RU2684639C1 - Method of removing endotoxins from biological fluids using covalently immobilized lysozyme as ligand - Google Patents
Method of removing endotoxins from biological fluids using covalently immobilized lysozyme as ligand Download PDFInfo
- Publication number
- RU2684639C1 RU2684639C1 RU2018121114A RU2018121114A RU2684639C1 RU 2684639 C1 RU2684639 C1 RU 2684639C1 RU 2018121114 A RU2018121114 A RU 2018121114A RU 2018121114 A RU2018121114 A RU 2018121114A RU 2684639 C1 RU2684639 C1 RU 2684639C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lysozyme
- sorbent
- immobilized
- matrix
- ligand
- Prior art date
Links
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 title claims abstract description 58
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 title claims abstract description 58
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 title claims abstract description 58
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 48
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 10
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 claims description 6
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 abstract description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 abstract 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 5
- 239000000495 cryogel Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000002113 nanodiamond Substances 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 3
- 241001248479 Pseudomonadales Species 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 3
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N Methyl acrylate Chemical compound COC(=O)C=C BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 230000001420 bacteriolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005474 detonation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 2
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 241000947836 Pseudomonadaceae Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- -1 bromoacetyl Chemical class 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010557 suspension polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к технологиям использования сорбентов, применяемых в том числе для медицинских целей, а именно для экстракорпоральной терапии больных с сепсисом с использованием сорбции биологических жидкостей.The invention relates to technologies for the use of sorbents, including those used for medical purposes, namely, in extracorporeal therapy of patients with sepsis using sorption of biological fluids.
Уровень техникиThe level of technology
Использование препаратов иммобилизованного лизоцима является важной задачей, расширяющей спектр медицинского и биотехнологического применения данного фермента.The use of drugs immobilized lysozyme is an important task, expanding the range of medical and biotechnological use of this enzyme.
Бактериальный эндотоксин (БЭ) - это поверхностный липополисахарид бактерий, который накапливается в крови при сепсисе, на который сильно реагирует иммунная система человека. С медицинской точки зрения иногда важнее быстро убрать находящиеся в биожидкости БЭ, чем добиваться полного обезвреживания бактерий, продуцирующих эти БЭ. Проблема удаления БЭ в современной практике частично решается рядом сорбентов с синтетическими лигандами. Есть патенты на эту тему. Выборочно это:Bacterial endotoxin (BE) is a superficial lipopolysaccharide of bacteria that accumulates in the blood during sepsis, to which the human immune system strongly reacts. From a medical point of view, it is sometimes more important to quickly remove the BEs located in the biological fluid than to achieve the complete neutralization of the bacteria producing these BEs. The problem of BE removal in modern practice is partially solved by a number of sorbents with synthetic ligands. There are patents on this topic. Selectively this:
В международной заявке на изобретение WO 2010083545 SORBENT FOR ENDOTOXINS (Опубликовано: 2010-07-29) описывается сорбент для удаления БЭ из биологической жидкости, который содержит нерастворимый в воде пористый носитель и полимиксин (polymixin), который иммобилизуется на носителе, причем упомянутый носитель имеет нейтральную, гидрофобную поверхность и иммобилизированный полимиксин удерживается на поверхности сорбента путем гидрофобного взаимодействия. Сорбент разработан для экстракорпоральной очистки крови, прежде всего, для лечения сепсиса. Данная заявка фактически покрывает все варианты сорбентов с полимиксином, иммобилизированным посредством гидрофобного взаимодействия.In the international patent application WO 2010083545 SORBENT FOR ENDOTOXINS (Published: 2010-07-29) describes a sorbent for removing EB from a biological fluid, which contains a water-insoluble porous carrier and polymyxin (polymixin), which is immobilized on the carrier, and the said carrier has neutral, hydrophobic surface and immobilized polymyxin is retained on the surface of the sorbent by hydrophobic interaction. The sorbent is designed for extracorporeal blood purification, primarily for the treatment of sepsis. This application actually covers all versions of sorbents with polymyxin immobilized through hydrophobic interaction.
Однако, такой способ иммобилизации не исключает утечку лиганда.However, this method of immobilization does not preclude the leakage of the ligand.
В патенте на изобретение DE 4209988 ENDOTOXIN ADSORBER HAVING HIGH BINDING CAPACITY - COMPRISES POLYETHYLENEIMINE BONDED TO POROUS CARRIER, ESP. POLYSACCHARIDE (Опубликовано: 1993-03-04) заявляются адсорбенты эндотоксинов, содержащие полиэтиленимин, нековалентно или ковалентно связанные с внутренней и/или наружной поверхностью пористого материала носителя. Материал-носитель представляет собой мембрану или гранулу, например, полисахарид, целлюлозу, полисульфон, полиакрилонитрил или полиамид. Такие адсорбенты используются для удаления БЭ из биологических жидкостей.In the patent for invention DE 4209988 ENDOTOXIN ADSORBER HAVING HIGH BINDING CAPACITY - COMPRISES POLYETHYLENEIMINE BONDED TO POROUS CARRIER, ESP. POLYSACCHARIDE (Published: 1993-03-04) are claimed to be endotoxin adsorbents containing polyethyleneimine, non-covalently or covalently bonded to the inner and / or outer surface of the porous material of the carrier. The carrier material is a membrane or granule, for example, a polysaccharide, cellulose, polysulfone, polyacrylonitrile or polyamide. Such adsorbents are used to remove BE from biological fluids.
Однако, в изобретении не показана гемосовместимость сорбента и сам лиганд иной, чем в предлагаемом изобретении.However, the invention does not show the hemocompatibility of the sorbent and the ligand itself is different than in the present invention.
В патенте RU 2641924 СОРБЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ (Опубликовано: 23.01.2018 Бюл. №3) описан сорбционный материал, содержащий пористый носитель, функциональные группы на поверхности которого ковалентно связаны с лигандом, способным к образованию прочных комплексов с бактериальными эндотоксинами. Пористый носитель представляет собой гранулы размером от 50 до 900 микрон, выполненные из полимера или сополимера. Изобретение обеспечивает получение новых селективных сорбентов для очистки жидких сред от БЭ.Sorption material, method of its production and method of its application (Published: 01/23/2018 Bulletin No. 3) describes sorption material containing porous carrier, functional groups on the surface of which are covalently bound to a ligand capable of forming strong complexes with bacterial endotoxins. Porous media is granules in the size from 50 to 900 microns, made of polymer or copolymer. The invention provides for obtaining new selective sorbents for the purification of liquid media from EB.
Однако, отличается материал носителя (матрицы), способ иммобилизации и сам лиганд. Кроме того, не показана гемосовместимость сорбента.However, the material of the carrier (matrix), the method of immobilization and the ligand itself differ. In addition, hemocompatibility of the sorbent is not shown.
Найдена только лишь одна статья Capture of bacterial endotoxins using a supermacroporous monolithic matrix with immobilized polyethyleneimine, lysozyme or polymyxin В. Авторы: Amro Наnоrа, Fatima M. Plieva, Martin 
Однако, здесь испытания по удалению БЭ проводилась только на модельных растворах с БЭ и нет исследований гемосовместимости сорбента. Также использована другая схема иммобилизации в отличие от схемы в предлагаемом изобретении.However, here the tests for the removal of BE were performed only on model solutions with BE and there are no studies of the sorbent hemocompatibility. Also used another scheme immobilization in contrast to the scheme in the present invention.
Еще имеется работа, посвященная криогелю поливинилового спирта, в который был нековалентно включен лизоцим на стадии изготовления самого криогеля в процессе циклического многократного замораживания-оттаивания (ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЛИЗОЦИМА В КРИОГЕЛЬ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА. Декина С.С., Романовская И.И., Овсепян А.М., Молодая А.Л., Пашкин И.И. // Biotechnol. Acta. 2014. V.7. No 3. Р. 69). Иммобилизованный таким образом лизоцим характеризуется расширенным рН-профилем активности, существенно отличным от такового для растворимого фермента. Расширение рН-профиля активности является положительным моментом в плане дополнительного расширения спектра условий применимости лизоцима.There is also work on polyvinyl alcohol cryogel, in which lysozyme was non-covalently included at the manufacturing stage of the cryogel itself in the process of cyclic multiple freeze-thawing (imismobilization of polyvinyl alcohol in a cryogel. Dekina, S., Romanovskaya, I. Y. Ovchev, Ovcher, OV, Y. Y., Ovchev, Ovcher, S. Y., Oyk Yev, Ovk, Ovysk, YV, Yev, Yev, Ovchev, S. Y., Oyk Yev, Yev, Yev, Yev, Yev, Yev, Yev, Yev, Yev, YV, Yev, YV, Y. Y., Yev, Y. Y. M., Young A.L., Pashkin I.I. // Biotechnol. Acta. 2014. V.7. No 3. R. 69). Lysozyme immobilized in this way is characterized by an extended pH profile of activity that is significantly different from that of a soluble enzyme. The expansion of the pH profile of activity is a positive point in terms of additional expansion of the range of conditions of applicability of lysozyme.
Однако, у лизоцима, нековалентно иммобилизованного в криогеле поливинилового спирта, есть ограничения по сферам применения, особенно в медицине, так как в этом варианте иммобилизации присутствует фактор утечки фермента из геля, и не была показана возможность удаления БЭ из биожидкости.However, lysozyme, non-covalently polyvinyl alcohol immobilized in the cryogel, has limitations on the fields of application, especially in medicine, since in this variant of immobilization the factor of enzyme leakage from the gel is present, and the possibility of removing EB from biofluid has not been shown.
Еще один вариант иммобилизации лизоцима - это включение белка в нанопоры наночастиц силикагеля (Као K.-Ch., Lin T.-S., Мои Ch.-Y. // J. Phys. Chem. C. 2014. V. 118. P. 6734). Было показано, что при такой иммобилизации несколько возрастала активность и заметно улучшалась стабильность активности лизоцима.Another option for the immobilization of lysozyme is the inclusion of protein in the nanopores of silica gel nanoparticles (Kao K.-Ch., Lin T.-S., My Ch.-Y. // J. Phys. Chem. C. 2014. V. 118. P. 6734). It was shown that with such immobilization, the activity slightly increased and the stability of lysozyme activity was noticeably improved.
Однако следует отметить, что данный вариант иммобилизации также является нековалентным присоединением и соответственно предполагает утечку белка с частиц, и также не была показана возможность удаления БЭ из биологической жидкости.However, it should be noted that this variant of immobilization is also non-covalent attachment and, accordingly, implies the leakage of protein from the particles, and also the possibility of removing BE from the biological fluid was not shown.
Существует способ приготовления лизоцима, ковалентно иммобилизованного на полистироле (Wu Y., Daeschel М.А. // J. Food Sci. 2007. V. 72. Nr.9 P.M369). В этом методе применяются подходы из твердофазного синтеза пептидов. Используют хлорметил-полистирол, на который прививают s-аминокапроновую кислоту с третбутилоксикарбонильной защитой, затем переводят аминогруппу в бромацетил производное с последующим присоединением единственного гистидина лизоцима (His-15). Полученный иммобилизованный лизоцим обладает хорошей стабильностью. Из плюсов способа следует отметить точную направленную иммобилизацию и отсутствие побочных продуктов с неустановленной структурой.There is a method for preparing lysozyme covalently immobilized on polystyrene (Wu Y., Daeschel MA // J. Food Sci. 2007. V. 72. Nr.9 P.M369). This method uses approaches from solid-phase peptide synthesis. Chloromethyl-polystyrene is used on which s-aminocaproic acid is grafted with tert-butyloxycarbonyl protection, then the amino group is converted to a bromoacetyl derivative followed by the addition of a single histidine lysozyme (His-15). The resulting immobilized lysozyme has good stability. Of the advantages of the method, it should be noted precise directional immobilization and the absence of by-products with an unidentified structure.
Из минусов способа можно отметить высокую стоимость исходных материалов и сложность схемы синтеза, что однозначно станет препятствием для широкого практического применения. Также не показана возможность удаления БЭ из биологической жидкости.Of the drawbacks of the method, it is possible to note the high cost of raw materials and the complexity of the synthesis scheme, which definitely will be an obstacle to widespread practical use. The possibility of removing BE from a biological fluid is also not shown.
Также в ходе патентного поиска были проанализированы несколько патентов про способы иммобилизации лизоцима в матрицах сорбентов.Also during the patent search, several patents were analyzed about methods for immobilizing lysozyme in sorbent matrices.
Патент RU 2569510 СОРБЕНТ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИЙ СОБОЙ НАНОАЛМАЗНЫЙ МАТЕРИАЛ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ (Опубликовано: 27.11.2015 Бюл. №33). Сорбенты из наноалмазсодержащих материалов получают в результате детонационного синтеза и модификации. Поверхность детонационных наноалмазов подвергают целенаправленному изменению путем модифицирования химически активными жидкими и газообразными веществами при повышенных температурах. В результате модифицирования состав поверхностных радикалов, содержащих атомы неуглеродной природы (О, Н, N, S), пополняется дополнительными атомами, что приводит к появлению дополнительных аналогичных или новых функциональных групп, способных образовывать связи с функциональными группами биологических объектов. Изобретение обеспечивает возможность удаления широкого спектра белковых материалов с помощью полученных сорбентов из различных биологических жидкостей.Patent RU 2569510 SORBENT, REPRESENTING A NANO-DIAMOND MATERIAL (OPTIONS), METHODS OF OBTAINING AND USING (Published: 11/27/2015 Bul. No. 33). Sorbents from nano-diamond-containing materials are obtained as a result of detonation synthesis and modification. The surface of detonation nanodiamonds is subjected to purposeful change by modifying with chemically active liquid and gaseous substances at elevated temperatures. As a result of modifying the composition of surface radicals containing non-carbon atoms (O, H, N, S), additional atoms are replenished, which leads to the appearance of additional analogous or new functional groups capable of forming bonds with functional groups of biological objects. The invention provides the ability to remove a wide range of protein materials using the obtained sorbents from various biological fluids.
Однако, наноалмазы в медицинских экстракорпоральных процедурах не используются, лизоцим привязан нековалентно и поэтому не исключена утечка в биожидкость.However, nanodiamonds are not used in medical extracorporal procedures, lysozyme is bound non-covalently and therefore leakage into biofluid is not excluded.
Патент Китая CN 106589202 (A) LYSOZYME IMMOBILIZED CARRIER AND PREPARATION METHOD THEREOF (Опубликовано: 2017-04-26). Изобретение относится к матрице (носителю) иммобилизованного лизоцима и способу получения, относящемуся к области иммобилизации фермента. В изобретении применяется экологически безопасный технологический процесс суспензионной полимеризации с использованием метилакрилата в качестве основного сырья, дивинилбензола в качестве сшивающего агента, регулирующего структуру смолы путем добавления третьего мономерного стирола для увеличения механической прочности носителя, макропористый носитель лизоцима был приготовлен в присутствии реагента, а гидролиз слабокислой макропористой катионообменной смолы был получен с получением ферментного носителя. В конце отвержденный лизоцим получали взаимодействием смолы, глутаральдегида и лизоцима.China Patent CN 106589202 (A) LYSOZYME IMMOBILIZED CARRIER AND PREPARATION METHOD THEREOF (Published: 2017-04-26). The invention relates to a matrix (carrier) of immobilized lysozyme and method of production relating to the field of immobilization of the enzyme. The invention uses an environmentally friendly suspension polymerization process using methyl acrylate as the main raw material, divinylbenzene as a crosslinking agent that regulates the resin structure by adding a third monomeric styrene to increase the mechanical strength of the carrier, the macroporous lysozyme carrier was prepared in the presence of a reagent, and hydrolysis of the weakly acidic macroporous cation exchange resin was obtained to obtain an enzyme carrier. At the end, cured lysozyme was obtained by reacting resin, glutaraldehyde and lysozyme.
Однако, для данного материала не была показана гемосовместимость и не была показана возможность удаления БЭ из биологической жидкости.However, hemocompatibility was not shown for this material and the possibility of removing BE from biological fluid was not shown.
Таким образом в ходе тщательных патентно-информационных поисков не удалось найти ни одной публикации про удаление эндотоксинов из биологических жидкостей с помощью гемосовместимого сорбента с иммобилизованным лизоцимом, что позволяет сделать предварительный вывод, что, вероятно, этого никто еще не делал практически до сих пор.Thus, in the course of thorough patent information searches, no publication was found on the removal of endotoxins from biological fluids using a hemocompatible sorbent with immobilized lysozyme, which allows us to make a preliminary conclusion that probably no one has done this until now.
Раскрытие изобретенияDISCLOSURE OF INVENTION
Задачей предлагаемого изобретения явилась практическая реализация идеи применения иммобилизованного лизоцима в качестве лиганда в матрице гемосовместимого сорбента для удаления БЭ из биологических жидкостей с практическим отсутствием риска утечки лизоцима (невнесение никаких дополнительных веществ) в сорбируемую биологическую жидкость (водный раствор, в том числе физраствор, плазму крови и цельную кровь (с учетом гемосовместимости сорбента)). Возможна адаптация и к другим биожидкостям.The task of the present invention was the practical implementation of the idea of using immobilized lysozyme as a ligand in a matrix of hemocompatible sorbent for removing EB from biological fluids with practically no risk of lysozyme leakage (not adding any additional substances) to the sorbed biological fluid (aqueous solution, including saline, blood plasma and whole blood (taking into account sorbent hemocompatibility)). Adaptation to other biofluids is possible.
Задача решается предлагаемым способом удаления БЭ из биологических жидкостей с помощью химически (ковалентно) иммобилизованного в аминированной агарозной матрице лизоцима в качестве лиганда. Способ проверен на удалении энтеробактериальных эндотоксинов (кишечной палочки Escherichia coli, сорбция 65±17 нг на мл сорбента) и псевдомонадных эндотоксинов (синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa, сорбция 190±25 нг на мл сорбента). Кишечная палочка и синегнойная палочка относятся к тем бактериям, эндотоксины которых очень серьезно ухудшают прогноз у больных с сепсисом.The problem is solved by the proposed method of removing EB from biological fluids using chemically (covalently) immobilized in an aminated agarose matrix of lysozyme as a ligand. The method was tested on the removal of enterobacterial endotoxins (Escherichia coli Escherichia coli, sorption 65 ± 17 ng per ml of sorbent) and pseudomonadal endotoxins (Pseudomonas aeruginosa syrup purulent, sorption 190 ± 25 ng per ml of sorbent). E. coli and Pseudomonas aeruginosa are among those bacteria whose endotoxins very seriously worsen the prognosis in patients with sepsis.
Иммобилизацию лизоцима на агарозной аминированной матрице проводят с получением молекулярного спейсера -NH-C6H12-NH-C5H10-NH-, присоединяющего молекулу лизоцима.Immobilization of lysozyme on an agarose aminated matrix is carried out with the preparation of a molecular spacer —NH — C 6 H 12 —NH — C 5 H 10 —NH-, which joins the lysozyme molecule.
Перечень рисунковList of drawings
Рис. 1 - Схема приготовления аминированной матрицы и затем ковалентная иммобилизация (присоединение к матрице) лизоцима через молекулярный спейсер.Fig. 1 - Scheme of preparation of the aminated matrix and then covalent immobilization (attachment to the matrix) of lysozyme through a molecular spacer.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
На рис. 1 представлена схема приготовления аминированной матрицы и затем ковалентная иммобилизация (присоединение к матрице) лизоцима через молекулярный спейсер. Большую роль в повышении эффективности действия иммобилизованного лизоцима играет применение спейсера (для устранения стерических препятствий присоединению макромолекулярных лигандов (лизоцима) между ними и матрицей бывает необходимо ввести молекулу спейсера). Наиболее перспективный вариант иммобилизованного лизоцима получен ковалентным присоединением фермента к матрице через спейсер -NH-C6H12-NH-C5H10-NH-.In fig. 1 shows the preparation of an aminated matrix and then covalent immobilization (attachment to the matrix) of lysozyme through a molecular spacer. The use of a spacer (to eliminate steric hindrances to the attachment of macromolecular ligands (lysozyme) between them and the matrix, it is necessary to introduce a spacer molecule) plays a major role in increasing the effectiveness of immobilized lysozyme. The most promising variant of immobilized lysozyme is obtained by covalent addition of the enzyme to the matrix via the –NH – C 6 H 12 –NH – C 5 H 10 –NH- spacer.
Для аминирования агарозной матрицы ее промывали 10-тью объемами дистиллированной воды на стеклянном фильтре, присоединенном к водоструйному насосу с помощью колбы Бунзена. К навеске геля добавляли двукратное количество 2% водного раствора периодата натрия и инкубировали 2 часа на качалке при 20°С. После инкубации матрицу промывали 20-кратным объемом дистиллированной воды. К матрице, активированной периодатом натрия, добавляли однократный объем 2М раствора 1,6-диаминогексана и инкубировали 2 часа на качалке при 25°С. Затем добавляли 2-кратный объем свежеприготовленного 0,5% (по весу) раствора натрия боргидрида натрия и инкубировали 30 минут при перемешивании. Обработку боргидридом повторяли дважды. Далее промывали гель 5-кратным объемом 1 М раствора NaCl и 20-кратным объемом дистиллированной воды. Затем к 10 мл 50% суспензии аминированной матрицы в буферной смеси 30 мМ NaHCO3-NaOH, рН=10,0 добавляли 0,56 мл 25% раствора глутарового альдегида и перемешивали в течение 30 мин на качалке при 25°С. Далее гель промывали 50 мл буферного раствора 30 мМ NaHCO3-NaOH, рН=10,0 и смешивали с 10 мл раствора лизоцима в том же буферном растворе (концентрация лизоцима 7,5 мг/мл). Смесь инкубировали 1 час на качалке при 25°С. Полученный сорбент обрабатывали 10 мл 0,5% (по весу) водного раствора боргидрида натрия дважды. Время каждой инкубации с раствором боргидрида натрия составляло 20 мин. После блокировки сорбент промывали 200 мл дистиллированной воды. Выход на стадии иммобилизации лизоцима для всех образцов составил не менее 98%. В качестве матрицы сорбента использовали промышленно выпускаемые макропористые агарозные матрицы марок Sepharose (Сефароза) (производитель GE Healthcare, США) и WorkBeads (WB) 200 Sec (производитель Bio-Works, Швеция) (прим.: в настоящий момент максимальный опыт использования в клинической медицинской практике накоплен для сорбентов на основе агарозных матриц).For amination of the agarose matrix, it was washed with 10 volumes of distilled water on a glass filter attached to a water-jet pump using a Bunsen flask. A double amount of a 2% aqueous solution of sodium periodate was added to the gel sample and incubated for 2 hours on a rocking chair at 20 ° C. After incubation, the matrix was washed with a 20-fold volume of distilled water. A single volume of 2M solution of 1,6-diaminohexane was added to the sodium periodate-activated matrix and incubated for 2 hours on a rocking chair at 25 ° C. A 2-fold volume of freshly prepared 0.5% (by weight) sodium borohydride sodium solution was then added and incubated for 30 minutes with stirring. The treatment with borohydride was repeated twice. Then the gel was washed with a 5-fold volume of 1 M NaCl solution and a 20-fold volume of distilled water. Then to 10 ml of a 50% suspension of the aminated matrix in a buffer mixture of 30 mM NaHCO 3 -NaOH, pH = 10.0, 0.56 ml of a 25% solution of glutaraldehyde was added and stirred for 30 minutes on a rocking chair at 25 ° C. Next, the gel was washed with 50 ml of a buffer solution of 30 mM NaHCO 3 -NaOH, pH = 10.0 and mixed with 10 ml of a solution of lysozyme in the same buffer solution (lysozyme concentration 7.5 mg / ml). The mixture was incubated for 1 hour on a rocking chair at 25 ° C. The resulting sorbent was treated with 10 ml of a 0.5% (by weight) aqueous solution of sodium borohydride twice. The time of each incubation with sodium borohydride solution was 20 minutes. After blocking, the sorbent was washed with 200 ml of distilled water. The output at the stage of immobilization of lysozyme for all samples was at least 98%. As the sorbent matrix, industrially manufactured macroporous agarose matrices of the Sepharose (Sepharose) brands (manufactured by GE Healthcare, USA) and WorkBeads (WB) 200 Sec (manufactured by Bio-Works, Sweden) were used (note: at the moment, the maximum experience in clinical medicine) practice accumulated for sorbents based on agarose matrices).
Для доказательства, что лиганд иммобилизованного лизоцима не отваливается от матрицы (и потом не утекает из сорбента) получали смывы с гелей препаратов иммобилизованного лизоцима. В колонку высотой 5 см и сечением 1 см2 помещали 2 мл 50% суспензии сорбента. Далее исследовали связывание иммобилизованным лизоцимом бактериальных эндотоксинов (липополисахаридов) при добавлении полученного на выходе из колонки смыва. Затем собирали вытекший из колонки раствор и дополнительно промывали колонку буферной смесью. Собирали смыв с колонку до достижения суммарного объема жидкости 3 мл. В случае наличия утечки лиганда, смывы будут обладать бактериолитической активностью. Бактериолитическая активность регистрируется уже при концентрации лизоцима 0,05 мкг в мл и более. Так как в смывах активности нами не обнаружено, то мы можем гарантировать, что концентрация лизоцима в смывах менее 0,05 мкг в мл. Весь смыв может содержать не более 3×0,05 мкг = 0,15 мкг. Объем сорбента в этом испытании был 1 мл, иммобилизованного лизоцима было 15 мг (15000 мкг) на мл сорбента. Таким образом в смыве не может быть лизоцима в количестве более 0,15/15000=0,00001 (одной стотысячной части) от иммобилизованного количества (или 0,001%).To prove that the ligand of immobilized lysozyme does not fall off from the matrix (and then does not flow away from the sorbent), washings from the gels of preparations of immobilized lysozyme were obtained from the gels. In a column with a height of 5 cm and a cross section of 1 cm 2 were placed 2 ml of a 50% sorbent suspension. Next, the binding of bacterial endotoxins (lipopolysaccharides) by immobilized lysozyme was investigated by adding the washout obtained at the outlet of the column. Then the solution spilled from the column was collected and the column was additionally washed with a buffer mixture. Collected wash from the column to achieve a total volume of liquid 3 ml. In the event of a leak of ligand, washes will have bacteriolytic activity. Bacteriolytic activity is recorded already at a lysozyme concentration of 0.05 μg per ml or more. Since no activity was detected in the washings, we can guarantee that the concentration of lysozyme in the washings is less than 0.05 µg per ml. The entire washout can contain no more than 3 × 0.05 µg = 0.15 µg. The sorbent volume in this test was 1 ml, the immobilized lysozyme was 15 mg (15000 μg) per ml sorbent. Thus, lysozyme cannot be in the washout in an amount greater than 0.15 / 15000 = 0.00001 (one hundred thousandth part) of the immobilized amount (or 0.001%).
Также были получены экспериментальные результаты проверки гемосовместимости (с кровью человека) синтезированного сорбента с иммобилизованным лизоцимом. По методике проверки кровь доноров брали в пробирки 50 мл с предварительно добавленным до конечной концентрации 2,5 Ед/мл гепарином. Колонку делали из носика 10 мл и фильтра 90 (133) мкм. Вносили 200 мкл сорбента, промывали 2 мл физиологического раствора, снизу надевали силиконовый шланг. Предобработку сорбента гепарином проводили после промывки физиологическим раствором из расчета 100 Ед гепарина на 1 мл сорбента, инкубация сорбента с 2-кратным объемом физ. раствора с гепарином, RT, перемешивание, 10 мин. Хроматографию сорбента с 4 мл крови проводили при комнатной температуре, самотеком, время контакта от 20 до 30 минут. Кровь после хроматографии собирали в пробирку 15 мл. В качестве отрицательного контроля использовалась колонка без сорбента. В кровь после колонки добавляли ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ, аликвотили по 1 мл и измеряли клетки в геманализаторе Elite3 Erba Mannheim (2-3 параллели). Сравнительные результаты представлены в таблицах 1-8 по эритроцитам, тромбоцитам, лимфоцитам, гемоглобину и гематокриту.Experimental results of testing hemocompatibility (with human blood) of a synthesized sorbent with immobilized lysozyme were also obtained. According to the test procedure, donor blood was taken in 50 ml tubes with heparin previously added to a final concentration of 2.5 U / ml. The column was made from a spout of 10 ml and filter 90 (133) microns. 200 μl of sorbent was applied, washed with 2 ml of saline, and a silicone hose was put on the bottom. Pretreatment of the sorbent with heparin was carried out after washing with a physiological solution at the rate of 100 U of heparin per 1 ml of sorbent, the incubation of the sorbent with a 2-fold volume of physical. solution with heparin, RT, stirring, 10 min. Chromatography of the sorbent with 4 ml of blood was performed at room temperature, by gravity, the contact time from 20 to 30 minutes. Blood chromatography was collected in a 15 ml tube. A column without sorbent was used as a negative control. EDTA was added to the blood after the column to a final concentration of 10 mM, 1 ml aliquots or 1 and cells were measured in an Elite3 Erba Mannheim hemanalyzer (2-3 parallels). Comparative results are presented in tables 1-8 for erythrocytes, platelets, lymphocytes, hemoglobin and hematocrit.
Общим выводом анализа результатов в таблицах является то, что синтезированный по предлагаемому способу сорбент с иммобилизованным лизоцимом совместим с цельной кровью человека (гемосовместим).The general conclusion of the analysis of the results in the tables is that the sorbent synthesized by the proposed method with immobilized lysozyme is compatible with human whole blood (hemocompatible).
Результаты проверки гемосовместимости полученного сорбента с ковалентно иммобилизованным лизоцимомThe results of testing the hemocompatibility of the obtained sorbent with covalently immobilized lysozyme
1. Эритроциты1. Red blood cells
2. Тромбоциты.2. Platelets.
3. Лимфоциты3. Lymphocytes
4. Гемоглобин, гематокрит.4. Hemoglobin, hematocrit.
Примеры проверки осуществления способа - с энтеробактериальными эндотоксинами и псевдомонадными эндотоксинами.Examples of verification of the implementation of the method with enterobacterial endotoxins and pseudomonadal endotoxins.
В таблице 9 представлены данные по связыванию иммобилизованным лизоцимом бактериальных токсинов (липополисахаридов) микроорганизма Escherichia coli (кишечная палочка) семейства Enterobacteriaceae и микроорганизма Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) семейства Pseudomonadaceae. Концентрацию эндотоксина определяли по его активности при помощи набора для определения активности эндотоксина "Hycult". В качестве стандарта энтеробактериального эндотоксина использовали препарат Escherichia coli 055-В5 ("Endosafe", США), и стандарт псевдомонадного эндотоксина Pseudomonas_aeruginosa «Пирогенал» 100 мкг/мл ("Медгамал", Россия).Table 9 presents the data on the immobilized lysozyme binding of bacterial toxins (lipopolysaccharides) of Escherichia coli microorganism (Escherichia coli) of the Enterobacteriaceae family and Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas bacillus) of the Pseudomonadaceae family. The concentration of endotoxin was determined by its activity using the kit for determining the activity of endotoxin "Hycult". As the standard for enterobacterial endotoxin, Escherichia coli 055-B5 (Endosafe, United States) was used, and Pseudomonas_aeruginosa Pyrogenal, a standard of pseudomonad endotoxin, 100 μg / ml (Medgamal, Russia) was used.
Прим.: 1 нанограмм (нг) на мл геля = 5 ЕЭ (единиц эндотоксина)Note: 1 nanogram (ng) per ml of gel = 5 UE (endotoxin units)
Из данных таблицы 9 видно, что вышеописанный иммобилизованный лизоцим способен достаточно эффективно связывать (удалять) эндотоксины кишечной и синегнойной палочек. Например, при тяжелом сепсисе у пациента может быть порядка 100 или более ЕЭ на мл плазмы крови. Соответственно, например, колонка с сорбентом объемом 250 мл может удалять до 81250 ЕЭ энтеробактериального эндотоксина или 237500 ЕЭ псевдомонадного эндотоксина, что соответствует содержанию эндотоксинов: в 0,812 литра (для энтеробактериального эндотоксина) или 2,375 литра (для псевдомонадного эндотоксина) такого пациента, у которого исходно 100 ЕЭ на мл плазмы его крови. При 2-3 литрах плазмы объем крови пациента составляет до 4-6 литров.From the data of table 9 it can be seen that the immobilized lysozyme described above is capable of effectively binding (removing) endotoxins of intestinal and pseudomonas aeruginosa. For example, in severe sepsis, a patient may have about 100 EE or more per ml of blood plasma. Accordingly, for example, a 250 ml column with a sorbent can remove up to 81250 EE of enterobacterial endotoxin or 237500 EE of pseudomonad endotoxin, which corresponds to the content of endotoxins: 0.812 liters (for enterobacterial endotoxin) or 2.375 liters (for pseudomonadal endotoxin) of such a patient, for a patient with 2.375 liters (2.375 liters) of this patient or 2.375 liters of this patient) 100 E per ml of plasma of his blood. With 2-3 liters of plasma, the patient's blood volume is up to 4-6 liters.
Таким образом, иммобилизованный лизоцим в сорбенте способен существенно снижать уровень эндотоксинов при его применении в сорбционных колонках.Thus, immobilized lysozyme in the sorbent can significantly reduce the level of endotoxins when it is used in sorption columns.
Представленные экспериментальные данные подтверждают практическое решение задач изобретения. Результаты экспериментов показали достаточно высокую эффективность и доказали возможность применения вышеописанного иммобилизованного лизоцима в качестве лиганда в матрице сорбента для удаления эндотоксинов из биологических жидкостей с отсутствием риска утечки лизоцима в обрабатываемую (фильтруемую) биологическую жидкость и при этом подтверждена гемосовместимость сорбента.The presented experimental data confirm the practical solution of the problems of the invention. The results of the experiments showed a fairly high efficiency and proved the possibility of using the above-described immobilized lysozyme as a ligand in the sorbent matrix to remove endotoxins from biological fluids with no risk of lysozyme leaking into the treated (filtered) biological fluid, and the hemocompatibility of the sorbent was confirmed.
Предлагаемый способ разработан в рамках выполнения работы по Соглашению №14.574.21.0181 между Министерством образования и науки Российской Федерации (Госзаказчик) и МГТУ им. Н.Э. Баумана.The proposed method was developed in the framework of the work under the Agreement No. 14.574.21.0181 between the Ministry of Education and Science of the Russian Federation (Government Customer) and MGTU. N.E. Bauman.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018121114A RU2684639C1 (en) | 2018-06-07 | 2018-06-07 | Method of removing endotoxins from biological fluids using covalently immobilized lysozyme as ligand |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018121114A RU2684639C1 (en) | 2018-06-07 | 2018-06-07 | Method of removing endotoxins from biological fluids using covalently immobilized lysozyme as ligand |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2684639C1 true RU2684639C1 (en) | 2019-04-11 |
Family
ID=66168146
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018121114A RU2684639C1 (en) | 2018-06-07 | 2018-06-07 | Method of removing endotoxins from biological fluids using covalently immobilized lysozyme as ligand |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2684639C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1622398A1 (en) * | 1988-07-21 | 1991-01-23 | Институт Органического Синтеза Ан Латвсср | Method of extracting recombinant interleukine-2 from bacterial cells |
| CN106589202A (en) * | 2016-12-05 | 2017-04-26 | 黄晖 | Lysozyme immobilized carrier and preparation method thereof |
-
2018
- 2018-06-07 RU RU2018121114A patent/RU2684639C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1622398A1 (en) * | 1988-07-21 | 1991-01-23 | Институт Органического Синтеза Ан Латвсср | Method of extracting recombinant interleukine-2 from bacterial cells |
| CN106589202A (en) * | 2016-12-05 | 2017-04-26 | 黄晖 | Lysozyme immobilized carrier and preparation method thereof |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Dekina S.S et al."MUCOADHESIVE GEL WITH IMMOBILIZED LYSOZYME: PREPARATION AND PROPERTIES", Biotechnologia Acta, 2015, Vol.8, No. 3, p.104-109. * |
| Левашов П.А. и др. "СИНТЕЗ АФФИННЫХ СОРБЕНТОВ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ СИНТЕТИЧЕСКИМИ ЛИГАНДАМИ ДЛЯ ПРОЦЕДУР ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО АФЕРЕЗА", Биомедицинская химия, т.56(6), 2010, 739-746. * |
| Левашов П.А. и др. "СИНТЕЗ АФФИННЫХ СОРБЕНТОВ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ СИНТЕТИЧЕСКИМИ ЛИГАНДАМИ ДЛЯ ПРОЦЕДУР ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО АФЕРЕЗА", Биомедицинская химия, т.56(6), 2010, 739-746. Dekina S.S et al."MUCOADHESIVE GEL WITH IMMOBILIZED LYSOZYME: PREPARATION AND PROPERTIES", Biotechnologia Acta, 2015, Vol.8, No. 3, p.104-109. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0110409B1 (en) | Adsorbent and process for preparing the same | |
| JP5656871B2 (en) | Endotoxin sorbent | |
| CA2481711C (en) | Method and device for selective separation of a compound from a body fluid | |
| JP5858299B2 (en) | A new adsorbent for endotoxin. | |
| US20050249724A1 (en) | Extracorporeal stablised expanded bed adsorption method for the treatment of sepsis | |
| JP2004516896A (en) | Extracorporeal capture of specific biopolymers from extracellular body fluids | |
| JPH0434451B2 (en) | ||
| US6090292A (en) | Device for purifying solutions containing proteins and use of the device | |
| JPH03238004A (en) | Separation method and separation agent | |
| CN100493695C (en) | Endotoxin adsorption material for curing endotoxemia | |
| RU2684639C1 (en) | Method of removing endotoxins from biological fluids using covalently immobilized lysozyme as ligand | |
| JPH01171638A (en) | Adsorbent for serum amyloid a protein | |
| RU2694883C1 (en) | Method of lysocyme covalent immobilization for subsequent application of immobilized lysozyme to reduce bacterial population of biological fluids | |
| JPH0667472B2 (en) | Adsorbent for serum amyloid P protein | |
| JPH0622633B2 (en) | Adsorbent and removal device using the same | |
| JPH0611333B2 (en) | Immune complex adsorbent and immune complex removing apparatus using the same | |
| JPS59169532A (en) | Adsorbing material of c-reactive protein | |
| AU2008201015B2 (en) | Improved separation | |
| US6803183B2 (en) | Method for removing pyrogens from plasma and blood for treatment of septic shock | |
| Falkenhagen et al. | Possibilities of selective and unselective adsorbent development in blood purification | |
| Beena et al. | Chitosan: A novel matrix for hemoperfusion | |
| RU2700605C1 (en) | Sorbent for combined removal from human plasma of atherogenic lipoproteids and c-reactive protein | |
| JP2013010701A (en) | Endotoxin adsorbent,column for whole blood perfusion type extracorporeal circulation using the same, and chromatography filler for purifying pharmaceutical drug | |
| JP5250288B2 (en) | Method for operating body fluid purification system | |
| JPH01158970A (en) | Immunoglobulin adsorbing material for direct blood perfusion and adsorbing apparatus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20200907 |