RU2688434C1 - Способ дифференциации штаммов Helicobacter pylori путем молекулярно-генетического типирования - Google Patents
Способ дифференциации штаммов Helicobacter pylori путем молекулярно-генетического типирования Download PDFInfo
- Publication number
- RU2688434C1 RU2688434C1 RU2018135336A RU2018135336A RU2688434C1 RU 2688434 C1 RU2688434 C1 RU 2688434C1 RU 2018135336 A RU2018135336 A RU 2018135336A RU 2018135336 A RU2018135336 A RU 2018135336A RU 2688434 C1 RU2688434 C1 RU 2688434C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primers
- dna
- ind
- gene
- pylori
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 title claims description 11
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 title claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 35
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 claims description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 4
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 101100106703 Escherichia coli (strain K12) yphC gene Proteins 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 101100508942 Haloferax volcanii (strain ATCC 29605 / DSM 3757 / JCM 8879 / NBRC 14742 / NCIMB 2012 / VKM B-1768 / DS2) ipp gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 206010019375 Helicobacter infections Diseases 0.000 description 1
- 101100227989 Mus musculus Fbxl14 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 101100408978 Streptococcus agalactiae serotype V (strain ATCC BAA-611 / 2603 V/R) ppaC gene Proteins 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 101150088806 atpA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150026213 atpB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000023652 chronic gastritis Diseases 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 101150095218 der gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- -1 efp Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 101150029137 mutY gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 101150092823 ppa gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011867 re-evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150055940 ureI gene Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способам молекулярно-генетического типирования штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, которые используются при микробиологическом и молекулярно-генетическом мониторинге штаммов H.pylori, циркулирующих на различных территориях, с целью их дифференциации. Из ДНК Н. pylori исследуемой пробы выявляют пять общих INDEL-генов, имеющих делеции определенного размера, а именно IND-3330, 5605, 6405, 340 и 1390, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфических праймеров, выявляющих два альтернативных аллеля: к гену IND-3330 - праймерыис длиной амплифицированного фрагмента 60 п. н. или 69 п. н., к гену IND-5605 - праймерыис длиной амплифицированного фрагмента 93 п. н. или 102 п. н., к гену IND-6405 - праймерыис длиной амплифицированного фрагмента 100 п. н. или 106 п. н. к гену IND-340 - праймерыис длиной амплифицированного фрагмента 79 п. н. или 85 п. н., к гену IND-13 90 - праймерыис длиной амплифицированного фрагмента 64 п. н. или 76 п. н., при этом учет результатов дифференциации проводят визуально после электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по пяти INDEL-генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов Н. pylori. При этом ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит: 1,5 мМ Mg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера), 25 нг ДНК-матрицы,1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК, объемом 5 мкл, которую получают из разных штаммов Н. pylori. ПЦР проводят с соблюдением режимов: 1 этап - денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл); 2 этап - денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 55°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с (35 циклов); 3 этап - досинтез при 72°С - 7 мин (1 цикл). Способ позволяет достоверно и быстро дифференцировать один штамм от другого и определить их происхождение. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 4 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способам молекулярно-генетического типирования штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, которые используются при микробиологическом и молекулярно-генетическом мониторинге штаммов H.pylori, циркулирующих на различных территориях, с целью их дифференциации.
В настоящее время существует проблема распространенности хеликобактериоза среди различных групп населения, а пути его передачи позволяют рассматривать хеликобактериоз как инфекционное заболевание, носящее характер эпидемии. Инфицированность взрослого населения России, по результатам выборочных исследований, колеблется от 50 до 80%, а в некоторых регионах она приближается к 100%, в связи с чем на федеральном и региональном уровнях уделяется большое внимание внедрению современных методов диагностики Н. pylori-ассоциированных заболеваний и мониторинга инфекции.
Эрадикация Н. pylori является одним из основных направлений в терапии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, однако даже после интенсивной терапии, Н. pylori вновь обнаруживается в биоптатах слизистой оболочки желудка. По данным [1], частота повторного выявления Н. pylori в течение года после успешной эрадикационной терапии варьирует от 0 до 41.5%. Повторное выявление Н. pylori, как полагают, происходит посредством двух различных механизмов: реинфекции и рецидивирования. Подтверждением факта реинфекции является наличие геномных различий между прежним и новым штаммами Н. pylori. Для изучения путей передачи хеликобактериоза также необходим простой, надежный и воспроизводимый способ молекулярного генотипирования Н. pylori.
Известны способы молекулярного типирования Н. pylori, а именно, гель-электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) [2], полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP) [3], приемы, направленные на определение межгенных повторяющихся (ERIC-PCR) и внегенных палиндромных последовательностей у энтеробактерий (REP-PCR) [4, 5], применение универсальных (случайных) праймеров в системе RAPD-PCR [6] и методы VNTR-анализа [7, 8].
Однако практическое использование многих из них ограничивается как сложностью методического характера, так и проблемами с воспроизводимостью и оценкой результатов [9].
Известен способ анализа вариабельных тандемных повторов - VNTR-анализ [7, 8], позволяющий определять уникальную аллельную формулу для каждой культуры и тем самым четко дифференцировать штаммы самых различных возбудителей. VNTR-анализ заключается в том, что проводят амплификацию ДНК исследуемого штамма с набором специфических праймеров к индивидуальному VNRT-локусу. Полученные специфические фрагменты исследуют различными методами с целью точного определения молекулярной массы амплифицированного фрагмента ДНК. В зависимости от установленной массы каждого фрагмента вычисляют число тандемных повторов для исследуемого локуса. Подобное исследование проводят для нескольких локусов. Сочетание чисел, характеризующих число повторов каждого из изученных локусов, составляет уникальную аллельную VNTR-формулу для анализируемого штамма H.pylori.
Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков. Индивидуальные амплифицированные VNTR-фрагменты обладают большой молекулярной массой, и соседние аллели отличаются весьма незначительно: обычно всего шесть нуклеотидов, что и делает весьма затруднительным определение их истинного веса с точностью до нуклеотида. Для точного определения размера аллелей необходимы сложные и трудоемкие методики определения молекулярной массы амплифицированного фрагмента.
Известны исследования, которые показали наличие в генах различных живых организмов особых стабильно наследуемых генетических характеристик, заключающихся во вставках-делециях (insertions/deletions) коротких фрагментов ДНК, при этом такие гены обозначают как INDEL-гены. Изучение полиморфизма INDEL-генов в настоящее время широко используется при молекулярном типировании [10].
За прототип выбран способ мультилокусного секвенирования-типирования (MLST) генов "домашнего хозяйства" [11], который заключается в выделении ДНК из исследуемой культуры с с помощью набора Instagene Matrix Kit (Bio-Rad Cat. No. 732-6030), постановки ПЦР со специфическими праймерами к семи генам Н. pylori (ureI, mutY, efp, ppa, yphC, atpA, and trpC), затем проводят секвенирование всех семи амплифицированных фрагментов, определяют позиции всех нуклеотидных замен и с помощью сложного программного обеспечения определяют генотип каждого штамма.
Недостатком способа является то, что для проведения исследования необходим сложный и дорогостоящий импортный ДНК-секвенатор, а само проведение анализа требует использования дорогостоящих импортных расходных материалов, и сложной процедуры интерпретации полученных результатов с помощью дорогостоящего программного обеспечения. Эти обстоятельства приводит к крайне высокой стоимости анализа, его большой продолжительности во времени (от нескольких дней до нескольких недель) и полной зависимости исследователя от поставок производителем расходных материалов из-за рубежа.
Технической задачей настоящего изобретения является разработка нового способа позволяющего достоверно, быстро и с невысокой себестоимостью осуществлять дифференциацию штаммов Н. pylori, выделенных в различных регионах, областях и странах.
Поставленная задача достигается тем, что в известном способе дифференциации штаммов Helicobacter pylori путем молекулярно-генетического типирования, включающем выделение ДНК из исследуемого штамма Н. pylori, постановку ПНР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза, из ДНК исследуемого штамма Н. pylori выявляют пять общих INDEL-генов, имеющих делеции определенного размера а именно IND-3330, 5605, 6405, 340 и 1390, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфических праймеров, выявляющих два альтернативных аллеля:
к гену IND-3330 - праймеры 
и
к гену IND-5605 - праймеры 
и
к гену IND-6405 - праймеры 
и
к гену IND-340 - праймеры 
и
к гену IND-13 90 - праймеры 
и
при этом учет результатов дифференциации проводят визуально после электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по пяти INDEL-генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы, устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов Н. pylori.
При этом ПИР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит:
1,5 мМ Mg-буфер,
0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера),
25 нг ДНК-матрицы,
1 ед.. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК, объемом 5 мкл, которую получают из разных штаммов Н. pylori.
Кроме того ПНР проводят с соблюдением режимов:
1 этап - денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл);
2 этап - денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 55°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с (35 циклов);
3 этап - досинтез при 72°С - 7 мин (1 цикл).
Обоснование выбора праймеров.
С помощью программного обеспечения, разработанного авторами ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, было проанализировано более 3000 генов Н. pylori в базе данных GenBank. В процессе компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей штаммов Н. pylori в базе данных GenBank авторы идентифицировали ряд INDEL-генов, отличающихся по размеру у штаммов Н. pylori различного происхождения, и имеющих только два альтернативных варианта размера ампликона. В результате было выделено 5 общих генов, имеющих делеции определенного размера, а именно:
IND - 3330, 5605, 6405, 340 и 1390 (см. таблицу 1).
С помощью программного обеспечения Primer М и BLAST NCBI к варьирующим участкам указанных генов 5605, 6405, 340, 3330,1390 были сконструированы специфические праймеры.
Набор значений размера фрагментов для каждого штамма по каждому из пяти INDEL-генов является его индивидуальной характеристикой и позволяет дифференцировать один штамм от другого и определять их происхождение с помощью кластерного анализа.
Способ осуществляется следующим образом.
Перед постановкой способа дифференциации штаммов Helicobacter pylori выделяют ДНК исследуемой культуры. Бактериальную суспензию исследуемого штамма в дистиллированной воде вносят в микропробирку объемом 1,5 мл, после чего проводят обеззараживание материала и выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [12]. Затем в ПЦР проводят амплификацию выделенной ДНК со специфическими праймерами:
к гену 3330,
- 
с длиной амплифицированного фрагмента 60 п. н. или 69 п. н.,
к гену 5605,
- 
с длиной амплифицированного фрагмента 93 п. н. или 102 п. н.,
к гену 6405,
- 
с длиной амплифицированного фрагмента 100 п. н. или 106 п. н.,
к гену 340,
- 
с длиной амплифицированного фрагмента 79 п. н. или 85 п. н.,
к гену 1390,
- 
с длиной амплифицированного фрагмента 64 п. н. или 76 п. н.
Условия проведения реакции амлификации.
Амплификацию проводят по следующей схеме: денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 55°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с; синтез при 72°С - 7 мин (1 цикл).
Реакционную смесь объемом 25 мкл готовят из расчета: 1,5 мМ Mg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера) 25 нг ДНК-матрицы, 1 ед.. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода. В качестве матрицы используют геномную ДНК (объемом 5 мкл), полученную из разных штаммов Н. pylori. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК.
При этом учет результатов типирования проводят визуально после электрофореза, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по пяти INDEL-генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы, устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов Н. Pylori (hp Europe, hspEAsiahsp, WAfrica). что дает возможность дифференцировать один штамм от другого.
Проведенные исследования доказывают, что использование разработанного способа молекулярно-генетического типирования штаммов Н. pylori по структуре INDEL-генов позволяет выявлять штаммы с различными аллельными вариантами INDEL-генов.
Пример 1.
В эксперименте использованы штаммы Н. pylori из коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института, выделенные в Ростовской области. Бактерии Н. pylori (штаммы №30, 48, 53, 59, 88, 90, 115, 124 и R) суспендируют 150 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводят выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [12]. Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к гену 3330 
и 
с длиной амплифицированного фрагмента 60 п. н. или 69 п. н.; и праймеры к гену 5605 
и 
с длиной амплифицированного фрагмента 93 п. н. или 102 п. н.
В реакционную ПЦР смесь добавляют по 1 микролитру специфических праймеров, 1 микролитр термостабильной ДНК-полимеразы и вносили 5 микролитров супернатанта ДНК. Общий объем реакционной смеси составляет 25 микролитров. Смесь перемешивают на вортексе и амплифицируют при условиях: 95°С - 3 мин (1 цикл); 95°С - 20 сек, 55°С - 20 сек, 72°С - 20 сек (35 циклов), 72°С - 7 мин. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК (фото 1). На фото 1 отражен: электрофорез продуктов амплификации INDEL-генов 3330 и 5605.
А - продукты амплификации INDEL-гена 3330; стрелки указывают позиции аллелей 60 и 69 п. н., М-маркерная ДНК.
В - продукты амплификации INDEL-гена 5605; стрелки указывают позиции аллеля 102 п. н., М-маркерная ДНК.
Таким образом анализ продуктов амплификации INDEL-гена 3330 (А) показывает, что два из шести изученных штаммов (№30 и 53) имеют аллель 69 п. н., а четыре(48,59,88,90) - аллель 60 п. н. Анализ продуктов амплификации INDEL-гена 5605 (В) показывает, что все три изученных, штамма имеют одинаковый аллель 102 п. н. Данные по размерам аллелей для каждого штамма заносят в таблицу и сравнивают величины аллелей между собой и с идентификационной таблицей 1 для штаммов Н. Pylori из базы данных GenBank.
Вывод:исследуемые штаммы можно отличить друг от друга по одному локусу, но недостаточно дифференцировать так как они могут быть как Европейские так и Азиатские, в связи с этим потребуются дополнительные исследования к другим INDEL-генам.
Пример 2.
Из коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института были взяты штаммы Н. pylori (№R, 134, 146, 155, 157, 206, 70, 77, 115, 124). Бактерии Н. pylori суспендируют в 150 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводят выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [12].
Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к гену 6405 
и 
с длиной амплифицированного фрагмента 100 п. н. или 106 п. н.; праймеры к гену 340 
и 
, с длиной амплифицированного фрагмента 79 п. н. или 85 п. н.; праймеры к гену 1390 
и 
с длиной амплифицированного фрагмента 64 п. н. или 76 п. н.
В реакционную ПЦР смесь добавляют по 1 микролитру специфических праймеров, 1 микролитр термостабильной ДНК-полимеразы и вносят 5 микролитров супернатанта ДНК. Общий объем реакционной смеси составляет 25 микролитров. Смесь перемешивают на вортексе и амплифицируют при условиях: 95°С - 3 мин (1 цикл); 95°С - 20 сек, 55°С - 20 сек, 72°С - 20 сек (35 циклов), 72°С - 7 мин.
Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК (см. фото 2).
А - продукты амплификации INDEL-генов 6405, 340; стрелки указывают позиции аллелей 100,106 п. н. и 79, 85 п. н., М-маркерная ДНК.
В - продукты амплификации INDEL-гена 1390; стрелки указывают позиции аллелей 64 и 76 п. н., М-маркерная ДНК.
Анализ продуктов амплификации INDEL-гена 6405 (А) показывает, что два из шести изученных штаммов (157,206) имеют аллель 106 п. н., а четыре (R,134,146,155) - аллель 100 п. н. Анализ продуктов амплификации INDEL-гена 340 (А) показывает, что пять из шести изученных штаммов (134,146,155,157,206) имеют аллель 79 п. н., а один (R) - аллель 85 п. н. Анализ продуктов амплификации INDEL-гена 1390 (В) показывает, что два из шести (R,134) изученных штаммов имеют аллель 64 п. н., а четыре (70,77,115,124) - аллель76 п. н. Данные по размерам аллелей для каждого штамма заносят в таблицу, и проводят сравнительный анализ выявленных INDEL-генов между собой и с идентификационной таблицей 1.
Следовательно для дифференциации указанных штаммов необходимо провести дополнительные исследования к другим INDEL-генам.
Пример 3. Расследование случая семейного хеликобактериоза.
У семьи из трех человек (отец, мать и ребенок) был диагностирован хронический гастрит. После взятия биопсийного материала из каждого образца была выделена культура Н. pylori. Для выяснения происхождения штамма Н. pylori у ребенка был проведен анализ всех выделенных культур, как описано в примерах 1 и 2. Результаты определения аллелей 5 INDEL-генов приведены в таблице 2.
Результаты показывают совпадение генотипов штаммов Н. pylori, выделенных от матери и ребенка по всем пяти INDEL-генам и их отличие от генотипа штамма Н. pylori, выделенного от отца.
Вывод: передача штамма Н. pylori ребенку могла произойти только от матери.
Пример 4.
Из коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института выбраны 14 штаммов Н. pylori, выделенных в Ростовской области. Последние дифференцированы методом молекулярно-генетического типирования с помощью предложенного способа (см. табл. 3). Полученные результаты свидетельствуют о возможности дифференциации штаммов Н. pylori по указанным пяти INDEL-генам.
Анализ коллекции штаммов Н. pylori, выделенных в Ростовской области, подтвердил существование полиморфизма длин указанных генов. Обнаружено существование всего двух четко дискриминируемых по электрофоретической подвижности аллелей для каждого из INDEL-генов (см. таблицу 3).
Вывод: Набор значений размера фрагментов аллелей для каждого штамма по каждому из пяти INDEL-генов является его индивидуальной характеристикой и позволяет дифференцировать один штамм от другого и определять их происхождение путем сравнения с идентификационной таблицей 1.
Использование предполагаемого изобретения позволяет достоверно и быстро за счет подбора праймеров унифицировать и создать набор значений размера фрагментов аллелей для каждого штамма Н. pylori по каждому из пяти INDEL-генов, которые являются его индивидуальной характеристикой и позволяют дифференцировать один штамм от другого и определять их происхождение.
Источники информации
1. Xia Н.Х., Talley N.J, Keane СТ., 
C.F. Reccurence of Helicobacter pylori infection after successful eradication: nature and possible causes // Dig. Dis. Sci. - 1997. - Vol. 42. - №9. - P. 1821-1834.
2. Takami, S., T. Hayashi, H. Akashi, T. Shimoyama, and T. Tamura. 1994. Genetic heterogeneity of Helicobacter pylori by pulse-field gel electrophoresis and re-evaluation of DNA homology. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. Suppl. 1:S53-S60
3. Salaun, L., C. Audibert, G. Le Ley, C. Burucoa, J.L. Fauchere, and B. Picard. 1998. Panmictic structure of Helicobacter pylori demonstrated by the comparative study of six genetic markers. FEMS Microbiol. Lett. 161:231-239.
4. Ann-Catrin, E.Т., N. Hosseini, A.M. Svennerholm, and I. Bo 
. 2000. Different Helicobacter pylori strains colonize the antral and duodenal mucosa of duodenal ulcer patients. Helicobacter 5:69-78.
5. Miehlke, S., R. Thomas, O. Gutierrez, D.Y. Graham, and M.F. Go. 1999. DNA fingerprinting of single colonies of Helicobacter pylori from gastric cancer patients suggests infection with a single predominant strain. J. Clin. Microbiol. 37:245-247.
6. Akopyantz, N., N. O. Bukanov, T. U.Westblom, S. Kresovich, and D. E. Berg. 1992. DNA diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori detected by PCR-based RAPD fingerprinting. Nucleic Acids Res. 20:5137-5142.
7. Guo. Genotyping analysis of Helicobacter pylori using multiple-locus variable-number tandem-repeats analysis in five regions of China and Japan/. Guo et al. // BMC Microbiology 2011, 11:197.
8. Vladimir M. Sorokin*, Ruslan V. Pisanov, Elena A. Bereznyak, Lubov A. Prozorova. Development of a Multiple-Locus Variable number of tandem repeat Analysis (MLVA) for Helicobacter pylori and its application to Helicobacter pylori isolates from Rostov Region, Russia. Electron. J. Biomed. - 2012, 3:32-9. (www.biomed.uninet.edu.06.2013.)
9. Van Belkum A., Struelens M., de Visser H. et al. Role the genomic typing in taxonomy, evolutionary genetics and microbial epidemiology // J. Clin. Microbiol.Rev. - 2001. - Vol. 14(3). - P. 547-560.
10. Larsson P., Svensson K., Karlsson L., Guala D., Granberg M., Forsman M., and Johansson A. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis. // Emerging Infectious Diseases 2007. Vol. 13, No. 11, P. 1725-1732.
11. Silvia E Molina-Castro, Dayana Herrera, Wendy 
Vanessa 
& Clas Une (2014) The geographic origin of Helicobacter pylori isolated from Costa Rican patients, Gut Microbes, 5:4, 517-521, DOI: 10.4161/gmic.32148
12. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: Методические указания. МУ 1.3.2569-09. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2009. - 35 с.
Claims (21)
1. Способ дифференциации штаммов Helicobacter pylori путем молекулярно-генетического типирования, включающий выделение ДНК из исследуемого штамма Н. pylori, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза, отличающийся тем, что из ДНК исследуемого штамма Н. pylori выявляют пять общих INDEL-генов, имеющих делеции определенного размера, а именно IND-3330, 5605, 6405, 340 и 1390, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфических праймеров, выявляющих два альтернативных аллеля:
к гену IND-3330 - праймеры 
и
к гену IND-5605 - праймеры 
и
к гену IND-6405 - праймеры 
и
к гену IND-340 - праймеры 
и
к гену IND-1390 - праймеры 
и
при этом учет результатов дифференциации проводят визуально после электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по пяти INDEL-генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов Н. pylori.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ПНР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит:
1,5 мМ Mg-буфер,
0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера),
25 нг ДНК-матрицы,
1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК объемом 5 мкл, которую получают из разных штаммов Н. pylori.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ПЦР проводят с соблюдением режимов:
1 этап - денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл);
2 этап - денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 55°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с (35 циклов);
3 этап - досинтез при 72°С - 7 мин (1 цикл).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018135336A RU2688434C1 (ru) | 2018-10-05 | 2018-10-05 | Способ дифференциации штаммов Helicobacter pylori путем молекулярно-генетического типирования |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018135336A RU2688434C1 (ru) | 2018-10-05 | 2018-10-05 | Способ дифференциации штаммов Helicobacter pylori путем молекулярно-генетического типирования |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2688434C1 true RU2688434C1 (ru) | 2019-05-21 |
Family
ID=66636752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018135336A RU2688434C1 (ru) | 2018-10-05 | 2018-10-05 | Способ дифференциации штаммов Helicobacter pylori путем молекулярно-генетического типирования |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2688434C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2816184C1 (ru) * | 2023-05-24 | 2024-03-26 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ дифференциации штаммов Pseudomonas aeruginosa с помощью молекулярно-генетического типирования |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2346987C2 (ru) * | 2007-12-25 | 2009-02-20 | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для ускоренной диагностики коклюша |
| RU2457255C2 (ru) * | 2010-06-01 | 2012-07-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии | Синтетические олигонуклеотидные праймеры, способ выявления и дифференциации штаммов вируса лихорадки долины рифт на основе полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа |
| RU2478717C1 (ru) * | 2011-09-23 | 2013-04-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ дифференцирования подвидов туляремийного микроба |
| RU2596401C1 (ru) * | 2015-03-30 | 2016-09-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ дифференциации токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы по ингибирующей активности |
-
2018
- 2018-10-05 RU RU2018135336A patent/RU2688434C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2346987C2 (ru) * | 2007-12-25 | 2009-02-20 | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для ускоренной диагностики коклюша |
| RU2457255C2 (ru) * | 2010-06-01 | 2012-07-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии | Синтетические олигонуклеотидные праймеры, способ выявления и дифференциации штаммов вируса лихорадки долины рифт на основе полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа |
| RU2478717C1 (ru) * | 2011-09-23 | 2013-04-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ дифференцирования подвидов туляремийного микроба |
| RU2596401C1 (ru) * | 2015-03-30 | 2016-09-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ дифференциации токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы по ингибирующей активности |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2816184C1 (ru) * | 2023-05-24 | 2024-03-26 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ дифференциации штаммов Pseudomonas aeruginosa с помощью молекулярно-генетического типирования |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| El-Sayed et al. | Molecular biological tools applied for identification of mastitis causing pathogens | |
| Iraola et al. | Application of a multiplex PCR assay for Campylobacter fetus detection and subspecies differentiation in uncultured samples of aborted bovine fetuses | |
| Motiwala et al. | Current understanding of the genetic diversity of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis | |
| Kumar et al. | Rapid multiplex PCR assay for the simultaneous detection of the Brucella Genus, B. abortus, B. melitensis, and B. suis | |
| RU2458141C1 (ru) | Способ идентификации токсигенных штаммов v. cholerae o1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления | |
| Calleros et al. | Assessing the intra-species genetic variability in the clonal pathogen Campylobacter fetus: CRISPRs are highly polymorphic DNA markers | |
| Xin et al. | Rapid detection and differentiating of the predominant Salmonella serovars in chicken farm by TaqMan multiplex real-time PCR assay | |
| Amoupour et al. | Differentiation of Brucella abortus and B. melitensis biovars using PCR-RFLP and REP-PCR | |
| US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| Gand et al. | Development of a real-time PCR method for the genoserotyping of Salmonella Paratyphi B variant Java | |
| RU2612137C1 (ru) | Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica | |
| RU2360972C1 (ru) | Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления | |
| RU2405836C2 (ru) | Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа beijing | |
| WO2012087135A1 (en) | Genetic markers specific for clostridium difficile ribotypes 027 (nap01/b1; rt 027) and 078 (nap7/8; rt 078) and their use | |
| RU2688434C1 (ru) | Способ дифференциации штаммов Helicobacter pylori путем молекулярно-генетического типирования | |
| Shangkuan et al. | Diversity of DNA sequences among Vibrio cholerae O1 and non‐O1 isolates detected by whole‐cell repetitive element sequence‐based polymerase chain reaction | |
| RU2736649C1 (ru) | Способ генетической дифференциации штаммов Yersinia pseudotuberculosis путем молекулярно-генетического типирования | |
| RU2482191C1 (ru) | СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ Helicobacter pylori МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОГО VNTR-ТИПИРОВАНИЯ | |
| RU2737775C1 (ru) | Способ идентификации yersinia pestis и yersinia pseudotuberculosis и одновременной дифференциации yersinia pestis основного и центральноазиатского подвидов методом мультиплексной пцр | |
| CN111712583B (zh) | 使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法 | |
| RU2816184C1 (ru) | Способ дифференциации штаммов Pseudomonas aeruginosa с помощью молекулярно-генетического типирования | |
| RU2756854C1 (ru) | Способ дифференциации штаммов Francisella tularensis путем молекулярно-генетического типирования | |
| RU2732448C9 (ru) | Способ идентификации штаммов VIBRIO CHOLERAE O1, определения их токсигенности и биовара с дифференциацией биовара ЭльТор на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления с учетом результатов в режиме "реального времени" | |
| JP4379308B2 (ja) | メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセット | |
| JPWO2019123690A1 (ja) | 改良Ｔｍマッピング法 |