RU2692675C1 - Недеструктивный способ оценки цитотоксичности наночастиц с использованием микроводоросли Dunaliella salina в качестве биосенсора - Google Patents
Недеструктивный способ оценки цитотоксичности наночастиц с использованием микроводоросли Dunaliella salina в качестве биосенсора Download PDFInfo
- Publication number
- RU2692675C1 RU2692675C1 RU2018123205A RU2018123205A RU2692675C1 RU 2692675 C1 RU2692675 C1 RU 2692675C1 RU 2018123205 A RU2018123205 A RU 2018123205A RU 2018123205 A RU2018123205 A RU 2018123205A RU 2692675 C1 RU2692675 C1 RU 2692675C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gold nanoparticles
- value
- eff
- chlorophyll
- nanoparticles
- Prior art date
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 title claims abstract description 10
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 241000195633 Dunaliella salina Species 0.000 title claims description 29
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 claims abstract description 32
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 claims abstract description 31
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 claims abstract description 31
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 26
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 18
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 18
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 14
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims abstract description 14
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000005375 photometry Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 231100000491 EC50 Toxicity 0.000 claims description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 11
- 239000004247 glycine and its sodium salt Substances 0.000 claims description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 6
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 231100000613 environmental toxicology Toxicity 0.000 abstract description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 abstract description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 28
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 9
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 7
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 6
- NFSDQNVXOCGBRV-UHFFFAOYSA-N gold(3+);phosphane Chemical compound P.[Au+3] NFSDQNVXOCGBRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 5
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000011858 nanopowder Substances 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 102100035769 Apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 240000009108 Chlorella vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000007089 Chlorella vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 235000010652 Chlorella vulgaris var autotrophica Nutrition 0.000 description 1
- 240000000862 Chlorella vulgaris var. autotrophica Species 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029952 Double-strand-break repair protein rad21 homolog Human genes 0.000 description 1
- 241000195634 Dunaliella Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000929927 Homo sapiens Apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus Proteins 0.000 description 1
- 101000584942 Homo sapiens Double-strand-break repair protein rad21 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000998158 Homo sapiens NF-kappa-B inhibitor beta Proteins 0.000 description 1
- 101000669667 Homo sapiens RNA-binding protein with serine-rich domain 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150039798 MYC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150022024 MYCN gene Proteins 0.000 description 1
- 102100033457 NF-kappa-B inhibitor beta Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100039323 RNA-binding protein with serine-rich domain 1 Human genes 0.000 description 1
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100459258 Xenopus laevis myc-a gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005083 Zinc sulfide Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002103 nanocoating Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000010801 sewage sludge Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 229910052984 zinc sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- DRDVZXDWVBGGMH-UHFFFAOYSA-N zinc;sulfide Chemical compound [S-2].[Zn+2] DRDVZXDWVBGGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/748—Cyanobacteria, i.e. blue-green bacteria or blue-green algae, e.g. spirulina
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
- B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области экологической токсикологии и биотехнологии и предназначено для экспресс-оценки цитотоксичности наночастиц золота. Способ оценки цитотоксичности наночастиц золота, заключающийся в недеструктивной фотометрической оценке содержания хлорофилла в суспензиях культур микроводоросли Dunaliella salina, включает культивирование микроводоросли Dunaliella salina с использованием питательной среды Бен-Амотца, разведение наночастиц золота культуральной средой Бен-Амотца, подготовку проб путём внесения культуры микроводоросли Dunaliella salina в разведенные наночастицы золота таким образом, чтобы посевная доза составила 106 клеток/мл, триплицирование проб, инкубирование проб в течение 48 ч, фотометрическое измерение суспензий культур Dunaliella salina in vivo путём регистрации экстинкции на трех длинах волн: 640, 680 и 740 нм, вычисление высоты пика поглощения хлорофилла, расчет значения эффективности токсического действия по формуле, далее рассчитывают значения полуэффективной концентрации наночастиц золота EC5048 методом линейной интерполяции по формуле. Вышеописанный способ позволяет эффективно оценить токсическое действие наночастиц золота. 4 ил., 2 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области экологической токсикологии и биотехнологии и предназначено для экспресс-оценки цитотоксичности наночастиц различного состава и строения, а также веществ, используемых при их синтезе.
Ежегодно, по оценке ряда исследователей, производится более 75000 тонн различных наночастиц [1]. В связи с этим оценка биобезопасности наноматериалов для здоровья человека и окружающей среды представляется важной задачей. Сложность характеристики их биосовместимости связана с несколькими аспектами. Во-первых, наночастицы вследствие своих физико-химических свойств могут вносить изменения в системы стандартных токсикологических тестов, искажая результаты анализа [2]. Во-вторых, интенсивное развитие технологий синтеза наночастиц требует разработки оперативных методов оценки их токсичности, поскольку использование лабораторных животных для этих целей требует много времени на проведение экспериментов. Необходимым является создание клеточных диагностических тест-систем для предварительной оценки токсичности наночастиц с дальнейшей характеристикой безопасности отдельных материалов в условиях in vivo [3].
Известен способ определения токсичности материалов, в основе которого лежит оценка изменения интенсивности люминесценции генно-инженерного штамма бактерий при воздействии токсикантов, которая регистрируется прибором «Биотокс» [4]. Недостатком данного способа является его непригодность для оценки токсичности люминесцирующих наноматериалов (квантовые точки, флуоресцирующие золотые нанокластеры), так как есть большая вероятность получения ложноотрицательных результатов. Это связано с тем, что данные частицы могут вносить значительный вклад в регистрируемый оптический сигнал. Одним из недостатков также следует считать высокую стоимость производства данного биосенсора из-за использования дорогостоящего процесса лиофилизации.
Известен способ оценки влияния наночастиц бентонита на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки и мононуклеарные клетки- лимфоциты [5]. По завершению инкубации наночастиц с клетками методом проточной цитофлуориметрии определяют влияние наночастиц на производство активных форм кислорода, образование апоптотических и некротических клеток, функции митохондрий, состояние лизосомального аппарата. Полученные результаты сравнивают с соответствующими показателями контрольных образцов исследуемых клеток.
Известен также способ оценки влияния золотых наночастиц с размером от 2 до 200 нм на клетки Т-лимфобластного лейкоза человека линии Джуркат на основе измерения уровня экспрессии различных генов: Smad, NFKBIB, RNPS1, ACIN1, RAD21, Myc, MycN, Mxd [6].
Данные технические решения предполагают использование клеток животных и человека в качестве тест-объектов при оценке токсичности наночастиц. Токсикологические тесты на животных клетках являются первой линией методов, используемых для оценки потенциальной биобезопасности наночастиц для человеческого организма. Недостаткам данных тестов являются: сложность поддержания культур, высокие требованиями к квалификации оператора, необходимость оборудования специальных помещений для культивирования клеток и высокая стоимостью оборудования.
В свою очередь одноклеточные водоросли являются очень удобными объектами для биотестирования, поскольку обладают высокой чувствительностью к токсикантам и простотой поддержания культур. Их культивирование не требует больших временных и денежных затрат.
Известен способ оценки токсичности наночастиц сульфида цинка с использованием красной микроводоросли Porhyridium cruentum в качестве биосенсора [7]. В качестве критерия токсичности используется содержание малонового диальдегида, которое оценивается в биомассе микроводорослей фотометрически. Таким образом, характеризуется выраженность окислительного стресса в клетках. Недостатком данного способа является его трудоемкость, необходимость деструкции клеток и экстракции из них малонового диальдегида, что сопряжено со значительными затратами времени и использованием дополнительных реактивов: трихлоруксусной и тиобарбитуровой кислот.
Известен способ оценки цитотоксичности нанопорошков и изделий из наноматериалов по изменению оптической плотности культуры микроводоросли Chlorella vulgaris [8]. Данное техническое решение является наиболее близким аналогом настоящему изобретению. В качестве тест-функции фотометрически регистрируется содержание хлорофилла в суспензиях микроводорослей по абсолютному значению оптической плотности на 680 нм. Длительность экспозиции микроводорослей с токсикантами составляет 22 часа. Недостатком данного способа является неприменимость используемого алгоритма фотометрического мониторинга для оценки содержания хлорофилла в пробах с хромофорными наночастицами. К примеру, плазмонно-резонансные наночастицы золота и серебра могут за счет агрегации и хроматических изменений трансформировать спектр экстинкции культуры микроводорослей, искажая результаты анализа. К недостаткам способа можно отнести тот факт, что анализ проводится с использованием 50 мл колб Эрленмейера. Это существенно повышает расход токсиканта и время выполнения теста.
Недостатком вышеперечисленных способов является также неприменимость используемых в них видов микроводорослей для экстраполяции результатов токсикологического теста на клетки человека и млекопитающих. Такие микроводоросли как Porhyridium и Chlorella характеризуются наличием ригидной целлюлозной клеточной стенки, что существенным образом изменяет их отклик на воздействие наночастиц по сравнению с животными клетками [9]. Некоторые авторы полагают, что микроводоросли рода Dunaliella, вследствие отсутствия жесткой клеточной стенки, обладают сходством с животными клетками в отношении механизма взаимодействия с наноматериалами. Так, было показано, что чувствительность культур Dunaliella salina на воздействие серебряных наночастиц на порядок отличалась от культур микроводоросли Chlorella autotrophica, обладающей типичным морфологическим строением [10].
Задачей настоящего изобретения является разработка способа недеструктивной фотометрической оценки цитотоксичности наночастиц любого типа, включая хромофорные наночастицы, в формате миниатюризованного теста с использованием культур микроводоросли Dunaliella salina в качестве биосенсора.
Техническим результатом данного изобретения является повышение информативности и воспроизводимости токсикологического теста с наночастицами, упрощение аналитической процедуры, снижение расхода токсиканта и времени выполнения теста.
Технический результат достигается благодаря тому, что способ оценки цитотоксичности наночастиц заключается в недеструктивной фотометрической оценке содержания хлорофилла в суспензиях культур микроводоросли Dunaliella salina, включающий культивирование микроводоросли Dunaliella salina с использованием питательной среды Бен-Амотца, разведение токсиканта культуральной средой Бен-Амотца, подготовка проб путём внесения культуры микроводоросли Dunaliella salina в разведенный токсикант таким образом, чтобы посевная доза составила 106 клеток/мл, триплицирование проб, инкубирование проб в течение 48 часов, фотометрическое измерение суспензий культур Dunaliella salina in vivo путём регистрации экстинкции на трех длинах волн: 640, 680 и 740 нм, вычисление высоты пика поглощения хлорофилла, расчет значения эффективности токсического действия по формуле Eff = (1 - A680 C / A680C0) × 100, где Eff- величина эффективности токсического действия, %; A680C – значение величины пика поглощения хлорофилла in vivo в экспериментальной пробе; A680C0 – значение величины пика поглощения хлорофилла in vivo в контрольной пробе, расчет значения полуэффективной концентрации токсиканта EC5048 методом линейной интерполяции по формуле EC5048 = ((C>50% - С<50%) / (Eff>50% - Eff<50%)) Ч (50 - Eff<50%) + C<50%, где EC5048 – полумаксимальная эффективная концентрация токсиканта, мг/л; С>50% – значение концентрации токсиканта, давшее более 50 % эффекта, мг/л; С<50% – значение концентрации токсиканта, давшее менее 50 % эффекта, мг/л; Eff>50% значение эффективности действия более 50 %; Eff<50% – значение эффективности действия менее 50%.
Заявляемое изобретение иллюстрируется чертежами.
Фиг. 1 - Схема работы микропланшетной тест-системы.
Фиг. 2 - Спектры экстинкции суспензий D.salina, зарегистрированные через 48 часов после инкубации со стоковым раствором 3 нм фосфониевых золотых наночастиц (ФЗНЧ-3)в концентрациях 0 (1), 40 (2) и 100 (3) мг Au/л.
Фиг. 3 - Спектры экстинкции суспензий D.salina, зарегистрированные через 48 часов после инкубации со стоковым раствором 15 нм фосфониевых золотых наночастиц (ФЗНЧ-15) в концентрациях 0 (1), 40 (2) и 100 (3) мг Au/л.
Фиг. 4 - Фотометрическая оценка эффективности токсического действия ФЗНЧ-3 и ФЗНЧ-15 при 48-часовой экспозиции с культурами D.salina.
В предложенном способе оценки цитотоксичности наночастиц в качестве биосенсора используют альгологически чистые культуры микроводоросли D. salina из коллекции культур Института физиологии растений РАН. Для периодического культивирования микроводоросли культивируют в лабораторных условиях с использованием питательной среды Бен-Амотца состава: NaCl, 1,5 M; NaHCO3, 50 мМ; MgSO4 ×7H2O, 5 мМ; KNO3, 5 мМ; CaCl2 × 2H2O,0,3 мМ; K2HPO4 × 3H2O, 0,2 мМ; ЭДТА, 30 мкМ; MnSO4 ×5H2O, 7 мкМ; FeSO4, 2 мкМ; CuCl2, 1 мкМ; ZnSO4 × 7H2O, 1 мкМ; СoSO4, 1 мкМ; (NH4)2MoO4, 1 мкМ. Каждые два дня для сохранения экспоненциальной стадии роста и повышения однородности культуру пересевают на свежую среду. Для постановки токсикологического эксперимента используют только синхронизированную культуру после трех последовательных пассажей. При поддержании культуры периодически осуществляют микроскопический мониторинг ее морфофизиологических характеристик. В токсикологическом тесте следует использовать только физиологически активную культуру. Диагностические критерии такого состояния клеток следующие: эллипсоидная и яйцевидная форма клеток; высокая клеточная подвижность; распределение микроводорослей во всей толще среды; отсутствие больших скоплений клеток (пальмеллоидных образований).
Предложенный способ реализуется следующим образом. На первом этапе в лунках 96-луночного полистиренового микропланшета готовят разведения токсиканта культуральной средой Бен-Амотца. Затем в лунки вносят культуру D.salina таким образом, чтобы посевная доза составила 106 клеток/мл. Каждая проба триплицируется. Конечный объем образца в лунке составляет 200 мкл.
На втором этапе микропланшет с пробами инкубируют в течение 48 часов. Культивирование осуществляют в ламинарном шкафу при постоянном освещении и температуре.
На третьем этапе после 48 – часовой экспозиции в пробах фотометрически оценивают содержание хлорофилла по высоте пика поглощения в красной спектральной области. Проводят фотометрические измерения суспензий культур D.salina in vivo, регистрируя экстинкцию на трех длинах волн: 640, 680 и 740 нм. Затем в каждой пробе вычисляют высоту пика поглощения хлорофилла, скорректированного на светорассеяние. Согласно полученным результатам, данный оптический параметр значительно коррелирует с содержанием хлорофилла в спиртовых экстрактах и количеством клеток микроводорослей [11].
Высота пика поглощения хлорофилла в области 665-680 нм в суспензиях культур микроводорослей in vivo и экстрактах тех же культур отражает его содержание, поскольку в красной спектральной области у микроводорослей поглощает только данный пигмент. Фактором, затрудняющим интерпретацию значений высоты пика поглощения in vivo является светорассеяние, которое вносит неконтролируемый вклад в изменение значения экстинкции. Поэтому в алгоритме расчета делают коррекцию на светорассеяние. Расчет ведут по формуле A680 = (E680 – E740) – 0.6(E640 – E740), где E640, E680 и E740 – усредненные значения экстинкции на длинах волн: 640, 680 и 740 нм. Таким образом, значение поглощения хлорофилла, определяемое под данному алгоритму in vivo, коррелирует со значением поглощения хлорофилла, рассчитываемым в экстрактах культур.
Высота пика поглощения хлорофилла in vivo в суспензиях культур коррелирует с количеством клеток микроводорослей, поскольку хлорофилл является основным пигментом микроводорослей и его содержание непосредственно связано с количеством их биомассы.
На основании значений поглощения хлорофилла в каждой экспериментальной пробе рассчитывают значение эффективности токсического действия по формуле:
Eff = (1 - A680 C / A680C0) × 100,
где
Eff- величина эффективности токсического действия, %;
A680C – значение величины пика поглощения хлорофилла in vivo в экспериментальной пробе;
A680C0 – значение величины пика поглощения хлорофилла in vivo в контрольной пробе.
Далее на основании значений эффективности токсического действия методом линейной интерполяции рассчитывают значение полуэффективной концентрации токсиканта EC5048 по формуле:
EC5048 = ((C>50% - С<50%) / (Eff>50% - Eff<50%)) Ч (50 - Eff<50%) + C<50%,
где EC5048 – полумаксимальная эффективная концентрация токсиканта, мг/л; С>50% – значение концентрации токсиканта, давшее более 50 % эффекта, мг/л; С<50% – значение концентрации токсиканта, давшее менее 50 % эффекта, мг/л; Eff>50% значение эффективности действия более 50 %; Eff<50% – значение эффективности действия менее 50%.
Изобретение иллюстрируется примерами.
Пример 1: Фотометрическое измерение поглощения хлорофилла в суспензиях культур D.salina
Используются следующие реагенты, расходные материалы и приборы: Накопительная 3-дневная культура микроводоросли D. salina; культуральная среда Бен-Амотца; автоматическая одноканальная пипетка на 200 мкл; плоскодонный 96-луночный планшет, планшетный спектрофотометр Spark 10M (Tecan, Австрия).
Этап 1- Приготовление серии разведений культуры D. salina
Перемешать культуру D.salina пипетированием. В лунки A1-A3 планшета одноканальной пипеткой внести по 200 мкл суспензии исходной культуры. В лунках блока B1-D3 развести исходную культуру в 2, 4 и 8 раз средой Бен-Амотца таким образом, чтобы конечный объем в каждой лунке составил 200 мкл. Каждое разведение делать в трех повторностях. Протокол разведений приведен в таблице 1.
Таблица 1.
Протокол разведений суспензий D. salina
| Наименование лунок | Вносимый объём суспензии исходной культуры D. salina, мкл | Вносимый объем культуральной среды Бен-Амотц, мкл |
| A1-A3 | 200 | 0 |
| B1-B3 | 100 | 100 |
| C1-C3 | 50 | 150 |
| D1-D3 | 25 | 175 |
Этап 2- Фотометрические измерения суcпензий культур D.salina
Поместить планшет в спектрофотометр. Провести регистрацию спектров экстинкции в режиме кинетики сканирования после 7-минутной темновой паузы в диапазоне длин волн 400-800 нм с шагом 1 нм, спектральной шириной щели 3,5 нм, тремя циклами с 3-х минутным интервалом.
Этап 3. Расчет показателя поглощения хлорофилла A680
Для каждой длины волны вычислить среднее значение экстинкции по временам измерений. Вычислить средние значения экстинкции по 5 длинам волн в окрестностях точек 640 нм (638,639,640,641, 642 нм), 680 нм (678,679, 680, 681, 682 нм), 740 нм (738,739,740, 741, 742 нм). Рассчитать показатель поглощения хлорофилла по формуле: A680 = (E680-E740) -(E640-E740) ×0,6, где E640, E680 и E740 – усредненные значения экстинкции на длинах волн: 640, 680 и 740 нм.
Пример 2: Оценка цитотоксичности 3 нм и 15 нм золотых наночастиц с использованием микропланшетной тест-системы
Используются следующие реагенты, расходные материалы и приборы: стоковый раствор 3 нм фосфониевых золотых наночастиц (ФЗНЧ-3) с конечной концентрацией 1 г Au/л, стоковый раствор 15 нм фосфониевых золотых наночастиц (ФЗНЧ-15) с конечной концентрацией 1 г Au/л, 3-дневная культура D.salina в экспоненциальной стадии роста, культуральная среда Бен-Амотца, 96-луночный плоскодонный микропланшет, планшетный спектрофотометр Spark 10M (Tecan, Австрия), ламинарный шкаф; люминесцентные лампы ЛЛ-12/16 Вт (IEK,Россия) (2 штуки), ртутный термометр.
Этап 1- Подготовка тестовой культуры D.salina к эксперименту
В 15 мл пластиковой пробирке развести накопительную 3-дневную культуру D.salina культуральной средой Бен-Амотца таким образом, чтобы показатель поглощения хлорофилла A680 в ней составлял порядка 0,06, что соответствует числовой концентрации 2 × 106 кл/мл.
Этап 2- Приготовление концентрационных рядов токсикантов
В лунках микропланшета блока A1-H6 приготовить вертикально ориентированные концентрационные ряды токсикантов ФЗНЧ-3 и ФЗНЧ-15 диапазона: 10,20,30,40,60,80,100 мг Au/л. С этой целью сделать разведения стоковых растворов наночастиц культуральной средой Бен-Амотца и тестовой культурой микроводорослей. Каждую пробу триплицировать. Протокол разведений токсикантов приведен в таблице 2.
Таблица 2
Протокол приготовления разведений токсикантов
| Номер ряда | Добавляемый в лунку объем стокового раствора наночастиц, мкл | Добавляемый в лунку объем культуральной среды Бен-Амотца, мкл | Добавляемый в лунку объем суспензии культуры D.salina, мкл | Конечная концентрация токсиканта в лунке, мг Au/л |
| A1-A6 | 20 | 80 | 100 | 100 |
| B1-B6 | 16 | 84 | 100 | 80 |
| C1-C6 | 12 | 88 | 100 | 60 |
| D1-D6 | 8 | 92 | 100 | 40 |
| E1-E6 | 6 | 94 | 100 | 30 |
| F1-F6 | 4 | 96 | 100 | 20 |
| G1-G6 | 2 | 98 | 100 | 10 |
| H1-H6 | 0 | 100 | 100 | 0 |
Этап 3. Экспозиция клеток микроводорослей с токсикантами
Инкубировать микропланшет с пробами в ламинарном шкафу в течение 48 часов при постоянном освещении двумя люминесцентными лампами, создающими поток фотонов 80-100 мкмоль×м-2×с-1. Расстояние от крышки планшета до ламп должно составлять 10-11 см. Поддерживаемая температура воздуха должна составлять 23±2 °С. Мониторинг температуры осуществлять ртутным термометром, который помещается рядом с планшетом.
Этап 4. Фотометрические измерения суспензий D.salina и расчет значений A680.
Поместить планшет в спектрофотометр. Провести регистрацию спектров экстинкции в режиме кинетики сканирования после 7-минутной темновой паузы в диапазоне длин волн 400-800 нм с шагом 1 нм, спектральной шириной щели 3,5 нм, тремя циклами с 3-х минутным интервалом. Рассчитать во всех пробах показатель поглощения хлорофилла по формуле: A680 = (E680-E740) -(E640-E740) ×0,6.
Этап 5. Расчет значений эффективности токсического действия
На основании значений показателя поглощения хлорофилла рассчитать величину эффективности токсиканта для каждой экспериментальной пробы по формуле: Eff= (1-(A680C/A680 C0)) Ч100, где Eff- величина эффективности токсического действия, %; A680C – значение величины поглощения хлорофилла в экспериментальной пробе; A680C0 – значение величины поглощения хлорофилла в контрольной пробе.
Этап 6. Расчет полумаксимальной эффективной концентрации токсиканта (EC5048)
Рассчитать показатели EC5048 для токсикантов в окрестностях Eff =50 по формуле: EC5048=((C>50%-С<50%)/(Eff>50% - Eff <50%)) Ч (50- Eff <50%)+C <50%, где EC5048 – полумаксимальная эффективная концентрация токсиканта, мг/л; С>50% – значение концентрации токсиканта, давшее более 50 % эффекта, мг/л; С <50% – значение концентрации токсиканта, давшее менее 50 % эффекта, мг/л; Eff>50% значение эффективности действия более 50 %; Eff <50% – значение эффективности действия менее 50%.
На фиг. 2 и 3 представлены изменения спектров экстинкции in vivo при инкубации культур D.salina c препаратами ФЗНЧ-3 и ФЗНЧ-15 в течение 48 часов. На фиг. 4 представлена диаграмма, отражающая фотометрическую оценку эффективности токсического действия наночастиц. Концентрация золота 100 мг Au/л вызывает гибель всех клеток при 48-часовой экспозиции с ФЗНЧ-3, о чем свидетельствует отсутствие характеристического пика поглощения хлорофилла в красной спектральной области. При концентрации 40 мг Au/л ФЗНЧ-15 величина пика составляет 40 ± 3 % от контрольного значения. Рассчитанное для ФЗНЧ-3 значение EC5048 составляет 25,7 ± 0,3 мг Au/л. Напротив, экспозиция культур D.salina c 15 нм фосфониевыми золотыми наночастицами не вызывала существенного токсического эффекта, поэтому рассчитать для них значение EC50 не представлялось возможным.
1. Piccinno F., Gottschalk F., Seeger S., Nowack B. Industrial production quantities and uses of ten engineered nanomaterials in Europe and the world // J. Nanopart. Res. – 2012. – V. 14. – P. 1109.
2. Selk H., Handy R.D., Fernandes T.F., Klaine S.J., Petersen E.J. Nanomaterials in the aquatic environment: A European Union –United States perspective on the status of ecotoxicity testing, research priorities and challenges ahead // Environ. Toxicol. Chem. – 2016. –V. 35. – P. 1055-1067.
3. Joris F., Manshian B.B., Peynshaert K., De Smedt S.C., Braeckmans K., Soenen S.J. Assessing nanoparticle toxicity in cell-based assays: influence of cell culture parameters and optimized models for bridging the in vitro –in vivo gap // Chem. Soc. Rev. – 2013. – V. 42. – P. 8339-8359.
4. Методика определения токсичности химических веществ, полимеров, материалов и изделий с помощью биотеста "Эколюм", MP от 15.06.2007 N 01.018-07).
5. Пат. RU 2460997 C1.
6. Пат. US № 20100279289.
7. Пат. MD № 4200B1
8. Методика определения индекса токсичности нанопорошков, изделий из наноматериалов, нанопокрытий, отходов и осадков сточных вод, содержащих наночастицы, по изменению оптической плотности тест-культуры водоросли хлорелла, от 14.05.2010, ФР 1.39.2010.09103.
9. Sendra M., Yeste P.M., Moreno-Garrido I., Gatica J.M., Blasco J. CeO2 NPs, toxic or protective to phytoplankton? Charge of nanoparticles and cell wall as factors which cause changes in cell complexity // Sci Total Environ. – Vol. 590-591. – P. 304-315.
10. Yue Y., Li X., Sigg L., Suter M., Pillai S., Behra R., Schirmer K. Interaction of silver nanoparticles with algae and fish cells: a side by side comparsion // J. Nanobiotechnol. –Vol. 15. – doi: 10.1186/s12951-017-0254-9.
11. Чумаков Д.С., Голубев А.А., Дыкман Л.А., Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А. Оптическая оценка жизнеспособности микроводорослей Dunaliella salina при токсикологическом тестировании // Коллоидный журнал. –Т. 79, № 6. –C. 808-812.
Claims (13)
- Способ оценки цитотоксичности наночастиц золота, заключающийся в недеструктивной фотометрической оценке содержания хлорофилла в суспензиях культур микроводоросли Dunaliella salina, включающий культивирование микроводоросли Dunaliella salina с использованием питательной среды Бен-Амотца, разведение наночастиц золота культуральной средой Бен-Амотца, подготовку проб путём внесения культуры микроводоросли Dunaliella salina в разведенные наночастицы золота таким образом, чтобы посевная доза составила 106 клеток/мл, триплицирование проб, инкубирование проб в течение 48 ч, фотометрическое измерение суспензий культур Dunaliella salina in vivo путём регистрации экстинкции на трех длинах волн: 640, 680 и 740 нм, вычисление высоты пика поглощения хлорофилла, расчет значения эффективности токсического действия по формуле
- Eff = (1 - A680 C / A680C0) × 100,
- где Eff- величина эффективности токсического действия, %;
- A680C – значение величины пика поглощения хлорофилла in vivo в экспериментальной пробе;
- A680C0 – значение величины пика поглощения хлорофилла in vivo в контрольной пробе,
- A680 = (E680 – E740) – 0.6(E640 – E740), где E640, E680 и E740 – усредненные значения экстинкции на длинах волн 640, 680 и 740 нм,
- расчет значения полуэффективной концентрации наночастиц золота EC5048 методом линейной интерполяции по формуле
- EC5048 = ((C>50% - С<50%) / (Eff>50% - Eff<50%)) × (50 - Eff<50%) + C<50%,
- где EC5048 – полумаксимальная эффективная концентрация наночастиц золота, мг/л;
- С>50% – значение концентрации наночастиц золота, давшее более 50% эффекта, мг/л;
- С<50% – значение концентрации наночастиц золота, давшее менее 50% эффекта, мг/л;
- Eff>50% - значение эффективности действия более 50%;
- Eff<50% – значение эффективности действия менее 50%.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018123205A RU2692675C1 (ru) | 2018-06-26 | 2018-06-26 | Недеструктивный способ оценки цитотоксичности наночастиц с использованием микроводоросли Dunaliella salina в качестве биосенсора |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018123205A RU2692675C1 (ru) | 2018-06-26 | 2018-06-26 | Недеструктивный способ оценки цитотоксичности наночастиц с использованием микроводоросли Dunaliella salina в качестве биосенсора |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2692675C1 true RU2692675C1 (ru) | 2019-06-26 |
Family
ID=67038348
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018123205A RU2692675C1 (ru) | 2018-06-26 | 2018-06-26 | Недеструктивный способ оценки цитотоксичности наночастиц с использованием микроводоросли Dunaliella salina в качестве биосенсора |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2692675C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2756524C1 (ru) * | 2020-08-10 | 2021-10-01 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью | Способ оценки токсичности микро- и наночастиц по их морфологическим признакам |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU866470A1 (ru) * | 1980-02-21 | 1981-09-23 | Научно-Исследовательский Институт Биологии При Иркутском Государственном Университете Им. А.А.Жданова | Способ оценки токсичности различных веществ сточных и природных вод |
| RU2541457C1 (ru) * | 2014-10-03 | 2015-02-10 | Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского | Способ определения влияния токсичности сточных вод на водные соленые среды |
-
2018
- 2018-06-26 RU RU2018123205A patent/RU2692675C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU866470A1 (ru) * | 1980-02-21 | 1981-09-23 | Научно-Исследовательский Институт Биологии При Иркутском Государственном Университете Им. А.А.Жданова | Способ оценки токсичности различных веществ сточных и природных вод |
| RU2541457C1 (ru) * | 2014-10-03 | 2015-02-10 | Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского | Способ определения влияния токсичности сточных вод на водные соленые среды |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DOI: 10.18500/1816-9775-2017-17-3-305-311. * |
| ЧУМАКОВ Д.C., ГОЛУБЕВ А.А., КОННОВА C. А., ДЫКМАН Л.А., БОГАТЫРЕВ В.А. Оценка цитотоксичности ионного и коллоидного золота для микроводоросли Dunaliella Salina в микропланшетной тест-системе // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2017. Т. 17, вып. 3. С. 305-311. * |
| ЧУМАКОВ Д.C., ГОЛУБЕВ А.А., КОННОВА C. А., ДЫКМАН Л.А., БОГАТЫРЕВ В.А. Оценка цитотоксичности ионного и коллоидного золота для микроводоросли Dunaliella Salina в микропланшетной тест-системе // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2017. Т. 17, вып. 3. С. 305-311. DOI: 10.18500/1816-9775-2017-17-3-305-311. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2756524C1 (ru) * | 2020-08-10 | 2021-10-01 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью | Способ оценки токсичности микро- и наночастиц по их морфологическим признакам |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dorsey et al. | Rapid analytical technique for the assessment of cell metabolic activity in marine microalgae | |
| Peniuk et al. | Identification and quantification of suspended algae and bacteria populations using flow cytometry: applications for algae biofuel and biochemical growth systems | |
| Walsh | Principles of toxicity testing with marine unicellular algae | |
| WO2017098815A1 (ja) | 微細藻類のモニタリング装置及び微細藻類のモニタリング方法 | |
| Steinberg et al. | Comparison of techniques used to count single-celled viable phytoplankton | |
| Binet et al. | Use of JC-1 to assess mitochondrial membrane potential in sea urchin sperm | |
| Li et al. | Nanomaterial libraries and model organisms for rapid high-content analysis of nanosafety | |
| RU2692675C1 (ru) | Недеструктивный способ оценки цитотоксичности наночастиц с использованием микроводоросли Dunaliella salina в качестве биосенсора | |
| Alam et al. | Standard techniques and methods for isolating, selecting and monitoring the growth of microalgal strain | |
| Catherine et al. | Cyanobacterial samples: preservation, enumeration, and biovolume measurements | |
| Strovas et al. | Direct measurement of oxygen consumption rates from attached and unattached cells in a reversibly sealed, diffusionally isolated sample chamber | |
| Moutier et al. | Evolution of the scattering properties of phytoplankton cells from flow cytometry measurements | |
| Espinosa-Calderon et al. | Description of photosynthesis measurement methods in green plants involving optical techniques, advantages and limitations | |
| Solomonova et al. | Ecotoxicological aspects of the influence of ionic and nano copper on structural and functional characteristics of Dunaliella salina (Teod.) | |
| Markina | Flow cytometry as a method to study marine unicellular algae: development, problems, and prospects | |
| Grigoryeva | Studying Cyanobacteria by Means of Fluorescence Methods: A | |
| Zhang et al. | Effects of interspecific interactions between Microcystis aeruginosa and Chlorella pyrenoidosa on their growth and physiology | |
| Eleršek | The advantages of flow cytometry in comparison to fluorometric measurement in algal toxicity test | |
| Hofstraat et al. | Flow cytometry and other optical methods for characterization and quantification of phytoplankton in seawater | |
| Rout et al. | Reactive oxygen species detection of drosophila cells by flow cytometry | |
| JP2007248050A (ja) | 生細胞の微弱光による解析を行なうための細胞の処理方法および解析方法 | |
| Arora et al. | Concepts and techniques for the study of algae | |
| Steinberg et al. | Ataxonomic assessment of phytoplankton integrity by means of flow cytometry | |
| Carranza et al. | Fluorescence microscopy and flow cytofluorometry of reactive oxygen species | |
| Petrescu et al. | Toxicity evaluation by flow cytometric analysis of nanoparticles using the unicellular alga Chlorella |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200627 |