RU2691413C1 - Method for determining bacterial endotoxin in biological fluids - Google Patents
Method for determining bacterial endotoxin in biological fluids Download PDFInfo
- Publication number
- RU2691413C1 RU2691413C1 RU2017145802A RU2017145802A RU2691413C1 RU 2691413 C1 RU2691413 C1 RU 2691413C1 RU 2017145802 A RU2017145802 A RU 2017145802A RU 2017145802 A RU2017145802 A RU 2017145802A RU 2691413 C1 RU2691413 C1 RU 2691413C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- samples
- lal
- concentration
- reagent
- reaction
- Prior art date
Links
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 title claims description 14
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 claims abstract description 37
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 claims abstract description 14
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 5
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 19
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000239224 Tachypleus tridentatus Species 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000009998 heat setting Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- 241000239205 Merostomata Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 108010045487 coagulogen Proteins 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000007893 endotoxin activity Effects 0.000 description 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к области медицины и клинической лабораторной диагностики. Более подробно изобретение относится к способу (методу) определения уровня эндотоксина, основанному на реакции in vitro между бактериальным эндотоксином (БЭ) и ЛАЛ-реактивом в биологических жидкостях (плазме крови и моче и т.п.).The invention relates to the field of medicine and clinical laboratory diagnostics. The invention relates in more detail to a method (method) for determining the level of endotoxin based on an in vitro reaction between bacterial endotoxin (BE) and LAL-reagent in biological fluids (plasma and urine, etc.).
Уровень техникиThe level of technology
Известен ряд способов (методов) определения бактериальных эндотоксинов (БЭ) в биологических жидкостях, например, по следующим патентным документам: патенту РФ RU 2325645 (МПК G01N 33/48, G01N 33/579, опубл. 27.05.2008 Бюл. №15), японскому патенту JP 4761448 (МПК G01N 33/48; G01N 33/579, опубл. 2011-08-31), японской патентной заявке JP 2003232794 (МПК G01N 33/579, опубл. 2003-08-22), китайскому патенту CN 1696636 (МПК G01N 1/28, опубл. 2005-11-16), международной РСТ-заявке WO 2009005231 (МПК G01N 33/49, G01N 33/579, опубл. 2009-01-08).The number of known methods (methods) for the determination of bacterial endotoxins (EB) in biological fluids, for example, in the following patent documents: RF patent RU 2325645 (IPC G01N 33/48, G01N 33/579, publ. 27.05.2008 Bul. No. 15), Japanese patent JP 4761448 (IPC G01N 33/48; G01N 33/579, publ. 2011-08-31), Japanese patent application JP 2003232794 (IPC G01N 33/579, publ. 2003-08-22), Chinese patent CN 1696636 (IPC G01N 1/28, publ. 2005-11-16), international PCT application WO 2009005231 (IPC G01N 33/49, G01N 33/579, publ. 2009-01-08).
По патенту RU 2325645 СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТАЛ-ТЕСТА, В КОТОРОМ РЕГИСТРАЦИЮ ОБРАЗОВАНИЯ ПОЛИМЕРА КОАГУЛОГЕНА ПРОИЗВОДЯТ ПО СТРУКТУРЕ ОБРАЗУЮЩИХСЯ БЕЛКОВЫХ ФРАКТАЛОВ, проводят в биологических средах и лекарственных средствах. Сущность способа: смешивают тахплеус лизат (ТАЛ) и разведения исследуемого образца нанесением на апирогенную поверхность, инкубируют с закрытой крышкой в течение 30…60 мин при 37°С, выдерживают апирогенную поверхность в термостате при открытой крышке до высыхания капель смеси реагентов, регистрируют образование полимера коагулогена под увеличением по образующимся белковым фракталам и при их наличии определяют активность эндотоксина в последнем разведении.According to patent RU 2325645 METHOD FOR DETERMINING THE CONTENT bacterial endotoxins WITH TAL-test, wherein the registration form polymers coagulogy made on Protein structure forms fractals, carried out in biological fluids and medicines. The essence of the method: mix tahpleus lysate (TAL) and dilution of the test sample by drawing on a pyrogen-free surface, incubate with the lid closed for 30 ... 60 min at 37 ° C, maintain pyrogen-free surface in a thermostat with the lid open until the drops of the reagent mixture dry, register polymer formation coagulogen under the increase in the resulting protein fractals and, if present, determine the activity of endotoxin in the last dilution.
Недостатком способа является его невысокая точность из-за субъективного визуального контроля результатов теста, в отличие от измерения оптической плотности в результате хромогенного анализа, использующегося в предлагаемом способе. Кроме того, использование ТАЛ-реагента (лизат мечехвостов вида Tachypleus tridentatus) также накладывает определенные ограничения на его применение, в связи со сложностью его приобретения на территории РФ (необходимо ждать поставок из Китая), в отличие от ЛАЛ-реактива, который широко и активно применяется повсеместно.The disadvantage of this method is its low accuracy due to the subjective visual control of the test results, in contrast to the measurement of optical density as a result of chromogenic analysis used in the proposed method. In addition, the use of TAL-reagent (lysate of horseshoe crabs of the species Tachypleus tridentatus) also imposes certain restrictions on its use, due to the complexity of its acquisition in the territory of the Russian Federation (it is necessary to wait for deliveries from China), unlike LAL-reagent, which is widely and actively applied everywhere.
Способ по патенту JP 4761448 BLOOD ENDOTOXIN MEASURING METHOD направлен на количественное измерение эндотоксина в крови, которое не может быть получено обычными методами, и уточняет связь между количеством эндотоксина в крови и клиническим состоянием. В способе отделяются только эритроциты и удаляются из цельной крови, а количество эндотоксина, содержащегося в оставшейся частице крови, измеряется, тем самым корректируя эндотоксин, содержащийся в лейкоцитах и эндотоксине, содержащемся в плазме.The method according to JP 4761448 BLOOD ENDOTOXIN MEASURING METHOD aims to quantify endotoxin in the blood, which cannot be obtained by conventional methods, and clarifies the relationship between the amount of endotoxin in the blood and the clinical condition. In the method, only red blood cells are separated and removed from whole blood, and the amount of endotoxin contained in the remaining blood particle is measured, thereby correcting the endotoxin contained in leukocytes and endotoxin contained in plasma.
Недостатком способа является возможность его применения исключительно для анализа крови, в отличие от предлагаемого способа, позволяющего оценивать содержание БЭ в разных биологических жидкостях.The disadvantage of this method is the possibility of its use exclusively for blood analysis, in contrast to the proposed method, allowing to evaluate the content of BE in various biological fluids.
Способ по патентной заявке JP 2003232794 METHOD FOR MEASURING ENDOTOXIN ACTIVITY предназначен для точного и быстрого измерения активности эндотоксина методом ЛАЛ-теста (реагент Limulus Amebocyte Lysate (лимулус лизат, сокращенно ЛАЛ) с применением предварительной обработки образца, которая включает в себя стадии добавления поверхностно-активного вещества в образец с последующей ультразвуковой обработкой. Поверхностно-активное вещество представляет собой анионное вещество, его концентрация в образце составляет менее 0,01%. Измерение содержания бактериального эндотоксина проводят методом турбидиметрического ЛАЛ-теста.The method according to patent application JP 2003232794 METHOD FOR MEASURING ENDOTOXIN ACTIVITY is designed to accurately and quickly measure the activity of endotoxin using the LAL test (Limulus Amebocyte Lysate reagent (limulus lysate, abbreviated LAL) using a sample pretreatment that includes the steps of adding a surfactant substances in the sample, followed by ultrasonic treatment. Surfactant is an anionic substance, its concentration in the sample is less than 0.01%. Measurement of the content of bacterial endotoxin carried out by turbidimetric LAL test.
Особенностью этого способа является специфичная предварительная обработка, существенно отличающаяся от обработки, используемой в предлагаемом способе.A feature of this method is a specific pretreatment, significantly different from the processing used in the proposed method.
Аналог по подготовке образцов крови для тестирования БЭ - способ по патенту CN 1696636 METHOD FOR PREPARING BLOOD FOR TESTING ENDOTOXIN OF BACTERIA включает приготовление сыворотки крови, добавление нескольких раз 0,1…0,3% qulatong (Х-100) в небольшое количество сыворотки крови, нагревание в водяной бане, обработку в ледяной бане, разбавление апирогенной водой и смешивание небольшого количества разбавленной жидкости с таким же количеством реагента лизата Tachypleus tridentatus для получения кровяного продукта, который используется для обнаружения бактериальных эндотоксинов.Analogue on the preparation of blood samples for BE testing - method according to CN 1696636 METHOD FOR PREPARING BLOOD FOR TESTING ENDOTOXIN OF BACTERIA involves the preparation of blood serum, adding several times 0.1 ... 0.3% qulatong (X-100) to a small amount of blood serum , heating in a water bath, processing in an ice bath, diluting with pyrogen-free water, and mixing a small amount of diluted liquid with the same amount of Tachypleus tridentatus lysate reagent to obtain a blood product that is used to detect bacterial endotoxins.
Недостатком способа является сложность предварительной обработки образцов для исследования, а также узость его применения только в крови, а не в разных биологических жидкостях, как в предлагаемом способе. Кроме того, также, как и в патенте RU 2325645 в качестве реагента для определения используется лизат, выделенный из мечехвостов вида Tachypleus tridentatus, в отличие от применяемого в нашем изобретении лизата амебоцитов Limulus Polyphemus, являющегося более распространенным и легкодоступным реагентом.The disadvantage of this method is the complexity of pre-treatment of samples for research, as well as the narrowness of its use only in the blood, and not in different biological fluids, as in the proposed method. In addition, also, as in patent RU 2325645, the lysate isolated from the horseshoe crab species Tachypleus tridentatus is used as a reagent, in contrast to the Limulus Polyphemus amoebocyte lysate used in our invention, which is the more common and readily available reagent.
Способ по РСТ-заявке WO 2009005231 METHODS FOR QUANTITATIVELY DETERMINING ENDOTOXIN (количественного определения эндотоксина в биологическом образце) включает в себя этапы: (а) получение биологического образца; (б) термическая обработка биологического образца; (в) получение реакционного раствора путем добавления ЛАЛ-реагента (реагента Limulus Amebocyte Lysate (сокращенно ЛАЛ) в инактивированный биологический образец; и (г) измерение значения оптической плотности реакционного раствора после определенного времени реакции или измерения времени, когда раствор достигает заданного значения оптической плотности. С помощью изобретения можно определять количество эндотоксина в биологическом образце более точным и удобным образом.The PCT method of WO 2009005231 METHODS FOR QUANTITATIVELY DETERMINING ENDOTOXIN (quantitative determination of endotoxin in a biological sample) includes the steps of: (a) obtaining a biological sample; (b) heat treatment of a biological sample; (c) obtaining a reaction solution by adding LAL reagent (Limulus Amebocyte Lysate reagent (abbreviated LAL) to an inactivated biological sample; and (d) measuring the optical density of the reaction solution after a certain reaction time or measuring the time when the solution reaches the specified optical density Using the invention, it is possible to determine the amount of endotoxin in a biological sample in a more accurate and convenient manner.
Основным недостатком этого способа является использование турбидиметрического ЛАЛ-теста (кинетического и по конечной точке). Такая модификация ЛАЛ-теста требует дорогостоящего и узкоспецифичного оборудования - микропланшетного ридера для регистрации изменения оптической плотности, вызванной помутнением исследуемых образцов. В отличие от этого в предлагаемом способе определение содержания БЭ происходит при помощи хромогенного ЛАЛ-теста, что позволяет использовать любой лабораторный спектрофотометр.The main disadvantage of this method is the use of a turbidimetric LAL-test (kinetic and at the end point). Such a modification of the LAL-test requires expensive and highly specific equipment - a microplate reader to register changes in optical density caused by clouding of the samples under study. In contrast, in the proposed method, the determination of BE content is carried out using a chromogenic LAL test, which allows the use of any laboratory spectrophotometer.
Раскрытие изобретенияDISCLOSURE OF INVENTION
Задачей изобретения является разработка более универсального способа, пригодного для количественного определения БЭ в разных видах биологических жидкостей, в т.ч. в плазме крови и в моче, используя метод хромогенного ЛАЛ-теста для определения БЭ со специфичной предварительной обработкой образцов из разных видов биологических жидкостей. Преимуществом хромогенного метода анализа является отсутствие необходимости использовать дорогостоящее оборудование, а также высокая чувствительность и специфичность метода.The objective of the invention is to develop a more universal method suitable for the quantitative determination of BE in various types of biological fluids, including in the blood plasma and in the urine using the chromogenic LAL test to determine the BE with specific pretreatment of samples from different types of biological fluids. The advantage of the chromogenic method of analysis is the absence of the need to use expensive equipment, as well as the high sensitivity and specificity of the method.
Задача решается способом определения бактериального эндотоксина в биологических жидкостях, характеризующимся зависящей от вида биологической жидкости предварительной подготовкой образцов для последующего хромогенного ЛАЛ-теста, проведение реакции подготовленных образцов с ЛАЛ-реактивом и спектрофотометрическое определение концентрации бактериального эндотоксина в образцах после реакции с ЛАЛ-реактивом, при этом реакция образцов с ЛАЛ-реактивом включает: внесение в стерильные пробирки 100 мкл обработанных образцов биологических жидкостей, загрязненных эндотоксином, и добавление 100 мкл ЛАЛ-реактива (прим.: в реальных анализах заранее наведенные растворы с известными концентрациями БЭ используют в качестве калибровочной кривой. При анализе биологической жидкости больного, в которой необходимо определить содержание БЭ, она обрабатывается по методике, описанной в примерах осуществления способа. В результате определяется значение оптической плотности при длине волны 388 нм (этой длине волны соответствует максимум поглощения комплекса хромогенного ЛАЛ субстрата с БЭ), далее это значение сравнивается со значениями, полученными для конкретных концентраций эндотоксина, и делается вывод, сколько БЭ было в биологической жидкости больного). Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты; спектрофотометрическое определение концентрации бактериального эндотоксина в образцах включает измерение концентрации БЭ по показателю оптической плотности образца после ЛАЛ-теста на длине волны λ=388 нм. При этом в реальных анализах и моделирующих экспериментах всегда делается ЛАЛ тест на каждом образце не менее чем в 3 повторностях.The problem is solved by the method of determining bacterial endotoxin in biological fluids, characterized by preliminary preparation of samples for subsequent chromogenic LAL-test depending on the type of biological fluid, carrying out the reaction of the prepared samples with LAL reagent and spectrophotometric determination of the concentration of bacterial endotoxin in the samples after reaction with LAL reagent Thus, the reaction of samples with LAL-reagent includes: the introduction into sterile tubes 100 μl of the treated samples of biological endotoxin-contaminated fluids and the addition of 100 μl of LAL reagent (note: in real analyzes, pre-induced solutions with known concentrations of EB are used as a calibration curve. When analyzing a patient’s biological fluid, it is necessary to determine the BE content, it is processed by the method, described in the examples of the method. As a result, the value of optical density is determined at a wavelength of 388 nm (this wavelength corresponds to the absorption maximum of the complex of the chromogenic LAL substrate with B ), Then this value is compared with the values obtained for specific concentrations of endotoxin, and it is judged how many base elements were in a biological fluid of the patient). The tubes were thermostated for 1 hour at 37 ° C. To stop the reaction, 50 μl of 50% acetic acid was added to each tube; Spectrophotometric determination of the concentration of bacterial endotoxin in the samples includes the measurement of the concentration of BE in terms of the optical density of the sample after the LAL test at a wavelength λ = 388 nm. At the same time, in real analyzes and modeling experiments, the LAL test is always done on each sample in at least 3 replications.
Предварительная подготовка образцов из плазмы крови включает разбавление образцов плазмы крови физиологическим раствором в 10…100 раз и последующую термическую обработку при 45…85°С в течение 30…60 мин. При этом после проведения ЛАЛ-теста в ходе спектрофотометрического определения концентрации БЭ в образцах плазмы крови при помощи термической обработки и разведения возможно определение наличия БЭ в растворе с концентрацией БЭ на границе между 0,005 ЕЭ/мл и 0,010 ЕЭ/мл и с более высокими концентрациями БЭ.Preliminary preparation of samples from blood plasma includes dilution of blood plasma samples with saline 10 ... 100 times and subsequent heat treatment at 45 ... 85 ° C for 30 ... 60 minutes. At the same time, after performing the LAL test during spectrophotometric determination of BE concentration in blood plasma samples using heat treatment and dilution, it is possible to determine the presence of BE in a solution with BE concentration at the border between 0.005 EE / ml and 0.010 EE / ml and with higher BE concentrations .
Предварительная подготовка образцов из мочи включает экстракцию мочи при помощи хлорорганического растворителя, включающего, но не ограничивающегося одним из следующих: хлористый метилен, 1,2-дихлорэтан. При этом после проведения ЛАЛ-теста в ходе спектрофотометрического определения концентрации БЭ в образцах мочи при помощи экстракции хлор-органическим растворителем возможно определение наличия БЭ в растворе с концентрацией БЭ на границе между 1,00 ЕЭ/мл и 2,00 ЕЭ/мл и с более высокими концентрациями БЭ.Preliminary preparation of samples from urine involves the extraction of urine using an organochlorine solvent, including but not limited to one of the following: methylene chloride, 1,2-dichloroethane. At the same time, after carrying out the LAL-test during spectrophotometric determination of the concentration of EB in urine samples using extraction with a chloro-organic solvent, it is possible to determine the presence of EB in a solution with a concentration of EB at the border between 1.00 EU / ml and 2.00 EE / ml and higher concentrations of EB.
Идея предлагаемого способа заключается в том, что фермент фактор С, содержащийся в лизате амебоцитов мечехвостов Limulus Amebocyte Lysate (ЛАЛ-реагент), реагирует с БЭ, что запускает каскад ферментативных реакций, приводящий к активации свертывающего фермента. Этот фермент в свою очередь гидролизует особый хромогенный субстрат с образованием окрашенного продукта. Регистрация сигнала происходит спектрофотометрически по изменению оптической плотности (т.е. по интенсивности окраски).The idea of the proposed method is that the enzyme factor C contained in the lysate of amoebocytes of the Limulus Amebocyte Lysate horseshoe crab (LAL reagent) reacts with BE, which triggers a cascade of enzymatic reactions leading to activation of the coagulating enzyme. This enzyme in turn hydrolyzes a particular chromogenic substrate to form a colored product. The signal is recorded spectrophotometrically by a change in optical density (i.e., by the intensity of color).
Преимущества предлагаемого способа от найденных аналогов следующие:The advantages of the proposed method from the found analogues are as follows:
1) RU 2325645 - предлагаемый метод является более точным и позволяет количественно определять содержание бактериального эндотоксина в биологических жидкостях, благодаря применению хромогенной модификации ЛАЛ-теста в отличие от визуального контроля, использующегося авторами в данном патенте;1) RU 2325645 - the proposed method is more accurate and allows you to quantify the content of bacterial endotoxin in biological fluids, thanks to the use of a chromogenic modification of the LAL-test, in contrast to the visual control used by the authors in this patent;
2) JP 761448 (В2) - преимущество предлагаемого способа в большей универсальности, так как в японском методе определяют бактериальный эндотоксин только в крови, тогда как в предлагаемом способе не только в крови и плазме крови, но и в моче, т.е. более широко применимый, универсальный способ;2) JP 761448 (B2) - the advantage of the proposed method is more versatile, as in the Japanese method, bacterial endotoxin is determined only in the blood, whereas in the proposed method, not only in blood and plasma, but also in urine, i.e. more widely applicable, universal way;
3) JP 2003232794 (А) - метод, используемый авторами в данном патенте, позволяет проводить определение БЭ в специфичных условиях применения, существенно отличных от признаков предлагаемого способа.3) JP 2003232794 (A) - the method used by the authors in this patent, allows the determination of BE in specific conditions of use, significantly different from the characteristics of the proposed method.
4) CN 1696636 (A) - близкий1 аналог предварительной обработки образцов крови, включающая в себя обработку раствором тритон Х-100, нагревание-охлаждение и разбавление. Отличие от предлагаемого способа: а) другие концентрации реагента тритон Х-100; б) другие температуры охлаждения; и в предлагаемом способе это разные методики: либо нагревание и разбавление, либо обработка тритон Х-100, с последующей кислотно-щелочной обработкой образцов, тогда как в приведенном патенте все операции необходимо применять к каждому образцу (усложнение), по сравнению с предлагаемым способом требуется больше стадий по предварительные обработки крови. Кроме того, также описывается определение БЭ только в крови (сыворотке крови).4) CN 1696636 (A) is a close 1 analogue of pretreatment of blood samples, which includes treatment with Triton X-100 solution, heating-cooling and dilution. The difference from the proposed method: a) other concentrations of the reagent Triton X-100; b) other cooling temperatures; and in the proposed method these are different methods: either heating and dilution, or treating Triton X-100, followed by acid-base treatment of the samples, whereas in the given patent all operations must be applied to each sample (complication), compared to the proposed method more stages on pre-treatment of blood. In addition, the definition of EB only in blood (serum) is also described.
5) WO 2009005231 (А1) - по сравнению с данным методом, из преимуществ предлагаемого способа можно указать, что определение содержания БЭ происходит при помощи хромогенного ЛАЛ-теста, что позволяет использовать любой сравнительно недорогой и доступный лабораторный спектрофотометр.5) WO 2009005231 (A1) - compared with this method, from the advantages of the proposed method, it can be indicated that the determination of BE content is carried out using a chromogenic LAL test, which allows using any relatively inexpensive and affordable laboratory spectrophotometer.
Примеры осуществление изобретения Примеры 1, 2, 3 - для образцов плазмы крови, примеры 4, 5, 6 -для образцов мочи. Общими приемами для всех примеров являлись проведение реакции подготовленных образцов с ЛАЛ-реактивом и спектрофотометрическое определение концентрации бактериального эндотоксина в образцах после реакции с ЛАЛ-реактивом.Examples of the implementation of the invention Examples 1, 2, 3 - for plasma samples, examples 4, 5, 6 for urine samples. Common techniques for all examples were the reaction of the prepared samples with the LAL reagent and the spectrophotometric determination of the concentration of bacterial endotoxin in the samples after the reaction with the LAL reagent.
Пример 1.Example 1
1. Приготовление раствора бактериального эндотоксина1. Preparation of a solution of bacterial endotoxin
Стандарт бактериального эндотоксина был разбавлен 3,4 мл апирогенной воды и получена концентрация 50 ЕЭ/мл.The standard of bacterial endotoxin was diluted with 3.4 ml of pyrogen-free water and a concentration of 50 EU / ml was obtained.
2. Подготовка плазмы2. Preparation of plasma
Образцы крови были отцентрифугированы при 1200 g в течение 10 минут. Отделенная плазма была отобрана в стерильные пробирки 10×75 мм.Blood samples were centrifuged at 1200 g for 10 minutes. Separated plasma was collected in sterile tubes 10 × 75 mm.
3. Загрязнение плазмы3. Plasma pollution
Образцы плазмы были загрязнены раствором бактериального эндотоксина (50 ЕЭ/мл) до концентрации последнего соответственно: 5, 0,5, 0,05, 0,005, 0,0025 ЕЭ/мл.Plasma samples were contaminated with a solution of bacterial endotoxin (50 EE / ml) to a concentration of the latter, respectively: 5, 0.5, 0.05, 0.005, 0.0025 EE / ml.
4. Обработка образцов4. Sample processing
А) В стерильных пробирках к 0,1 мл плазмы было добавлено 0,9 мл физиологического раствора хлорида натрия. Таким образом, кровь была разведена в 10 раз.A) In sterile test tubes, 0.9 ml of physiological sodium chloride solution was added to 0.1 ml of plasma. Thus, the blood was diluted 10 times.
Б) Пробирки были термостатированы при 45°С в течение 60 минут (при термостатировании их не закрывают).B) The tubes were thermostated at 45 ° C for 60 minutes (they are not closed during thermostating).
5. Проведение реакции с ЛАЛ-реактивом5. Conducting the reaction with LAL-reagent
В стерильные пробирки было налито 100 мкл обработанных образцов, загрязненных до определенных концентраций эндотоксина, и туда же добавлено 100 мкл ЛАЛ-реактива. Также был образец сравнения: это 100 мкл не загрязненной плазмы и 100 мкл ЛАЛ-реактива. Все концентрации и образец сравнения были приготовлены в 3 повторностях. Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты.100 μl of the treated samples contaminated to certain concentrations of endotoxin were poured into sterile tubes, and 100 μl of LAL reagent was added to the same. There was also a reference sample: these are 100 μl of non-contaminated plasma and 100 μl of LAL reagent. All concentrations and reference sample were prepared in 3 replicates. The tubes were thermostated for 1 hour at 37 ° C. To stop the reaction, 50 μl of 50% acetic acid was added to each tube.
6. Спектрофотометрическое определение концентрации БЭ в образцах6. Spectrophotometric determination of BE concentration in samples.
Концентрацию эндотоксина измеряли по показателю оптической плотности на длине волны λ=388 нм.The concentration of endotoxin was measured in terms of optical density at a wavelength of λ = 388 nm.
7. Результаты анализа7. Results of the analysis
Пробирки с отрицательным контролем (незагрязненная плазма) после часа термсотатирования при 37°С, а также пробирки, содержащие 0,005; 0,0025 ЕЭ/мл остались прозрачными. В пробирках с содержанием бактериального эндотоксина в концентрации 5,00; 0.50. 0,05, 0,01 ЕЭ/мл раствор окрасился в желтый цвет. Оптическая плотность для каждой концентрации при λ=388 нм определялась как среднее значение из трех повторностей (таблица 1).Negative control tubes (unpolluted plasma) after an hour of heat setting at 37 ° C, as well as tubes containing 0.005; 0,0025 EE / ml remained transparent. In tubes containing a bacterial endotoxin at a concentration of 5.00; 0.50. 0.05, 0.01 U / ml solution turned yellow. The optical density for each concentration at λ = 388 nm was determined as the average of three replications (Table 1).
Таким образом, в плазме крови при помощи термической обработки и разведения возможно определение наличия БЭ в растворе с концентрацией БЭ на границе между 0,005 ЕЭ/мл и 0,010 ЕЭ/мл и с более высокими концентрациями БЭ.Thus, in the blood plasma using heat treatment and dilution, it is possible to determine the presence of EB in a solution with an EB concentration at the boundary between 0.005 EE / ml and 0.010 EE / ml and with higher concentrations of EB.
Пример 2.Example 2
1. Приготовление раствора бактериального эндотоксина1. Preparation of a solution of bacterial endotoxin
Стандарт бактериального эндотоксина был разбавлен 3,4 мл апирогенной воды и получена концентрация 50 ЕЭ/мл.The standard of bacterial endotoxin was diluted with 3.4 ml of pyrogen-free water and a concentration of 50 EU / ml was obtained.
2. Подготовка плазмы2. Preparation of plasma
Образцы крови были отцентрифугированы при 1200g в течение 10 минут. Отделенная плазма была отобрана в стерильные пробирки 10×75 мм.Blood samples were centrifuged at 1200g for 10 minutes. Separated plasma was collected in sterile tubes 10 × 75 mm.
3. Загрязнение плазмы:3. Plasma pollution:
Образцы плазмы были загрязнены раствором бактериального эндотоксина (50 ЕЭ/мл) до концентрации последнего соответственно: 5, 0,5,0,05, 0,005, 0,0025 ЕЭ/мл.Plasma samples were contaminated with a solution of bacterial endotoxin (50 EE / ml) to a concentration of the latter, respectively: 5, 0.5.0.05, 0.005, 0.0025 EE / ml.
4. Обработка образцов4. Sample processing
А) В стерильных пробирках к 0,1 мл плазмы было добавлено 4,9 мл физиологического раствора хлорида натрия. Таким образом, кровь была разведена в 50 раз.A) In sterile test tubes, 4.9 ml of physiological sodium chloride solution was added to 0.1 ml of plasma. Thus, the blood was diluted 50 times.
Б) Пробирки были термостатированы при 60°С в течение 30 минут.B) The tubes were thermostated at 60 ° C for 30 minutes.
5. Проведение реакции с ЛАЛ-реактивом5. Conducting the reaction with LAL-reagent
В стерильные пробирки было налито 100 мкл обработанных образцов, загрязненных до определенных концентраций эндотоксина, и туда же добавлено 100 мкл ЛАЛ-реактива. Также был образец сравнения: это 100 мкл не загрязненной плазмы и 100 мкл ЛАЛ-реактива. Все концентрации и образец сравнения были приготовлены в 3 повторностях. Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты.100 μl of the treated samples contaminated to certain concentrations of endotoxin were poured into sterile tubes, and 100 μl of LAL reagent was added to the same. There was also a reference sample: these are 100 μl of non-contaminated plasma and 100 μl of LAL reagent. All concentrations and reference sample were prepared in 3 replicates. The tubes were thermostated for 1 hour at 37 ° C. To stop the reaction, 50 μl of 50% acetic acid was added to each tube.
6. Спектрофотометрическое определение концентрации БЭ в образцах6. Spectrophotometric determination of BE concentration in samples.
Концентрацию эндотоксина измеряли по показателю оптической плотности на длине волны λ=388 нм.The concentration of endotoxin was measured in terms of optical density at a wavelength of λ = 388 nm.
7. Результаты анализа аналогичны результатам анализа примера 1.7. The results of the analysis are similar to the results of the analysis of Example 1.
Пример 3.Example 3
1. Приготовление раствора бактериального эндотоксина1. Preparation of a solution of bacterial endotoxin
Стандарт бактериального эндотоксина был разбавлен 3,4 мл апирогенной воды и получена концентрация 50 ЕЭ/мл.The standard of bacterial endotoxin was diluted with 3.4 ml of pyrogen-free water and a concentration of 50 EU / ml was obtained.
2. Подготовка плазмы2. Preparation of plasma
Образцы крови были отцентрифугированы при 1200g в течение 10 минут. Отделенная плазма была отобрана в стерильные пробирки 10×75 мм.Blood samples were centrifuged at 1200g for 10 minutes. Separated plasma was collected in sterile tubes 10 × 75 mm.
3. Загрязнение плазмы3. Plasma pollution
Образцы плазмы были загрязнены раствором бактериального эндотоксина (50 ЕЭ/мл) до концентрации последнего соответственно: 5, 0,5, 0,05, 0,005, 0,0025 ЕЭ/мл.Plasma samples were contaminated with a solution of bacterial endotoxin (50 EE / ml) to a concentration of the latter, respectively: 5, 0.5, 0.05, 0.005, 0.0025 EE / ml.
4. Обработка образцов4. Sample processing
А) В стерильных пробирках к 0,1 мл плазмы было добавлено 9,9 мл физиологического раствора хлорида натрия. Таким образом, кровь была разведена в 100 раз.A) In sterile test tubes, 9.9 ml of physiological sodium chloride solution was added to 0.1 ml of plasma. Thus, the blood was diluted 100 times.
Б) Пробирки были термостатированы при 85°С в течение 60 минут.B) The tubes were thermostated at 85 ° C for 60 minutes.
5. Проведение реакции с ЛАЛ-реактивом5. Conducting the reaction with LAL-reagent
В стерильные пробирки было налито 100 мкл обработанных образцов, загрязненных до определенных концентраций эндотоксина, и туда же добавлено 100 мкл ЛАЛ-реактива. Также был образец сравнения: это 100 мкл не загрязненной плазмы и 100 мкл ЛАЛ-реактива. Все концентрации и образец сравнения были приготовлены в 3 повторностях. Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты.100 μl of the treated samples contaminated to certain concentrations of endotoxin were poured into sterile tubes, and 100 μl of LAL reagent was added to the same. There was also a reference sample: these are 100 μl of non-contaminated plasma and 100 μl of LAL reagent. All concentrations and reference sample were prepared in 3 replicates. The tubes were thermostated for 1 hour at 37 ° C. To stop the reaction, 50 μl of 50% acetic acid was added to each tube.
6. Спектрофотометрическое определение концентрации БЭ в образцах Концентрацию эндотоксина измеряли по показателю оптической плотности на длине волны λ=388 нм.6. Spectrophotometric determination of BE concentration in samples Endotoxin concentration was measured in terms of optical density at a wavelength λ = 388 nm.
7. Результаты анализа аналогичны результатам анализа примера 1.7. The results of the analysis are similar to the results of the analysis of Example 1.
Пример 4.Example 4
1. Приготовление раствора бактериального эндотоксина:1. Preparation of the bacterial endotoxin solution:
Стандарт бактериального эндотоксина был разбавлен 3,4 мл апирогенной воды и получена концентрация 50 ЕЭ/мл.The standard of bacterial endotoxin was diluted with 3.4 ml of pyrogen-free water and a concentration of 50 EU / ml was obtained.
2. Загрязнение мочи:2. Contamination of urine:
Образцы мочи были загрязнены раствором бактериального эндотоксина (50 ЕЭ/мл) до концентрации последнего соответственно: 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,1; 0,05 ЕЭ/мл.Urine samples were contaminated with a solution of bacterial endotoxin (50 EE / ml) to a concentration of the latter, respectively: 5.0; 2.0; 1.0; 0.5; 0.1; 0.05 U / ml
3. Обработка образцов.3. Processing samples.
А) В стерильных пробирках к 1 мл мочи было добавлено 0,25 мл хлороформа и смесь была перемешана на вибрационном встряхивателе в течение 4 часов.A) In sterile test tubes, 0.25 ml of chloroform was added to 1 ml of urine and the mixture was stirred on a shaker for 4 hours.
Б) Содержимое пробирок было отцентрифугировано при 4000 об/мин в течение 10 минут. Средний мутный слой был отобран и использовался для проведения ЛАЛ-теста.B) The contents of the tubes were centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes. The middle cloudy layer was selected and used for the LAL test.
4. Проведение реакции с ЛАЛ-реактивом:4. Conducting the reaction with LAL-reagent:
В стерильные пробирки было налито 100 мкл обработанных образцов, загрязненных до определенных концентраций эндотоксина, и туда же добавлено 100 мкл ЛАЛ-реактива. Также был образец сравнения: это 100 мкл незагрязненной плазмы и 100 мкл ЛАЛ-реактива. Все концентрации и образец сравнения были приготовлены в 3 повторностях. Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты.100 μl of the treated samples contaminated to certain concentrations of endotoxin were poured into sterile tubes, and 100 μl of LAL reagent was added to the same. There was also a reference sample: these are 100 μl of unpolluted plasma and 100 μl of LAL reagent. All concentrations and reference sample were prepared in 3 replicates. The tubes were thermostated for 1 hour at 37 ° C. To stop the reaction, 50 μl of 50% acetic acid was added to each tube.
5. Спектрофотометрическое определение концентрации БЭ в образцах Концентрацию эндотоксина измеряли по показателю оптической плотности на длине волны λ=388 нм.5. Spectrophotometric determination of the concentration of BE in the samples The concentration of endotoxin was measured in terms of optical density at a wavelength of λ = 388 nm.
6. Результаты анализа6. Results of analysis
Пробирки с отрицательным контролем (незагрязненная моча) после часа термсотатирования при 37°С, а также пробирки, содержащие 0,5; 0,1; 0,05 ЕЭ/мл. остались прозрачными. В пробирках с содержанием бактериального эндотоксина в концентрации 5,0; 2,0; 1,0 ЕЭ/мл раствор окрасился в желтый цвет. Оптическая плотность для каждой концентрации при λ=388 нм определялась как среднее значение из трех повторностей (таблица 2).Negative control tubes (unpolluted urine) after an hour of heat setting at 37 ° C, as well as tubes containing 0.5; 0.1; 0.05 U / ml remained transparent. In test tubes containing bacterial endotoxin at a concentration of 5.0; 2.0; 1.0 EU / ml solution turned yellow. The optical density for each concentration at λ = 388 nm was determined as the average value of three replications (Table 2).
Таким образом, в моче при помощи экстракции хлор-органическим растворителем возможно определение наличия БЭ в растворе с концентрацией БЭ на границе между 1,00 ЕЭ/мл и 2,00 ЕЭ/мл и с более высокими концентрациями БЭ.Thus, in the urine using extraction with a chloro-organic solvent it is possible to determine the presence of BE in a solution with a concentration of BE at the border between 1.00 EE / ml and 2.00 EE / ml and with higher concentrations of EB.
Пример 5.Example 5
1. Приготовление раствора бактериального эндотоксина:1. Preparation of the bacterial endotoxin solution:
Стандарт бактериального эндотоксина был разбавлен 3,4 мл апирогенной воды и получена концентрация 50 ЕЭ/мл.The standard of bacterial endotoxin was diluted with 3.4 ml of pyrogen-free water and a concentration of 50 EU / ml was obtained.
2. Загрязнение мочи:2. Contamination of urine:
Образцы мочи были загрязнены раствором бактериального эндотоксина (50 ЕЭ/мл) до концентрации последнего соответственно: 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,1; 0,05 ЕЭ/мл.Urine samples were contaminated with a solution of bacterial endotoxin (50 EE / ml) to a concentration of the latter, respectively: 5.0; 2.0; 1.0; 0.5; 0.1; 0.05 U / ml
3. Обработка образцов.3. Processing samples.
А) В стерильных пробирках к 1 мл мочи было добавлено 0,25 мл хлористого метилена и смесь была перемешана на вибрационном встряхивателе в течение 4 часов.A) In sterile test tubes, 0.25 ml of methylene chloride was added to 1 ml of urine and the mixture was mixed on a shaker with a shaker for 4 hours.
Б) Содержимое пробирок было отцентрифугировано при 4000 об/мин в течение 10 минут. Средний мутный слой был отобран и использовался для проведения ЛАЛ-теста.B) The contents of the tubes were centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes. The middle cloudy layer was selected and used for the LAL test.
4. Проведение реакции с ЛАЛ-реактивом:4. Conducting the reaction with LAL-reagent:
В стерильные пробирки было налито 100 мкл обработанных образцов, загрязненных до определенных концентраций эндотоксина, и туда же добавлено 100 мкл ЛАЛ-реактива. Также был образец сравнения: это 100 мкл не загрязненной плазмы и 100 мкл ЛАЛ-реактива. Все концентрации и образец сравнения были приготовлены в 3 повторностях. Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты.100 μl of the treated samples contaminated to certain concentrations of endotoxin were poured into sterile tubes, and 100 μl of LAL reagent was added to the same. There was also a reference sample: these are 100 μl of non-contaminated plasma and 100 μl of LAL reagent. All concentrations and reference sample were prepared in 3 replicates. The tubes were thermostated for 1 hour at 37 ° C. To stop the reaction, 50 μl of 50% acetic acid was added to each tube.
5. Спектрофотометрическое определение концентрации БЭ в образцах Концентрацию эндотоксина измеряли по показателю оптической плотности на длине волны λ=388 нм.5. Spectrophotometric determination of the concentration of BE in the samples The concentration of endotoxin was measured in terms of optical density at a wavelength of λ = 388 nm.
6. Результаты анализа аналогичны результатам анализа примера 4.6. The results of the analysis are similar to the results of the analysis of Example 4.
Пример 6.Example 6
1. Приготовление раствора бактериального эндотоксина:1. Preparation of the bacterial endotoxin solution:
Стандарт бактериального эндотоксина был разбавлен 3,4 мл апирогенной воды и получена концентрация 50 ЕЭ/мл.The standard of bacterial endotoxin was diluted with 3.4 ml of pyrogen-free water and a concentration of 50 EU / ml was obtained.
2. Загрязнение мочи:2. Contamination of urine:
Образцы мочи были загрязнены раствором бактериального эндотоксина (50 ЕЭ/мл) до концентрации последнего соответственно: 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,1; 0,05 ЕЭ/мл.Urine samples were contaminated with a solution of bacterial endotoxin (50 EE / ml) to a concentration of the latter, respectively: 5.0; 2.0; 1.0; 0.5; 0.1; 0.05 U / ml
3. Обработка образцов.3. Processing samples.
А) В стерильных пробирках к 1 мл мочи было добавлено 0,3 мл 1,2-дихлорэтана и смесь была перемешана на вибрационном встряхивателе в течение 4 часов.A) In sterile test tubes, 0.3 ml of 1,2-dichloroethane was added to 1 ml of urine and the mixture was mixed on a shaker with a shaker for 4 hours.
Б) Содержимое пробирок было отцентрифугировано при 4000 об/мин в течение 10 минут Средний мутный слой был отобран и использовался для проведения ЛАЛ-теста.B) The contents of the tubes were centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes. A medium turbid layer was selected and used for the LAL test.
4. Проведение реакции с ЛАЛ-реактивом:4. Conducting the reaction with LAL-reagent:
В стерильные пробирки было налито 100 мкл обработанных образцов, загрязненных до определенных концентраций эндотоксина, и туда же добавлено 100 мкл ЛАЛ-реактива. Также был образец сравнения: это 100 мкл не загрязненной плазмы и 100 мкл ЛАЛ-реактива. Все концентрации и образец сравнения были приготовлены в 3 повторностях. Пробирки были термостатированы в течение 1 часа при 37°С. Для прекращения реакции в каждую пробирку было добавлено по 50 мкл 50% уксусной кислоты.100 μl of the treated samples contaminated to certain concentrations of endotoxin were poured into sterile tubes, and 100 μl of LAL reagent was added to the same. There was also a reference sample: these are 100 μl of non-contaminated plasma and 100 μl of LAL reagent. All concentrations and reference sample were prepared in 3 replicates. The tubes were thermostated for 1 hour at 37 ° C. To stop the reaction, 50 μl of 50% acetic acid was added to each tube.
5. Спектрофотометрическое определение концентрации БЭ в образцах Концентрацию эндотоксина измеряли по показателю оптической плотности на длине волны λ=388 нм.5. Spectrophotometric determination of the concentration of BE in the samples The concentration of endotoxin was measured in terms of optical density at a wavelength of λ = 388 nm.
6. Результаты анализа аналогичны результатам анализа примера 4.6. The results of the analysis are similar to the results of the analysis of Example 4.
Предлагаемый способ разработан и апробирован в рамках выполнения работы по Соглашению №14.577.21.0165 между Министерством образования и науки Российской Федерации (Госзаказчик) и МГТУ им. Н.Э.Баумана.The proposed method has been developed and tested in the framework of the work under the Agreement No. 14.577.21.0165 between the Ministry of Education and Science of the Russian Federation (Government customer) and MGTU. N.E. Bauman.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017145802A RU2691413C1 (en) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Method for determining bacterial endotoxin in biological fluids |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017145802A RU2691413C1 (en) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Method for determining bacterial endotoxin in biological fluids |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2691413C1 true RU2691413C1 (en) | 2019-06-13 |
Family
ID=66947816
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017145802A RU2691413C1 (en) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Method for determining bacterial endotoxin in biological fluids |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2691413C1 (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113670914A (en) * | 2021-08-19 | 2021-11-19 | 青岛易邦生物工程有限公司 | Bacterial endotoxin detection method of oil emulsion inactivated vaccine |
CN115078347A (en) * | 2022-05-31 | 2022-09-20 | 中国食品药品检定研究院 | Method for detecting bacterial endotoxin of dipalmitoyl phosphatidylcholine |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2325645C1 (en) * | 2006-11-13 | 2008-05-27 | Закрытое Акционерное Общество "Кдо-Тест" (Зао "Кдо-Тест") | Method of bacterial endotoxins detection with application of tal-test implying coagulogene polymer registered by structure of generated protein fractals |
-
2017
- 2017-12-26 RU RU2017145802A patent/RU2691413C1/en active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2325645C1 (en) * | 2006-11-13 | 2008-05-27 | Закрытое Акционерное Общество "Кдо-Тест" (Зао "Кдо-Тест") | Method of bacterial endotoxins detection with application of tal-test implying coagulogene polymer registered by structure of generated protein fractals |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
LAUGERETTE F. еt al. Endotoxemia Analysis by the Limulus Amoebocyte Lysate Assay in Different Mammal Species Used in Metabolic Studies // J Anal Bioanal. Tech. - 2015. - Vol.6, No.4. - P.251-256. * |
LINDSAY G.K. et al. Single-step, chromogenic limulus amebocyte lysate assay for endotoxin // Journal of clinical microbiology. - 1989. - Vol.27, No.5. - P.947-951. * |
LINDSAY G.K. et al. Single-step, chromogenic limulus amebocyte lysate assay for endotoxin // Journal of clinical microbiology. - 1989. - Vol.27, No.5. - P.947-951. LU C. еt al. Ultra-fast microwave assistance reverse microemulsion synthesis of Fe3O4@SiO2 core-shell nanoparticles as a highly recyclable silver nanoparticles catalytic platform in the reduction of 4-nitroaniline // RSC Adv. - 2016. - Vol.6. - P.88762-88769. LAUGERETTE F. еt al. Endotoxemia Analysis by the Limulus Amoebocyte Lysate Assay in Different Mammal Species Used in Metabolic Studies // J Anal Bioanal. Tech. - 2015. - Vol.6, No.4. - P.251-256. MARSHALL J.C. et al. Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence // Critical Care. - 2002. - Vol.6, No.4. - P.342-348. NACHUM R. et al. Chromogenic Limulus Amoebocyte Lysate Assay for Rapid Detection of Gram-Negative Bacteriuria // Journal of clinical microbiology. - 1985. - Vol.21, No.5. - P.759-763. * |
LU C. еt al. Ultra-fast microwave assistance reverse microemulsion synthesis of Fe3O4@SiO2 core-shell nanoparticles as a highly recyclable silver nanoparticles catalytic platform in the reduction of 4-nitroaniline // RSC Adv. - 2016. - Vol.6. - P.88762-88769. * |
MARSHALL J.C. et al. Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence // Critical Care. - 2002. - Vol.6, No.4. - P.342-348. * |
NACHUM R. et al. Chromogenic Limulus Amoebocyte Lysate Assay for Rapid Detection of Gram-Negative Bacteriuria // Journal of clinical microbiology. - 1985. - Vol.21, No.5. - P.759-763. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113670914A (en) * | 2021-08-19 | 2021-11-19 | 青岛易邦生物工程有限公司 | Bacterial endotoxin detection method of oil emulsion inactivated vaccine |
CN113670914B (en) * | 2021-08-19 | 2024-03-08 | 青岛易邦生物工程有限公司 | Bacterial endotoxin detection method of oil emulsion inactivated vaccine |
CN115078347A (en) * | 2022-05-31 | 2022-09-20 | 中国食品药品检定研究院 | Method for detecting bacterial endotoxin of dipalmitoyl phosphatidylcholine |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109596843B (en) | A kind of assay kit of serum amyloid A protein | |
CN109266717B (en) | Method and device for detecting bacterial drug resistance through single cell analysis | |
JP5824750B2 (en) | Detection and / or quantification of endotoxin | |
RU2691413C1 (en) | Method for determining bacterial endotoxin in biological fluids | |
US20150276742A1 (en) | Kit For Sampling And Detection Of Endotoxin In Aqueous Solution | |
CN109239065A (en) | A kind of stable urine total protein quality-control product and its preparation method and application | |
Lu et al. | A time-resolved fluorescence lateral flow immunoassay for rapid and quantitative serodiagnosis of Brucella infection in humans | |
CA2732011A1 (en) | Method for measurement of physiologically active substance derived from organism and measurement apparatus | |
EP2299273A1 (en) | Method of assaying physiologically active substance of biological origin, kit for assaying physiologically active substance of biological origin and apparatus for assaying physiologically active substance of biological origin | |
US20200166528A1 (en) | Methods for Improving Assays of Biological Samples | |
CN103940812B (en) | A kind of spectrophotography quickly detects method and the application of coliform | |
CN106546729B (en) | Novel process method for removing serum matrix effect in dry immunofluorescence quantitative detection | |
EP4085245B1 (en) | Method and device for analysis of liquid samples | |
CN106198993A (en) | A kind of mensuration reagent of Procalcitonin. albumen and preparation method thereof | |
RU2325645C1 (en) | Method of bacterial endotoxins detection with application of tal-test implying coagulogene polymer registered by structure of generated protein fractals | |
RU2425384C2 (en) | Diagnostic technique for clinical course of salmonellosis-protozoal acute enteric infections in children | |
EP1664771A2 (en) | A method for qualitative and/or quantitative detection of polyethylene glycols in biological fluids | |
CN101221181B (en) | Indirect method for detecting lymphocyte subgroup with mono-clone antibody SPA hematid rosette method | |
CN109030486A (en) | A kind of Test for Bacterial Endotoxins of hemoglobin samples | |
Mitsumoto et al. | Novel endotoxin assay by laser light‐scattering particle‐counting method | |
JP4197797B2 (en) | Inspection method of oocyst concentration of Cryptosporidium | |
Shi et al. | Clinical Performance Evaluation of Feces Analyzer KU-F10. | |
CN109975260B (en) | Method for detecting lysozyme based on nanogold fluorescence and application thereof | |
CN109932513B (en) | Application of RPPA and PWG in preparation of respiratory tract pathogen detection product | |
Lindeberg | Evaluation of Manual and QIAcube miRNA Extraction from Plasma with the miRNeasy Advanced Kit from Qiagen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20200225 |