обладающее избирательным действием на опухолевые клетки, активирующее их апоптоз и препятствующее формированию их резистентности. Полуконова Н.В., Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Полуконова А.В., Бучарская А.Б., Маслякова Г.Н.). Так, на фиг. 1А видно, что под действием экстракта аврана количество клеток с аутофагосомами, выраженное в процентах, находится в обратной корреляции как с количеством мертвых клеток, также выраженным в процентах, так и с концентрацией экстракта.So, for example, we found that the extract of Avran medicinal, which has an antitumor effect (Patent for invention RUS 2519769 03/21/2013. A tool with antitumor and immunomodulatory effects. Polukunova N.V., Navolokin N.A., Durnova N.A. , Maslyakova GN, Bucharskaya AB) also applies to agents with selective effect on tumor cells, activating their apoptosis and preventing the formation of their resistance due to inhibition of cytoprotective autophagy (an application for the invention has been sent. , having a selective effect on tumor cells, activating their apoptosis and preventing the formation of their resistance. Polukunova N.V., Navolokin N.A., Mudrak D.A., Polukonova A.V., Bucharskaya A.B., Maslyakova G. .N.). Thus, in FIG. 1A shows that under the action of an Avran extract, the number of cells with autophagosomes, expressed as a percentage, is inversely correlated with both the number of dead cells, also expressed as a percentage, and with the concentration of the extract.
В то время, как другой противоопухолевый экстракт - бессмертника песчаного {Наволокин К.А., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н., Скворцова В.В., Байтман Т.П., Бучарская А.Б., Дурнова НА. Противоопухолевая активность растительных экстрактов, содержащих биофлавоноиды // Российский биотерапевтический журнал. 2013. Т. 12. №2. С. 59-59; Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Матвеева О.В., Тычина С.А., Бучарская А.Б., Полуконова К.В., Маслякова Г.Н. Влияние растительных экстрактов, содержащих флавоноиды, на лейкоцитарную формулу и красный костный мозг лабораторных крыс с перевитой саркомой 45 // Успехи современного естествознания. 2015. №4. С. 134-140; Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Полуконова К.В., Тычина С.А., Канаева Т.В., Бучарская А.Б., Маслякова Г.Н. Антикахексическая и противоопухолевая активность флавоноидсодержащего экстракта бессмертника песчаного (Helichnysum arenarium) при пероралъном введении крысам с перевитой саркомой-45 // Злокачественные опухоли. 2016. №4-S1 (20). С. 329-330) не формирует резистентность опухолевых клеток за счет ингибирования цитопротекторной аутофагии. На фиг. 1Б при действии экстракта бессмертника не было выявлено корреляции как между количеством клеток с аутофагосомами и количеством мертвых клеток, так и количеством клеток с аутофагосомами и концентрацией экстракта, что связано с отсутствием у этого экстракта свойства ингибировать аутофагию.While another antitumor extract is a sandy immortelle {Navolokin KA, Polukonova N.V., Maslyakova GN, Skvortsova VV, Baytman TP, Bucharskaya AB, Durnova ON . Antitumor activity of plant extracts containing bioflavonoids // Russian Biotherapeutic Journal. 2013. V. 12. No.2. Pp. 59-59; Navolokin N.A., Mudrak D.A., Matveeva O.V., Tychina S.A., Bucharskaya A.B., Polukonova K.V., Maslyakova G.N. Influence of plant extracts containing flavonoids on leukocyte formula and red bone marrow of laboratory rats with inoculated sarcoma 45 // Successes of modern natural science. 2015.
Необходима разработка способа оценки, позволяющего определить минимально эффективную концентрацию противоопухолевого средства в преодолении формирования резистентности опухолевых клеток за счет ингибирования цитопротекторной аутофагии.It is necessary to develop an assessment method that allows to determine the minimum effective concentration of an antitumor agent in overcoming the formation of tumor cell resistance by inhibiting cytoprotective autophagy.
Модели in vitro с использованием культур клеток и биохимических показателей на клеточном уровне в последнее время находят все более широкое применение в различных областях биомедицинских исследований и получают постепенное признание регулирующих организаций в качестве замены тестов на животных. Тестирование в экспериментах in vitro позволяет провести отбор из множества препаратов и служит важным этапом, целью которого является получение первичной информации о противоопухолевом действии лекарственных средств, и составляет основу правильного выбора схем применения химиопрепаратов при проведении как адъювантной, так и неоадъювантной химиотерапии.In vitro models using cell cultures and biochemical indicators at the cellular level have recently become more widely used in various fields of biomedical research and are gradually being recognized by regulatory organizations as a replacement for animal tests. Testing in in vitro experiments allows for the selection of a variety of drugs and serves as an important step, the purpose of which is to obtain primary information about the antitumor effect of drugs, and forms the basis of the correct choice of schemes for the use of chemotherapy drugs when conducting both adjuvant and neoadjuvant chemotherapy.
Известен способ оценки цитотоксической активности противоопухолевых средств по выживаемости клеток с помощью стандартного МТТ-теста (колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток) с использованием МТТ-реагента (3, 4, 5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолиум бромид). Метод основан на способности дегидрогеназ живых, метаболически активных клеток восстанавливать МТТ- реагент до голубых нерастворимых кристаллов формазана (Mosmann, Tim (December 1983). «Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays». Journal of Immunological Methods 65 (1-2): 55-63). Восстановление МТТ и других тетразолиевых красителей зависит от клеточной метаболической активности из-за тока НАДФ-Н. Быстро делящиеся клетки, к которым могут относиться не только опухолевые клетки, показывают высокую степень восстановления МТТ.There is a method of assessing the cytotoxic activity of anticancer agents by cell survival using the standard MTT test (colorimetric test to assess the metabolic activity of cells) using MTT reagent (3, 4, 5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide) . The method is based on the ability of dehydrogenases of living, metabolically active cells to restore MTT reagent to blue insoluble formazan crystals (Mosmann, Tim (December 1983). “Rapid colorimetric assay”. Journal of Immunological Methods 65 (1-2): 55-63). Recovery of MTT and other tetrazolium dyes depends on cellular metabolic activity due to current NADP-H. Rapidly dividing cells, which may include not only tumor cells, show a high degree of MTT recovery.
Недостатком способа является то, что он неспецифичен и может использоваться для определения цитотоксичности не только противоопухолевых средств, полученные с помощью этого теста результаты не позволяют определить эффективные концентрации противоопухолевого лекарственного средства в преодолении формирования резистентности опухолевых клеток, кроме того из-за того, что способ отражает только состояние дыхания клеток, он не всегда адекватно говорит о цитотоксичности.The disadvantage of this method is that it is not specific and can be used to determine cytotoxicity not only of antitumor agents, the results obtained using this test do not allow to determine effective concentrations of antitumor drug in overcoming the formation of resistance of tumor cells, moreover, because the method reflects only the state of cell respiration, it does not always adequately speak of cytotoxicity.
Известен способ оценки противоопухолевых средств (Патент РФ «Способ скрининга противоопухолевых препаратов- ингибиторов PARP1 на основе биохимических методов анализа» опубликовано в Бюл. 14.06.17 г.; Lili Zhai, ShuaiLi, HuilanLi, Yi Zheng, Ronggang Lang, Yu Fan, Feng Gu, Xiaojing Guo, Xinmin Zhang, Li Fu. Polymorphism sinpoly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1) promoterand 3' untranslated region and their association with PARP1 expression in breast cancer patients // IntJ Clin Exp Pathol. 2015; 8(6): 7059-7071; Патент РФ «Тест- система для скрининга химических соединений на наличие ингибирующей активности в отношении PARP1» №2 016148005 решение о выдаче 19.12.17 г.) на стадии первичного скрининга и стадии химической оптимизации соединения. В основе данного способа лежат исследования транскрипционного белкового фактора PARP1, являющегося мишенью действия противоопухолевых препаратов. Создана база данных, содержащая информацию об ингибиторах PARP1 (http: //parp1inhibitors.ru/). Получены две системы: одна на базе мононуклеосомной матрицы, но с двухлинкерными участками, в которые размещены флуорофорные метки; вторая система - динуклеосомная, собрана из двух рядом расположенных нуклеосом, что позволяет оценивать влияние нескольких нуклеосом в системе.A known method for evaluating antitumor agents (Patent RF "Method for screening antitumor drugs-PARP1 inhibitors based on biochemical methods of analysis" was published in the Bull. 14.06.17; Lili Zhai, ShuaiLi, HuilanLi, Yi Zheng, Ronggang Lang, Yu Fan, Feng Gu Xinmin Zhang, Li Fu., Polymorphism sinpoly (ADP-ribose), polymerase-1 (PARP1), promotes 3 patients (8). ): 7059-7071; Patent of the Russian Federation "Test system for screening chemical compounds for the presence of inhibitory activity against PARP1" No. 2,016,148,005 decision to issue December 19, 1717) at the stage of primary screening and chemical compound optimization stages. The basis of this method lies in the study of the transcriptional protein factor PARP1, which is the target of the action of anticancer drugs. A database containing information on PARP1 inhibitors (http: //parp1inhibitors.ru/) has been created. Two systems were obtained: one based on a mononucleosome matrix, but with two-linker sites in which fluorophore labels are placed; the second system is dinucleosome, assembled from two adjacent nucleosomes, which allows to evaluate the effect of several nucleosomes in the system.
Недостатком данного способа является то, что он не выявляет такого свойства противоопухолевого средства, как преодоление формирования резистентности опухолевых клеток за счет ингибирования цитопротекторной аутофагии.The disadvantage of this method is that it does not reveal such a property of an antitumor agent as overcoming the formation of tumor cell resistance due to inhibition of cytoprotective autophagy.
Наиболее близким к заявленному способу является способ оценки потенциальной противоопухолевой активности и цитотоксичности противоопухолевых препаратов в экспериментах in vitro. Для этого опухолевые клетки подвергаются воздействию растворами потенциальных противоопухолевых средств в разных концентрациях в течение различного времени, при этом получают зависимость доли выживших (погибших) клеток в результате такого воздействия. Оценка количества выживших клеток производится косвенными методами: как колориметрическим методом с использованием МТТ (J. Carmichael, W.G. DeGraff, A.F. Gazdar, J.D. Minna, J.B. Mitchell. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res. 1987, Vol. 47, 4, p. 936-942), так и флуоресцентным методом с использованием флуоресцеиндиацетата (ФДА) (J.R. Sellers, S. Cook, V.C. Goldmacher. A cytotxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Meth. 1994. V. 172, p. 255-264) или с использованием радиоактивных меток (М Korbelik, GKrosl. Enhanced macrophage cytotoxicity against tumor cells treated with photodynamic therapy. Photochem Photobiol. 1994, Vol. 60, 5, p. 497-502). При всех перечисленных способах клетки после воздействия дополнительно инкубируют с растворами веществ, которые, в зависимости от жизнедеятельности клеток, изменяют уровень поглощения, флуоресценции или радиоактивный сигнал, что позволяет, измеряя количественно уровень поглощения, флуоресценции или радиоактивный сигнал, количественно оценить долю выживших или погибших клеток.The closest to the claimed method is a method for evaluating the potential antitumor activity and cytotoxicity of antitumor drugs in in vitro experiments. For this, tumor cells are exposed to solutions of potential antitumor agents in different concentrations for different times, and the dependence of the percentage of surviving (dead) cells as a result of such exposure is obtained. The number of surviving cells is estimated by indirect methods: as a colorimetric method using MTT (J. Carmichael, WG DeGraff, AF Gazdar, JD Minna, JB Mitchell. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res. 1987 , Vol. 47, 4, p. 936-942), and by the fluorescent method using fluorescein diacetate (FDA) (JR Sellers, S. Cook, VC Goldmacher. Survival survival fractions of cells). J. Immunol. Meth. 1994. V. 172, p. 255-264) or using radioactive labels (M Korbelik, GKrosl. Enhanced macrophage treated with photodynamic therapy. Photodioma. 1994, Vol. 60, 5 , p. 49 7-502). With all these methods, the cells after incubation are additionally incubated with solutions of substances that, depending on the vital activity of the cells, change the level of absorption, fluorescence or a radioactive signal, which allows, by quantifying the level of absorption, fluorescence or a radioactive signal, to quantify the proportion of surviving or dead cells .
Недостатком данного способа является получение данных только о доли выживших или погибших клеток, что недостаточно ни для установления способности противоопухолевого средства к преодолению формирования резистентности опухолевых клеток в результате химиотерапии, ни для определения его минимальных эффективных концентраций. Кроме того, при расчете эффективной концентрации цитотоксичности противоопухолевого средства выбирают концентрацию, вызывающую максимальную гибель опухолевых клеток. Обычно такая концентрация достаточно высока и может оказывать негативное воздействие и на здоровые, неопухолевые клетки.The disadvantage of this method is to obtain data only on the proportion of surviving or dead cells, which is insufficient either to establish the ability of an antitumor agent to overcome the formation of tumor cell resistance as a result of chemotherapy, or to determine its minimum effective concentrations. In addition, when calculating the effective concentration of the cytotoxicity of the antitumor agent, the concentration causing the maximum death of the tumor cells is selected. Typically, this concentration is quite high and can have a negative effect on healthy, non-tumor cells.
Нами впервые для определения минимально эффективных концентраций противоопухолевого лекарственного средства, обладающего свойством, препятствующим формированию резистентности опухолевых клеток за счет ингибирования в них цитопротекторных аутофагосом, предложено использование количества клеток с аутофагосомами, выраженное в процентах от числа живых клеток. Подтверждением наличия у лекарственного противоопухолевого средства способности подавлять формирование аутофагосом в опухолевых клетках является наличие обратной корреляции между процентом клеток с аутофагосомами и концентрацией лекарственного средства при условии наличия прямой корреляции между процентом мертвых клеток и значением концентрации лекарственного средства, как видно на фиг 1А. Значение концентрации такого лекарственного средства, при которой процент клеток с аутофагосомами будет равен нулю и будет минимально эффективной для преодоления резистентности опухолевых клеток за счет ингибирования цитопротекторной аутофагии.For the first time, we used the number of cells with autophagosomes, expressed as a percentage of the number of living cells, to determine the minimum effective concentrations of an antitumor drug that has the property that prevents the formation of tumor cell resistance by inhibiting cytoprotective autophagosomes in them. Confirmation of the ability of the medicinal antitumor agent to suppress the formation of autophagosomes in tumor cells is the inverse correlation between the percentage of cells with autophagosomes and the drug concentration, provided there is a direct correlation between the percentage of dead cells and the concentration value of the drug, as seen in Figure 1A. The concentration of such a drug, at which the percentage of cells with autophagosomes will be zero and will be minimally effective in overcoming the resistance of tumor cells by inhibiting cytoprotective autophagy.
Технической задачей заявленного способа является разработка алгоритма выявления минимально эффективных концентраций противоопухолевых лекарственных средств, ингибирующих цитопротекторную аутофагию в опухолевых клетках, что позволит повысить эффективность методов лечения злокачественных новообразований за счет снижения значений эффективных концентраций лекарственного средства.The technical objective of the claimed method is to develop an algorithm for detecting the minimum effective concentrations of anticancer drugs inhibiting cytoprotective autophagy in tumor cells, which will increase the effectiveness of methods for treating malignant tumors by reducing the effective concentrations of the drug.
СПОСОБ СОСТОИТ В СЛЕДУЮЩЕМ: используются клеточные культуры опухолей человека, которые подвергаются воздействию растворами в разных концентрациях противоопухолевого средства, препятствующим формированию резистентности опухолевых клеток за счет ингибирования в них цитопротекторных аутофагосом в течение 24 ч. Затем после воздействия лекарственным средством клетки инкубируют с двумя флуоресцентными красителями в тесте «живые и мертвые», например, акридиновый оранжевый (окрашивающий в зеленый цвет только живые клетки) и йодистый пропидий (интеркалирующий через разрушенную мембрану ядра погибающих или уже погибших клеток и окрашивающий их в красно-оранжевый цвет). Применение одновременно двух флуоресцентных красителей позволяет выявлять общее количество погибших клеток (окрашивание в красный цвет), и общее количество живых клеток (окрашивание в зеленый цвет), в том числе клеток с аутофагосомами.THE METHOD CONTAINS IN THE FOLLOWING: cell cultures of human tumors are used that are exposed to solutions in different concentrations of an antitumor agent that prevents the formation of tumor cell resistance by inhibiting cytoprotective autophagosomes in them for 24 hours. Then, after exposure to the drug, the cells are incubated with two fluorescent dyes in “live and dead” test, for example, acridine orange (dyeing only living cells in green) and propid iodide diy (intercalating through the destroyed membrane of the nucleus of the dead or already dead cells and dyeing them in red-orange color). The use of two fluorescent dyes simultaneously allows the detection of the total number of dead cells (red staining) and the total number of living cells (green staining), including cells with autophagosomes.
После окрашивания красителями подсчитывают: среднее количество клеток (СКК) в поле зрения, среднее количество живых клеток, количество клеток с аутофагосомами и определяют процент клеток с аутофагосомами от количества живых клеток. Концентрация, при которой процентом клеток с аутофагосомами будет равен нулю и будет минимально эффективной для преодоления резистентности опухолевых клеток. На фиг. 1А видно, что минимально эффективной концентрацией экстракта аврана является концентрация 0,75 мг/мл, при которой процент клеток с аутофагосомами равен нулю.After staining with dyes, the average number of cells (HSC) in the field of view, the average number of living cells, the number of cells with autophagosomes are counted and the percentage of cells with autophagosomes of the number of living cells is determined. The concentration at which the percentage of cells with autophagosomes will be zero and will be minimally effective in overcoming the resistance of tumor cells. FIG. 1A, it can be seen that the minimum effective concentration of Avran extract is 0.75 mg / ml, at which the percentage of cells with autophagosomes is zero.
Для анализа выбрана культура клеток рака шейки матки Hela и противоопухолевый растительный экстракт аврана лекарственного (Патент на изобретение RUS 2519769 21.03.2013. Средство, обладающее противоопухолевым и иммуномодулирующим действием. Полуконова К.В., Наволокин Н.А., Дурнова Н.А., Маслякова Г.К, Бучарская А.Б.). Экстракт получен определенным способом (Патент на изобретение RUS 2482863 15.02.2012. Способ получения сухого экстракта из растительного сырья, обладающего биологической активностью Полуконова К.В., Наволокин НА., Дурнова НА., Маслякова Г.Н, Бучарская А.Б.), направленный на снижение токсичности экстрактивных веществ и повышение выхода флавоноидов. В качестве флуоресцентных красителей использованы акридиновый оранжевый и йодистый пропидий.For the analysis, a cell culture of Hela cervical cancer and an antitumor plant extract of avran medicinal was chosen (Patent for invention Invention RUS 2519769 03/21/2013. An agent with antitumor and immunomodulatory effects. Polukunova KV, Navolokin NA, Durnova N.А. , Maslyakova G.K., Bucharskaya A.B.). Extract obtained in a specific way (Patent for invention RUS 2482863 15.02.2012. A method of obtaining a dry extract from plant raw materials with biological activity Polukonova KV, Navolokin NA., Durnova NA., Maslyakova G.N., Bucharskaya AB) aimed at reducing the toxicity of extractives and increasing the yield of flavonoids. Acridine orange and propidium iodide were used as fluorescent dyes.
На фиг. 2А представлены клетки Hela при флюоресцентной микроскопии и окраске акридиновым оранжевым и йодистым пропидием через 24 ч после инкубации только в среде в контроле, стрелкой указаны единичные аутофагосомы. Появление мертвых клеток единично.FIG. 2A shows Hela cells under fluorescence microscopy and staining with acridine orange and propidium iodide 24 hours after incubation only in the control medium; the arrow indicates isolated autophagosomes. The appearance of dead cells is single.
На фиг. 2Б представлены клетки Hela при флюоресцентной микроскопии и окраске акридиновым оранжевым и йодистым пропидием через 24 ч после инкубации с экстрактом аврана в концентрации 0,1875 мг/мл, стрелкой указаны многочисленные аутофагосомы. СКК в поле зрения по сравнению с контролем в диапазоне концентраций от 0,0937 до 3 мг/мл сократилось в два раза (таб. 1), а при концентрации 6 мг/мл - в три раза, что свидетельствовало о высокой цитостатической активности экстракта.FIG. Figure 2B shows Hela cells by fluorescence microscopy and acridine orange and propidium iodide staining 24 hours after incubation with an Avran extract at a concentration of 0.1875 mg / ml, the arrow indicates numerous autophagosomes. The CCM in the field of view compared to the control in the concentration range from 0.0937 to 3 mg / ml was halved (tab. 1), and at a concentration of 6 mg / ml - three times, indicating a high cytostatic activity of the extract.
Примечание: *указаны достоверные отличия с контролем при T>1.96 и p<0.05Note: * there are significant differences with the control at T> 1.96 and p <0.05
Процент мертвых клеток прямо пропорционально увеличивался, начиная от концентрации 0,1875 мг/мл, т.е. экстракт обладал и значительной цитотоксической активностью.The percentage of dead cells increased in direct proportion from a concentration of 0.1875 mg / ml, i.e. The extract also had significant cytotoxic activity.
Максимальная аутофагическая активность экстракта наблюдалась при концентрациях 0,0937 и 0,1875 мг/мл (табл. 1), что свидетельствовало об активном действии экстракта на опухолевые клетки. Выявлена достаточно четкая тенденция - при резком падении количества клеток с аутофагосомами, резко увеличивается количество мертвых клеток (табл. 1), что подтверждает роль цитопротекторной аутофагии при выживании опухолевых клеток в условиях противоопухолевой терапии.The maximum autophagic activity of the extract was observed at concentrations of 0.0937 and 0.1875 mg / ml (Table 1), which indicated the active effect of the extract on tumor cells. A rather clear tendency was revealed - with a sharp drop in the number of cells with autophagosomes, the number of dead cells sharply increases (Table 1), which confirms the role of cytoprotective autophagy in the survival of tumor cells under conditions of antitumor therapy.
Начиная с концентрации экстракта 0,375 мг/мл число клеток с аутофагосомами резко сократилось.Starting with an extract concentration of 0.375 mg / ml, the number of cells with autophagosomes sharply decreased.
На фиг. 3 видно, что, начиная с концентрации экстракта 0,75 мг/мл, в опухолевых клетках Hela аутофагосомы не образовывались.FIG. 3 shows that, starting with an extract concentration of 0.75 mg / ml, autophagosomes were not formed in Hela tumor cells.
На фигуре 1А представлена зависимость между процентом клеток с аутофагосомами и концентраций экстракта. Для выявления взаимосвязи был проведен корреляционный анализ методом Спирмана; для оценки взаимосвязи показателей был использован непараметрический критерий Спирмана. В результате анализа выявлена обратная двусторонняя взаимосвязь средней силы (r=-0.56) высокой статистической значимости (р=0.004) уже в первые 24 ч эксперимента. На фиг. 1А видно, что при концентрации 0,75 мг/мл экстракт ингибирует процесс образования аутофагосом и начинается резкая гибель опухолевых клеток, следовательно, эта концентрация минимально эффективная в преодолении формирования резистентности опухолевых клеток.Figure 1A shows the relationship between the percentage of cells with autophagosomes and the concentrations of the extract. To identify the relationship was carried out correlation analysis method Spearman; To assess the relationship of the indicators, the non-parametric Spearman criterion was used. As a result of the analysis, an inverse bilateral relationship of the average force (r = -0.56) of high statistical significance (p = 0.004) was revealed already in the first 24 hours of the experiment. FIG. 1A, it can be seen that at a concentration of 0.75 mg / ml, the extract inhibits the formation of autophagosomes and the abrupt death of tumor cells begins, therefore, this concentration is minimally effective in overcoming the formation of tumor cell resistance.
В результате минимально эффективной концентрацией экстракта аврана, полученной описанным способом, оказалась концентрация 0,75 мг/мл, в то время, как концентрация, которая бы была получена наиболее близким к заявленному способу, при которой погибает наибольшее количество опухолевых клеток - 3 мг/мл. Следовательно, заявленный нами способ позволил снизить значение минимально эффективной концентрации, что позволяет существенно снизить и токсический эффект, оказываемый и на здоровые клетки.As a result, the lowest effective concentration of Avran extract obtained by the method described was 0.75 mg / ml, while the concentration that would be obtained closest to the claimed method, at which the greatest number of tumor cells dies - 3 mg / ml . Therefore, the method claimed by us allowed us to reduce the value of the minimum effective concentration, which can significantly reduce the toxic effect on healthy cells.
Таким образом, учитывая полученные результаты, мы считаем целессообразным для определения минимально эффективной концентрации противоопухолевого лекарственного средства, препятствующего формированию резистентности опухолевых клеток за счет ингибирования цитопротекторной аутофагии, использование процента клеток с аутофагосомами от количества живых клеток. Значение концентрации, при которой процент клеток с аутофагосомами будет равен нулю и будет минимально эффективной для преодоления резистентности опухолевых клеток.Thus, taking into account the results obtained, we consider it advisable to determine the minimum effective concentration of an antitumor drug that prevents the formation of tumor cell resistance by inhibiting cytoprotective autophagy, using a percentage of cells with autophagosomes of the number of living cells. The concentration value at which the percentage of cells with autophagosomes will be zero and will be minimally effective for overcoming the resistance of tumor cells.
ПримерExample
Брали культуру клеток рака шейки матки Hela и противоопухолевый растительный экстракт аврана лекарственного (экстракт получали способом, указанным в Патенте на изобретение RUS 2482863 15.02.2012. Способ получения сухого экстракта из растительного сырья, обладающего биологической активностью Полуконова К.В., Наволокин Н.А., Дурнова Н.А., Маслякова Г.Н, Бучарская А.Б.).They took the culture of Hela cervical cancer cells and Avran medicinal plant antitumor extract (extract was obtained by the method indicated in the Patent for invention RUS 2482863 February 15, 2012. A method of obtaining a dry extract from plant raw materials possessing biological activity Polukunova KV, Navolokin N.A. ., Durnova N.A., Maslyakova G.N., Bucharskaya A.B.).
Опухолевые клетки рака шейки матки Hela были получены из криобанка коллекции клеточных культур лаборатории вирусологии (г. Саратов) научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН. Культивирование проводилось в пластиковых флаконах в среде RPMI 4 (10% эмбриональной сыворотки, гентамицин, ампициллин, амфотерицин).Hela cervical cancer tumor cells were obtained from a cryobank of a cell culture collection at the Virology Laboratory of the Saratov Research Veterinary Station of the RAAS. Cultivation was carried out in plastic vials in
Эксперименты проводили в 96 луночных культуральных планшетах - одна контрольная и пять экспериментальных. Контролем служили клетки в питательной среде без добавления экстракта, выросших в течение суток. В 21 лунку внесли водный раствор экстракта аврана по три лунки каждой концентрации и три лунки были контрольными. Анализировались следующие концентрации: 0,0937, 0,1875, 0,375, 0,75, 1,5, 3, 6 мг/мл.The experiments were carried out in 96 well culture plates - one control and five experimental. Served as control cells in a nutrient medium without the addition of an extract that grew during the day. A water solution of Avran extract was added to 21 wells, three wells of each concentration and three wells were the control. The following concentrations were analyzed: 0.0937, 0.1875, 0.375, 0.75, 1.5, 3, 6 mg / ml.
Клетки культивировали в СO2-инкубаторе при 37°С в течение 24 часов, после чего окрашивали. В качестве красителя использовали йодистый пропидий, проникающий в нежизнеспособные клетки за счет разрушения их мембраны.Cells were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C for 24 hours, then stained. Propidium iodide was used as a dye, penetrating into non-viable cells due to the destruction of their membrane.
Для визуализации клеток использовали режим регистрации флюоресценции. Световой микроскоп LeicaDM 2500 с дополнительным галогеновым осветителем Leica CLS 150, позволяющим освещать объект с двух сторон сбоку, для реализации режима темного поля. Захват и анализ изображений проводили с помощью цифровой видеокамеры LeicaDFC 420 С и программного обеспечения LeicaApplicationSuite V 3.1. Конфокальный микроскоп Leica LSM SP-5 (LeicaMicrosistems, Германия) в режиме регистрации флюоресценции со спектральным сдвигом соответствующим используемым флюорофорам. Для обсчета клеток использовали программное обеспечение ImageJ.To visualize the cells, the fluorescence registration mode was used. Light microscope LeicaDM 2500 with an additional halogen illuminator Leica CLS 150, which allows to illuminate the object from both sides from the side, to implement the dark field mode. Capture and image analysis were performed using a LeicaDFC 420 C digital video camera and LeicaApplicationSuite V 3.1 software. Leica LSM SP-5 confocal microscope (LeicaMicrosistems, Germany) in the mode of registration of fluorescence with a spectral shift corresponding to the used fluorophores. For cell counting, ImageJ software was used.
Для анализа клеток в контрольной и экспериментальной культурах были использованы следующие показатели: среднее количество клеток (СКК) в поле зрения, среднее количество мертвых клеток, среднее количество живых клеток, количество клеток с аутофагосомами и зависимость процента клеток с аутофагосомами от концентрации.For the analysis of cells in the control and experimental cultures, the following indicators were used: average cell number (HCC) per field of view, average number of dead cells, average number of living cells, number of cells with autophagosomes, and concentration dependence of the percentage of cells with autophagosomes.
На фиг. 2А представлены клетки Hela при флюоресцентной микроскопии и окраске акридиновым оранжевым и йодистым пропидием через 24 ч после инкубации только в среде в контроле, стрелкой указаны единичные аутофагосомы. Появление мертвых клеток единично.FIG. 2A shows Hela cells under fluorescence microscopy and staining with acridine orange and propidium iodide 24 hours after incubation only in the control medium; the arrow indicates isolated autophagosomes. The appearance of dead cells is single.
На фиг. 2Б представлены клетки Hela при флюоресцентной микроскопии и окраске акридиновым оранжевым и йодистым пропидием через 24 ч после инкубации с экстрактом аврана в концентрации 0,1875 мг/мл, стрелкой указаны многочисленные аутофагосомы. СКК в поле зрения по сравнению с контролем в диапазоне концентраций от 0,0937 до 3 мг/мл сократилось в два раза (таб. 1), а при концентрации 6 мг/мл - в три раза, что свидетельствовало о высокой цитостатической активности экстракта.FIG. Figure 2B shows Hela cells by fluorescence microscopy and acridine orange and propidium iodide staining 24 hours after incubation with an Avran extract at a concentration of 0.1875 mg / ml, the arrow indicates numerous autophagosomes. The CCM in the field of view compared to the control in the concentration range from 0.0937 to 3 mg / ml was halved (tab. 1), and at a concentration of 6 mg / ml - three times, indicating a high cytostatic activity of the extract.
Процент мертвых клеток прямо пропорционально увеличивался, начиная от концентрации 0,1875 мг/мл, т.е. экстракт обладал и значительной цитотоксической активностью.The percentage of dead cells increased in direct proportion from a concentration of 0.1875 mg / ml, i.e. The extract also had significant cytotoxic activity.
Максимальная аутофагическая активность экстракта наблюдалась при концентрациях 0,0937 и 0,1875 мг/мл (табл. 1), что свидетельствовало об активном действии экстракта на опухолевые клетки. Выявлена достаточно четкая тенденция - при резком падении количества клеток с аутофагосомами, резко увеличивается количество мертвых клеток (табл. 1), что подтверждает роль цитопротекторной аутофагии при выживании опухолевых клеток в условиях противоопухолевой терапии.The maximum autophagic activity of the extract was observed at concentrations of 0.0937 and 0.1875 mg / ml (Table 1), which indicated the active effect of the extract on tumor cells. A rather clear tendency was revealed - with a sharp drop in the number of cells with autophagosomes, the number of dead cells sharply increases (Table 1), which confirms the role of cytoprotective autophagy in the survival of tumor cells under conditions of antitumor therapy.
Начиная с концентрации экстракта 0,375 мг/мл число клеток с аутофагосомами резко сократилось.Starting with an extract concentration of 0.375 mg / ml, the number of cells with autophagosomes sharply decreased.
На фиг. 3 видно, что, начиная с концентрации экстракта 0,75 мг/мл, в опухолевых клетках Hela аутофагосомы не образовывались.FIG. 3 shows that, starting with an extract concentration of 0.75 mg / ml, autophagosomes were not formed in Hela tumor cells.
На фигуре 1А представлена зависимость между процентом клеток с аутофагосомами и концентраций экстракта. Для выявления взаимосвязи был проведен корреляционный анализ методом Спирмана; для оценки взаимосвязи показателей был использован непараметрический критерий Спирмана. В результате анализа выявлена обратная двусторонняя взаимосвязь средней силы (r=-0.56) высокой статистической значимости (р=0.004) уже в первые 24 ч эксперимента. На фиг. 1А видно, что при концентрации 0,75 мг/мл экстракт ингибирует процесс образования аутофагосом и начинается резкая гибель опухолевых клеток, следовательно, эта концентрация минимально эффективная в преодолении формирования резистентности опухолевых клеток.Figure 1A shows the relationship between the percentage of cells with autophagosomes and the concentrations of the extract. To identify the relationship was carried out correlation analysis method Spearman; To assess the relationship of the indicators, the non-parametric Spearman criterion was used. As a result of the analysis, an inverse bilateral relationship of the average force (r = -0.56) of high statistical significance (p = 0.004) was revealed already in the first 24 hours of the experiment. FIG. 1A, it can be seen that at a concentration of 0.75 mg / ml, the extract inhibits the formation of autophagosomes and the abrupt death of tumor cells begins, therefore, this concentration is minimally effective in overcoming the formation of tumor cell resistance.
В результате минимально эффективной концентрацией экстракта аврана, полученной описанным способом, оказалась концентрация 0,75 мг/мл, в то время, как концентрация, которая бы была получена наиболее близким к заявленному способу, при которой погибает наибольшее количество опухолевых клеток - 3 мг/мл. Следовательно, заявленный нами способ позволил снизить значение минимально эффективной концентрации, что позволяет существенно снизить и токсический эффект, оказываемый и на здоровые клетки.As a result, the lowest effective concentration of Avran extract obtained by the method described was 0.75 mg / ml, while the concentration that would be obtained closest to the claimed method, at which the greatest number of tumor cells dies - 3 mg / ml . Therefore, the method claimed by us allowed us to reduce the value of the minimum effective concentration, which can significantly reduce the toxic effect on healthy cells.
Таким образом, для определения минимально эффективной концентрации противоопухолевого лекарственного средства, препятствующего формированию резистентности опухолевых клеток за счет ингибирования цитопротекторной аутофагии, использование процента клеток с аутофагосомами от количества живых клеток целесообразно. Значение концентрации, при которой процент клеток с аутофагосомами будет равен нулю и будет минимально эффективной для преодоления резистентности опухолевых клеток.Thus, to determine the minimum effective concentration of an anticancer drug that prevents the formation of tumor cell resistance by inhibiting cytoprotective autophagy, the use of a percentage of cells with autophagosomes in the number of living cells is appropriate. The concentration value at which the percentage of cells with autophagosomes will be zero and will be minimally effective for overcoming the resistance of tumor cells.
В отличие от наиболее близкого к заявленному способу оценки эффективной концентрации противоопухолевых препаратов в экспериментах in vitro в предлагаемом нами способе эффективная концентрация будет существенно ниже и поэтому будет оказывать меньшее негативное влияние на здоровые клетки.In contrast to the closest to the claimed method of assessing the effective concentration of anticancer drugs in in vitro experiments in our proposed method, the effective concentration will be significantly lower and therefore will have less negative impact on healthy cells.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018105465A RU2693829C1 (en) | 2018-02-13 | 2018-02-13 | Method for determining minimum effective concentration of antitumour drug which inhibits cytoprotective autophagy in vitro |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018105465A RU2693829C1 (en) | 2018-02-13 | 2018-02-13 | Method for determining minimum effective concentration of antitumour drug which inhibits cytoprotective autophagy in vitro |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2693829C1 true RU2693829C1 (en) | 2019-07-05 |
Family
ID=67252294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018105465A RU2693829C1 (en) | 2018-02-13 | 2018-02-13 | Method for determining minimum effective concentration of antitumour drug which inhibits cytoprotective autophagy in vitro |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2693829C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2482863C1 (en) * | 2012-02-15 | 2013-05-27 | Наталья Владимировна Полуконова | Method for preparing dry extract of herbal raw material possessing biological activity |
| RU2639535C2 (en) * | 2015-12-07 | 2017-12-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method for screening of antitumor preparations - parp1 inhibitors based on biochemical methods of analysis |
-
2018
- 2018-02-13 RU RU2018105465A patent/RU2693829C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2482863C1 (en) * | 2012-02-15 | 2013-05-27 | Наталья Владимировна Полуконова | Method for preparing dry extract of herbal raw material possessing biological activity |
| RU2639535C2 (en) * | 2015-12-07 | 2017-12-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method for screening of antitumor preparations - parp1 inhibitors based on biochemical methods of analysis |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LIN CJ et al., Resveratrol enhances the therapeutic effect of temozolomide against malignant glioma in vitro and in vivo by inhibiting autophagy, Free Radic Biol Med. 2012 Jan 15;52(2):377-91 - . 55-264. * |
| LIN CJ et al., Resveratrol enhances the therapeutic effect of temozolomide against malignant glioma in vitro and in vivo by inhibiting autophagy, Free Radic Biol Med. 2012 Jan 15;52(2):377-91 - реферат. SELLERS J.R. et al., A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Meth. 1994. V. 172, p. 255-264. * |
| SELLERS J.R. et al., A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Meth. 1994. V. 172, p. 2 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gookin et al. | The conundrum of feline trichomonosis: The more we learn the ‘trickier’it gets | |
| Ahmed et al. | Gastrointestinal stromal tumours (GIST)–17 years experience from mid trent region (United Kingdom) | |
| JP6019500B2 (en) | Method for detecting cancer cells using fluorescently labeled L-glucose derivative and imaging agent for cancer cells containing the derivative | |
| Zhang et al. | Isoniazid promotes the anti-inflammatory response in zebrafish associated with regulation of the PPARγ/NF-κB/AP-1 pathway | |
| CN108635354A (en) | Methanesulfomide type small molecular inhibitor application in preparation of anti-tumor drugs | |
| Anoveros-Barrera et al. | Immunohistochemical phenotyping of T cells, granulocytes, and phagocytes in the muscle of cancer patients: association with radiologically defined muscle mass and gene expression | |
| CN102023207B (en) | Method for carrying out enzyme-linked immunoadsorption detection on integral zebra fish and application thereof | |
| RU2693829C1 (en) | Method for determining minimum effective concentration of antitumour drug which inhibits cytoprotective autophagy in vitro | |
| Raman et al. | Increase number of mitochondrion-like organelle in symptomatic Blastocystis subtype 3 due to metronidazole treatment | |
| Advani et al. | A Phase 1 study of imatinib mesylate in combination with cytarabine and daunorubicin for c-kit positive relapsed acute myeloid leukemia | |
| Rao et al. | Current aspects and future strategies in oral cancer research: A review | |
| Yegen et al. | The effect of neoadjuvant therapy on the size, number, and distribution of mesorectal lymph nodes | |
| Motta et al. | Pleuric presentation of extranodal marginal zone lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue: a case report and a review of the literature | |
| RU2694547C1 (en) | Agent having selective action on tumor cells, activating apoptosis thereof and preventing formation of resistance thereof | |
| CN104958306B (en) | Platinum medicine is preparing the application in treating ovarian cancer to compound Hu 17 alone or in combination | |
| Rudiger et al. | Chemosensitivity testing of circulating epithelial tumor cells (CETC) in vitro: correlation to in vivo sensitivity and clinical outcome | |
| Karamkhani et al. | Assessment of apoptosis induction by methanol extract of Sea Cucumber in blastocystis hominis isolated from human samples using flow cytometry and DNA fragmentation test | |
| Cerrato et al. | Assessment of transcription inhibition as a characteristic of immunogenic cell death | |
| Minami et al. | Two cases of mediastinal gray zone lymphoma | |
| Lizarraga et al. | Incidents of snake fungal disease caused by the fungal pathogen Ophidiomyces ophidiicola in Texas | |
| RU2712946C1 (en) | Method for assessing the balance of the immune, inflammatory and anti-inflammatory reaction of alveolar macrophages recovered from resected parts of the lung of patients suffering pulmonary tuberculosis, depending on the degree of mycobacterium tuberculosis macrophages infection | |
| Bose et al. | Benzophenone And Pyrazine Derivatives Differential Effects On Ovarian Cancer (SK-OV-3) Cell Line | |
| Calik et al. | GASTROINTESTINAL STROMAL TUMOR: SINGLE-CENTER EXPERIENCE WITH REVIEW OF THE LITERATURE | |
| RU2319963C1 (en) | Method for determining indications to organ-saving treatment of urinary bladder carcinoma patients | |
| Kirschner et al. | Evaluation of a Combined MicroRNA-Clinical Score as Prognostic Factor for Malignant Pleural Mesothelioma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210214 |