RU2691108C1 - Method for determining mitochondrial dysfunction in patients with non-alcoholic fatty liver disease - Google Patents
Method for determining mitochondrial dysfunction in patients with non-alcoholic fatty liver disease Download PDFInfo
- Publication number
- RU2691108C1 RU2691108C1 RU2018126445A RU2018126445A RU2691108C1 RU 2691108 C1 RU2691108 C1 RU 2691108C1 RU 2018126445 A RU2018126445 A RU 2018126445A RU 2018126445 A RU2018126445 A RU 2018126445A RU 2691108 C1 RU2691108 C1 RU 2691108C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nafld
- patients
- mitochondrial dysfunction
- fatty liver
- alcoholic fatty
- Prior art date
Links
- 208000008338 non-alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 11
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 11
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 9
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 6
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 4
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 4
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000007863 steatosis Effects 0.000 description 4
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 3
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 3
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 3
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N (R)-carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 206010052805 Drug tolerance decreased Diseases 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000037656 Respiratory Sounds Diseases 0.000 description 2
- 206010047924 Wheezing Diseases 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 2
- 229960004203 carnitine Drugs 0.000 description 2
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 2
- QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N costic aldehyde Natural products C1CCC(=C)C2CC(C(=C)C=O)CCC21C QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N iso-beta-costal Natural products C1C(C(=C)C=O)CCC2(C)CCCC(C)=C21 ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 2
- 230000001020 rhythmical effect Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004611 Abdominal Obesity Diseases 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical class [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010065941 Central obesity Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 206010050029 Mitochondrial cytopathy Diseases 0.000 description 1
- 201000002169 Mitochondrial myopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 208000032140 Sleepiness Diseases 0.000 description 1
- 206010041349 Somnolence Diseases 0.000 description 1
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010042434 Sudden death Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000007642 Vitamin B Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 239000010796 biological waste Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Chemical class 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 208000022119 inability to concentrate Diseases 0.000 description 1
- 208000023692 inborn mitochondrial myopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 208000030212 nutrition disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 1
- 230000000276 sedentary effect Effects 0.000 description 1
- 208000019116 sleep disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022925 sleep disturbance Diseases 0.000 description 1
- 230000037321 sleepiness Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002910 solid waste Substances 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 229960002555 zidovudine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к гепатологии и клинической лабораторной диагностике, и может использоваться для определения митохондриальной дисфункции у больных неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП).The invention relates to the field of medicine, in particular to hepatology and clinical laboratory diagnostics, and can be used to determine mitochondrial dysfunction in patients with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).
Известно, что митохондриальные дисфункции играют важную роль в патогенезе многих заболеваний, в том числе - неалкогольной жировой болезни печени. НАЖБП является одним из самых распространенных заболеваний в гепатологии, приводящих к ухудшению качества жизни, инвалидизации и смерти, что обусловлено высоким риском ее прогрессирования с развитием цирроза, печеночно-клеточной недостаточности, гепатоцеллюлярной карциномы и сердечно-сосудистых осложнений. Распространенность НАЖБП в популяции составляет от 6,3% до 33%, причем заболевание встречается в любом возрасте. В России за последние 7 лет распространенность НАЖБП возросла более чем на 10% и составила 37,3%, что позволило ей занять лидирующее место в структуре заболеваний внутренних органов.It is known that mitochondrial dysfunctions play an important role in the pathogenesis of many diseases, including non-alcoholic fatty liver disease. NAFLD is one of the most common diseases in hepatology, leading to a deterioration in the quality of life, disability and death, due to the high risk of its progression with the development of cirrhosis, hepatocellular failure, hepatocellular carcinoma and cardiovascular complications. The prevalence of NAFLD in the population ranges from 6.3% to 33%, with the disease occurring at any age. In Russia over the past 7 years, the prevalence of NAFLD has increased by more than 10% and amounted to 37.3%, which allowed it to take a leading position in the structure of diseases of internal organs.
В течение заболевания выделяют несколько стадий, основными из которых являются стеатоз, стеатогепатит, фиброз и цирроз печени. Развитие жирового гепатоза при НАЖБП представляет собой неспецифическую реакцию гепатоцитов на различного рода токсические воздействия. Так, формированию заболевания способствуют абдоминальное ожирение, гипергликемия, малоподвижный образ жизни, высококалорийная пища, а также наличие экопатогенных факторов, таких как: угарный газ, цианиды, соли тяжелых металлов; побочное действие ряда лекарственных веществ (азидотимидина, вальпроатов, аминогликозидов, некоторых других), алиментарные нарушения (дефицит витаминов группы В), что приводит к возникновению полисистемных митохондриальных дисфункций. В свою очередь, увеличение числа митохондриальных дисфункций является одним из важнейших механизмов, способствующих прогрессированию заболевания.During the course of the disease, several stages are distinguished, the main of which are steatosis, steatohepatitis, fibrosis and cirrhosis of the liver. The development of fatty hepatosis in NAFLD is a nonspecific response of hepatocytes to various toxic effects. For example, abdominal obesity, hyperglycemia, a sedentary lifestyle, high-calorie foods, and the presence of ecopathogenic factors, such as carbon monoxide, cyanides, and heavy metal salts, contribute to the formation of the disease. side effects of a number of medicinal substances (azidothymidine, valproates, aminoglycosides, and some others), nutritional disorders (vitamin B deficiency), which leads to the emergence of polysystem mitochondrial dysfunctions. In turn, an increase in the number of mitochondrial dysfunctions is one of the most important mechanisms contributing to the progression of the disease.
Доказано, что ультраструктурные нарушения митохондриального аппарата обуславливают развитие функциональной недостаточности митохондрий и являются одним из патогенетических факторов развития неалкогольного стеатоза печени. Подтверждением морфологических нарушений гепатоцитов при НАЖБП являются: увеличение размера митохондриального аппарата со значительным его набуханием, незначительное количество митохондрий в поле зрения, специфические паракристаллиновые включения в митохондриальном матриксе со сниженной плотностью, выявляемые при электронной микроскопии.It is proved that ultrastructural disorders of the mitochondrial apparatus cause the development of functional mitochondrial insufficiency and are one of the pathogenetic factors of the development of non-alcoholic liver steatosis. Confirmation of morphological disorders of hepatocytes with NAFLD are: an increase in the size of the mitochondrial apparatus with its significant swelling, a small number of mitochondria in sight, specific paracrystalline inclusions in the mitochondrial matrix with a reduced density, detected by electron microscopy.
Своевременное определение митохондриальной дисфункции необходимо для выявления НАЖБП на ранней стадии, что позволит не допустить прогрессирование заболевания и предупредить развитие сердечно-сосудистых осложнений.Timely determination of mitochondrial dysfunction is necessary for detecting NAFLD at an early stage, which will prevent the progression of the disease and prevent the development of cardiovascular complications.
Известные способы определения митохондриальной дисфункции, равно как и диагностика НАЖБП, достаточно сложны и трудоемки. Они проводятся с использованием хромато-масс-спектрометрии, электронно-оптического, гистохимического исследований биопсионного материала. Обследование пациентов с подозрением на митохондриальную дисфункцию включает: исследование уровней лактата, пирувата, кетоновых тел и их соотношение натощак, а также после различных нагрузок, определение аминокислотного состава крови и мочи, определение содержания жирных кислот, спектра липидов и фосфолипидов, общего и свободного карнитина, и продуктов перекисного окисления липидов в крови. Для динамической оценки интенсивности аэробных окислительных процессов в организме используют цитохимические тесты с определением активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов периферической крови. Для определения структурных изменений, приводящих к митохондриальной дисфункции, используют электронную микроскопию.Known methods for determining mitochondrial dysfunction, as well as the diagnosis of NAFLD, are quite complex and time consuming. They are carried out using chromatography-mass spectrometry, electron-optical, histochemical studies of bioptic material. Examination of patients with suspected mitochondrial dysfunction includes: a study of the levels of lactate, pyruvate, ketone bodies and their fasting ratio, as well as after various loads, determination of the amino acid composition of blood and urine, determination of fatty acids, lipid and phospholipid spectrum, total and free carnitine and blood lipid peroxidation products. For a dynamic assessment of the intensity of aerobic oxidative processes in the body, cytochemical tests are used to determine the activity of succinate dehydrogenase of peripheral blood lymphocytes. To determine the structural changes leading to mitochondrial dysfunction, using electron microscopy.
Неалкогольный стеатоз длительное время может протекать бессимптомно и без изменения лабораторных показателей, однако, в ряде случаев возможны минимальные повышения активности печеночных ферментов. Одним из критериев возникновения и развития стеатоза печени является наличие митохондриальной дисфункции [1, 2, 4].Non-alcoholic steatosis for a long time may be asymptomatic and without changing laboratory parameters, however, in some cases minimal increases in liver enzyme activity are possible. One of the criteria for the occurrence and development of liver steatosis is the presence of mitochondrial dysfunction [1, 2, 4].
Таким образом, очевидным является поиск унифицированного способа, в полной мере позволяющего верифицировать наличие митохондриальной дисфункции, как уже нами указано выше, являющейся одним из предикторов возникновения стеатоза, который является начальной стадией НАЖБП. Своевременная диагностика стадии НАЖБП и выявление факторов риска, способствующих развитию заболевания, являются актуальной задачей современного здравоохранения. Их констатация позволит выбрать оптимальные диагностические методы и варианты терапии, препятствующие дальнейшему прогрессированию заболевания. Несмотря на то, что неалкогольная жировая дистрофия печени рассматривается как доброкачественное состояние, она может приводить к развитию печеночной недостаточности и внезапной смерти больного. Как правило, патоморфологически в таких случаях выявляется повреждение или разрушение митохондрий, сопровождающееся мелкокапельной липидной инфильтрацией гепатоцитов.Thus, it is obvious to search for a unified method that fully allows to verify the presence of mitochondrial dysfunction, as we have already indicated above, which is one of the predictors of the occurrence of steatosis, which is the initial stage of NAFLD. The timely diagnosis of NAFLD and the identification of risk factors contributing to the development of the disease are an urgent task for modern healthcare. Their statement will allow you to choose the best diagnostic methods and treatment options that prevent further progression of the disease. Despite the fact that non-alcoholic fatty liver is considered as a benign condition, it can lead to the development of liver failure and the sudden death of the patient. As a rule, pathomorphologically in such cases, damage or destruction of mitochondria is detected, accompanied by a small droplet lipid infiltration of hepatocytes.
В настоящее время не существует достоверных критериев оценки митохондриальной дисфункции у пациентов с НАЖБП. В результате проведенных исследований различными авторами у больных НАЖБП получены различные результаты. Так, одним из прогностических факторов неблагоприятного течения НАЖБП считается развитие митохондриальных дисфункций [1, 2]. Однако методы, способные выявить митохондриальную дисфункцию при стеатозе у больных с НАЖБП, имеют свои недостатки, такие как: применение нескольких узкоспецифичных реагентов и наукоемких методик, дорогостоящих исследований с использованием хромато-масс-спектрометрии, электронно-оптического, гистохимического исследований биопсионного материала, исследование уровней лактата, пирувата, кетоновых тел и их соотношение натощак и после различных нагрузок, определение аминокислотного состава крови и мочи, определение содержания жирных кислот, спектра липидов и фосфолипидов, общего и свободного карнитина и продуктов перекисного окисления липидов в крови [1, 2, 5]. Указанные недостатки существенно ограничивают внедрение подобных методов в рутинную врачебную практику.Currently there are no reliable criteria for assessing mitochondrial dysfunction in patients with NAFLD. As a result of the research conducted by various authors in patients with NAFLD, various results were obtained. Thus, the development of mitochondrial dysfunctions is considered one of the prognostic factors of an unfavorable course of NAFLD [1, 2]. However, methods capable of detecting mitochondrial dysfunction in steatosis in patients with NAFLD have their drawbacks, such as: the use of several highly specific reagents and high-tech techniques, costly studies using chromatography-mass spectrometry, electron-optical, histochemical studies of biopsy material, research levels lactate, pyruvate, ketone bodies and their ratio on an empty stomach and after various loads, determination of the amino acid composition of blood and urine, determination of fatty acid content slot, lipid and phospholipid spectrum, total and free carnitine and blood lipid peroxidation products [1, 2, 5]. These drawbacks significantly limit the introduction of such methods into routine medical practice.
В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности нами выбран способ определения митохондриальной дисфункции, заключающийся в исследовании биоптатов печени с помощью электронной микроскопии [1,2].As a prototype according to the closest technical essence, we have chosen the method for determining mitochondrial dysfunction, which consists in the study of liver biopsy specimens using electron microscopy [1,2].
Способ, выбранный нами в качестве прототипа, обладает следующими недостатками:The method chosen by us as a prototype has the following disadvantages:
• Недостаточно высокие точность (52,5%), специфичность (57,0%) и чувствительность (47,4%) способа.• Insufficiently high accuracy (52.5%), specificity (57.0%) and sensitivity (47.4%) of the method.
• Субъективность исследования, зависит от опыта и навыков морфолога, проводящего исследование.• The subjectivity of the study depends on the experience and skills of the morphologist conducting the study.
• Зависит от участка забора биоптата и количества забранного материала.• It depends on the biopsy sampling site and the amount of material collected.
Точность выполнения данного теста напрямую зависит от преаналитического этапа исследования и включает в себя математическую погрешность, заложенную при выполнении любого расчетного показателя [4].The accuracy of this test is directly dependent on the pre-analytical stage of the study and includes the mathematical error inherent in the performance of any calculated indicator [4].
• Прицельная биопсии печени исключает возможность ее выполнения амбулаторно, требует обязательного пребывания пациента в стационаре, что приводит к длительности выполнения способа (на получение результатов патологоморфологического исследования биоптата требуется до 2-х недель) и повышение его стоимости.• A targeted biopsy of the liver excludes the possibility of its implementation on an outpatient basis, requires the patient to stay in the hospital, which leads to the duration of the method (it takes up to 2 weeks to obtain the results of pathological and morphological biopsy research) and increase its cost.
• Способ инвазивен, достаточно травматичен, что является риском осложнений и связанных с этим отказом до трети больных от выполнения ПБП.• The method is invasive, traumatic enough, which is a risk of complications and associated with this failure up to a third of patients from performing FSA.
Техническим результатом изобретения является:The technical result of the invention is:
• повышение точности, чувствительности и специфичности способа определения митохондриальной дисфункции у больных с НАЖБП;• improving the accuracy, sensitivity and specificity of the method for determining mitochondrial dysfunction in patients with NAFLD;
• возможность выполнения способа амбулаторно, что сократит время его выполнения и снизит стоимость;• the ability to perform the method on an outpatient basis, which will reduce the time of its execution and reduce the cost;
• неинвазивность исследования, что исключит риск осложнений и травматичность выполнения способа, присущих прототипу, и в связи с этим увеличит комплаентность пациентов к обследованию.• non-invasive research, which eliminates the risk of complications and the trauma of performing the method inherent in the prototype, and in this regard will increase the compliance of patients for examination.
Технический результат изобретения достигается тем, что у больного НАЖБП выделяют ДНК из лейкоцитов венозной крови с последующим проведением полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением при этом стандартных пар праймеров с последующим определением длины концевых участков хромосом лейкоцитов периферической крови. При значениях данного показателя выше референсных определяют митохондриальную дисфункцию.The technical result of the invention is achieved by the fact that in a patient with NAFLD, DNA is isolated from venous blood leukocytes followed by polymerase chain reaction (PCR) using standard primer pairs followed by determining the length of the chromosome end sections of peripheral blood leukocytes. With the values of this indicator higher than the reference ones, mitochondrial dysfunction is determined.
Способ осуществляется следующим образом: Выделяют ДНК из лейкоцитов венозной крови пациента НАЖБП. Проводят ПЦР с применением при этом стандартных пар праймеров Tel1 ggtttttgagggtgagggtgagggtgagggt и Tel2 tcccgactatccctaccctatccctatcccta. Анализ длины концевых участков хромосом (теломер) проводят с использованием набора DAKO Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometry (DAKO, Дания), согласно инструкции. В качестве внешнего контроля используют специальную клеточную линию Т-лимфобластной лейкемии 1301 (НРА Culture Collections, Великобритания), которая характеризуется стабильной длиной теломер (Hultdin, 1998). Данную культуру поддерживают в среде RPMI с добавлением 10% бычьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина и пенициллин/стрептомицина 100 мкг/мл (HyClone, США). Клетки исследуемого образца и контрольной линии 1301 выравнивают по количеству после отмывки в PBS с добавлением 0,1% BSA. Одну часть образца и 1301 ресуспендируют в 300 мкл гибридизационного раствора с пептидо-нуклеиновым зондом, меченным флуорохромом FITC и комплементарным теломерной последовательности ДНК, другую - без зонда. Далее проводят денатурацию ДНК при температуре +82°С в течение 10 мин и гибридизацию в течение 12 часов при комнатной температуре в темноте. Затем дважды осуществляют отмывку клеток с инкубацией в отмывочном буфере DAKO при температуре +40°С в течение 10 мин. На следующем этапе клетки ресуспендируют в растворе DAKO для окраски ДНК (буфер, содержащий пропидиум ийодид и РНК-азу А) и выдерживают в течение 30 мин при температуре +37°С в темноте. После выделения ДНК определяют ее концентрацию, выравнивают для всех образцов и определяют длину теломер. В ходе анализа методом ПЦР в реальном времени оценивают количество ДНК с теломерной последовательностью в геноме. Параллельно проводят ПЦР в реальном времени к одноколейному участку венозной ДНК. Отношение количеств теломерной и одноколейной матриц пропорционально длине теломер. Образцы периферической крови хранят при комнатной температуре в течение 24-48 часов. При полученных значениях длины концевых участков хромосом лейкоцитов периферической крови выше референсных определяют митохондриальную дисфункцию, что, как нами уже было указано выше, является одним из прогностических факторов неблагоприятного течения НАЖБП [1, 2].The method is as follows: DNA is isolated from leukocytes of the venous blood of a patient in NAFLD. PCR is carried out using standard pairs of Tel1 ggttttggggtgagggtgagggtgagggt and Tel2 tcccgactatccctaccctatccctatcccta primers. Analysis of the length of the chromosome end sections (telomeres) is carried out using the DAKO Telomere PNA Kit / FITC for Flow Cytometry kit (DAKO, Denmark), according to the instructions. As an external control, a special T-lymphoblastic leukemia cell line 1301 (HPA Culture Collections, United Kingdom) is used, which is characterized by a stable telomere length (Hultdin, 1998). This culture is maintained in RPMI medium supplemented with 10% bovine serum, 2 mM L-glutamine and penicillin / streptomycin 100 μg / ml (HyClone, USA). Cells of the sample and control line 1301 are leveled by quantity after washing in PBS with the addition of 0.1% BSA. One part of the sample and 1301 are resuspended in 300 μl of a hybridization solution with a peptide-nucleic acid probe labeled with FITC fluorochrome and complementary to the telomeric DNA sequence, and the other without a probe. Then DNA is denatured at a temperature of + 82 ° C for 10 minutes and hybridized for 12 hours at room temperature in the dark. Then the cells are washed twice with incubation in the wash buffer DAKO at a temperature of + 40 ° C for 10 minutes. At the next stage, the cells are resuspended in DAKO solution for DNA staining (buffer containing propidium iiodide and RNA-ase A) and incubated for 30 minutes at a temperature of + 37 ° С in the dark. After DNA extraction, its concentration is determined, aligned for all samples, and the telomere length is determined. During the analysis by real-time PCR, the amount of DNA with a telomeric sequence in the genome is estimated. In parallel, real-time PCR is performed to a single-track venous DNA region. The ratio of the quantities of telomeric and single-track matrices is proportional to the length of telomeres. Peripheral blood samples are stored at room temperature for 24-48 hours. With the obtained lengths of the end sections of the chromosomes of peripheral blood leukocytes above the reference ones, mitochondrial dysfunction is determined, which, as we have already indicated above, is one of the prognostic factors of unfavorable course of NAFLD [1, 2].
Референсные значения теломерного теста, характерные для определенных возрастных категорий, представленные в таблице 2, получены на основании данных исследования Geraldin Aubert [Collapse of Telomere Homeostasis in Hematopoietic Cells Caused by Heterozygous Mutations in Telomerase Genes, PLoS Genet. 2012 May; 8(5): e1002696], длины теломер популяции.The reference telomeric test values specific to certain age categories, presented in Table 2, were obtained from the Geraldin Aubert study [Collapse of Telomere Homeostasis in Hematopoietic Cells Caused by Heterozygous Mutations in Telomerase Genes, PLoS Genet. 2012 May; 8 (5): e1002696], telomere population length.
Оборудование: проточный цитометр FC500 (Beckman Coulter, США) с программным обеспечением СХР; анализатор жизнеспособности клеток Vi-CELLTM (Beckman Coulter, США); электронные дозаторы на 20 мкл, 100 мкл, 1000 мкл, 5000 мкл и штатив для дозаторов (Biohit, Финляндия); контейнеры для жидких биологических отходов и твердых отходов; таймер; мешалка типа Вортекс; твердотельный термостат Bio RDB-120 (Biosan); микроцентрифуга 500 × g. Реактивы: Набор Telomtr PNA KitXFITC for Flow Cytometry (Dako, Дания) на 20 тестов, состоял из следующих реагентов: Vial 1 - буфер для гибридизации без зонда (Hybridization Solution - Vial1) - флакон на 12 мл, готовый к использованию, содержит 70% формамид; Vial 2 - буфер для гибридизации с зондом Telomtr PNA Kit\ FITC (Telomtr PNA Kit\FITC in hybridization solution-Vial 2) флакон на 12 мл, готовый к использованию, содержит 70% формамид; Vial 3 - отмывочный буфер (Wash Solution) флакон на 20 мл, перед использованием требуется 10-кратное разведение в дистиллированной воде. Vial 4 - ресуспензионный буфер для окрашивания ДНК (DNA-staining Solution), флакон на 4 мл, для использования требуется 10-кратное разведение в дистиллированной воде. Содержит пропидиум ийодид и РНКазу А. Реактивы хранят при температуре +2...+8°С.Equipment: flow cytometer FC500 (Beckman Coulter, USA) with CXP software; Vi-CELLTM cell viability analyzer (Beckman Coulter, USA); 20 µl, 100 µl, 1000 µl, 5000 µl electronic dispensers and a stand for dispensers (Biohit, Finland); containers for liquid biological waste and solid waste; timer; Vortex type mixer; solid thermostat Bio RDB-120 (Biosan); 500 × g microcentrifuge. Reagents: Telomtr PNA KitXFITC for Flow Cytometry kit (Dako, Denmark) for 20 tests, consisted of the following reagents: Vial 1 - buffer for hybridization without probe (Hybridization Solution - Vial1) - 12 ml bottle, ready to use, contains 70% formamide; Vial 2 - buffer for hybridization with the Telomtr PNA Kit \ FITC probe (Telomtr PNA Kit \ FITC in hybridization solution-Vial 2) ready-to-use vial of 12 ml, containing 70% formamide; Vial 3 - wash buffer (Wash Solution) 20 ml vial, requires 10-fold dilution in distilled water before use. Vial 4 - resuspension buffer for DNA staining (DNA-staining Solution), 4 ml vial, requires 10-fold dilution in distilled water. It contains propidium iiodide and RNase A. Reagents are stored at a temperature of +2 ... + 8 ° С.
Отличительные существенные признаки и причинно-следственная связь между ними и достигаемым результатом:Distinctive essential features and a causal link between them and the result achieved:
Выделяют ДНК из лейкоцитов венозной крови больного НАЖБП с последующим проведением полимеразной цепной реакции с применением при этом стандартных пар праймеров с последующим определением длины концевых участков хромосом лейкоцитов периферической крови, и при полученных значениях данного показателя выше референсных определяют митохондриальную дисфункции у больных НАЖБП.DNA is isolated from leukocytes of the venous blood of a patient with NAFLD followed by a polymerase chain reaction using standard primer pairs followed by determining the length of the terminal chromosomes of peripheral blood leukocytes, and when the values of this indicator are higher than the reference, mitochondrial dysfunction is determined in patients with NAFLD.
Из полученных данных обследования нами установлено, что у пациентов с НАЖБП, имеющих теломерный тест в пределах референсных значений, отсутствовали признаки митохондриальной дисфункции. При электронной микроскопии у данной группы пациентов во всех гепатоцитах немногочисленные жировые включения в виде крупных липидных капель. Капли окружены мембраной, к которой часто плотно прилежат митохондрии. Мембраны между ними не нарушены. В органеллах дистрофические и деструктивные изменения отсутствуют. В цитоплазме содержание полисом и гликогена не изменено.From the obtained survey data, we found that patients with NAFLD having a telomeric test within the reference values had no signs of mitochondrial dysfunction. With electron microscopy in this group of patients in all hepatocytes there are few fat inclusions in the form of large lipid droplets. The droplets are surrounded by a membrane to which the mitochondria are often densely attached. The membranes between them are not broken. In organelles dystrophic and destructive changes are absent. In the cytoplasm, the content of the polis and glycogen is not changed.
У пациентов с НАЖБП, имеющих количество нуклеотидных пар теломер выше референсных значений, наблюдались изменения, характерные для оксидативного стресса и митохондриальной дисфункции. При электронной микроскопии жировые включения встречаются в виде мелких, средних и крупных липидных капель. Во многих гепатоцитах они занимают значительные участки цитоплазмы. Очень крупные липидные капли занимают большую часть цитоплазмы, смещая ядро с небольшим участком цитоплазмы с органеллами на периферию клетки. Во всех гепатоцитах в органеллах видны выраженные дистрофические и деструктивные изменения. В строении митохондрий наблюдается их набухание или гомогенизация, фрагментация крист, частичное разрушение наружной мембраны. Резко уменьшено в цитоплазме и содержание полисом и гликогена.In patients with NAFLD, with the number of nucleotide pairs of telomeres above the reference values, changes characteristic of oxidative stress and mitochondrial dysfunction were observed. In electron microscopy, fatty inclusions are found in the form of small, medium and large lipid droplets. In many hepatocytes, they occupy significant portions of the cytoplasm. Very large lipid drops occupy most of the cytoplasm, displacing the nucleus with a small portion of the cytoplasm with organelles to the periphery of the cell. In all the hepatocytes, pronounced dystrophic and destructive changes are visible in the organelles. In the structure of mitochondria, their swelling or homogenization, fragmentation of the cristae, and partial destruction of the outer membrane are observed. The content of polysome and glycogen is sharply reduced in the cytoplasm.
Теломерный тест является наиболее объективным, менее затратным и более безопасным для пациентов методом исследования, в отличие от определения митохондриальной цитопатии с использование метода электронной микроскопии биоптатов печени.The telomeric test is the most objective, less expensive and safer for patients by the method of research, in contrast to the determination of mitochondrial cytopathy using the method of electron microscopy of liver biopsy specimens.
Мы предполагаем, что возникновение оксидативного стресса приводит к развитию митохондриальной дисфункции, что, в свою очередь, способствует активации теломеразы, фермента, участвующего в присоединении нуклеотидных пар к концевым участкам ДНК хромосом - теломерам. И, напротив, низкая длина теломер, определяемая у пациентов НАЖБП, указывает на отсутствие оксидативного стресса и митохондриальной дисфункции.We assume that the occurrence of oxidative stress leads to the development of mitochondrial dysfunction, which, in turn, contributes to the activation of telomerase, an enzyme involved in the attachment of nucleotide pairs to the end sections of chromosome DNA - telomeres. Conversely, low telomere length, as determined in patients with NAFLD, indicates a lack of oxidative stress and mitochondrial dysfunction.
Таким образом, совокупность существенных отличительных признаков является новой и позволяет, по сравнению с прототипом:Thus, the set of essential distinguishing features is new and allows, compared with the prototype:
• повысить точность, чувствительность и специфичность способа определения митохондриальной дисфункции у больных с НАЖП;• to increase the accuracy, sensitivity and specificity of the method for determining mitochondrial dysfunction in patients with NAAT;
• выполнить способ амбулаторно, что сокращает время его выполнения и снижает стоимость;• perform the method on an outpatient basis, which reduces the time of its execution and reduces the cost;
• проводить неинвазивное исследование, что исключает риск осложнений и травматичность выполнения способа, присущих прототипу, и в связи с этим увеличивает комплаентность пациентов к обследованию.• conduct a non-invasive study, which eliminates the risk of complications and the trauma of performing the method inherent in the prototype, and in this regard increases the compliance of patients for examination.
Приводим примеры из клинической практики:We give examples from clinical practice:
Пример 1. Пациент А., 34 года.Example 1. Patient A., 34 years.
Жалобы на выраженную утомляемость, общая слабость, снижение толерантности к физической нагрузке, тянущие боли в правом подреберье, эпизоды тошноты при погрешности в диете. Снижение умственного функционирования, уменьшение объема повседневной деятельности. По шкале FSS пациент набрал 37 баллов, что свидетельствует о наличие астении средней тяжести.Complaints of pronounced fatigue, general weakness, decreased tolerance to physical exertion, nagging pain in the right hypochondrium, episodes of nausea with errors in diet. Decrease in mental functioning, decrease in volume of daily activity. On the FSS, the patient scored 37 points, which indicates the presence of moderate asthenia.
Из анамнеза: Считает себя больным в течение 2 лет, когда впервые отметил утомляемость, снижение толерантности к физической нагрузке, через год стал беспокоить дискомфорт в правом подреберье, переходящий в тупую ноющую боль, обратился за помощью к терапевту, по данным обследования был выявлен синдром цитолиза, маркеры вирусных гепатитов отрицательны, аутоиммунная панель печени без отклонений от референсных значений. На основании полученных данных пациенту установлен диагноз: Неалкогольная жировая болезнь печени. Стеатогепатит, минимальной степени активности.From the anamnesis: Considers himself ill for 2 years, when he first noted fatigue, decreased exercise tolerance, a year later he began to be disturbed by discomfort in the right hypochondrium, turning into dull aching pain, turned to the therapist for help, according to a survey, cytolysis was detected , viral hepatitis markers are negative, autoimmune panel of the liver without deviations from reference values. Based on the data obtained, the patient was diagnosed with: Non-alcoholic fatty liver disease. Steatohepatitis, the minimum degree of activity.
При объективном осмотре:An objective examination:
Состояние удовлетворительное. Сознание ясное, кожные покровы обычной окраски и влажности, телосложение гиперстеническое.Satisfactory condition. Consciousness is clear, the skin is the usual color and moisture, body hyperstenic.
Язык обложен серым налетом, сосочки выражены. Склеры обычной окраски.The tongue is coated with gray bloom, the nipples are pronounced. Sclera normal color.
Пульс 80 уд. в мин.Pulse 80 beats. in minutes
АД 130/89 мм.рт.ст.HELL 130/89 mm.rt.st.
Тоны сердца приглушены, ритмичные.Heart sounds are muffled, rhythmic.
Дыхание жесткое, хрипов нет.ЧДД 18 в мин.Breathing hard, wheezing no. BCD 18 min.
Живот при пальпации мягкий, болезненный в правом подреберье.The abdomen during palpation is soft, painful in the right hypochondrium.
Край печени выступает на 2 см из-под края реберной дуги, край печени плотный, ровный, болезненный при пальпации.The edge of the liver protrudes 2 cm from under the edge of the costal arch, the edge of the liver is dense, even, painful on palpation.
Отеков нет.There is no edema.
Клинический анализ крови:Clinical blood test:
Биохимический анализ крови:Blood chemistry:
УЗИ печени: Жировой гепатоз II ст.Ultrasound of the liver: Fatty hepatosis II Art.
Генетическое исследование: Теломерный тест (т.п.н.) 7,7, то есть в данном клиническом случае отмечается нормальный показатель теломерного теста, (референсное значение для этой возрастной категории - 5,46-8,14), то есть митохондриальная дисфункция у данного больного отсутствует.Genetic testing: The telomeric test (kb) 7.7, that is, in this clinical case, the normal indicator of the telomeric test is observed (the reference value for this age group is 5.46-8.14), that is, mitochondrial dysfunction this patient is absent.
Пример 2. Пациент Н, 32 лет.Example 2. Patient H, 32 years old.
Жалобы на общую слабость, снижение работоспособности, невозможность сконцентрироваться, выполнение умственной работы стало практически невозможным, нарушение сна в ночное время, постоянная сонливость днем. По шкале тяжести астении FSS пациент набрал 57 баллов, признаки выраженного астенического расстройства. Боли в правом подреберье, тянущего характера, периодическое появление поносов.Complaints of general weakness, decreased performance, inability to concentrate, doing mental work has become almost impossible, sleep disturbance at night, constant sleepiness during the day. On a scale of severity of asthenia FSS, the patient scored 57 points, signs of marked asthenic disorder. Pain in the right hypochondrium, pulling character, periodic appearance of diarrhea.
Из анамнеза: Считает себя больным около 2,5 лет, когда впервые отметил утомляемость, общую слабость, снижение толерантности к физическим нагрузкам, дискомфорт в правом подреберье. В связи с чем обратился в поликлинику по месту жительства, где был выявлен синдром цитолиза. В ходе обследования данных вирусные маркеры отрицательные, показатели аутоиммунной панели в норме. Пациенту был уставлен диагноз: Неалкогольная жировая болезнь печени. Стеа-тогепатит умеренной степени активности.From the anamnesis: He considers himself a patient for about 2.5 years, when he first noted fatigue, general weakness, decreased tolerance to physical exertion, and discomfort in the right hypochondrium. In this connection, he turned to the clinic at the place of residence, where cytolysis syndrome was detected. In the course of the survey, the virus markers were negative, and the autoimmune panel was normal. The patient was diagnosed with Non-alcoholic fatty liver disease. Stea-tohepatitis moderate degree of activity.
При объективном осмотре: Состояние удовлетворительное. Сознание ясное, кожные покровы обычной окраски и влажности, телосложение нормостеничекое.At objective examination: The condition is satisfactory. Consciousness is clear, the skin is the usual color and moisture, the body normostenichekoe.
Язык обложен белым налетом, сосочки выражены.The tongue is coated with white bloom, nipples are pronounced.
Пульс 72 уд. в мин.Pulse 72 beats. in minutes
АД 120/80 мм.рт.ст.HELL 120/80 mm Hg
Тоны сердца приглушены, ритмичные.Heart sounds are muffled, rhythmic.
Дыхание жесткое, хрипов нет. ЧДД 18 в мин.Breathing hard, no wheezing. NPV 18 per minute
Живот при пальпации мягкий, дискомфортный в правом подреберье.The abdomen during palpation is soft, uncomfortable in the right hypochondrium.
Край печени выступает на 3 см из-под края реберной дуги, край печени плотный, ровный, болезненный при пальпации.The edge of the liver protrudes 3 cm from under the edge of the costal arch, the edge of the liver is dense, even, painful on palpation.
Отеков нет.There is no edema.
Клинический анализ крови:Clinical blood test:
Биохимический анализ крови:Blood chemistry:
УЗИ печени: Жировой гепатоз II ст.Ultrasound of the liver: Fatty hepatosis II Art.
Биопсия печени: У пациента при исследовании материала с помощью электронного микроскопа наблюдается нарушение жирового обмена (жировая дистрофия), которое сопровождается появлением в цитоплазме гепатоцитов липидных капель. Жировые включения встречаются преимущественно в виде мелких и средних липидных капель, которые занимают значительные участки цитоплазмы.Liver biopsy: When a patient examines material using an electron microscope, there is a violation of lipid metabolism (fatty degeneration), which is accompanied by the appearance of lipid drops in the cytoplasm of hepatocytes. Fatty inclusions are found mainly in the form of small and medium lipid droplets, which occupy significant portions of the cytoplasm.
Желчные капилляры у без нарушений, что свидетельствует об их проходимости.Bile capillaries in no violation, which indicates their patency.
Во всех гепатоцитах в органеллах видны выраженные дистрофические и деструктивные изменения. В строении митохондрий наблюдается их набухание или гомогенизация, фрагментация крист, частичное разрушение наружной мембраны. Содержание гранулярной эндоплазматической сети в клетках уменьшено. Она представлена единичными короткими канальцами или вакуолями с уменьшенным количеством связанных с ее мембранами рибосом и расположена вблизи митохондрий. Резко уменьшено в цитоплазме и содержание полисом и гликогена. Все эти изменения в гепатоцитах свидетельствуют о нарушении в них энергетической, синтетической и пластической функции, что приводит к гибели части органелл и появлению в цитоплазме значительных участков, которые выглядят оптически пустыми.In all the hepatocytes, pronounced dystrophic and destructive changes are visible in the organelles. In the structure of mitochondria, their swelling or homogenization, fragmentation of the cristae, and partial destruction of the outer membrane are observed. The content of the granular endoplasmic reticulum in the cells is reduced. It is represented by single short tubules or vacuoles with a reduced number of ribosomes bound to its membranes and is located near the mitochondria. The content of polysome and glycogen is sharply reduced in the cytoplasm. All these changes in hepatocytes indicate a violation of their energy, synthetic and plastic functions, which leads to the death of part of the organelles and the appearance in the cytoplasm of significant areas that look optically empty.
Генетическое исследование: Теломерный тест (т.п.н.) 9,5 то есть у пациента Н. отмечался уровень теломерного теста выше референсного значения (6,46-8,914), таким образом, у данного больного была определена митохондриальная дисфункция.Genetic testing: Telomeric test (kb) 9.5, that is, patient N. had a telomeric test level higher than the reference value (6.46-8.914), thus, this patient was identified mitochondrial dysfunction.
Это свидетельствует о наличие у пациента выраженного оксидативного стресса и активации теломеразы - фермента, способствующего увеличению концевых участков хромосом (теломер). Таким образом, происходит увеличение регенераторного потенциала организма.This indicates that the patient has pronounced oxidative stress and activation of telomerase, an enzyme that contributes to an increase in the end sections of chromosomes (telomeres). Thus, there is an increase in the regenerative potential of the organism.
Чувствительность заявляемого способа, составляющая 100%, рассчитана нами по формуле:The sensitivity of the proposed method, which is 100%, is calculated by us using the formula:
гдеWhere
ЧС - чувствительность способа;ES - the sensitivity of the method;
ИП - истинноположительные результаты;PI - true positive results;
ЛО - ложноотрицательные результаты.LO - false-negative results.
Чувствительность способа прототипа, составляющая 47,4%, рассчитана нами по формуле:The sensitivity of the prototype method, amounting to 47.4%, is calculated by us using the formula:
ЧП - чувствительность прототипа;PE - the sensitivity of the prototype;
ИП - истинноположительные результаты;PI - true positive results;
ЛО - ложноотрицательные результаты.LO - false-negative results.
Точность заявляемого способа, составляющая 100%, рассчитана нами по формуле:The accuracy of the proposed method, which is 100%, is calculated by us using the formula:
ТС - точность способа;TC - the accuracy of the method;
ИП - истинноположительные результаты;PI - true positive results;
ИО - истинноотрицательные результаты;IO - true negative results;
ЛП - ложноположительные результаты;LP - false positive results;
ЛО - ложноотрицательные результаты.LO - false-negative results.
Точность способа прототипа, составляющая 52,5%, рассчитана нами по формуле:The accuracy of the prototype method, which is 52.5%, is calculated by us using the formula:
ТП - точность способа прототипа;TP - the accuracy of the method of the prototype;
ИП - истинноположительные результаты;PI - true positive results;
ИО - истинноотрицательные результаты;IO - true negative results;
ЛП - ложноположительные результаты;LP - false positive results;
ЛО - ложноотрицательные результаты.LO - false-negative results.
Специфичность заявляемого способа, составляющая 100%, рассчитана нами по формуле:The specificity of the proposed method, which is 100%, is calculated by us according to the formula:
СС - специфичность способаSS - the specificity of the method
ИО - истинноотрицательные результаты;IO - true negative results;
ЛП - ложноположительные результаты;LP - false positive results;
Специфичность способа прототипа, составляющая 57%, рассчитана нами по формуле:The specificity of the prototype method, which is 57%, is calculated by us using the formula:
СП - специфичность прототипаSP - prototype specificity
ИО - истинноотрицательные результаты;IO - true negative results;
ЛП - ложноположительные результаты;LP - false positive results;
Таким образом, заявляемый способ повышает точность определения митохондриальной дисфункции у больных неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП), в сравнении с электронной микроскопией биоптатов печени (способ прототип) на 47,5%, чувствительность - на 52,6%, а специфичность - на 43,0%. Заявляемый способ, в отличие от прототипа, возможно выполнять амбулаторно, что сокращает время обследования, проводимого с целью подбора медикаментозной терапии и снижает его стоимость. Неинвазивность исследования исключает риск осложнений и травматичность выполнения способа, присущих прототипу, и в связи с этим увеличивает комплаентность пациентов к обследованию.Thus, the inventive method improves the accuracy of mitochondrial dysfunction in patients with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), in comparison with electron microscopy of liver biopsy specimens (method prototype) by 47.5%, sensitivity - by 52.6%, and specificity - by 43 , 0%. The inventive method, in contrast to the prototype, it is possible to perform on an outpatient basis, which reduces the time of the survey, conducted with the aim of selecting drug therapy and reduces its cost. Non-invasive research eliminates the risk of complications and the trauma of performing the method inherent in the prototype, and in this regard increases the compliance of patients to the survey.
Список используемой литературы:Bibliography:
1. Селиверстов П.В., Радченко В.Г. Роль митохондриальной цитопатии при стеатозе у больных неалкогольной жировой болезнью печени // Эффективная фармакотерапия - 2017, №16. - С. 16-24.1. Seliverstov P.V., Radchenko V.G. The role of mitochondrial cytopathy in case of steatosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease // Effective pharmacotherapy - 2017, # 16. - p. 16-24.
2. Радченко В.Г., Селиверстов П.В., Иванова В.Ф., Ситкин С.И. Алгоритм лечения неалкогольной жировой болезни печени и роль митохондриальной дисфункции в ее развитии // Фарматека - 2017. - №6. С. 12-19.2. Radchenko V.G., Seliverstov P.V., Ivanova V.F., Sitkin S.I. The algorithm for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease and the role of mitochondrial dysfunction in its development // Farmakheta - 2017. - №6. Pp. 12-19.
3. Клембовский А.И., Сухорукое B.C. Учение о митохондриальной патологии в современной медицине. Материалы I Всероссийской конференции «Клинические и патогенетические проблемы нарушений клеточной энергетики». М.: 1999: 28-303. Klembovsky, A.I., Sukhorukovy, B.C. The doctrine of mitochondrial pathology in modern medicine. Materials of the I All-Russian Conference "Clinical and pathogenetic problems of disorders of cellular energy". M .: 1999: 28-30
4. Селиверстов П.В. Неалкогольная жировая болезнь печени: от теории к практике // Архив внутренней медицины - 2015. - №1 (21). С. 19-264. Seliverstov P.V. Non-alcoholic fatty liver disease: from theory to practice // Archive of Internal Medicine - 2015. - №1 (21). Pp. 19-26
5. Пути верификации неалкогольной жировой болезни печени / П.В. Селиверстов и др. // Врач- 2015. - №10. С. 53-555. Ways of verification of non-alcoholic fatty liver disease / P.V. Seliverstov et al. // Doctor-2015. - №10. Pp. 53-55
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018126445A RU2691108C1 (en) | 2018-07-17 | 2018-07-17 | Method for determining mitochondrial dysfunction in patients with non-alcoholic fatty liver disease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018126445A RU2691108C1 (en) | 2018-07-17 | 2018-07-17 | Method for determining mitochondrial dysfunction in patients with non-alcoholic fatty liver disease |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2691108C1 true RU2691108C1 (en) | 2019-06-11 |
Family
ID=66947462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018126445A RU2691108C1 (en) | 2018-07-17 | 2018-07-17 | Method for determining mitochondrial dysfunction in patients with non-alcoholic fatty liver disease |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2691108C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA23577U (en) * | 2007-02-26 | 2007-05-25 | Univ Kharkiv State Medical | Method for diagnosing of mitochondropathy |
| RU2595827C1 (en) * | 2015-06-08 | 2016-08-27 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for prediction of hepatotrophic therapy in patients with non-alcoholic fatty liver disease |
| WO2019018610A1 (en) * | 2017-07-19 | 2019-01-24 | Bio-Rad Europe Gmbh | Biomarker combinations to simultaneously evaluate non-alcoholic steatohepatitis and hepatic fibrosis status |
-
2018
- 2018-07-17 RU RU2018126445A patent/RU2691108C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA23577U (en) * | 2007-02-26 | 2007-05-25 | Univ Kharkiv State Medical | Method for diagnosing of mitochondropathy |
| RU2595827C1 (en) * | 2015-06-08 | 2016-08-27 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for prediction of hepatotrophic therapy in patients with non-alcoholic fatty liver disease |
| WO2019018610A1 (en) * | 2017-07-19 | 2019-01-24 | Bio-Rad Europe Gmbh | Biomarker combinations to simultaneously evaluate non-alcoholic steatohepatitis and hepatic fibrosis status |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Qi et al. | micro-RNA screening and prediction model construction for diagnosis of salt-sensitive essential hypertension | |
| Roy et al. | Wound site neutrophil transcriptome in response to psychological stress in young men | |
| Brinkmeyer-Langford et al. | Consequences of perinatal bisphenol A exposure in a mouse model of multiple sclerosis | |
| RU2619872C1 (en) | Method for estimation of individual risk of excessive body and obesity development in children consuming drinking water with increased chloroform and tetrachloromethane content | |
| CN107893114A (en) | For primer pair, kit and the method for instructing fentanyl class medicine personalized medicine related gene to detect | |
| RU2691108C1 (en) | Method for determining mitochondrial dysfunction in patients with non-alcoholic fatty liver disease | |
| RU2595827C1 (en) | Method for prediction of hepatotrophic therapy in patients with non-alcoholic fatty liver disease | |
| CN104946772B (en) | Mark and its application that mitochondria associated serum miRNA occurs as human obesity | |
| CN110241197A (en) | Primer combination of probe and kit and application for instructing Atorvastatin drug personalized medicine related gene to detect | |
| CN110295224A (en) | Primer combination of probe and kit and application for instructing Rosiglitazone drug personalized medicine related gene to detect | |
| CN110373457A (en) | A kind of mRNA marker and its application for ulcerative colitis diagnosis | |
| RU2687731C1 (en) | Diagnostic technique in children of asthenic-vegetative syndrome under exposure conditions with aluminum | |
| CN110551821B (en) | Primers, probe and kit for detecting MEF2D gene rearrangement by using fluorescent quantitative PCR | |
| Komar et al. | Hepatic SOD1 gene expression changes in the NAFLD pathogenesis in obesity | |
| RU2533286C1 (en) | Method for prediction of clinical course and treatment efficacy of type 2 diabetes mellitus | |
| CN112626199A (en) | Primer and method for detecting risk prediction site for converting chronic hepatitis into liver cirrhosis | |
| CN112852944A (en) | Application of long-chain non-coding RNA in preparation of liver injury biomarker | |
| Wiersielis et al. | Intermittent fasting disrupts hippocampal-dependent memory and norepinephrine content in aged male and female mice | |
| CN112626204B (en) | Primers and method for detecting HLA-B1502 typing useful for guiding administration of carbamazepine | |
| CN113398247B (en) | Application of substance for promoting CD44 level in preparation of product for treating/preventing vascular endothelial inflammation by promoting CD44 | |
| RU2779085C1 (en) | Method for detecting predisposition to the development of metabolic syndrome in the form of obesity in schoolchildren aged 7-10 years | |
| Elbahr et al. | PNPLA3 L148M (rs738409) polymorphism as a risk for new onset diabetes mellitus and obesity in non-NASH/cryptogenic living related donor liver transplant recipients | |
| RU2750659C1 (en) | Method for determining the etiology of acute toxic hepatitis | |
| Kofinova et al. | Genetic Polymorphisms in Bulgarian Children with Non-alcoholic Fatty Liver Disease | |
| CN114525334B (en) | Primer group, probe group, kit and method for detecting vitamin D susceptibility gene polymorphism |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200718 |