RU2688321C2

RU2688321C2 - Method for improving the collecting of hematopoietic cells during their cultivation on the stromal layers by pre-magnetization of the latter

Info

Publication number: RU2688321C2
Application number: RU2016148666A
Authority: RU
Inventors: Мария Владимировна Савватеева; Александр Михайлович Дёмин; Виктор Павлович Краснов; Александр Вадимович Белявский
Priority date: 2016-12-12
Filing date: 2016-12-12
Publication date: 2019-05-21
Also published as: RU2016148666A3; RU2016148666A

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention refers to biotechnology, namely to producing representative populations of hematopoietic cells and a kit for preparing them. Method involves culturing hematopoietic cells on magnetic stromal layers obtained by incubating stromal cells with magnetic nanoparticles or magnetic liposomes with subsequent treatment of mitomycin C cells or irradiation with X-ray or gamma radiation to stop their division, when collecting hematopoietic cells, culture is dissociated by treatment with trypsin, collagenase, or another proteolytic enzyme, or by intensive mixing of the culture, and purification of cell preparations is carried out by removing magnetic stroma on magnet.EFFECT: invention allows increasing the total number of hematopoietic cells collected after culturing.5 cl, 10 dwg, 2 tbl, 9 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕTECHNICAL FIELD TO WHICH INVENTION RELATES.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине представляет собой способ культивирования гемопоэтических клеток на поддерживающих стромальных слоях, которые делаются магнитными путем инкубации с магнитными наночастицами.The invention relates to biotechnology and medicine is a method of cultivating hematopoietic cells on supporting stromal layers, which are made magnetic by incubation with magnetic nanoparticles.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND

Гемопоэтические клетки, включая стволовые кроветворные клетки (СКК) и предшественники представляют большой интерес для медицины, поскольку используются в трансплантациях при лечении наследственных и онкологических заболеваний, а также перспективны для терапии ряда других патологий. Большой интерес представляют перспективы использования гемопоэтических клеток в генной терапии наследственных и приобретенных заболеваний кроветворных и иммунных систем.Hematopoietic cells, including hematopoietic stem cells (CSCs) and progenitors are of great interest for medicine because they are used in transplantations in the treatment of hereditary and oncological diseases, as well as promising for the treatment of a number of other pathologies. Of great interest are the prospects for the use of hematopoietic cells in gene therapy of hereditary and acquired diseases of the hematopoietic and immune systems.

При этом СКК являются чрезвычайно редкими клетками, и их низкое содержание в пуповинной крови делает препараты пуповинной крови зачастую недостаточными для трасплантации взрослым пациентам. Учитывая также, что СКК обычно являются покоящимися клетками и крайне редко делятся, что затрудняет введение в них генных конструкций, во всей остроте встает вопрос о размножении этих клеток в культуре.However, HSCs are extremely rare cells, and their low content in cord blood makes cord blood preparations often insufficient for transplantation to adult patients. Considering also that HSCs are usually resting cells and rarely divide, which makes it difficult to introduce gene constructs into them, the question of the reproduction of these cells in culture arises in all sharpness.

До настоящего времени наиболее часто использовались подходы, связанные с попытками размножения СКК и предшественников в классической культуре с использованием различных сочетаний цитокинов. В целом, эти попытки можно считать малоудачными, поскольку они не сопровождались существенным размножением СКК в культуре.Until now, approaches associated with attempts at reproduction of HSCs and precursors in classical culture using various combinations of cytokines have been used most frequently. In general, these attempts can be considered unsuccessful, since they were not accompanied by a significant multiplication of HSCs in culture.

Наиболее важным альтернативным подходом является культивирование гемопоэтических клеток на подслоях стромальных клеток. Многочисленные данные показывают, что в организме СКК находятся в костном мозге в так называемых нишах, то есть окружении, состоящем из клеток и внеклеточного матрикса. Наиболее важными типами микроокружения считается эндостальная остеобластная ниша и эндотелиальная ниша. Клетки ниши находятся в тесном контакте с СКК и предоставляют последним не только секретируемые цитокины, но также и мембрано-связанные лиганды рецепторов, задействованных в важнейших сигнальных путях, контролирующих самообновление, пролиферацию и дифференцировку СКК, а также белки клеточной адгезии, и белки внеклеточного матрикса, которые также влияют на состояние СКК. Таким образом, культивирование СКК, гемопоэтических предшественников и других гемопоэтических клеток в присутствии и в контакте со стромальными клетками, которые частично воспроизводят условия ниши in vivo, более адекватно воспроизводят условия, в которых находятся гемопоэтические клетки in vivo, и могут давать возможность достичь истинного размножения в культуре.The most important alternative approach is the cultivation of hematopoietic cells on the sublayers of stromal cells. Numerous data show that in the body the SCCs are located in the bone marrow in the so-called niches, that is, an environment consisting of cells and an extracellular matrix. The most important types of microenvironment is considered to be an endosteal osteoblastic niche and an endothelial niche. Niche cells are in close contact with HSCs and provide the latter with not only secreted cytokines, but also membrane-bound receptor ligands involved in the most important signaling pathways controlling self-renewal, proliferation and differentiation of HCCs, as well as cell adhesion proteins, and extracellular matrix proteins, which also affect the state of the CCM. Thus, culturing HCCs, hematopoietic progenitors, and other hematopoietic cells in the presence and in contact with stromal cells, which partially reproduce niche conditions in vivo, more adequately reproduce the conditions under which hematopoietic cells are in vivo, and may make it possible to achieve true reproduction in culture.

Весьма важным является исследование различных видов стромы для выяснения возможностей размножения СКК. Хотя само по себе культивирование на стромальных подслоях не представляет сложностей и является давно отработанной процедурой, сбор гемопоэтических клеток после культивирования их на строме является технической проблемой. Как правило, после культивирования гемопоэтических клеток на строме, производится сбор неадгезивных клеток, причем с минимальными воздействиями на стромальный слой. Более интенсивные воздействия, такие, как энергичное пипетирование или обработка трипсином, приводят к сильному загрязнению стромальными клетками полученных препаратов гемопоэтических клеток, что, без очистки от стромальных клеток, сильно сужает возможности анализа и дальнейшего использования полученных препаратов. Предполагается, что при таком способе сбора потери гемопоэтических клеток относительно невелики, значительных избирательных потерь каких-либо видов клеток не происходит, и собранная фракция является достаточно репрезентативной. При этом даже в случае мягких обработок происходит определенное разрушение целостности стромального слоя, и часть клеток попадает в собранную фракцию гемопоэтических клеток и загрязняет их.Very important is the study of various types of stroma to determine the possibilities of reproduction of CCM. Although cultivation on the stromal sublayers is in itself not difficult and is a well-established procedure, collecting hematopoietic cells after cultivating them on the stroma is a technical problem. As a rule, after cultivation of hematopoietic cells on the stroma, non-adherent cells are collected, and with minimal impact on the stromal layer. More intense exposures, such as vigorous pipetting or trypsin treatment, lead to severe contamination of the obtained hematopoietic cell preparations with stromal cells, which, without purification of stromal cells, severely limits the possibilities of analysis and further use of the prepared preparations. It is assumed that with this method of collecting the loss of hematopoietic cells is relatively small, there is no significant selective loss of any cell types, and the collected fraction is quite representative. At the same time, even in the case of mild treatments, a certain destruction of the integrity of the stromal layer occurs, and some of the cells fall into the collected fraction of hematopoietic cells and contaminate them.

Альтернативным способом сбора гемопоэтических клеток после культивирования является обработка совместных культур трипсином для разрушения взаимодействий клеток с поверхностями культивирования и между собой. Для осуществления анализа полученных препаратов и дальнейшего использования производят разделение гемопоэтических клеток и стромальных клеток. Один из вариантов решения этой проблемы состоит в использовании антител, специфических к поверхностным маркерам, чтобы разделить стромальные и гемопоэтические клетки с помощью флюоресцентно-активируемой и или магнитно-активируемой клеточных сортировок. Для того, чтобы проводить негативное удаление стромальных клеток, вначале нужно проводить исследование отличий поверхностного антигенного профиля стромальных клеток от гемопоэтических, чтобы выбрать антитела, специфически реагирующие со стромальными клетками, но не с гемопоэтическими клетками.An alternative method of collecting hematopoietic cells after cultivation is the treatment of joint cultures with trypsin to destroy the interactions of cells with cultivation surfaces and between themselves. For the analysis of the obtained preparations and further use, they separate hematopoietic cells and stromal cells. One solution to this problem is to use antibodies specific to surface markers to separate stromal and hematopoietic cells using fluorescently activated and or magnetically activated cell sorts. In order to conduct a negative removal of stromal cells, it is first necessary to study the differences in the surface antigenic profile of stromal cells from hematopoietic, in order to select antibodies that specifically react with stromal cells, but not with hematopoietic cells.

Описаны также подходы, основанные на позитивном выделении гемопоэтических клеток с помощью антител к маркерам Sca-1 (Butler JM, Nolan DJ, Vertes EL, Varnum-Finney B, Kobayashi H, Hooper AT, Seandel M, Shido K, White IA, Kobayashi M, Witte L, May C, Shawber C, Kimura Y, Kitajewski J, Rosenwaks Z, Bernstein ID, Rafii S. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 2010 6(3):251-264) или CD45 (Nakamura Y, Arai F, Iwasaki H, Hosokawa K, Kobayashi I, Gomei Y, Matsumoto Y, Yoshihara H, Suda T. Isolation and characterization of endosteal niche cell populations that regulate hematopoietic stem cells. Blood. 2010 116(9):1422-1432). При этом Sca-1 является маркером ранних гемопоэтических клеток, включая и СКК, и поэтому при использовании выделяются не все гемопоэтические клетки, а только минорная субпопуляция ранних клеток. Кроме того, Sca-1 экспрессируется некоторыми стромальными клетками, например ОР9 клетками (Ichii М, Frank MB, Iozzo RV, Kincade PW. The canonical Wnt pathway shapes niches supportive of hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 2012 119(7): 1683-1692), что делает невозможным отделение такой стромы от гемопоэтических клеток.Approaches based on positive isolation of hematopoietic cells using antibodies to Sca-1 markers (Butler JM, Nolan DJ, Vertes EL, Varnum-Finney B, Kobayashi H, Hooper AT, Seandel M, Shido K, White IA, Kobayashi M , Witte L, May C, Shawber C, Kimura Y, Kitajewski J, Rosenwaks Z, Bernstein ID, Rafii S. Endothelial cells are notch-dependent hematopoietic stem cells. (3): 251-264) or CD45 (Nakamura Y, Arai F, Iwasaki H, Hosokawa K, Kobayashi I, Gomei Y, Matsumoto Y, Yoshihara H, Suda T. Isolation and characterization of the hematopoietic stem cells. Blood. 2010 116 (9): 1422-1432). At the same time, Sca-1 is a marker of early hematopoietic cells, including HSCs, and therefore, when using, not all hematopoietic cells are isolated, but only a minor subpopulation of early cells. In addition, Sca-1 is expressed by some stromal cells, for example, OP9 cells (Ichii M, Frank MB, Iozzo RV, Kincade PW. The canonical stem cell / progenitor cells. Blood. 2012 119 (7): 1683 -1692), which makes it impossible to separate such stroma from hematopoietic cells.

Хотя CD45 считается почти универсальным маркером гемопоэтических клеток, его экспрессия не характерна для ранних стадий гемопоэтической дифференцировки, из, например, эмбриональных стволовых клеток или гемангиобластов, и может снижаться при культивировании гемопоэтических клеток на стромальных слоях (Vodyanik MA, Thomson JA, Slukvin II. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 2006 108(6): 2095-2105; Hara T, Nakano Y, Tanaka M, Tamura K, Sekiguchi T, Minehata K, Copeland NG, Jenkins NA, Okabe M, Kogo H, Mukouyama Y, Miyajima A. Identification of podocalyxin-like protein 1 as a novel cell surface marker for hemangioblasts in the murine aorta-gonad-mesonephros region. Immunity. 1999 11 (5): 567-578).Although CD45 is considered to be an almost universal marker of hematopoietic cells, its expression is not characteristic of early stages of hematopoietic differentiation, for example, from embryonic stem cells or hemangioblasts, and may decrease with the cultivation of hematopoietic cells on the stromal layers (Vodyanik MA, Thomson JA, Slukvin II. Leukhoi, which is a boom cell for hematopoietic cells (Vodyanik MA, Thomson JA, Slukvin II. Leukhoic cells). (CD43) defines the human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 2006 108 (6): 2095-2105; Hara T, Nakano Y, Tanaka M, Tamura K, Sekiguchi T, Minehata K, Copeland NG, Jenkins NA, Okabe M, Kogo H, Mukouyama Y, Miyajima A. Identification of podocalyxin-like protein 1 as a new case for a man in the murine aorta-gonad-mesonephros r egion. Immunity. 1999 11 (5): 567-578).

Таким образом, при использовании маркера CD45 выделение репрезентативной популяции гемопоэтических клеток также не гарантировано.Thus, when using the CD45 marker, the selection of a representative population of hematopoietic cells is also not guaranteed.

Еще одним способом, который может приводить к желаемому результату, является стабильное мечение стромальных клеток путем введения в них интегрирующих конструкций, экспрессирующих маркерный белок (например, зеленый флюоресцентный белок), который можно использовать для разделения гемопоэтических и стромальных клеток с помощью флюоресцентно-активируемой и или магнитно-активируемой клеточных сортировок. Однако это предполагает проведение значительной предварительной работы по получению генетически модифицированных линий стромальных клеток, экспрессирующий такой белок. Кроме того, данный метод малопригоден для работы с первичными клетками, такими, как мезенхимальные стромальные/стволовые клетки (МСК), которые способны проходить только ограниченное число делений в культуре. При этом высокая стоимость антител ограничивает возможность массового применения такого рода подходов. Производительность флюоресцентно-активируемой сортировки также мешает рутинному использованию подобных подходов.Another way that can lead to the desired result is stable labeling of stromal cells by introducing integrating constructs expressing a marker protein (for example, a green fluorescent protein) into them, which can be used to separate hematopoietic and stromal cells with a fluorescently activated and or magnetically activated cell sorts. However, this implies a significant preliminary work to obtain genetically modified stromal cell lines expressing such a protein. In addition, this method is unsuitable for working with primary cells, such as mesenchymal stromal / stem cells (MSCs), which are able to undergo only a limited number of divisions in culture. At the same time, the high cost of antibodies limits the possibility of mass use of such approaches. The performance of fluorescent-activated sorting also interferes with the routine use of such approaches.

Таким образом, в настоящее время не существует подхода, который позволял бы без значительных потерь получать после совместного культивирования со стромальными клетками очищенные препараты гемопоэтических клеток, адекватно представляющих набор гемопоэтических субпопуляций, образующихся в результате культивирования на строме, в том числе и ранних клеток, а также клеток, плотно ассоциированных со стромой, или находящихся под стромальным слоем, и при этом не требовал бы предварительных этапов сравнения поверхностных маркеров гемопоэтических и стромальных клеток или получения генетически модифицированных линий стромальных клеток.Thus, at present, there is no approach that would allow, without significant losses, to obtain, after co-cultivation with stromal cells, purified preparations of hematopoietic cells adequately representing a set of hematopoietic subpopulations resulting from the cultivation on the stroma, including early cells, as well as cells closely associated with the stroma, or under the stromal layer, and at the same time would not require preliminary stages of comparison of surface markers of hematopoietic and stromal cells or obtaining genetically modified stromal cell lines.

Данная техническая проблема решена в заявке тем, что препараты стромальных клеток, в дополнение к стандартной обработке для необратимой остановки их пролиферации с помощью известных в технике подходов, например, митомицина С или гамма-облучения, также инкубируют с магнитными наночастицами (МНЧ), в результате чего стромальные клетки поглощают МНЧ и становятся магнитными. В качестве МНЧ используют наночастицы Fe₃O₄, как поверхностно модифицированные, так и без дополнительной модификации поверхности. Для выделения чистой фракции магнитных стромальных клеток проводят их выделение путем осаждения на стенки сосуда с помощью магнита, и полученную фракцию клеток используют для культивирования с гемопоэтическими клетками. Для снижения нагрузки магнитной стромы наночастицами и повышения времени ее жизни возможно также проведение предварительного титрования связывания стромальными клетками магнитных частиц, при этом для очистки магнитной стромы используют препараты магнитных стромальных клеток, в которых доля магнитных клеток не превышает 90%. После окончания совместного культивирования выделяют очищенную фракцию гемопоэтических клеток путем обработки культур трипсином или, в других вариантах исполнения, коллагеназой, диспазой или другими протеолитическими ферментами, пригодными для использования в этих целях, или же без применения протеаз, с использованием хелаторов двухвалентных ионов металлов и интенсивным пипетированием и перемешиванием для разрушения контактов между стромальными и гемопоэтическими клетками, после чего удаляют магнитные стромальные клетки путем их осаждения на стенки сосуда с помощью магнита.This technical problem is solved in the application by the fact that stromal cell preparations, in addition to the standard treatment for irreversibly stopping their proliferation using methods known in the art, for example, mitomycin C or gamma irradiation, are also incubated with magnetic nanoparticles (MNPs), as a result which stromal cells absorb MNPs and become magnetic. Nanoparticles of Fe ₃ O ₄ , both surface modified and without additional surface modification, are used as MNPs. To isolate the pure fraction of magnetic stromal cells, they are isolated by precipitation on the walls of the vessel with a magnet, and the resulting fraction of cells is used for cultivation with hematopoietic cells. To reduce the load of the magnetic stroma with nanoparticles and increase its lifetime, it is also possible to pre-titrate the binding of magnetic particles by stromal cells, while magnetic stromal cells are used to clean the magnetic stroma, in which the proportion of magnetic cells does not exceed 90%. After the end of co-culture, a purified fraction of hematopoietic cells is isolated by treating the cultures with trypsin or, in other versions, collagenase, dyspase or other proteolytic enzymes suitable for this purpose, or without the use of proteases, using chelators of divalent metal ions and intensive pipetting and mixing to break the contact between stromal and hematopoietic cells, after which magnetic stromal cells are removed by deposition on the walls of the vessel using a magnet.

Наиболее близким по техническому уровню к настоящему изобретению является работа A. Ito et al. (Ito A, Jitsunobu H, Kawabe Y, Ijima H, Kamihira M. Magnetic separation of cells in coculture systems using magnetite cationic liposomes. Tissue Eng Part С Methods. 2009 15(3): 413-423), в которой применено магнитное мечение клеток с помощью магнитных липосом, которые потом используются для сокультивирования с немечеными клетками, с целью последующего получения очищенных препаратов сокультивируемых клеток.The closest in technical level to the present invention is the work of A. Ito et al. (Ito A, Jitsunobu H, Kawabe Y, Ijima H, Kamihira M. Magnetic separation cationic liposomes systems. Magnetic cutting method. 2009 15 (3): 413-423) with magnetic tagging cells using magnetic liposomes, which are then used for cocultivation with unlabeled cells, with the aim of subsequently obtaining purified preparations of co-cultivated cells.

В отличие от работы Ito et al., в настоящем изобретении применены МНЧ, которые имеют значительное преимущество перед магнитными липосомами с точки зрения хранения. Кроме того, использованные МНЧ, как далее показано в примерах 2 и 3, обладают весьма высокой скоростью связывания с клетками, обеспечивая оптимальную эффективность мечения уже за 15-30 мин инкубации (по сравнению с несколькими часами в работе Ito et al.).In contrast to the work of Ito et al., In the present invention, MNPs are used which have a significant advantage over magnetic liposomes from the point of view of storage. In addition, the used MNPs, as further shown in examples 2 and 3, have a very high rate of cell binding, providing optimum labeling efficiency already in 15-30 minutes of incubation (compared to several hours in Ito et al.).

Наиболее важным отличием настоящего изобретения от работы Ito et al. является то, что возможность использования магнитно меченых клеток в качестве стромальных слоев при культивировании гемопоэтических клеток в работе Ito et al. не была показана и даже не предлагалась. Тем более, в работе Ito et al. не было показано, что обработка магнитными нанолипосомами не вызывает снижения поддерживающей активности стромальных клеток. В то же время, очевидно, что стромальные линии, используемые для совместного культивирования с гемопоэтическими клетками, должны обладать поддерживающей кроветворные клетки активностью, в противном случае их использование лишено практического смысла. Поэтому для применения магнитных стромальных слоев принципиально важно, чтобы после магнетизации стромальных клеток их поддерживающая активность оставалась бы на прежнем уровне или, если падала, то незначительно. Без информации о том, что это действительно так, возможность успешного применения магнитных стромальных слоев для совместного культивирования с гемопоэтическими клетками не является очевидной для специалиста. В примере 7 настоящей заявки приводится доказательство того, что после магнетизации стромальных клеток с помощью МНЧ их поддерживающая активность не падает, а даже, возможно, увеличивается.The most important difference of the present invention from the work of Ito et al. is that the possibility of using magnetically labeled cells as stromal layers in the cultivation of hematopoietic cells in Ito et al. was not shown or even offered. Moreover, in the work of Ito et al. it was not shown that treatment with magnetic nanoliposomes does not cause a decrease in the supporting activity of stromal cells. At the same time, it is obvious that the stromal lines used for co-culture with hematopoietic cells must have hematopoietic cell-supporting activity, otherwise their use is devoid of practical meaning. Therefore, for the application of magnetic stromal layers, it is of fundamental importance that after the magnetisation of stromal cells their supporting activity would remain at the same level or, if it fell, insignificantly. Without information that this is true, the possibility of successful application of magnetic stromal layers for co-cultivation with hematopoietic cells is not obvious to a specialist. Example 7 of the present application provides evidence that after magnetisation of stromal cells using MNPs, their supporting activity does not decrease, and even, possibly, increases.

В примерах 5 и 6 настоящей заявки приводятся данные о том, что применение магнитной стромы для культивирования гемопоэтических клеток с последующим сбором клеток с помощью трипсина приводит к значительному увеличению выхода тотальных гемопоэтических клеток, и еще более значительному увеличению выхода ранних гемопоэтических клеток, включая колониеобразующие клетки и клетки с фенотипом предшественников и стволовых кроветворных клеток Lin^-, kit⁺, Scal⁺, по сравнению с наиболее распространенным способом с использованием немагнитной стромы и сбора неадгезивных клеток. В примере 8 настоящей заявки показано, что при культивировании гемопоэтической CD34⁺ популяции клеток из пуповинной крови человека на магнитной строме увеличивается как общее число собранных клеток, так и, в гораздо большей степени, число ранних клеток с фенотипом CD34⁺CD38^-, по сравнению с контрольной немагнитной стромой.Examples 5 and 6 of the present application provide evidence that the use of a magnetic stroma for cultivating hematopoietic cells, followed by collecting cells with trypsin, leads to a significant increase in the yield of total hematopoietic cells, and an even more significant increase in the yield of early hematopoietic cells, including colony-forming cells and cells with the phenotype of hematopoietic progenitors and stem cells Lin ^-, kit ^{^+,} Scal ^+, compared with the most common method using nonmagnetic stroma collect non-adherent cells. Example 8 herein shows that when cultured hematopoietic CD34 ⁺ cell population from human cord blood with magnetic stroma increases as the total number of collected cells and, to a much greater extent, the number of the earliest cells with the phenotype CD34 ⁺ CD38 ^-, compared with control non-magnetic stroma.

В работе Ito et al. таких сведений не содержится. Таким образом, хотя в работе Ito et al. применен способ магнитного мечения для сокультивирования клеток в принципе, в этой работе не содержится очевидных для специалиста указаний, что данный способ может быть успешно применен для размножения гемопоэтических клеток, и что данный способ, при обеспечении существенной чистоты получаемых фракций гемопоэтических клеток, может давать значительное увеличение выхода как тотальных ядерных клеток, так и ранних гемопоэтических клеток, по сравнению с использованием немагнитной стромы и сбора неадгезивных клеток. По сравнению с другими способами отделения стромальных от гемопоэтических клеток, использование магнитной стромы позволяет получать репрезентативные препараты гемопоэтических клеток, а не только специфические субпопуляции их, и не требует проведения дополнительных работ по генетической модификации стромальных клеток или идентификацию поверхностных маркеров, дискриминирующих стромальные и гемопоэтические клетки. Магнитное мечение не вызывает снижения поддерживающей активности исследованных видов стромальных клеток, однако при необходимости уровень мечения стромальных клеток может быть понижен для дальнейшего снижения эффекта МНЧ на функционирование стромы, при этом 100% меченая строма может быть получена путем предварительной очистки частично меченых МНЧ клеток на магните. Набор для проведения культивирования гемопоэтических клеток на магнитной строме включает в себя препарат магнитных наночастиц, эффективно магнетизирующих стромальные клетки, а также магнит для удаления магнитной стромы после культивирования. Некоторые варианты набора могут также включать в себя стромальные клетки, митомицин С и среды для инкубации клеток с магнитными наночастицами.In Ito et al. such information is not contained. Thus, although in Ito et al. the method of magnetic labeling has been applied for cocultivation of cells in principle, this work does not contain obvious indications to the expert that this method can be successfully applied for the reproduction of hematopoietic cells, and that this method, while ensuring substantial purity of the obtained fractions of hematopoietic cells, can give a significant increase the output of both total nuclear cells and early hematopoietic cells, compared with the use of non-magnetic stroma and the collection of non-adherent cells. Compared with other methods of separating stromal from hematopoietic cells, the use of a magnetic stroma makes it possible to obtain representative preparations of hematopoietic cells, not only their specific subpopulations, and does not require additional work on the genetic modification of stromal cells or the identification of surface markers that discriminate stromal and hematopoietic cells. Magnetic labeling does not reduce the maintenance activity of the studied types of stromal cells, however, if necessary, the level of labeling of stromal cells can be lowered to further reduce the effect of MNPs on stroma functioning, while 100% labeled stroma can be obtained by pre-cleaning partially labeled MNC cells on a magnet. The kit for carrying out the cultivation of hematopoietic cells on a magnetic stroma includes the preparation of magnetic nanoparticles, effectively magnetising stromal cells, as well as a magnet for removing the magnetic stroma after cultivation. Some kit options may also include stromal cells, mitomycin C, and media for incubating cells with magnetic nanoparticles.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУРBRIEF DESCRIPTION OF FIGURES

Фиг. 1. Схема, описывающая получение МНЧ.FIG. 1. Scheme describing the receipt of MNP.

Фиг. 2. Зависимость эффективности связывания МНЧ с двумя типами стромальных клеток, MS5 и J2/3T3, от концентрации МНЧ. Инкубация клеток с МНЧ проводилась в течение 10 мин. По оси абсцисс показан процент клеток, выделяемых с помощью магнита.FIG. 2. Dependence of the efficiency of binding of MNPs with two types of stromal cells, MS5 and J2 / 3T3, on the concentration of MNPs. Incubation of cells with MNP was carried out for 10 min. The abscissa shows the percentage of cells secreted by a magnet.

Фиг. 3. Зависимость эффективности связывания МНЧ со стромальными клетками от времени при двух концентрациях МНЧ. А - связывание с ОР9 клетками, Б - связывание с J2/3T3 клетками. МНЧ использовались в концентрациях 25 и 100 мкг/мл. По оси абсцисс показан процент клеток, выделяемых с помощью магнита.FIG. 3. Dependence of the efficiency of binding of MNPs with stromal cells on time at two concentrations of MNPs. A - binding to OP9 cells, B - binding to J2 / 3T3 cells. MNPs were used at concentrations of 25 and 100 μg / ml. The abscissa shows the percentage of cells secreted by a magnet.

Фиг. 4. Различные типы стромальных клеток могут быть эффективно нагружены МНЧ. 10⁶ стромальных клеток разных типов были инкубированы с МНЧ (25

g/ml) в течение 15 мин при комнатной температуре. По оси абсцисс показан процент клеток, выделяемых с помощью магнита.FIG. 4. Different types of stromal cells can be effectively loaded with MNPs. 10 ⁶ stromal cells of different types were incubated with MNP (25

g / ml) for 15 min at room temperature. The abscissa shows the percentage of cells secreted by a magnet.

Фиг. 5. Сохранение МНЧ клетками стромы после их нагрузки МНЧ и культивирования в течение периода, характерного для совместного культивирования гемопоэтических и стромальных клеток (7 дней). Стромальные клетки J2/3T3 и ОР9 были инкубированы с МНЧ (25

g/ml) в течение 15 мин, связавшие МНЧ клетки были выделены на магните, обработаны митомицином С для остановки их пролиферации и культивированы в течение 7 дней, после чего было проведено повторное выделение клеток на магните. Показан процент клеток, сохранивших магнитную метку.FIG. 5. Preservation of stromal cells MNCH after their loading of MNP and cultivation during the period characteristic of co-culture of hematopoietic and stromal cells (7 days). Stromal cells J2 / 3T3 and OP9 were incubated with MNP (25

g / ml) for 15 min, the bound MNP cells were isolated on a magnet, treated with mitomycin C to stop their proliferation and cultured for 7 days, after which the cells were re-isolated on the magnet. Shows the percentage of cells that retain the magnetic label.

Фиг. 6. Продукция ядерных клеток после культивирования Lin^- клеток на стромальных слоях. 15×10³ Lin^- клеток из костного мозга мыши были культивированы без добавления цитокинов в течение 7 дней на стромальных слоях ОР9 и J2/3T3. С контрольных слоев ОР9 и J2/3T3 собирали неадгезивную фракцию, в то время как с магнитных слоев ОР9+МНЧ и J2/3T3+МНЧ клетки собирали с помощью обработки трипсином и удаления стромальных клеток на магните. 50×10³ клеток после первого раунда культивирования засевали на соответствующие стромальные слои, после чего культивировали еще 7 дней и собирали так же, как и в первом раунде. (А) Число собранных клеток после одного (7 дней) и двух (14 дней) раундов культивирования на строме. (Б) Кумулятивная продукция клеток после двух раундов культивирования на стромальных слоях.FIG. 6. Production of nuclear cells after cultivation of Lin ^- cells on the stromal layers. 15 × ¹⁰ March Lin ^- mouse bone marrow cells were cultured without added cytokines for 7 days on stromal layers and ER9 J2 / 3T3. The non-adhesive fraction was collected from the OP9 and J2 / 3T3 control layers, while the OP9 + MNP and J2 / 3T3 + MNCH magnetic layers were collected using trypsin treatment and removing stromal cells on a magnet. After the first round of cultivation, 50 × 10 ³ cells were seeded onto the respective stromal layers, after which they were cultured for another 7 days and harvested in the same way as in the first round. (A) The number of harvested cells after one (7 days) and two (14 days) rounds of stromal culture. (B) Cumulative production of cells after two rounds of culture on the stromal layers.

Фиг. 7. Продукция колониеобразующих клеток (КОЕ, колониеобразующих единиц) после одного (7 дней) и двух (14 дней) раундов культивирования Lin^- клеток на контрольных (ОР9 и J2/3T3) и магнитных (ОР9/МНЧ и J2/3T3/ МНЧ) стромальных слоях. (А)FIG. 7. Production of colony forming cells (CFU, colony forming units) after one (7 days) and two (14 days) rounds of cultivation of Lin ^- cells on the control (OP9 and J2 / 3T3) and magnetic (OP9 / MNCH and J2 / 3T3 / MNCH) stromal layers. (BUT)

Анализ частоты КОЕ на 10⁵ клеток (светло-серые столбики) и общего числа КОЕ (темно-серые столбики) после 7 дней (1 раунд) культивирования на стромальных слоях. (Б) Анализ кумулятивной продукции КОЕ после одного и двух раундов культивирования на стромальных слоях. Анализ проводился на гемопоэтических фракциях, описанных на Фиг. 6. Анализ КОЕ был проведен с помощью стандартной методики подсчета колониеобразующих клеток в метил целлюлозе. При культивировании на магнитной строме и сборе с помощью трипсинизации число КОЕ резко повышается по сравнению с немагнитной стромой, в особенности в раунде 2.Analyze the CFU frequency per 10 ⁵ cells (light gray bars) and the total number of CFU (dark gray bars) after 7 days (1 round) of cultivation on the stromal layers. (B) Analysis of cumulative CFU production after one and two rounds of cultivation on the stromal layers. The analysis was performed on the hematopoietic fractions described in FIG. 6. The CFU analysis was performed using standard colony-forming cell counting in methyl cellulose. When cultured on a magnetic stroma and collected using trypsinization, the number of CFUs increases dramatically compared with a non-magnetic stroma, especially in round 2.

Фиг. 8. Анализ поверхностного фенотипа с помощью проточной цитофлюорометрии гемопоэтических клеток, собранных после культивирования Lin^- клеток в течение 7 дней на контрольных ОР9 и J2/3T3 (А и В, соответственно) и магнитных ОР9+МНЧ и J2/3T3+ МНЧ (Б и Г, соответственно) стромальных слоях. Окрашивание проводилось с помощью PE-Lin, FITC-Sca-1 и Alexa647-c-kit антител. Клетки, изображенные на диаграммах, были гейтированы по Lin^- фенотипу. Анализ проводился на гемопоэтических фракциях, описанных на Фиг. 6. При культивировании на магнитной строме и сборе с помощью трипсинизации число клеток с ранним фенотипом Lin^-, kit⁺, Scal⁺ (верхние правые квадранты А2) значительно повышается по сравнению с немагнитной стромой.FIG. 8. Analysis of the surface phenotype using flow cytofluorometry of hematopoietic cells collected after cultivation of Lin ^- cells for 7 days on control OP9 and J2 / 3T3 (A and B, respectively) and magnetic OP9 + MNH and J2 / 3T3 + MNH (B and D , respectively) stromal layers. Staining was performed with PE-Lin, FITC-Sca-1 and Alexa647-c-kit antibodies. The cells shown in the diagrams were gated on the Lin ^- phenotype. The analysis was performed on the hematopoietic fractions described in FIG. 6. When cultivated on a magnetic stroma and collected using trypsinization, the number of cells with the early phenotype Lin ^- , kit ⁺ , Scal ⁺ (upper right quadrants A2) is significantly increased compared to the non-magnetic stroma.

Фиг.9. Поддерживающая активность стромальных клеток не снижается после их магнетизации. (А) Общая продукция гемопоэтических клеток магнитной и обычной стромами. 30×10³ Lin^- клеток сокультивировали с магнитной и обычной J2/3T3 стромами, как описано в примере 5 (Фиг. 6, 7) и после 7 дней культивирования оба типа культур были трипсинизованы. Гемопоэтические клетки подсчитывали в камере Горяева, используя их морфологические отличия от стромальных клеток. (Б, В) Снятые со стромы клетки также анализировали с помощью проточной цитофлюорометрии с использованием PE-Lin, FITC-Sca-1 и Alexa647-c-kit антител. Показаны репрезентативные диаграммы для культур на контрольных (Б) и магнитных (В) J2/3T3 стромах. Клетки на диаграммах были гейтированы по Lin^- фенотипу. Квадрант L3 соответствует неокрашенным клеткам, квадрант L2 - ранним клеткам фенотипа LSK. (Г) Общее число LSK клеток, собранных с обоих типов стромы.Fig.9. The supporting activity of stromal cells does not decrease after their magnetisation. (A) Total production of hematopoietic cells by magnetic and normal stroma. 30 × ¹⁰ March Lin ^- cells cocultured with conventional magnetic and J2 / 3T3 stromal as described in Example 5 (Figures 6, 7.) And after 7 days of culturing both types of cultures were tripsinizovany. Hematopoietic cells were counted in the Goryaev chamber using their morphological differences from stromal cells. (B, C) The cells removed from the stroma were also analyzed using flow cytofluorometry using PE-Lin, FITC-Sca-1 and Alexa647-c-kit antibodies. Representative diagrams for cultures are shown on control (B) and magnetic (C) J2 / 3T3 stroma. Cells were gated on the charts for Lin ^- phenotype. L3 quadrant corresponds to unpainted cells, L2 quadrant corresponds to early LSK phenotype cells. (D) Total number of LSK cells collected from both types of stroma.

Фиг. 10. Сравнение схемы заявляемого и стандартного наиболее распространенного способов сбора гемопоэтических клеток после культивирования на стромальных слоях. Заявляемый способ дает возможность собирать сильно адгезивные и подстромальные клетки, в отличие от стандартного подхода. Поскольку ранние гемопоэтические клетки (колониеобразующие клетки, фенотипически ранние KSL клетки и гемопоэтические стволовые клетки) обладают высокой адгезией к стромальным слоям и активной миграцией в подстромальные области, заявляемый способ дает возможность существенно повышать выход ранних клеток, представляющих наибольший интерес для трансплантации, регенеративно медицины и других клинических применений.FIG. 10. Comparison of the scheme of the claimed and standard most common methods of collecting hematopoietic cells after cultivation on stromal layers. The inventive method makes it possible to collect strongly adherent and subchromatic cells, in contrast to the standard approach. Since early hematopoietic cells (colony-forming cells, phenotypically early KSL cells and hematopoietic stem cells) have high adhesion to the stromal layers and active migration to the sub-stromal areas, the inventive method makes it possible to significantly increase the yield of early cells that are of greatest interest for transplantation, regenerative medicine and other clinical applications.

Таблица 1. Общее число снятых со стромы ядерных клеток. Показано число снятых с контрольной (немагнитной) и магнитной стром. В случае с контрольной стромой проводилось снятие неадгезивных клеток, в случае с магнитной стромой - полная диссоциация культуры путем трипсинизации с последующим удалением магнитных клеток на магните.Table 1. The total number of nuclear cells removed from the stroma. The number taken from the control (non-magnetic) and magnetic stroma is shown. In the case of the control stroma, nonadhesive cells were removed, in the case of a magnetic stroma, complete dissociation of the culture was carried out by trypsinization followed by removal of the magnetic cells on the magnet.

Таблица 2. Фенотип снятых со стромы клеток. Показано число снятых с контрольной (немагнитной) и магнитной стром. CD34+ и CD34⁺CD38^- клетки представляют собой фракции, обогащенные гемопоэтическими предшественниками.Table 2. Phenotype of cells removed from stroma. The number taken from the control (non-magnetic) and magnetic stroma is shown. CD34 + and CD34 ⁺ CD38 ^- cells are fractions enriched with hematopoietic precursors.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯIMPLEMENTATION OF THE INVENTION

Пример 1. Получение магнитных наночастиц (МНЧ) с поверхностными модификациямиExample 1. Obtaining magnetic nanoparticles (MNP) with surface modifications

В качестве основы для получения модифицированных МНЧ использовались магнитные частицы на основе Fe₃O₄ (20-40 нм), полученные методом газофазного синтеза. ИК-спектры регистрировались на инфракрасном Фурье-спектрометре Nicolet 6700 FT-IR (Thermo Scientific). Регистрация спектров проводилась в диапазоне 400-4000 см^-1. Спектрофотометрические исследования проводились на УФ спектрофотометре UV2401PC, Shimadzu в диапазоне 190-450 нм. Морфологические исследования частиц проводились при использовании просвечивающего электронного микроскопа Philips СМ30.As a basis for obtaining modified MNPh, magnetic particles based on Fe ₃ O ₄ (20–40 nm), obtained by gas-phase synthesis, were used. IR spectra were recorded on a Nicolet 6700 FT-IR infrared Fourier spectrometer (Thermo Scientific). Registration of the spectra was carried out in the range of 400-4000 cm ^-1 . Spectrophotometric studies were conducted on a UV spectrophotometer UV2401PC, Shimadzu in the range of 190-450 nm. Morphological studies of the particles were carried out using a Philips CM30 transmission electron microscope.

Получение 3-аминопропилсилан-модифицированных МНЧGetting 3-aminopropyl-modified MNP

Схема получения модифицированных МНЧ показана на Фиг. 1. 3-Аминопропилсилан-модифицированные МНЧ 2 (МНЧ-APS) получали по аналогии с ранее разработанной методикой (Фиг. 1). Для этого 0,2 г исходных МНЧ Fe₃O₄ предварительно диспергировали в 50 мл 0.05 N водного раствора NaOH при использовании ультразвуковой бани (УЗ-бани) в течение 10 мин, и нагревали на водяной бане до 60°C в течение 5 ч, полученную суспензию оставляли на ночь. Через сутки МНЧ отделяли с использованием внешнего магнитного поля, промывали водой до нейтрального pH, после чего упаривали досуха, полученный порошок МНЧ использовали для дальнейшей модификации.The scheme for obtaining modified MNPs is shown in FIG. 1. 3-Aminopropylsilane-modified MNP 2 (MNP-APS) was obtained by analogy with the previously developed method (Fig. 1). To do this, 0.2 g of the initial MNPs of Fe ₃ O _{4 were} pre-dispersed in 50 ml of 0.05 N aqueous NaOH solution using an ultrasonic bath (ultrasonic bath) for 10 min, and heated on a water bath to 60 ° C for 5 h, the resulting suspension was left overnight. A day later, the MNPs were separated using an external magnetic field, washed with water until the pH was neutral, and then evaporated to dryness, the resulting MNP powder was used for further modification.

Для проведения поверхностной модификации 0.2 г полученных наночастиц диспергировали при обработке ультразвуком (УЗ-баня, 20 мин.) в 100 мл 95% этанола. К полученной суспензии добавляли 117 мкл 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES)1 (2.5 ммоль в расчете на 1 г МНЧ) и перемешивали в течение 16 ч. Модифицированные МНЧ осаждали при использовании внешнего магнитного поля. Растворитель декантировали, МНЧ промывали этанолом (двумя порциями по 30 мл) и ацетоном (тремя порциями по 35 мл). После декантации МНЧ 2 сушили в вакууме, получали 0,19 г МНЧ-APS.For surface modification, 0.2 g of the obtained nanoparticles were dispersed by ultrasonic treatment (ultrasonic bath, 20 minutes) in 100 ml of 95% ethanol. To the resulting suspension, 117 μl of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) 1 (2.5 mmol per 1 g of MNP) was added and stirred for 16 h. Modified MNP were besieged using an external magnetic field. The solvent was decanted, the MNP was washed with ethanol (two portions of 30 ml each) and acetone (three portions of 35 ml each). After decantation, the MNPs 2 were dried under vacuum, and 0.19 g of MNP-APS was obtained.

Получение N-di-Fmoc-L-лизин-модифицированных МНЧGetting N-di-Fmoc-L-lysine-modified MNP

0.100 г MH4-APS 2 диспергировали в 50 мл CH₃CN с использованием УЗ-бани в течение 10 мин. Затем при перемешивании добавляли 0.046 г N^α,N^ε-di-Fmoc-L-лизина 3 и 0.016 г 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) в качестве конденсирующего агента. Перемешивали 20 ч, после чего модифицированные МНЧ осаждали при использовании внешнего магнитного поля. Растворитель декантировали, МНЧ промывали ацетоном (пятью порциями по 15 мл). После промывки МНЧ 4 сушили под вакуумом, получали 0,085 г коричневого порошка.0.100 g of MH4-APS 2 was dispersed in 50 ml of CH ₃ CN using an ultrasound bath for 10 minutes. Then, with stirring, 0.046 g of N ^α , N ^ε -di-Fmoc-L-lysine 3 and 0.016 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) were added as a condensing agent. Stir for 20 h, after which the modified MNPs were besieged using an external magnetic field. The solvent was decanted, the MNP was washed with acetone (five portions of 15 ml each). After washing, the MNPs 4 were dried under vacuum; 0.085 g of brown powder was obtained.

Методом УФ-спектроскопии определяли количество не вступившего в реакцию N-di-Fmoc-L-лизина 1 и, исходя из полученных данных, рассчитывали количество иммобилизированного на МНЧ производного аминокислоты. Для этого был построен калибровочный график содержания N-di-Fmoc-L-лизина 1 в растворе CH₃CN. Количество N-di-Fmoc-L-лизина 1 в растворе определяли спектрофотометрически по максимуму поглощения (λ 265 нм). Растворитель и промывные растворы после проведения реакции собирали и упаривали. Остаток вновь растворяли в точном объеме CH₃CN и проводили фотометрическое определение количества не вступившей в реакцию N-Fmoc-аминокислоты 1 в анализируемом растворе. Количество аминокислотных остатков на поверхности модифицированных МНЧ 4 находили по разнице загруженного в реакцию и непрореагировавшего N-di-Fmoc-L-лизина. В результате, было рассчитано, что полученные модифицированные МНЧ 4 содержали 0.29 ммоль N-di-Fmoc-L-лизина в расчете на 1 г МНЧ.The amount of unreacted N-di-Fmoc-L-lysine 1 was determined by UV spectroscopy and, based on the data obtained, the amount of the amino acid derivative immobilized on the MNP was calculated. For this purpose, a calibration graph was prepared for the content of N-di-Fmoc-L-lysine 1 in a solution of CH ₃ CN. The amount of N-di-Fmoc-L-lysine 1 in the solution was determined spectrophotometrically by the maximum absorption (λ 265 nm). After the reaction, the solvent and the washing solutions were collected and evaporated. The residue was redissolved in the exact volume of CH ₃ CN and a photometric determination of the amount of unreacted N-Fmoc-amino acid 1 in the analyzed solution was performed. The amount of amino acid residues on the surface of the modified MNPs 4 was found from the difference of the unreacted N-di-Fmoc-L-lysine loaded into the reaction. As a result, it was calculated that the resulting modified MNP 4 contained 0.29 mmol of N-di-Fmoc-L-lysine per 1 g of MNP.

Получение L-лизин-модифицированных МНЧGetting L-lysine-modified MNP

0.064 г N-di-Fmoc-L-лизин-модифицированных МНЧ 4 диспергировали в 3 мл смеси диметилформамид : пиперидин (4:1) с использованием УЗ-бани в течение 10 мин, и через 20 мин МНЧ осаждали при использовании внешнего магнитного поля. Растворитель декантировали, МНЧ промывали водой (тремя порциями по 15 мл) до нейтральной pH и ацетоном (двумя порциями по 15 мл), сушили досуха. Получали 0.064 г коричневого порошка МНЧ 5.0.064 g of N-di-Fmoc-L-lysine-modified MNP 4 was dispersed in 3 ml of dimethylformamide: piperidine mixture (4: 1) using an ultrasound bath for 10 min, and after 20 min the MNC was precipitated using an external magnetic field. The solvent was decanted, the MNP was washed with water (three portions of 15 ml) to neutral pH and acetone (two portions of 15 ml), dried to dryness. Received 0.064 g of brown powder MNP 5.

Количество удаленных Fmoc-групп оценивали методом УФ-спектроскопии по аналогии с методикой определения количества Fmoc-групп в пептидах и аминокислотах, иммобилизированных на полимерные носители и используемых в твердофазном синтезе. В результате, было рассчитано, что полученные МНЧ 5 содержали 0.23 ммоль L-лизина в расчете на 1 г МНЧ. Средний размер частиц составлял 20 нм.The number of remote Fmoc groups was evaluated by UV spectroscopy by analogy with the method of determining the number of Fmoc groups in peptides and amino acids immobilized on polymeric carriers and used in solid-phase synthesis. As a result, it was calculated that the obtained MNPs 5 contained 0.23 mmol of L-lysine per 1 g of MNPs. The average particle size was 20 nm.

Пример 2. Кинетика связывания МНЧ с двумя типами стромальных клеток, ОР9 и J2/3T3.Example 2. The kinetics of binding MNPh with two types of stromal cells, OP9 and J2 / 3T3.

Для выяснения способности МНЧ связываться со стромальными клетками были использованы стромальные линии ОР9 и J2/3T3. Проводили связывание этих клеточных линий с МНЧ, описанными в примере 1. Вначале проверяли зависимость эффективности связывания от концентрации МНЧ. Стромальные клетки обрабатывали митомицином С для остановки их пролиферации, и после инкубации с разными концентрациями МНЧ в течение 10 мин связавшие МНЧ клетки выделяли на магните и подсчитывали в камере Горяева. Полученные данные, которые приведены на Фиг. 2, свидетельствуют о том, концентрация МНЧ 100

g/ml достаточна, чтобы около 90% клеток стали магнитными и могли быть выделены на магните.To determine the ability of MNPs to contact stromal cells, the stromal lines OP9 and J2 / 3T3 were used. The binding of these cell lines to the MNPs described in Example 1 was carried out. First, the dependence of the binding efficiency on the concentration of MNPs was checked. Stromal cells were treated with mitomycin C to stop their proliferation, and after incubating with different concentrations of MNP for 10 min, the bound MNP cells were isolated on a magnet and counted in a Goryaev chamber. The data obtained, which is shown in FIG. 2, indicate a concentration of MNPs of 100

g / ml is sufficient so that about 90% of the cells become magnetic and can be separated on a magnet.

Для выяснения времени, необходимого для эффективного связывания клеток с МНЧ стромальные клетки обрабатывали митомицином С и инкубировали с двумя концентрациями МНЧ, 25 и 100

g/ml в течение различного времени, после чего магнетизированные клетки выделяли на магните. Полученные данные, которые приведены на Фиг. 3, свидетельствуют о том, 10 и 30 мин достаточны, чтобы при концентрациях МНЧ 100

g/ml и 25

g/ml, соответственно, около 90% клеток приобрели магнитные свойства и могли быть выделены на магните.To determine the time required for effective binding of cells to MNP, stromal cells were treated with mitomycin C and incubated with two concentrations of MNP, 25 and 100

g / ml for various times, after which the magnetised cells were isolated on a magnet. The data obtained, which is shown in FIG. 3 indicate that 10 and 30 min are sufficient so that at concentrations of MNP 100

g / ml and 25

g / ml, respectively, about 90% of the cells acquired magnetic properties and could be isolated on a magnet.

Пример 3. Различные типы стромальных клеток эффективно накапливают МНЧ и приобретают магнитные свойства.Example 3. Different types of stromal cells effectively accumulate MNPs and acquire magnetic properties.

Для выяснения способности МНЧ связываться с разными типами стромальных клеток, применяемых для совместного культивирования с гемопоэтическими клетками, МНЧ в концентрации (25

g/ml) были инкубированы в течение 15 мин с 10⁶ стромальных клеток следующих типов: MS5, ОР9, J2/3T3, МСК (мезенхимальные стромальные клетки) мыши и МСК человека, после чего магнетизированные клетки выделяли на магните. Полученные данные, которые приведены на Фиг. 4, свидетельствуют о том, что все типы клеток обладали высокой, не ниже 85%, эффективностью связывания МНЧ и выделения на магните.To determine the ability of MNCH to bind with different types of stromal cells used for co-cultivation with hematopoietic cells, MNP in concentration (25

g / ml) were incubated for 15 min with 10 ⁶ stromal cells of the following types: MS5, OP9, J2 / 3T3, mouse MSC (mesenchymal stromal cells) mouse and human MSC, after which the magnetised cells were isolated on a magnet. The data obtained, which is shown in FIG. 4, indicate that all cell types had a high, not less than 85%, efficiency of binding of MNPs and magnet selection.

Пример 4. МНЧ хорошо сохраняются клетками стромы в течение времени культивирования.Example 4. MNPs are well preserved by stromal cells during the time of cultivation.

Стромальные клетки J2/3T3 и ОР9 были инкубированы в течение 15 мин с МНЧ (25

g/ml). Клетки, связавшие МНЧ, были выделены на магните, обработаны митомицином С для остановки их деления и культивированы в стандартных условиях (среда DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 2 мМ глутамином, пенициллином и стрептомицином) при 37°C, 5% CO₂ в течение 7 дней. После завершения культивирования среду отобрали, клетки обработали трипсином-ЭДТА, выделили на магните и подсчитали. Полученные результаты, представленные на Фиг. 5, показывают, что магнитная метка хорошо сохраняется стромальными клетками, причем от 94% до 98% клеток сохраняют МНЧ и могут, таким образом, быть удалены из смеси с гемопоэтическими клетками. Таким образом, МНЧ пригодны для получения очищенных препаратов гемопоэтических клеток после культивирования.Stromal cells J2 / 3T3 and OP9 were incubated for 15 min with MNP (25

g / ml). Cells that bound MNPs were isolated on a magnet, treated with mitomycin C to stop their division and cultured under standard conditions (DMEM with high glucose content, 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, penicillin and streptomycin) at 37 ° C , 5% CO ₂ for 7 days. After the cultivation was completed, the medium was removed, the cells were treated with trypsin-EDTA, isolated on a magnet and counted. The results shown in FIG. 5 show that the magnetic label is well preserved by stromal cells, and from 94% to 98% of the cells retain MNPs and can thus be removed from the mixture with hematopoietic cells. Thus, MNPs are suitable for obtaining purified preparations of hematopoietic cells after cultivation.

Пример 5. При культивировании на магнитной строме и сборе с помощью трипсинизации общее число ядерных клеток и число колониеобразующих клеток повышается по сравнению с культивированием на немагнитной строме и сбором неадгезивных клеток.Example 5. When cultivated on a magnetic stroma and collected using trypsinization, the total number of nuclear cells and the number of colony-forming cells is increased compared to cultivation on a non-magnetic stroma and the collection of non-adherent cells.

Для сравнения эффективности сбора гемопоэтических клеток после культивирования на магнитной и немагнитной стромах из костного мозга мышей была выделена фракция гемопоэтических клеток, обогащенная ранними клетками-предшественниками и гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК) (так называемая Lin- фракция). Выделение это фракции провели с помощью магнитной сортировки, основанной на удалении гемопоэтических клеток, несущих поверхностные маркеры дифференцированных клеток, согласно протоколу фирмы Miltenyi Biotec (Германия). Для этого к клеткам костного мозга мышей добавляли конъюгированные с биотином антитела к набору антигенов Lin, инкубировали с покрытыми стрептавидином магнитными шариками и разделяли на колонках MS MACS (Miltenyi Biotec), а прошедшую клеточную фракцию использовали для дальнейшей работы.To compare the efficiency of collecting hematopoietic cells after cultivation on magnetic and non-magnetic stroma from the bone marrow of mice, a fraction of hematopoietic cells enriched with early progenitor cells and hematopoietic stem cells (HSC) (the so-called Lin fraction) was isolated. The selection of this fraction was carried out using magnetic sorting, based on the removal of hematopoietic cells carrying surface markers of differentiated cells, according to the protocol of the company Miltenyi Biotec (Germany). To do this, biotin-conjugated antibodies to a set of Lin antigens were added to mouse bone marrow cells, incubated with streptavidin-coated magnetic beads and separated on MS MACS columns (Miltenyi Biotec), and the last cell fraction was used for further work.

Далее было проведено культивирование клеток Lin- фракции костного мозга мышей в течение 1 недели на магнитном и немагнитном стромальных слоях клеток J2/3T3 и ОР9.Further, the Lin fractions of the bone marrow of mice were cultured for 1 week on magnetic and non-magnetic stromal layers of J2 / 3T3 and OP9 cells.

Для этого 15×10³ клеток Lin- фракции культивировали на стромальных слоях клеток линий J2/3T3 и ОР9, которые были нагружены МНЧ, после чего магнитные клетки были дополнительно очищены осаждением на магните и далее обработаны митомицином С. Для контроля использовали соответствующие немагнитные слои, которые были обработаны митомицином С. Культивирование на строме проводили в CO₂ инкубаторе в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 2 мМ глутамином, пенициллином и стрептомицином. 50% смены среды проводили каждые 3 дня. После 7 дней культивирования (первый раунд культивирования) на немагнитных слоях проводили аккуратное пипетирование и собирали неадгезивные гемопоэтические клетки, в то время как на магнитных слоях проводили полную диссоциацию культур с помощью трипсинизации, после чего магнитные стромальные клетки удаляли на магните. В случае большого числа собранных клеток удаление стромальных клеток на магните проводили дважды. Собранные ядерные клетки подсчитывали, и часть собранных гемопоэтических клеток (50×10³) была использована для второго раунда культивирования в течение 1 недели на соответствующей строме. Общее число собранных клеток и число колониеобразующих единиц (КОЕ) оценивали после первого и второго раунда культивирования на строме. Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 6 и 7. Культивирование на магнитной строме и сбор клеток с помощью трипсинизации дали на первом раунде примерно в 2,6 и в 3,5 раз больше ядерных клеток для ОР9 и J2/3T3 стромы, соответственно, по сравнению с соответствующей немагнитной стромой. Во время второго раунда культивирования эти различия в целом сохранялись, что в результате привело к кумулятивной наработке (то есть общей наработке клеток в случае, если бы все снятые после первого раунда клетки были использованы для второго раунда) ядерных клеток с использованием магнитной стромы примерно в 7 и 10 раз больше для ОР9 и J2/3T3 стромы по сравнению с соответствующей немагнитной стромой (Фиг. 6). Подсчет гемопоэтических и стромальных клеток в собранных с магнитной стромы клеточных популяциях показал, что степень контаминации собранных образцов стромальными клетками (7-10%) был значительно ниже, чем в случае с немагнитной стромы, где число стромальных клеток даже превышало число гемопоэтических. Такая степень контаминации, по-видимому, является результатом постепенного ухудшения состояния стромального слоя во время культивирования, что приводит к нарушению его целостности, отшелушиванию стромальных клеток и загрязнению ими собираемой неадгезивной фракции.To do this, 15 × 10 ³ cells of the Lin fraction were cultured on the stromal layers of cells of the J2 / 3T3 and OP9 lines, which were loaded with MNPs, after which the magnetic cells were further purified by deposition on a magnet and further treated with mitomycin C. To control, the corresponding nonmagnetic layers were used, which were treated with mitomycin C. Cultivation on the stroma was carried out in a CO ₂ incubator in DMEM medium with a high content of glucose, 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, penicillin and streptomycin. 50% of the medium change was carried out every 3 days. After 7 days of cultivation (the first round of cultivation), careful pipetting was performed on nonmagnetic layers and nonadhesive hematopoietic cells were harvested, while on the magnetic layers, complete dissociation of the cultures was performed using trypsinization, after which magnetic stromal cells were removed on a magnet. In the case of a large number of collected cells, the removal of stromal cells on a magnet was performed twice. The harvested nuclear cells were counted, and a portion of the collected hematopoietic cells (50 × 10 ³ ) was used for the second round of culture for 1 week on the corresponding stroma. The total number of harvested cells and the number of colony forming units (CFU) were evaluated after the first and second round of culture on the stroma. The results of this experiment are shown in FIG. 6 and 7. Cultivation on the magnetic stroma and cell collection using trypsinization yielded approximately 2.6 and 3.5 times more nuclear cells for OP9 and J2 / 3T3 stroma in the first round, respectively, compared to the corresponding non-magnetic stroma. During the second round of cultivation, these differences largely remained, resulting in cumulative production (i.e. total cell production if all cells removed after the first round were used for the second round) of nuclear cells using a magnetic stroma in about 7 and 10 times more for the OP9 and J2 / 3T3 stroma compared with the corresponding non-magnetic stroma (Fig. 6). The count of hematopoietic and stromal cells in cell populations collected from the magnetic stroma showed that the degree of contamination of the collected samples with stromal cells (7-10%) was significantly lower than in the case of non-magnetic stroma, where the number of stromal cells even exceeded the number of hematopoietic. This degree of contamination appears to be the result of a gradual deterioration of the stromal layer during cultivation, which leads to a violation of its integrity, the exfoliation of the stromal cells and the contamination of the collected non-adhesive fraction by them.

Для анализа выхода прогениторных клеток после культивирования на строме в собранных клеточных популяциях был проведен анализ содержания миелоидных КОЕ путем подсчета колоний в метил целлюлозе. Для этого 10×10³ клеток после первого раунда или 50×10³ клеток после второго раунда высаживали в среду IMDM с метилцеллюлозой MethoCult М3134 (StemCell Technologies, Vancouver, Canada), содержащей 15% фетальную сыворотку крупного рогатого скота, 1×BIT 9500 заменитель сыворотки, 1,4×10^-4 М бета-меркаптоэтанол, фактор стволовых клеток (SCF) 100 нг/мл, интерлейкин-3 (IL-3) 10 нг/мл, интерлейкин-6 (IL-6) 10 нг/мл, эритропоэтин (ЕРО) 3 ед./мл, 2 мМ глутамин, пенициллин и стрептомицин. Клетки культивировали в течение 7 дней при 37°C в CO₂ инкубаторе (5% CO₂), колонии подсчитывали под инвертированным микроскопом. Полученные результаты (Фиг. 7) показывают, что число миелоидных КОЕ значительно выше во фракции, собранной с магнитной строме, чем с немагнитной. Так, после первого раунда культивирования частота КОЕ в полученной фракции гемопоэтических клеток была в 1,3 раза выше для ОР9 стромы и примерно в 3 раза выше для J2/3T3 стромы. Общее число миелоидных КОЕ было в 3,4 раза выше для магнитной ОР9 стромы и в 10,4 раза выше для магнитной J2/3T3 стромы, чем для соответствующих немагнитных стром. Второй раунд культивирования привел к дальнейшему увеличению числа КОЕ для магнитной по сравнению с немагнитной. Так, кумулятивное число КОЕ в собранных фракциях было выше в 9,7 раз в случае со стромой ОР9 и в 19,8 раз в случае со стромой J2/3T3 для магнитной стромы, чем для немагнитной.To analyze the release of progenitor cells after cultivation on the stroma in the collected cell populations, an analysis of the content of myeloid CFU was performed by counting colonies in methyl cellulose. To this end, 10 × 10 ³ cells after the first round or 50 × 10 ³ cells after the second round were planted in IMDM with methyl cellulose MethoCult M3134 (StemCell Technologies, Vancouver, Canada) containing 15% fetal bovine serum, 1 × BIT 9500 substitute serum, 1.4 × 10 ^-4 M beta-mercaptoethanol, stem cell factor (SCF) 100 ng / ml, interleukin-3 (IL-3) 10 ng / ml, interleukin-6 (IL-6) 10 ng / ml , erythropoietin (EPO) 3 units / ml, 2 mM glutamine, penicillin and streptomycin. Cells were cultured for 7 days at 37 ° C in a CO ₂ incubator (5% CO ₂ ), the colonies were counted under an inverted microscope. The results obtained (Fig. 7) show that the number of myeloid CFU is significantly higher in the fraction collected from the magnetic stroma than from the non-magnetic one. So, after the first round of cultivation, the frequency of CFU in the resulting fraction of hematopoietic cells was 1.3 times higher for OR9 stroma and about 3 times higher for J2 / 3T3 stroma. The total number of myeloid CFU was 3.4 times higher for the magnetic OP9 stroma and 10.4 times higher for the magnetic J2 / 3T3 stroma than for the corresponding non-magnetic stroma. The second round of cultivation led to a further increase in the number of CFUs for magnetic compared to non-magnetic. Thus, the cumulative number of CFU in the collected fractions was higher by 9.7 times in the case of the OP9 stroma and 19.8 times in the case of the J2 / 3T3 stroma for a magnetic stroma than for a magnetic one.

Более высокая частота КОЕ в собранных с магнитных стром клеточных фракций, вероятно, является следствием того, что гемопоэтические предшественники локализуются в основном под стромой или тесно ассоциированы с ней (Jing D, Fonseca AV, Alakel N, Fierro FA, Muller K, Bornhauser M, Ehninger G, Corbeil D, Ordemann R. Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchymal stromal cells - modeling the niche compartments in vitro. Haematologica. 2010 95(4):542-550).The higher frequency of CFUs in the cellular fractions collected from the magnetic stroma is probably due to the fact that the hematopoietic progenitors are localized mainly under the stroma or are closely associated with it (Jing D, Fonseca AV, Alakel N, Fierro FA, Muller K, Bornhauser M, Ehninger G, Corbeil D, Ordemann R. Hematopoietic cells in vitro modeling in vitro, co-culture with mesenchymal stromal cells, Haematologica. 2010 95 (4): 542-550.

Пример 6. При культивировании на магнитной строме и сборе с помощью трипсинизации число клеток с ранним фенотипом Lin-, kit+, Sca1+ значительно повышается по сравнению с немагнитной стромой.Example 6. When cultivated on a magnetic stroma and collected using trypsinization, the number of cells with the early phenotype Lin-, kit +, Sca1 + is significantly increased compared with a non-magnetic stroma.

Для того, чтобы определить выход ранних гемопоэтических клеток (гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники) после культивирования на строме, мы проанализировали с помощью проточной цитофлюорометрии частоту клеток с поверхностным фенотипом Lin^-Sca-⁺kit⁺(LSK клетки) в клеточных популяциях, полученных после 1 раунда культивирования на строме. Частота LSK клеток (Фиг. 8, верхние правые квадранты А2) была значительно выше в популяциях клеток, собранных с магнитной стромы, в том числе в 1,9 раз для ОР9 стромы и в 1,5 раз для стромы J2/3T3. Увеличение общего числа собранных LSK клеток для магнитной стромы, с учетом увеличения общего сбора ядерных клеток (пример 5), по сравнению с немагнитной, было еще выше.In order to determine the yield of early hematopoietic cells (hematopoietic stem cells and progenitor cells) after cultivation on the stroma, we analyzed, using flow cytofluorometry, the frequency of cells with the Lin ^- Sca- ⁺ kit ⁺ phenotype (LSK cells) in cell populations obtained after 1 round of cultivation on the stroma. The frequency of LSK cells (Fig. 8, upper right quadrants A2) was significantly higher in the cell populations collected from the magnetic stroma, including 1.9 times for the OR9 stroma and 1.5 times for the stroma J2 / 3T3. The increase in the total number of LSK cells collected for the magnetic stroma, taking into account the increase in the total collection of nuclear cells (Example 5), compared with non-magnetic, was even higher.

Пример 7. Поддерживающая активность стромальных клеток не снижается после их магнетизации.Example 7. The supporting activity of stromal cells does not decrease after their magnetisation.

Для выяснения того, может ли магнетизация стромальных клеток негативно повлиять на их способность поддерживать гемопоэтические клетки в культуре, 15×10³ клеток Lin- фракции культивировали с магнитной J2/3T3 и контрольной J2/3T3 стромами, после чего было подсчитано количество гемопоэтических клеток, а также проведена оценка фенотипа культивированных клеток с помощью проточной цитофлюорометрии. Полученные результаты представлены на Фиг. 9. Из Фиг. 9А следует, что магнетизация стромы не уменьшает количество размноженных на строме гемопоэтических клеток. Данные Фиг. 9Г показывают, что количество клеток с ранним фенотипом Lin-/Sca1+/c-kit+ даже несколько увеличивается при культивировании на магнитной строме.To find out whether the magnetisation of stromal cells can negatively affect their ability to support hematopoietic cells in culture, 15 × 10 ³ Lin-fraction cells were cultured with magnetic J2 / 3T3 and control J2 / 3T3 stroma, after which the number of hematopoietic cells was counted, and The phenotype of cultured cells was also evaluated using flow cytofluorometry. The results are presented in FIG. 9. Of FIG. 9A it follows that stromal magnetisation does not reduce the number of hematopoietic cells multiplied on the stroma. The data of FIG. 9G show that the number of cells with the early Lin- / Sca1 + / c-kit + phenotype even increases slightly when cultured on a magnetic stroma.

Пример 8. При культивировании на магнитной строме и сборе с помощью трипсинизации число клеток из костного мозга человека с ранним фенотипом CD34⁺CD38^- значительно повышается по сравнению с немагнитной стромой.Example 8. When cultivated on a magnetic stroma and collected using trypsinization, the number of cells from the bone marrow of a person with the early phenotype CD34 ⁺ CD38 ^is significantly increased compared to a nonmagnetic stroma.

В качестве стромального слоя были использованы мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из жировой ткани человека. В качестве исходного клеточного образца использовали обогащенную гемопоэтическими клетками и клетками-предшественниками фракцию CD34-позитивных клеток (CD34⁺ фракции) из пуповинной крови человека. Выделение CD34⁺ фракции проводилось с помощью магнитной селекции с использованием реагентов и оборудования фирмы Miltenyi Biotec (Германия). Было посеяно по 22 500 CD34⁺ клеток в каждую лунку 6-ти луночного планшета. Культивирование проводилось в течении 10 дней. Для последующего анализа три повтора были объединены. Полученные результаты показывают, что при культивировании на магнитной строме и сборе клеток с помощью трипсинизации общее число собранных ядерных клеток увеличивается в 1.66 раз, а частота клеток фенотипа CD34⁺CD38^-, соответствующего гемопоэтическим клеткам-предшественникам и стволовым клеткам, увеличивается в несколько десятков раз (40-50 раз).Mesenchymal stem cells (MSCs) from human adipose tissue were used as the stromal layer. A fraction of CD34-positive cells (CD34 ⁺ fractions) from human umbilical cord blood enriched with hematopoietic cells and progenitor cells was used as the initial cell sample. Isolation of the CD34 ⁺ fraction was carried out using magnetic selection using reagents and equipment from Miltenyi Biotec (Germany). 22,500 CD34 ⁺ cells were seeded in each well of a 6-well plate. Cultivation was carried out for 10 days. For the subsequent analysis, three repetitions were combined. The results show that when cultured on a magnetic stroma and collecting cells using trypsinization, the total number of collected nuclear cells increases 1.66 times, and the frequency of CD34 ⁺ CD38 ^- phenotype cells corresponding to hematopoietic progenitor cells and stem cells increases by a few dozen times ( 40-50 times).

Claims

1. A method of obtaining representative populations of hematopoietic cells and increasing the yield of hematopoietic progenitor cells and hematopoietic stem cells, including the cultivation of hematopoietic cells on the stromal cell layers, characterized in that the cultivation is carried out on magnetic stromal layers obtained by incubating the stromal cells with magnetic nanoparticles or on the stromal cells with magnetic nanoparticles or on the stromal cells or magnetic nanoparticles obtained by incubating the stromal cells with magnetic nanoparticles or on the stromal cells with magnetic nanoparticles or incandescent stromal cells. liposomes followed by cell treatment with mitomycin C or irradiation with x-ray or gamma radiation for stopping Their divisions, when collecting hematopoietic cells, dissociate the culture by treating with trypsin, collagenase, or another proteolytic enzyme, or intensively stirring the culture, and cleaning the cell preparations by removing the magnetic stroma on the magnet.

2. A method according to claim 1, characterized in that the stromal layers are made magnetic by incubating with magnetic Fe ₃ O ₄ nanoparticles capable of being captured by the cells.

3. The method according to p. 2, characterized in that to reduce the contamination of hematopoietic cells by stromal cells prior to cultivation, pre-purification of magnetic stromal cells on a magnet is carried out.

4. The method according to p. 3, characterized in that to reduce the load of the magnetic stroma with nanoparticles and increase its lifetime, pre-titration of the binding of magnetic particles by stromal cells is carried out and preparations of magnetic stromal cells in which the proportion of magnetic cells is not used to clean the magnetic stroma on the magnet exceeds 90%.

5. A kit for obtaining representative populations of hematopoietic cells and increasing the yield of hematopoietic progenitor cells and hematopoietic stem cells, including magnetic Fe ₃ O ₄ nanoparticles, effectively magnetizing stromal cells, magnet, stromal cells, mitomycin C and media for cell culture on magnetic stromal layers.