RU2691853C2 - Method for proton-resistant tumor cell culture - Google Patents
Method for proton-resistant tumor cell culture Download PDFInfo
- Publication number
- RU2691853C2 RU2691853C2 RU2018143005A RU2018143005A RU2691853C2 RU 2691853 C2 RU2691853 C2 RU 2691853C2 RU 2018143005 A RU2018143005 A RU 2018143005A RU 2018143005 A RU2018143005 A RU 2018143005A RU 2691853 C2 RU2691853 C2 RU 2691853C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- irradiation
- cells
- protons
- radiation therapy
- dose
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 abstract description 13
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000693 radiobiological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011127 radiochemotherapy Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002105 relative biological effectiveness Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 8
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- -1 carbon ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 1
- 208000010667 Carcinoma of liver and intrahepatic biliary tract Diseases 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007801 sublethal irradiation Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N5/00—Radiation therapy
- A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к онкологии и лучевой терапии и направлено на получение фундаментальных и прикладных данных по реакции опухолевых клеток рецидивов и метастазов, сформированных после ранее проведенного неэффективного курса лучевой терапии к повторному курсу лучевой терапии протонами.The invention relates to oncology and radiation therapy and is aimed at obtaining fundamental and applied data on the reaction of tumor cells to relapses and metastases, formed after a previously conducted ineffective course of radiation therapy to a repeated course of radiation therapy by protons.
Успех лучевой терапии злокачественных новообразований напрямую зависит от степени радиочувствительности опухолевых клеток. Поэтому исследования, направленные на изучение радиорезистентности опухолевых клеток, имеют решающее значение для разработки более эффективных методов лечения.The success of radiation therapy of malignant tumors directly depends on the degree of radiosensitivity of tumor cells. Therefore, research aimed at studying the radioresistance of tumor cells is crucial for the development of more effective treatments.
Известен способ получения резистентных клеточных линий (Jing, Z. et al. Reverse resistance to radiation in KYSE-150R esophageal carcinoma cell after epidermal growth factor receptor signal pathway inhibition by cetuximab / Z. Jing, L. Gong, C.Y. Xie, L. Zhang, H.F. Su, X. Deng, S.X. Wu // Radiotherapy and Oncology. 2009. V. 93. P. 468-473), где облучение опухолевых клеток карциномы пищевода человека проводили рентгеновским излучением, после чего обновляли питательную среду и культивировали клетки. Процедуру облучения повторяли 12 раз (1 Гр 3 раза, 2 Гр 3 раза и 4 Гр 3 раза) два раза в неделю до общих доз 21 Гр в течение 1,5 месяцев до образования радиорезистентных клеток.A method for producing resistant cell lines is known (Jing, Z., et al. Reversing the cell line after the epidermal growth factor) in order to obtain cure fusions / Z. Jing, L. Gong, CY Xie, L. Zhang , HF Su, X. Deng, SX Wu // Radiotherapy and Oncology. 2009. V. 93. P. 468-473), where the irradiation of human esophageal carcinoma tumor cells was performed by X-ray radiation, after which the nutrient medium was renewed and the cells were cultured. The irradiation procedure was repeated 12 times (1 Gy 3 times, 2 Gy 3 times and 4 Gy 3 times) twice a week to total doses of 21 Gy for 1.5 months until the formation of radioresistant cells.
Известен еще один вариант получения резистентных клеток (Xie, L. et al. Fractionated irradiation induced radio-resistant esophageal cancer EC 109 cells seem to be more sensitive to chemotherapeutic drugs / L. Xie, X. Song, J. Yu, L. Wei, B. Song, X. Wang // Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2009), где клеточную линию сначала выращивали примерно до 60% монослоя, затем клетки подвергали воздействию рентгеновского излучения в дозе 10 Гр, после чего культивировали примерно до 60% монослоя и снова облучали в дозе 10 Гр. Фракционированное облучение продолжались до суммарной дозы 80 Гр. После чего была установлена радиоустойчивая клеточная сублиния.Another option for the production of resistant cells is known (Xie, L. et al. Fractionated irradiation induced by radio-resistant esophageal cancer EC 109 cells), X. Song, J. Yu, L. Wei , B. Song, X. Wang (Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2009), where the cell line was first grown to approximately 60% of the monolayer, then the cells were exposed to X-rays at a dose of 10 Gy, and then cultured to approximately 60% monolayer and again irradiated at a dose of 10 Gy. Fractionated irradiation continued to a total dose of 80 Gy. After that, a radio-resistant cell subline was installed.
Похожая методика описана еще в одном исследовании (Fukuda K, Sakakura С, Miyagawa K, Kuriu Y, Kin S, Nakase Y, Hagiwara A, Mitsufuji S, Okazaki Y, Hayashizaki Y, Yamagishi H. Differential gene expression profiles of radioresistant oesophageal cancer cell lines established by continuous fractionated irradiation. Br J Cancer. 2004 Oct 18; 91(8): 1543-50), где линии клеток рака пищевода выращивали примерно до 50% монослоя и подвергали воздействию рентгеновского излучения в дозе 2 Гр и культивировали до 90% монослоя, затем пересевали в новые флаконы. Процедура повторялась до суммарной дозы 60 Гр.A similar technique is described in another study (Fukuda K, Sakakura C, Miyagawa K, Kuriu Y, Kin S, Nakase Y, Hagiwara A, Mitsufuji S, Okazaki Y, Hayashizaki Y, Yamagishi H. Differential gene of radioresistant oesophageal cancer cell lines established by continuous fractionated irradiation. Br J Cancer. 2004 Oct. 18; 91 (8): 1543-50), where esophageal cancer cell lines were grown to approximately 50% of the monolayer and were exposed to X-rays at a dose of 2 Gy and cultured to 90% monolayer, then transferred to new vials. The procedure was repeated until a total dose of 60 Gy.
Известен способ получения радиорезистентных опухолевых клеток человека (Shimura, Т. et al. Acquired radioresistance of human tumor cells by DNA-PK/AKT/GSK3b mediated cyclin Dl overexpression / T. Shimura, S. Kakuda, Y. Ochiai, H. Nakagawa, Y. Kuwahara, Y. Takai, J. Kobayashi, K. Komatsu, M. Fukumoto // Oncogene. 2010. N. 29. P. 4826-4837), где клетки подвергали воздействию фракционированного облучения рентгеном в дозе 0,5 Гр каждые 12 ч, 6 дней в неделю.A method of obtaining radioresistant human tumor cells is known (Shimura, T. et al. Acquired radioresistance of human tumor cells by DNA-PK / AKT / GSK3b mediated cyclin Dl overexpression / T. Shimura, S. Kakuda, Y. Ochiai, H. Nakagawa, Y. Kuwahara, Y. Takai, J. Kobayashi, K. Komatsu, M. Fukumoto // Oncogene. 2010. N. 29. P. 4826-4837), where cells were exposed to fractionated x-ray irradiation at 0.5 Gy every 12 hours, 6 days a week.
Общим недостатком представленных выше способов является тип воздействия к которому вырабатывается резистентность - рентгеновское излучение.A common disadvantage of the above methods is the type of exposure to which resistance is produced - X-rays.
Известны и другие способы получения радиорезистентных клеток, так в работе Y. Kuwahara et al. (Kuwahara Y, Li L, Baba T, Nakagawa H, Shimura T, Yamamoto Y, Ohkubo Y, Fukumoto M. Clinically relevant radioresistant cells efficiently repair DNA double-strand breaks induced by X-rays. Cancer Sci. 2009 Apr; 100(4):747-52. doi: 10.1111/j.1349-7006.2009.01082.x. Epub 2009 Feb 2), облучение клеток карциномы печени проводили в дозе 0,5 Гр каждые 12 ч в течение более 6 лет; суммарная доза составляла более 1600 Гр. В другом исследовании (Qing, Y. et al. Microarray analysis of DNA damage repair gene expression profiles in cervical cancer cells radioresistant to 252Cf neutron and X-rays / Y. Qing, X.Q. Yang, Z.Y. Zhong, X. Lei, J.Y. Xie, M.X. Li, D.B. Xiang, Z.P. Li, Z.Z. Yang, G. Wang, D. Wang // BMC Cancer. 2010) для получения двух радиорезистентных клеток линии HeLa в течение 8 месяцев подвергали их непрерывному сублетальному облучению общей дозой 75 Гр с помощью нейтронного излучения 252Cf и рентгеновского излучения. Так же известно исследование, где в режиме фракционирования с дозой 2 Гр в день и 5 дней в неделю в течение 7 месяцев получали резистентные клетки (Wei, K. et al. Radioresistant cell strain of human fibrosarcoma cells obtained after long-term exposure to x-rays / K. Wei, R Kodym., J. Cui-Zheng // Radiat Environ Biophys. 1998. N. 37. P. 133-137).There are other ways to obtain radioresistant cells, as in Y. Kuwahara et al. (Kuwahara Y, Li L, Baba T, Nakagawa H, Shimura T, Yamamoto Y, Ohkubo Y, Fukumoto M. Clinical Exposure X-rays. Cancer Sci. 2009 Apr; 100 ( 4): 747-52. Doi: 10.1111 / j.1349-7006.2009.01082.x.Epub 2009 Feb 2), irradiation of liver carcinoma cells was performed at a dose of 0.5 Gy every 12 hours for more than 6 years; total dose was more than 1600 Gy. In another study (Qing, Y. et al. Micro radiological analysis of radioresistant radiograms to 252Cf neutron and X-rays / Y. MX Li, DB Xiang, ZP Li, ZZ Yang, G. Wang, D. Wang (BMC Cancer. 2010) to obtain two radioresistant HeLa cells for 8 months were subjected to their continuous sublethal irradiation with a total dose of 75 Gy using neutron radiation 252 Cf and X-rays. It is also known a study where, in fractionation mode, with a dose of 2 Gy per day and 5 days per week for 7 months, resistant cells were obtained (Wei, K. et al. Obtained after long-term exposure to x -rays / K. Wei, R Kodym., J. Cui-Zheng // Radiat Environ Biophys. 1998. N. 37. P. 133-137).
Среди недостатков данных методов не только тип воздействия к которому вырабатывается резистентность, но и большие временные затраты для достижения результата.Among the shortcomings of these methods is not only the type of exposure to which resistance is produced, but also the large time costs to achieve a result.
Наиболее близким к заявляемому изобретению - прототипом, является способ предложенный K. Sato и др., где для выработки резистентных клонов использовали клетки плоскоклеочной карциномы NR-S1, которые облучали рентгеновским излучением в дозе 10 Гр 1 раз в две недели (6 Гр⋅экв в неделю) до суммарной дозы 60 Гр (72 Гр⋅экв). После окончательного облучения клетки культивировали в течение 4 недель до тестирующего воздействия рентгеновским излучением и ионами углерода (Sato, K. et al. Heterochromatin domain number correlates with X-ray and carbon-ion radiation resistance in cancer cells / K. Sato, T. Imai, R. Okayasu, T. Shimokawa // Radiation Research. 2014).The closest to the claimed invention, the prototype, is the method proposed by K. Sato et al., Where NR-S1 squamous-cell carcinoma cells were used to develop resistant clones, which were irradiated with X-rays at a dose of 10 Gy once every two weeks (6 GrVeq in week) to a total dose of 60 Gy (72 Grzkv). After the final irradiation, the cells were cultured for 4 weeks prior to the test exposure to X-rays and carbon ions (Sato, K. et al. Heterochromatin number of cells). Sato, T. Imai , R. Okayasu, T. Shimokawa // Radiation Research. 2014).
Как и в случае выше описанных подходов недостатком данного способа является факт выработки резистентности к ионам углерода. Указанный вид воздействия, так же как и протоны относится к тяжелым заряженным частицам, но обладает значительно более высоким значением относительной биологической эффективности, что не позволяет считать данные для ионов углерода, пригодными для прогнозирования биологических эффектов облучения протонами.As in the case of the above approaches, the disadvantage of this method is the fact of the development of resistance to carbon ions. This type of exposure, as well as protons, belongs to heavy charged particles, but has a significantly higher value of relative biological efficiency, which does not allow us to consider the data for carbon ions suitable for predicting the biological effects of proton irradiation.
В результате поиска по источникам патентной и научно-технической информации не выявлено сведений о способе формирования радиорезистентной культуре опухолевых клеток, аналогичной заявляемой.As a result of the search by the sources of patent and scientific and technical information, no information was found on the method of forming a radioresistant tumor cell culture, similar to the declared one.
Технический результат направлен на создание культуры клеток с резистентностью к протонам, сформированной длительным фракционированным облучением протонами.The technical result is aimed at creating a culture of cells with resistance to protons, formed by prolonged fractionated irradiation with protons.
Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается за счет того, что также как и в известном способе проводят облучение в дозе 6 Гр⋅экв, с учетом величины относительной биологической эффективности.This technical result in the implementation of the invention is achieved due to the fact that as well as in the known method, the irradiation is carried out at a dose of 6 GrV, taking into account the magnitude of the relative biological effectiveness.
Особенность заявляемого способа заключается в том, что культуру клеток подвергают облучению электронами 1 раз в неделю до суммарной дозы 60 Гр или протонами 1 раз в неделю до суммарной дозы 70 Гр (84 Гр⋅экв).The peculiarity of the proposed method lies in the fact that the cell culture is subjected to electron irradiation 1 time per week to a total dose of 60 Gy or protons 1 time per week to a total dose of 70 Gy (84 Gr-eq).
Изобретение поясняется подробным описанием, примерами исполнения и иллюстрациями, на которых изображено:The invention is illustrated by a detailed description, examples of execution and illustrations, which depict:
Фиг. 1 - Зависимость выживаемости клеток В16 после облучения протонами: В16 - родительская культура клеток; В16-е6 - сублиния, подвергнутая предварительному фракционированному облучению электронами.FIG. 1 - The dependence of the survival of B16 cells after irradiation with protons: B16 is the parental cell culture; B16-e6 - sublineia, subjected to pre-fractionated electron irradiation.
Фиг. 2 - Моделирование облучения фракциями по 1, 2 и 4 Гр на основе полученных данных для родительской линии В-16 (пунктирная линия, «p») и ее радиорезистентной сублинии (сплошная линия, «e6-p»).FIG. 2 - Simulation of irradiation with fractions of 1, 2 and 4 Gy based on the data obtained for the parent line B-16 (dashed line, “p”) and its radioresistant subline (solid line, “e6-p”).
Фиг. 3 - Выживаемость клеток родительской линии и резистентных клонов при воздействии тестирующего облучения в дозе 4 Гр: белый столбик - родительские клетки, серый - резистентная к протонам сублиния.FIG. 3 - Survival of cells of the parental line and resistant clones when exposed to test radiation at a dose of 4 Gy: white bar — parent cells, gray — proton-resistant subline.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Культуру клеток мышиной меланомы В16 подвергают облучению электронами в разовой дозе (РОД) 6 Гр (1 раз в неделю) до суммарной дозы (СОД) 60 Гр или протонами в дозе 5 Гр (1 раз в неделю) суммарной дозы 70 Гр. В день облучения клетки снимают с пластика смесью растворов версена (0,02%) и трипсина (0,25%) в соотношении 1:1, ресуспендируют в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки, до получения одиночных клеток. Для облучения клеточную суспензию разливают в микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл (Genfollower, Китай) по 1,3 мл. После облучения клетки подсчитывают в камере Горяева (Минимед, Россия) и высевают в количестве 200 тысяч на чашку Петри диаметром 35 мм (Corning, США). Пересев клеток и замена среды осуществляют при достижении плотности монослоя 90%. Между облучениями клетки культивируют в монослое в чашках Петри диаметром 35 мм (Corning, США) в среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Франция) и гентамицина в количестве 0,01 мг/мл среды в СО2-инкубаторе (МСО-5АС, Sanyo, Япония) при температуре +37°C и 5% содержании CO2.The cell culture of murine B16 melanoma is subjected to single-dose irradiation by electrons of 6 Gy (1 time per week) to a total dose (SOD) of 60 Gy or protons at a dose of 5 Gy (1 time per week) of a total dose of 70 Gy. On the day of irradiation, the cells are removed from the plastic with a mixture of solutions of versen (0.02%) and trypsin (0.25%) in a 1: 1 ratio, resuspended in RPMI-1640 medium containing 10% serum to obtain single cells. For irradiation, the cell suspension is poured into 1.5 ml microcentrifuge tubes of the type Eppendorf with a volume of 1.5 ml (Genfollower, China). After irradiation, cells are counted in a Goryaev chamber (Minimed, Russia) and seeded in an amount of 200 thousand per 35 mm Petri dish (Corning, USA). Cell subcultures and medium replacement are carried out when the monolayer density reaches 90%. Between irradiation, cells are cultured in monolayer in Petri dishes with a diameter of 35 mm (Corning, USA) in RPMI-1640 medium (PanEko, Russia) with the addition of 10% fetal calf serum (Biosera, France) and gentamicin in an amount of 0.01 mg / ml medium in the CO 2 incubator (MSO-5AS, Sanyo, Japan) at a temperature of + 37 ° C and 5% CO 2 content.
Выявленный эффект приобретенной опухолевыми клетками радиорезистентности к протонам может иметь ключевое значение в лучевой терапии с применением этого излучения. Это можно показать моделированием ответа клеток на большое количество фракций на основании кривых, представленных на Фиг. 1. При этом дозовая зависимость состоит из отдельных участков длиной в величину разовой дозы сеанса лучевой терапии. Моделирование для разовых доз 1, 2 и 4 Гр до суммарной дозы 20 Гр (20, 10 и 5 фракций соответственно) (Фиг. 2). Наибольшее отличие наблюдается при фракции в 1 Гр и составляет 5,5 Гр. С увеличением дозы за фракцию (переход к гипофракционированию) разница в эффективности воздействия уменьшается. Таким образом, даже незначительное (но статистически значимое) отклонение дозовой зависимости (при однократном облучении) ранее облученных клеток от кривой для исходных клеток может привести к значительному снижению эффективности облучения при фракционированном воздействии, принятом в лучевой терапии.The revealed effect of acquired proton radioresistance by tumor cells may be of key importance in radiation therapy using this radiation. This can be shown by simulating the response of cells to a large number of fractions based on the curves shown in FIG. 1. At the same time, dose dependence consists of separate sections with a length of one dose of a radiation therapy session. Simulation for single doses of 1, 2 and 4 Gy to a total dose of 20 Gy (20, 10 and 5 fractions, respectively) (Fig. 2). The greatest difference is observed at a fraction of 1 Gy and is 5.5 Gy. With an increase in the dose per fraction (transition to hypofractionation), the difference in the effectiveness of the effect decreases. Thus, even a slight (but statistically significant) deviation of the dose dependence (with single irradiation) of previously irradiated cells from the curve for the original cells can lead to a significant decrease in the efficiency of irradiation with fractionated exposure, adopted in radiation therapy.
Предлагаемый способ подтверждается конкретными примерами использования.The proposed method is confirmed by specific examples of use.
Пример 1. После последнего фракционированного облучения клетки культивировали в течение двух недель. Затем проводили исследование радиочувствительности клеток получивших суммарную дозу электронов 60 Гр к действию протонного излучения методом клоногенной активности. Дозы тестирующего облучения протонами составили 4, 6, 8 Гр. До и после облучения клетки находились на льду. Сравнение проводили с родительской линией, клетки которой облучали теми же излучениями без предварительного воздействия. По результатам исследования был построен график зависимости выживаемости клеток В16 после облучения протонами (Фиг. 1) из которого видно, что кривая выживаемости после облучения протонами располагается ниже кривой выживаемости, где клетки были подвергнуты фракционированному облучению электронами. Применение парного критерия Стьюдента позволило судить о наличии статистически значимого различия в отклике на облучения двух сублиний В16 (Р<0.05).Example 1. After the last fractionated irradiation, cells were cultured for two weeks. Then, a study was made of the radiosensitivity of cells that received a total dose of electrons of 60 Gy to the action of proton radiation by the method of clonogenic activity. The doses of testing proton irradiation were 4, 6, 8 Gy. Before and after irradiation, cells were on ice. The comparison was carried out with the parental line, the cells of which were irradiated with the same radiation without prior exposure. According to the study, a graph of survival of B16 cells after irradiation with protons (Fig. 1) was shown, from which it is evident that the survival curve after irradiation with protons is below the survival curve, where cells were subjected to fractionated electron irradiation. The use of the Student’s paired criterion made it possible to judge the presence of a statistically significant difference in the response to the exposures of two B16 sublines (P <0.05).
Пример 2. После окончания фракционированного облучения протонами в суммарное дозе 70 Гр клетки культивировали в течение двух недель по стандартной методике. Затем проводили исследование радиочувствительности клеток к действию протонного излучения методом клоногенной активности. Доза тестирующего воздействия составила 4 Гр. Согласно представленным результатам (Фиг. 3) и данным применения критерия Стьюдента, клетки подверженные длительному фракционированному облучению протонами приобрели резистентность к последующему воздействию протонами.Example 2. After the termination of fractionated irradiation with protons at a total dose of 70 Gy, the cells were cultured for two weeks by the standard method. Then, a study was made of the radiosensitivity of cells to the action of proton radiation by the method of clonogenic activity. The dose of the test exposure was 4 Gy. According to the presented results (Fig. 3) and the use of Student's t-test, cells subjected to prolonged fractionated proton irradiation have become resistant to subsequent exposure to protons.
Таким образом, предложенный способ позволяет эффективно получать резистентную клеточную культуру клеток, преимущество которой заключается в ее устойчивости к воздействию протонного излучения.Thus, the proposed method allows to effectively obtain a resistant cell culture of cells, the advantage of which lies in its resistance to the effects of proton radiation.
Полученная культура клеток может быть использована для проведения сравнительных радиобиологических исследований, направленных на выяснение и уточнение механизмов клеточной радиорезистентности, скрининг противоопухолевых препаратов в аспекте их применения в схемах химиолучевой терапии и на разработку эффективных схем лечения пациентов с рецидивами и метастазами, возникшими после ранее проведенного (неэффективного) курса лучевой терапии.The obtained cell culture can be used to conduct comparative radiobiological studies aimed at clarifying and clarifying the mechanisms of cellular radioresistance, screening of anticancer drugs in the aspect of their use in chemo-radiotherapy regimens and on developing effective treatment regimens for patients with relapses and metastases that have arisen after a previously conducted (ineffective a) course of radiation therapy.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018143005A RU2691853C2 (en) | 2018-12-05 | 2018-12-05 | Method for proton-resistant tumor cell culture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018143005A RU2691853C2 (en) | 2018-12-05 | 2018-12-05 | Method for proton-resistant tumor cell culture |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018143005A RU2018143005A (en) | 2019-01-15 |
| RU2018143005A3 RU2018143005A3 (en) | 2019-05-22 |
| RU2691853C2 true RU2691853C2 (en) | 2019-06-18 |
Family
ID=65013902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018143005A RU2691853C2 (en) | 2018-12-05 | 2018-12-05 | Method for proton-resistant tumor cell culture |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2691853C2 (en) |
-
2018
- 2018-12-05 RU RU2018143005A patent/RU2691853C2/en active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Katsutoshi Sato et al, Heterochromatin Domain Number Correlates with X-Ray and Carbon-IonRadiation Resistance in Cancer Cells, RADIATION RESEARCH 182, 408-419 (2014). * |
| Katsutoshi Sato et al, Heterochromatin Domain Number Correlates with X-Ray and Carbon-IonRadiation Resistance in Cancer Cells, RADIATION RESEARCH 182, 408-419 (2014). Н.В.Наседкина и др. ВЛИЯНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО РАДИАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОБЛУЧЕНИЯ ФОТОНАМИ И БЫСТРЫМИ НЕЙТРОНАМИ КЛЕТОК ЛИНИИ В-16, Техногенные системы и экологический риск, I Международная (XIV Региональная) научная конференция, 20-21 апреля 2017, сс.272-273. Wei, K. et al. Radioresistant cell strain of human fibrosarcoma cells obtained after long-term exposure to x-rays, Radiat Environ Biophys. 1998. no. 37, pp. 133-137. Y. Kuwahara et al. Clinically relevant radioresistant cells efficiently repair DNA double-strand breaks induced by X-rays. Cancer Sci. 2009 Apr; 100(4):747-752. Бекетов Е.Е. и др. Зависимость эффективности одновременного воздействия гамма-квантов и нейтронов с энергией 14 МэВ от вклада плотноионизирующего компонента, Радиация и риск, Бюллетень Национального радиационно-эпидемиологическог * |
| Н.В.Наседкина и др. ВЛИЯНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО РАДИАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОБЛУЧЕНИЯ ФОТОНАМИ И БЫСТРЫМИ НЕЙТРОНАМИ КЛЕТОК ЛИНИИ В-16, Техногенные системы и * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2018143005A (en) | 2019-01-15 |
| RU2018143005A3 (en) | 2019-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Friedl et al. | Radiobiology of the FLASH effect | |
| Bernier et al. | Radiation oncology: a century of achievements | |
| Ando et al. | Biological characteristics of carbon-ion therapy | |
| Suzuki et al. | Relative biological effectiveness for cell-killing effect on various human cell lines irradiated with heavy-ion medical accelerator in Chiba (HIMAC) carbon-ion beams | |
| Li et al. | Down‐regulation of microRNA 106b is involved in p21‐mediated cell cycle arrest in response to radiation in prostate cancer cells | |
| Rzeszowska-Wolny et al. | Ionizing radiation-induced bystander effects, potential targets for modulation of radiotherapy | |
| Belli, D. Bettega, P. Calzolari, F. Cera, R. Cherubini, M. Dalla Vecchia, M. Durante, S. Favaretto, G. Gialanella, G. Grossi | Inactivation of human normal and tumour cells irradiated with low energy protons | |
| Iwadate et al. | High linear energy transfer carbon radiation effectively kills cultured glioma cells with either mutant or wild-type p53 | |
| Ando et al. | Biological gain of carbon-ion radiotherapy for the early response of tumor growth delay and against early response of skin reaction in mice | |
| Nicolay et al. | Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy | |
| Onishi et al. | High linear energy transfer carbon-ion irradiation increases the release of the immune mediator high mobility group box 1 from human cancer cells | |
| Tsuboi et al. | Charged-particle mutagenesis: I. cytotoxic and mutagenic effects of high-LET charged iron particles on human skin fibroblasts | |
| CN107779438B (en) | Radiotherapy-tolerant lung cancer cell line and construction method and application thereof | |
| Ma et al. | Combining carbon ion irradiation and non-homologous end-joining repair inhibitor NU7026 efficiently kills cancer cells | |
| Li et al. | Efficacy of mesenchymal stem cells in the treatment of gastrointestinal malignancies | |
| Jin et al. | New understanding of the low-dose radiation-induced hormesis | |
| Zaboronok et al. | Proton beam irradiation stimulates migration and invasion of human U87 malignant glioma cells | |
| RU2691853C2 (en) | Method for proton-resistant tumor cell culture | |
| CN110878284A (en) | Model of lung cancer cell surviving or resisting by equal difference dose gradient radiation and construction and application | |
| Sato et al. | Repeated photon and C-ion irradiations in vivo have different impact on alteration of tumor characteristics | |
| Ahmed et al. | Differences in mRNA and microRNA microarray expression profiles in human colon adenocarcinoma HT-29 cells treated with either Intensity-modulated Radiation Therapy (IMRT), or Conventional Radiation Therapy (RT) | |
| Ding et al. | Evaluation of the response of HNSCC cell lines to γ-rays and 12C ions: can radioresistant tumors be identified and selected for 12c ion radiotherapy? | |
| Brahme | Physical, Biological, and Clinical Merits of High Energy Boron Ions for Radiation Therapy | |
| Hill et al. | Promotion, dose rate, and repair processes in radiation-induced neoplastic transformation | |
| Chernyi et al. | Search of MicroRNAs regulating the receptor status of breast cancer in silico and experimental confirmation of their expression in tumors |