JP2013010701A - Endotoxin adsorbent,column for whole blood perfusion type extracorporeal circulation using the same, and chromatography filler for purifying pharmaceutical drug - Google Patents
Endotoxin adsorbent,column for whole blood perfusion type extracorporeal circulation using the same, and chromatography filler for purifying pharmaceutical drug Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013010701A JP2013010701A JP2011143079A JP2011143079A JP2013010701A JP 2013010701 A JP2013010701 A JP 2013010701A JP 2011143079 A JP2011143079 A JP 2011143079A JP 2011143079 A JP2011143079 A JP 2011143079A JP 2013010701 A JP2013010701 A JP 2013010701A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- porous cellulose
- cellulose particles
- polymyxin
- endotoxin
- endotoxin adsorbent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
Abstract
Description
本発明は、製薬メーカー等での医薬品の精製工程及び医療現場における輸液又は透析液などからのエンドトキシンの除去、あるいは体外循環治療における敗血症などのエンドトキシンによって生じる様々な疾患の治療に好適に利用できるエンドトキシン吸着体に関する。また本発明は、全血灌流型体外循環用カラム及び医薬品精製用クロマトグラフィー充填剤に関する。 The present invention is an endotoxin that can be suitably used for the purification of pharmaceuticals at pharmaceutical manufacturers and the like, removal of endotoxins from infusion fluids or dialysis fluids in the medical field, or treatment of various diseases caused by endotoxins such as sepsis in extracorporeal circulation therapy. It relates to an adsorbent. The present invention also relates to a whole blood perfusion type extracorporeal circulation column and a chromatography packing material for pharmaceutical purification.
医薬品や医療材料の製造工程中に生息する細菌またはその死菌由来の細菌性毒素が医薬品に混入すると、患者に対して発熱等を引き起こす可能性がある。重症の場合、患者を死に至らしめることもある。特に、グラム陰性細菌の細胞壁由来のリポ多糖はエンドトキシンとして知られ、細菌性毒素を代表する物質である。エンドトキシンは極微量であっても血中に入ると発熱のほか、致死性ショック、血圧低下、血管内凝固及び白血球の活性化などの多くの生物学的作用を引き起こす。敗血症は、患者が細菌に感染して、その症状が全身に及んだ状態をいい、生菌そのものが血液中に無くてもエンドトキシンによって引き起こされる。敗血症ショックが長引くと臓器にもダメージが及び、機能不全などの重篤な症状をもたらすことが知られている。このように、エンドトキシンを除去することは工業的にも医学的にも重要である。 When bacteria that live in the manufacturing process of pharmaceuticals or medical materials or bacterial toxins derived from dead bacteria are mixed in the pharmaceuticals, there is a possibility of causing fever and the like to the patient. In severe cases, patients can be fatal. In particular, lipopolysaccharide derived from the cell wall of gram-negative bacteria is known as endotoxin and is a substance that represents bacterial toxins. Endotoxins, even in very small amounts, cause many biological effects such as fever, lethal shock, blood pressure reduction, intravascular coagulation, and leukocyte activation when entering the blood. Sepsis refers to a condition in which a patient is infected with bacteria and the symptoms are spread throughout the body, and is caused by endotoxin even if the live bacteria themselves are not in the blood. Prolonged septic shock is known to damage organs and cause serious symptoms such as dysfunction. Thus, it is industrially and medically important to remove endotoxin.
エンドトキシンの除去方法としては、活性炭やイオン交換体による吸着処理；膜やフィルターなどを用いたろ過処理；高温・高圧または酸・アルカリを用いた分解処理；などが知られている。しかし、これらは、いずれの方法においても、大掛かりな装置を必要とし、またタンパク質などの高次構造をとるような物質にとって過酷な条件を強いるために実用的でないなど、工業的に用いるには課題が多い。 Known methods for removing endotoxins include adsorption treatment with activated carbon or ion exchangers; filtration treatment using a membrane or filter; decomposition treatment using high temperature / high pressure or acid / alkali. However, these methods require a large-scale apparatus, and are not practical because they impose harsh conditions for substances having higher-order structures such as proteins. There are many.
一方、敗血症などの疾患の治療として、エンドトキシンを含む血液からエンドトキシンを除去するための血液浄化器材の開発も鋭意行われている。
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、７１１（１９９５）８１−９２（非特許文献１）やＪ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ、７８１（２００２）４１９−４３２（非特許文献２）などの総説によれば、エンドトキシンを吸着する物質として、４級アンモニウム基及びジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基などのイオン交換基；ポリエチレンイミンなどのカチオン性高分子；ポリリジン及びポリミキシンＢなどの低分子ペプチドなどが挙げられる。さらには、エンドトキシンを吸着する物質として、特表２００３−５１１３５４号公報（特許文献１）に示されているオリゴペプチドなどが挙げられる。これらはいずれも正電荷をもつことを特徴とする。これらの中でも、ポリミキシンＢは長きにわたり医療現場において使用された実績がある。ポリミキシンはバシルス属細菌の一種であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａが産生するポリペプチド抗生物質である。ポリミキシンには、ポリミキシンＡからＥなどの成分があり、エンドトキシンに対して親和性を有することが知られている。
On the other hand, as a treatment for diseases such as sepsis, a blood purifying apparatus for removing endotoxin from blood containing endotoxin has been intensively developed.
J. et al. Chromatography A, 711 (1995) 81-92 (Non-Patent Document 1) and J. Org. According to reviews such as Chromatography B, 781 (2002) 419-432 (Non-patent Document 2), ion-exchange groups such as quaternary ammonium groups and diethylaminoethyl (DEAE) groups; And low molecular weight peptides such as polylysine and polymyxin B. Furthermore, examples of the substance that adsorbs endotoxin include oligopeptides disclosed in JP-T-2003-511354 (Patent Document 1). These are all characterized by having a positive charge. Among these, polymyxin B has a long track record of use in the medical field. Polymyxin is a polypeptide antibiotic produced by Bacillus polymyxa, a kind of bacteria belonging to the genus Bacillus. Polymyxin has components such as polymyxin A to E, and is known to have affinity for endotoxin.
ポリミキシンを用いた医療用基材の例としては、ポリミキシンＢを共有結合によりポリスチレン誘導体繊維に固定化してなる繊維が市販されており、医療用器材として医療現場で使われている。これらは、特開昭６０−５１６６号公報（特許文献２）、特開昭６０−２０９５２５号公報（特許文献３）、特開昭６１−１３５６７４号公報（特許文献４）、特開昭６２−１９１７８号公報（特許文献５）などに開示された技術を取り入れて開発されている。また、特開平１０−３３９６０号公報（特許文献６）には、ポリミキシンＢをポリスルホン膜に結合させたエンドトキシンの除去膜が開示されている。繊維又は膜を担体とし、ポリミキシンをリガンドとして用いたこれらのエンドトキシン吸着体は、その成形性で難があったり、通液速度を大きくするとエンドトキシンが素通りしやすくなったりするなどの問題がある。
また、前掲の特開昭６１−１３５６７４号公報（特許文献４）では、ポリミキシンＢを繊維基材に固定化するために、クロルアセトアミドメチル基を繊維基材に導入し、この官能基を介してポリミキシンＢを繊維基材に結合させている。しかし、該官能基はアミド結合を有するために、化学構造上、酸性条件又はアルカリ条件で加水分解を生じる。このことにより固定化したポリミキシンＢが繊維基材から脱離する可能性も否定できない。
As an example of a medical base material using polymyxin, a fiber obtained by immobilizing polymyxin B to a polystyrene derivative fiber by covalent bonding is commercially available, and is used as a medical device in the medical field. These are disclosed in JP-A-60-5166 (Patent Document 2), JP-A-60-209525 (Patent Document 3), JP-A-61-135674 (Patent Document 4), JP-A-62-2. The technology disclosed in Japanese Patent No. 19178 (Patent Document 5) has been developed. Japanese Patent Laid-Open No. 10-33960 (Patent Document 6) discloses an endotoxin removal membrane in which polymyxin B is bound to a polysulfone membrane. These endotoxin adsorbents using fiber or membrane as a carrier and polymyxin as a ligand have problems such as difficulty in moldability, and it becomes easy for endotoxin to pass through when the liquid flow rate is increased.
Moreover, in the above-mentioned Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-135684 (Patent Document 4), in order to immobilize polymyxin B on a fiber base material, a chloroacetamidomethyl group is introduced into the fiber base material, Polymyxin B is bound to the fiber substrate. However, since the functional group has an amide bond, hydrolysis occurs under acidic conditions or alkaline conditions in terms of chemical structure. Therefore, the possibility that the immobilized polymyxin B is detached from the fiber substrate cannot be denied.
血液浄化器材としては、前述した繊維タイプを担体としたもの以外に、多孔質粒子を担体としたものも医療現場において実績がある。例えば、親水性多孔質セルロース粒子にデキストラン硫酸を固定化した器材は、ＬＤＬ（低密度リポタンパク）吸着剤として家族性高脂血症への適応に実績がある。また、親水性多孔質セルロース粒子にヘキサデシル基を固定化した器材は、ベータ２ミクログロブリン及び各種サイトカインの吸着剤として透析アミロイド症治療に実績がある。このように、多孔質セルロース粒子を材料とする担体は、医療現場において実績に裏付けられた信頼がある。しかし、多孔質セルロース粒子にポリミキシンを結合させた粒子に関しては、報告例は少ない。 As blood purification equipment, in addition to those using the above-described fiber type as a carrier, those using porous particles as a carrier have a track record in the medical field. For example, a device in which dextran sulfate is immobilized on hydrophilic porous cellulose particles has a track record of adaptation to familial hyperlipidemia as an LDL (low density lipoprotein) adsorbent. Moreover, the device which fixed the hexadecyl group to the hydrophilic porous cellulose particle has a track record in the treatment of dialysis amyloidosis as an adsorbent for beta-2 microglobulin and various cytokines. Thus, the carrier made of porous cellulose particles as a material has the reliability supported by the results in the medical field. However, there are few reports on particles obtained by binding polymyxin to porous cellulose particles.
Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏｒｇａｎｓ１７（９）：７７５−７８１（非特許文献３）では、多孔質セルロース粒子にポリミキシンＢを固定化したエンドトキシン吸着体が記載されている。同文献には、ポリミキシンＢの具体的な固定化方法は開示されていない。しかし、一般的に、セルロース粒子に官能基を直接結合させようとする場合、アルカリ条件で反応させることが多い。アルカリ条件でセルロース粒子に官能基を結合させる場合、セルロースの結晶構造の水素結合がアルカリによって壊れるため、セルロース担体の機械的強度が弱くなる傾向がある。機械的強度が弱いセルロース担体をカラムに充填すると、圧縮しやすくなり目詰まりを起こし、その結果、一定流速下での圧力が高くなり、使い勝手が悪くなる。 Artificial Organs 17 (9): 775-781 (Non-patent Document 3) describes an endotoxin adsorbent in which polymyxin B is immobilized on porous cellulose particles. This document does not disclose a specific immobilization method for polymyxin B. However, in general, when a functional group is directly bonded to cellulose particles, the reaction is often performed under alkaline conditions. When a functional group is bonded to cellulose particles under alkaline conditions, the hydrogen bond in the crystal structure of cellulose is broken by alkali, so that the mechanical strength of the cellulose carrier tends to be weakened. When a column is filled with a cellulose carrier having a low mechanical strength, it becomes easy to compress and clogs. As a result, the pressure under a constant flow rate increases, and the usability deteriorates.
特開昭５８−１３５１９号公報（特許文献７）及び特開２００２−２６３４８６号公報（特許文献８）では、ポリエチレンオキシドなどの直鎖標準物質を指標とした排除限界分子量が６０００以下の多孔質セルロース粒子（セルロファイン（登録商標）ＧＣ−７００）に、エポキシド基を介してポリミキシンＥを結合させた例が報告されている。しかし、このようなセルロース粒子ではポアサイズが小さいため、ポリミキシンの固定化量を上げることは難しい。また、特開昭５８−１３５１９号公報（特許文献７）に記載された方法では、セルロース粒子にブタンジオールグリシジルエーテルを反応させて多孔質セルロース粒子にエポキシド基を付加し、このエポキシド基を介して、セルロース粒子にポリミキシンＥを固定化している。しかし、この方法では、セルロース粒子にエポキシド基を付加するために８時間を要し、このエポキシド基を介してセルロース粒子にポリミキシンを固定化するためにさらに１６時間を要するため、工業的に有利な方法とは言い難い。 In JP-A-58-13519 (Patent Document 7) and JP-A-2002-263486 (Patent Document 8), porous cellulose having an exclusion limit molecular weight of 6000 or less using a linear standard substance such as polyethylene oxide as an index. An example in which polymyxin E is bound to particles (Cellulofine (registered trademark) GC-700) via an epoxide group has been reported. However, since the pore size of such cellulose particles is small, it is difficult to increase the amount of polymyxin immobilized. Further, in the method described in JP-A-58-13519 (Patent Document 7), butanediol glycidyl ether is reacted with cellulose particles to add an epoxide group to porous cellulose particles, and via this epoxide group, Polymyxin E is immobilized on cellulose particles. However, this method requires 8 hours to add an epoxide group to cellulose particles, and requires an additional 16 hours to immobilize polymyxin on cellulose particles via this epoxide group, which is industrially advantageous. It's hard to say how.
特開平１−１５６９１０号公報（特許文献９）及びＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，６１、２７５−２８１（１９８３）（非特許文献４）には、アガロース由来のセファロースを担体として、シアノブロミドを介してポリミキシンＢを結合させた多孔質粒子に関する記載がある。しかし、アガロース由来の担体では強度が不足するという難点がある。また、シアノブロミド活性法でポリミキシンＢを固定化する方法では、アルカリ条件に対して結合が不安定であるとされている。このため、固定化されているポリミキシンＢの漏れが懸念される。
特表２００５−５３２１３０号公報（特許文献１０）では、ステンレス鋼粒子のコアを有するエピクロロヒドリン架橋アガロースを担体とし、ジビニルスルホンを介してポリミキシンＢを結合させた粒子に関する報告がある。この粒子はコアがステンレス鋼粒子であるため強度はあるものの、広い吸着面積はない。また、ジビニルスルホンを介しての結合はアルカリに弱いという難点がある。
特開平３−２５４７５６号公報（特許文献１１）では、メタクリレート系共重合体由来の７０〜１５０μｍの粒径をもつ粒子を担体とし、リガンドとなるポリミキシンＢを、スペーサーを介して結合させてなる粒子に関する記載がある。同公報では、非特異的な吸着を回避するためにスペーサーが選択されているが、製法が複雑な上に、ＬＤＬ（低密度リポタンパク）の吸着に関してのみ着目されており、エンドトキシンの吸着に対する更なる改善は行われていない。
JP-A-1-156910 (Patent Document 9) and J. Pat. Immunological Methods, 61, 275-281 (1983) (Non-Patent Document 4) describes a porous particle in which polymyxin B is bound via cyanobromide using agarose-derived sepharose as a carrier. However, a carrier derived from agarose has a drawback that the strength is insufficient. Further, in the method of immobilizing polymyxin B by the cyanobromide activity method, the binding is considered to be unstable with respect to alkaline conditions. For this reason, there is concern about leakage of immobilized polymyxin B.
In Japanese translations of PCT publication No. 2005-532130 (Patent Document 10), there is a report on particles in which polymyxin B is bound via divinyl sulfone using epichlorohydrin crosslinked agarose having a core of stainless steel particles as a carrier. Although these particles have strength because the core is made of stainless steel particles, they do not have a wide adsorption area. Further, the bond via divinyl sulfone has a drawback that it is weak against alkali.
In Japanese Patent Laid-Open No. 3-254756 (Patent Document 11), particles having a particle size of 70 to 150 μm derived from a methacrylate copolymer and a polymyxin B serving as a ligand bonded via a spacer are used. There is a description about. In this publication, spacers are selected in order to avoid non-specific adsorption, but the manufacturing method is complicated, and attention is paid only to the adsorption of LDL (low density lipoprotein). No improvement has been made.
このような状況において、エンドトキシンを簡便に且つ効率よく除去することができるエンドトキシン吸着体の提供が求められている。特に、医療現場で実績のあるリガンドとしてのポリミキシンと、担体としての多孔質セルロース粒子との組合せをもち、化学的に安定な構造をもち医療現場及び医薬品の精製工程等で安全に使用できるエンドトキシン吸着体の提供が望まれている。このようなエンドトキシン吸着体を簡便な方法で製造することができることがさらに望ましい。 Under such circumstances, there is a demand for providing an endotoxin adsorbent that can remove endotoxin simply and efficiently. In particular, endotoxin adsorption that has a combination of polymyxin as a ligand that has been proven in the medical field and porous cellulose particles as a carrier, has a chemically stable structure, and can be used safely in the medical field and pharmaceutical purification processes. The body is desired. It is further desirable that such an endotoxin adsorbent can be produced by a simple method.
本発明者等は、上記従来技術の問題点に鑑み、医療現場及び医薬品の精製工程で安全に利用できるエンドトキシン吸着体を得るべく、種々検討した結果、多孔質セルロース粒子に、ポリミキシンを安定な結合様式で、簡便に、しかも効率よく導入できる方法を見出した。さらに本発明者らは、得られたポリミキシン結合多孔質セルロース粒子が、エンドトキシンの吸着能力が高く、医薬品及び血液中のエンドトキシンを効率よく除去することが可能であり、また、最適な粒子径を選択することによって全血灌流型の体外循環用カラムに好適に使用できることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。 In view of the above-mentioned problems of the prior art, the present inventors have made various studies in order to obtain an endotoxin adsorbent that can be safely used in the medical field and in a pharmaceutical purification process, and as a result, stable binding of polymyxin to porous cellulose particles. We have found a method that can be introduced simply and efficiently in a manner. Furthermore, the present inventors have obtained polymyxin-bonded porous cellulose particles having a high endotoxin adsorption ability, and can efficiently remove endotoxins in pharmaceuticals and blood, and select an optimal particle size. As a result, it was found that the column can be suitably used for a whole blood perfusion type extracorporeal circulation column, and the present invention has been completed based on these findings.
すなわち、本発明は、下記に示したエンドトキシン吸着体、全血灌流型体外循環用カラム、医薬品精製用クロマトグラフィー充填剤、多孔質セルロース粒子にポリミキシンを固定化する方法等に関するものである。 That is, the present invention relates to an endotoxin adsorbent, a whole blood perfusion type extracorporeal circulation column, a chromatographic packing material for pharmaceutical purification, a method for immobilizing polymyxin on porous cellulose particles, and the like shown below.
［１］架橋多孔質セルロース粒子に結合したホルミル基を介して、架橋多孔質セルロース粒子とポリミキシンとが共有結合してなるエンドトキシン吸着体。
［２］共有結合が、式−ＣＨ2−ＮＨ−で示される結合を含む、［１］記載のエンドトキシン吸着体。
［３］架橋多孔質セルロース粒子のポリエチレングリコールを用いた排除限界分子量が１０万以上５０万以下である、［１］又は［２］記載のエンドトキシン吸着体。
［４］架橋多孔質セルロース粒子の粒子径が、５０μｍ以上６００μｍ以下である、［１］〜［３］のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体。
［５］架橋多孔質セルロース粒子の粒子径が、３００μｍ以上６００μｍ以下である、［１］〜［４］のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体。
［６］ポリミキシンの結合量が、エンドトキシン吸着体の体積１ｍＬ当たり１ｍｇ以上１０ｍｇ以下である、［１］〜［５］のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体。
［７］ポリミキシンがポリミキシンＢである、［１］〜［６］のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体。
［８］架橋多孔質セルロース粒子が、エポキシド基を少なくとも一つ含む多価架橋剤によって、多孔質セルロース粒子が架橋されたものである、［１］〜［７］のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体。
［９］多価架橋剤が、エピクロロヒドリンである、［８］記載のエンドトキシン吸着体。
［１０］ホルミル基が、架橋多孔質セルロース粒子に結合した多価架橋剤由来のエポキシド基が加水分解して生成したジオール基を、過ヨウ素酸酸化によって開裂させて生成したホルミル基を含む、［１］〜［９］のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体。
［１１］［１］〜［１０］のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体を充填してなる全血灌流型体外循環用カラム。
［１２］［１］〜［１０］のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体を含む医薬品精製用クロマトグラフィー充填剤。
［１３］多孔質セルロース粒子にポリミキシンを固定化する方法であって、
多孔質セルロース粒子を、エポキシド基を少なくとも一つ含む多価架橋剤によって架橋して架橋多孔質セルロース粒子を得、
得られた架橋多孔質セルロース粒子に結合した多価架橋剤由来のエポキシド基を加水分解してジオール基を生成させ、前記ジオール基を過ヨウ素酸酸化によって開裂させてホルミル基を生成させて、架橋多孔質セルロース粒子にホルミル基が結合したホルミル化架橋多孔質セルロース粒子を得、
得られたホルミル化架橋多孔質セルロース粒子とポリミキシンとを反応させることにより、架橋多孔質セルロース粒子にポリミキシンを固定化する、方法。
[1] An endotoxin adsorbent formed by covalently bonding a crosslinked porous cellulose particle and polymyxin via a formyl group bonded to the crosslinked porous cellulose particle.
[2] The endotoxin adsorbent according to [1], wherein the covalent bond includes a bond represented by the formula —CH 2 —NH—.
[3] The endotoxin adsorbent according to [1] or [2], wherein the exclusion limit molecular weight of the crosslinked porous cellulose particles using polyethylene glycol is 100,000 or more and 500,000 or less.
[4] The endotoxin adsorbent according to any one of [1] to [3], wherein the particle diameter of the crosslinked porous cellulose particles is 50 μm or more and 600 μm or less.
[5] The endotoxin adsorbent according to any one of [1] to [4], wherein the crosslinked porous cellulose particles have a particle size of 300 μm or more and 600 μm or less.
[6] The endotoxin adsorbent according to any one of [1] to [5], wherein the amount of polymyxin bound is 1 mg or more and 10 mg or less per 1 mL of the volume of the endotoxin adsorbent.
[7] The endotoxin adsorbent according to any one of [1] to [6], wherein the polymyxin is polymyxin B.
[8] The endotoxin according to any one of [1] to [7], wherein the crosslinked porous cellulose particles are obtained by crosslinking the porous cellulose particles with a polyvalent crosslinking agent containing at least one epoxide group. Adsorbent.
[9] The endotoxin adsorbent according to [8], wherein the polyvalent crosslinking agent is epichlorohydrin.
[10] The formyl group includes a formyl group generated by cleaving a diol group generated by hydrolysis of an epoxide group derived from a polyvalent crosslinking agent bonded to crosslinked porous cellulose particles by periodate oxidation, [1] The endotoxin adsorbent according to any one of [9] to [9].
[11] A whole blood perfusion type extracorporeal circulation column packed with the endotoxin adsorbent according to any one of [1] to [10].
[12] A chromatographic packing material for purification of pharmaceuticals comprising the endotoxin adsorbent according to any one of [1] to [10].
[13] A method of immobilizing polymyxin on porous cellulose particles,
The porous cellulose particles are crosslinked with a polyvalent crosslinking agent containing at least one epoxide group to obtain crosslinked porous cellulose particles,
Hydrolysis of the epoxide group derived from the polyvalent crosslinking agent bonded to the obtained crosslinked porous cellulose particles to generate a diol group, the diol group is cleaved by periodate oxidation to form a formyl group, Obtaining a formylated crosslinked porous cellulose particle having a formyl group bonded to the porous cellulose particle;
A method of immobilizing polymyxin on crosslinked porous cellulose particles by reacting the obtained formylated crosslinked porous cellulose particles with polymyxin.
本発明によれば、リガンドとしてのポリミキシンと、担体としての多孔質セルロース粒子の組合せをもち、化学的に安定な構造を有するエンドトキシン吸着体を簡便な方法で得ることができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明のエンドトキシン吸着体を用いることにより生体内のエンドトキシンを簡便に且つ効率よく除去することができる。本発明のエンドトキシン吸着体は、架橋多孔質セルロース粒子の粒子径を所望の範囲に選択することによって、体外循環治療における敗血症などのエンドトキシンによって生じる様々な疾患の治療に好適に利用できる。
また、本発明の好ましい態様によれば、本発明のエンドトキシン吸着体を用いることにより様々なイオン強度又はｐＨの条件下でも簡便に且つ効率よくエンドトキシンを除去することができる。本発明のエンドトキシン吸着体は、製薬メーカーでの医薬品の精製工程及び医療現場における輸液又は透析液などからのエンドトキシンの除去にも好適に利用することができる。
According to the present invention, an endotoxin adsorbent having a combination of polymyxin as a ligand and porous cellulose particles as a carrier and having a chemically stable structure can be obtained by a simple method.
According to a preferred embodiment of the present invention, endotoxin in a living body can be easily and efficiently removed by using the endotoxin adsorbent of the present invention. The endotoxin adsorbent of the present invention can be suitably used for treatment of various diseases caused by endotoxin such as sepsis in extracorporeal circulation treatment by selecting the particle size of the crosslinked porous cellulose particles within a desired range.
Further, according to a preferred embodiment of the present invention, endotoxin can be easily and efficiently removed under various ionic strength or pH conditions by using the endotoxin adsorbent of the present invention. The endotoxin adsorbent of the present invention can be suitably used for the purification process of a pharmaceutical product by a pharmaceutical manufacturer and the removal of endotoxin from an infusion solution or a dialysate at a medical site.
以下、本発明のエンドトキシン吸着体、全血灌流型体外循環用カラム、医薬品精製用クロマトグラフィー充填剤、多孔質セルロース粒子にポリミキシンを固定化する方法等について詳しく説明する。
本発明のエンドトキシン吸着体は、架橋多孔質セルロース粒子に結合したホルミル基を介して、架橋多孔質セルロース粒子とポリミキシンとが共有結合してなることを特徴とする。本発明のエンドトキシン吸着体は、架橋多孔質セルロース粒子を担体として、ポリミキシンをリガンドとして用いていること、さらに、架橋多孔質セルロースに結合したホルミル基を介して架橋多孔質セルロース粒子とポリミキシンとが共有結合しているため化学的に安定性が高いことから、医療現場及び医薬品の精製工程等において安全に使用することができる。本発明の好ましい態様においては、架橋多孔質セルロース粒子に結合した反応性の高いホルミル基とポリミキシンが有するアミノ基との反応を利用して、架橋多孔質セルロース粒子とポリミキシンとが共有結合しているため、簡便な方法で、架橋多孔質セルロース粒子にポリミキシンを強固に固定化することができる。なお、本明細書において「ホルミル基を介して」というときは、ホルミル基が反応に関与して共有結合の一部を形成することを意味している。
Hereinafter, the endotoxin adsorbent of the present invention, a whole blood perfusion type extracorporeal circulation column, a chromatography filler for pharmaceutical purification, a method for immobilizing polymyxin on porous cellulose particles, and the like will be described in detail.
The endotoxin adsorbent of the present invention is characterized in that the crosslinked porous cellulose particles and polymyxin are covalently bonded via a formyl group bonded to the crosslinked porous cellulose particles. The endotoxin adsorbent of the present invention uses cross-linked porous cellulose particles as a carrier and polymyxin as a ligand. Furthermore, the cross-linked porous cellulose particles and polymyxin are shared via a formyl group bonded to the cross-linked porous cellulose. Since they are bonded, they are chemically stable and can be used safely in the medical field and pharmaceutical purification processes. In a preferred embodiment of the present invention, the crosslinked porous cellulose particles and the polymyxin are covalently bonded by utilizing the reaction between the highly reactive formyl group bonded to the crosslinked porous cellulose particle and the amino group of the polymyxin. Therefore, polymyxin can be firmly immobilized on the crosslinked porous cellulose particles by a simple method. In this specification, “via a formyl group” means that the formyl group participates in the reaction to form a part of a covalent bond.
上記のとおり、本発明の好ましい態様によれば、架橋多孔質セルロース粒子に結合したホルミル基とポリミキシンが有するアミノ基との反応を利用することができる。ホルミル基とアミノ基との反応によって、式−ＣＨ2−ＮＨ−で示される結合が形成される。本発明のエンドトキシン吸着体においては、式−ＣＨ2−ＮＨ−で示される結合を少なくとも一部に含むことが好ましく、架橋多孔質セルロース粒子とポリミキシンとの間に形成される共有結合の全てが上記式で示される結合であることが好ましい。本発明のエンドトキシン吸着体においては、式−ＣＨ2−ＮＨ−で示される結合を用いて、架橋多孔質セルロース粒子とポリミキシンとが共有結合していることで、様々なイオン強度又はｐＨの条件下においても化学的に安定であり、ポリミキシンが有意に脱離することがなく、エンドトキシンを効率よく除去することができる。 As described above, according to a preferred embodiment of the present invention, a reaction between a formyl group bonded to crosslinked porous cellulose particles and an amino group possessed by polymyxin can be used. By the reaction between the formyl group and the amino group, a bond represented by the formula —CH 2 —NH— is formed. In the endotoxin adsorbent of the present invention, it is preferable that the bond represented by the formula —CH 2 —NH— is included at least in part, and all the covalent bonds formed between the crosslinked porous cellulose particles and polymyxin are the above. The bond represented by the formula is preferable. In the endotoxin adsorbent of the present invention, the crosslinked porous cellulose particles and polymyxin are covalently bonded using a bond represented by the formula —CH 2 —NH— under various ionic strength or pH conditions. Is also chemically stable, polymyxin is not significantly eliminated, and endotoxin can be efficiently removed.
本発明に用いる架橋多孔質セルロース粒子のポリエチレングリコールを用いた排除限界分子量は、１０万以上が好ましい。該排除限界分子量は、１２万以上がより好ましく、１５万以上がさらに好ましい。排除限界分子量の上限は特に制限されないが、５０万以上になると粒子形成が難しくなる場合があるため、通常は５０万以下が好ましく、４０万以下がより好ましく、３０万以下がさらに好ましい。多孔質セルロース粒子の排除限界分子量が上記の範囲であると、本発明のエンドトキシン吸着体のエンドトキシン吸着能が向上し、エンドトキシンを効率よく除去することができる。 The exclusion limit molecular weight using polyethylene glycol of the crosslinked porous cellulose particles used in the present invention is preferably 100,000 or more. The exclusion limit molecular weight is more preferably 120,000 or more, and further preferably 150,000 or more. The upper limit of the exclusion limit molecular weight is not particularly limited, but it may be difficult to form particles when the molecular weight is 500,000 or more, and is usually preferably 500,000 or less, more preferably 400,000 or less, and even more preferably 300,000 or less. When the exclusion limit molecular weight of the porous cellulose particles is in the above range, the endotoxin adsorbing ability of the endotoxin adsorbent of the present invention is improved, and endotoxin can be efficiently removed.
また、本発明に用いる架橋多孔質セルロース粒子の粒子径は、ホルミル基を導入してポリミキシンを結合させる前に篩で分級することで、最適な粒子径分布幅を有するように調整しておくことが好ましい。該粒子径は、１０μｍ以上６００μｍ以下が使いやすいが、５０μｍ以上６００μｍ以下が好ましく、３００μｍ以上６００μｍ以下がより好ましい。架橋多孔質セルロース粒子の粒子径が上記の範囲であると、本発明のエンドトキシン吸着体の圧力損失を回避することができる。本発明のエンドトキシン吸着体を全血灌流型の体外循環用カラムに充填して用いる場合、架橋多孔質セルロース粒子の粒子径は２００μｍ以上６００μｍ以下が好ましく、３００μｍ以上６００μｍ以下がより好ましい。 The particle size of the crosslinked porous cellulose particles used in the present invention is adjusted to have an optimum particle size distribution width by classifying with a sieve before introducing a formyl group and bonding polymyxin. Is preferred. The particle size is preferably 10 μm or more and 600 μm or less, but is preferably 50 μm or more and 600 μm or less, and more preferably 300 μm or more and 600 μm or less. When the particle diameter of the crosslinked porous cellulose particles is in the above range, the pressure loss of the endotoxin adsorbent of the present invention can be avoided. When the endotoxin adsorbent of the present invention is packed into a whole blood perfusion type extracorporeal circulation column, the particle size of the crosslinked porous cellulose particles is preferably 200 μm or more and 600 μm or less, and more preferably 300 μm or more and 600 μm or less.
架橋多孔質セルロース粒子は、多孔質セルロース粒子を所定の方法により架橋することによって得られる。架橋多孔質セルロース粒子の原料となる多孔質セルロース粒子は、例えば結晶セルロース粉末を再生することで得ることができる。具体的には結晶セルロース粉末を直接ロダンカルシウム溶液に溶解させ、該溶液をオルト−ジクロロベンゼン等の高沸点溶媒に分散させることで、水／油（Ｗ／Ｏ）タイプの水性液滴をつくり、これにメタノール等のアルコールを加えることで、結晶セルロース粉末から多孔質セルロース粒子を再生することができる。特公昭６３−６２２５２号公報に示されるように、この方法で得られるセルロース粒子は非常に多孔質で硬度が高く、真球様の形状を示すのでクロマトグラフィー用充填剤への利用に適している。チッソ株式会社から市販されているセルファイン（登録商標）の基材としても利用されている。 Cross-linked porous cellulose particles are obtained by cross-linking porous cellulose particles by a predetermined method. The porous cellulose particles used as the raw material for the crosslinked porous cellulose particles can be obtained, for example, by regenerating crystalline cellulose powder. Specifically, by dissolving crystalline cellulose powder directly in a rhodan calcium solution and dispersing the solution in a high boiling point solvent such as ortho-dichlorobenzene, water / oil (W / O) type aqueous droplets are formed, The porous cellulose particles can be regenerated from the crystalline cellulose powder by adding an alcohol such as methanol thereto. As disclosed in Japanese Patent Publication No. 63-62252, the cellulose particles obtained by this method are very porous, have high hardness, and have a true spherical shape, so that they are suitable for use as a packing material for chromatography. . It is also used as a base material for Cellufine (registered trademark) commercially available from Chisso Corporation.
多孔質セルロース粒子の架橋方法は特に制限されないが、本発明に用いる架橋多孔質セルロース粒子としてはエポキシド基を少なくとも一つ含む多価架橋剤を用いて架橋されたものが好ましく、中でもエピクロロヒドリンを用いて架橋されたものが好ましい。多孔質セルロース粒子の架橋方法としては、多孔質セルロース粒子の懸濁液に、所定量の無機塩の存在下、所定のモル比で架橋剤とアルカリとを所定時間以上かけて連続滴下又は分割添加して架橋することが好ましい。例えば、未架橋の多孔質セルロース粒子の懸濁液に、セルロースモノマーのモル数の６〜２０倍量の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩及びホウ酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の無機塩の存在下、セルロースモノマーのモル数の４〜１２倍量の架橋剤と、架橋剤のモル数の０．１〜１．５倍量のアルカリとを３時間以上かけて連続滴下又は分割滴下することが好ましい。この方法により、機械的強度が高く、耐流速性に優れた架橋多孔質セルロース粒子を得ることができる。より具体的には、特開２００９−２４２７７０号公報に開示されている方法を参照することができる。 The method for crosslinking the porous cellulose particles is not particularly limited, but the crosslinked porous cellulose particles used in the present invention are preferably those crosslinked using a polyvalent crosslinking agent containing at least one epoxide group, and epichlorohydrin is particularly preferred. What was bridge | crosslinked using is preferable. As a method for cross-linking porous cellulose particles, a cross-linking agent and an alkali are continuously dropped or dividedly added to a suspension of porous cellulose particles over a predetermined time in a predetermined molar ratio in the presence of a predetermined amount of inorganic salt. It is preferable to crosslink. For example, in the suspension of uncrosslinked porous cellulose particles, at least one selected from the group consisting of hydrochloride, sulfate, phosphate and borate in an amount 6 to 20 times the number of moles of cellulose monomer. In the presence of an inorganic salt, 4 to 12 times the number of moles of cellulose monomer and 0.1 to 1.5 times the amount of alkali of the crosslinking agent are continuously dropped or divided over 3 hours or more. It is preferable to dripping. By this method, crosslinked porous cellulose particles having high mechanical strength and excellent flow resistance can be obtained. More specifically, the method disclosed in JP2009-242770A can be referred to.
架橋多孔質セルロース粒子は、多孔性を有しているために表面積の増加を期待することができ、クロマトグラフィー用の基材又は体外循環用カラムの充填剤として利用価値が高い。架橋多孔質セルロース粒子の細孔サイズ特性を示す指標として、ゲル分配係数Ｋａｖが挙げられる。ゲル分配係数Ｋａｖは、分子量の標準物質（ポリエチレングリコール）の溶出体積及びカラム体積の関係から次式により求めることができる。
Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍＬ）、Ｖｔは空カラム体積（ｍＬ）、Ｖ０はブルーデキストラン保持容量（ｍＬ）を表す。］
Since the crosslinked porous cellulose particles have porosity, an increase in surface area can be expected, and the utility value is high as a base material for chromatography or a filler for extracorporeal circulation columns. As an index indicating the pore size characteristics of the crosslinked porous cellulose particles, there is a gel distribution coefficient Kav. The gel partition coefficient Kav can be obtained from the relationship between the elution volume of the molecular weight standard substance (polyethylene glycol) and the column volume by the following equation.
Kav = (Ve−V 0 ) / (Vt−V 0 )
[In the formula, Ve represents a sample holding capacity (mL), Vt represents an empty column volume (mL), and V 0 represents a blue dextran holding capacity (mL). ]
ゲル分配係数Ｋａｖの測定方法は、例えば、Ｌ．Ｆｉｓｃｈｅｒ著生物化学実験法２「ゲルクロマトグラフィー」第１版（東京化学同人）等に記載されている。具体的な測定方法は、実施例にて示したとおりである。本発明に用いる架橋多孔質セルロース粒子のゲル分配係数Ｋａｖは、例えば、粒子形成時の結晶セルロースの溶解濃度の制御により調整することができる。本発明において、混合水溶液中の結晶セルロースの濃度は一般的には１〜１０重量％であるが、例えば結晶セルロースとして旭化成株式会社から市販されているセオラス（登録商標）ＰＨ１０１を使用した場合、その濃度を好ましくは４〜６重量％に調整することで架橋多孔質セルロース粒子に好適なゲル分配係数Ｋａｖを得ることができる。 The method for measuring the gel partition coefficient Kav is described in, for example, L.A. Fischer Biochemistry Experimental Method 2 “Gel Chromatography” 1st Edition (Tokyo Kagaku Dojin) and the like. The specific measurement method is as shown in the examples. The gel distribution coefficient Kav of the crosslinked porous cellulose particles used in the present invention can be adjusted, for example, by controlling the dissolution concentration of crystalline cellulose during particle formation. In the present invention, the concentration of crystalline cellulose in the mixed aqueous solution is generally 1 to 10% by weight. For example, when Ceolus (registered trademark) PH101 commercially available from Asahi Kasei Corporation is used as crystalline cellulose, A gel distribution coefficient Kav suitable for crosslinked porous cellulose particles can be obtained by adjusting the concentration to preferably 4 to 6% by weight.
架橋多孔質セルロース粒子にホルミル基を付加する方法は特に制限されなく、一般に多糖類のホルミル付加に用いられる方法を使用することができる。例えば、グルタルアルデヒド等のアルデヒド基（ホルミル基）を有する試薬を用いてセルロースに導入してもよい。また、架橋多孔質セルロース粒子に結合した多価架橋剤由来のエポキシド基を加水分解してジオール基を生成させ、このジオール基を、過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤を用いて過ヨウ素酸酸化することによって開裂させることで、架橋多孔質セルロース粒子にホルミル基を導入してもよい。より簡便な方法で架橋多孔質セルロース粒子にホルミル基を導入することができるという点では、後者の方法が好ましい。この方法によれば、セルロース粒子のグルコース骨格を開裂させることがなく、架橋に使用されずに片末端が遊離している架橋剤由来のエポキシド基を加水分解し、得られたジオール基を開裂させることでホルミル基を付加しているため、多孔質セルロース粒子の機械強度を有意に損なうことがない。特に、架橋の工程と同時に反応点となるジオール基を生成させることが可能な本発明の実施例に示したような方法が、製造工程の簡便さの観点からも最も好ましい。 The method for adding a formyl group to the crosslinked porous cellulose particles is not particularly limited, and a method generally used for the formyl addition of polysaccharides can be used. For example, you may introduce | transduce into a cellulose using the reagent which has aldehyde groups (formyl group), such as glutaraldehyde. Also, the epoxide group derived from the polyvalent crosslinking agent bonded to the crosslinked porous cellulose particles is hydrolyzed to produce a diol group, and this diol group is oxidized with periodate using an oxidizing agent such as sodium periodate. The formyl group may be introduced into the crosslinked porous cellulose particles by cleaving. The latter method is preferable in that a formyl group can be introduced into the crosslinked porous cellulose particles by a simpler method. According to this method, the glucose skeleton of the cellulose particles is not cleaved, the epoxide group derived from the crosslinking agent which is not used for crosslinking and free at one end is hydrolyzed, and the resulting diol group is cleaved. Thus, since the formyl group is added, the mechanical strength of the porous cellulose particles is not significantly impaired. In particular, the method as shown in the examples of the present invention capable of generating a diol group as a reaction point simultaneously with the crosslinking step is most preferable from the viewpoint of the simplicity of the production step.
本発明においては、例えば、多孔質セルロース粒子を、エポキシド基を少なくとも一つ含む多価架橋剤によって架橋して架橋多孔質セルロース粒子を得、
得られた架橋多孔質セルロース粒子に結合した多価架橋剤由来のエポキシド基を加水分解してジオール基を生成させ、前記ジオール基を過ヨウ素酸酸化によって開裂させてホルミル基を生成させて、架橋多孔質セルロース粒子にホルミル基が結合したホルミル化架橋多孔質セルロース粒子を得、
得られたホルミル化架橋多孔質セルロース粒子とポリミキシンとを反応させることにより、簡便な方法で、架橋多孔質セルロース粒子にポリミキシンを固定化することができる。
上記の方法によれば、セルロース骨格を切断することがなく、多孔質セルロース粒子にホルミル基を付加することができる。また、架橋多孔質セルロース粒子に付加した反応性の高いホルミル基と、ポリミキシンのアミノ基とが容易に共有結合することによって、ポリミキシンが脱離することが少なく、化学的に安定な状態で架橋多孔質セルロース粒子にポリミキシンを固定化することができる。さらには、本発明の実施例に示したとおり、使用したポリミキシンの量に対し高い効率で架橋多孔質セルロース粒子にホルミル基を介してポリミキシンを結合させることができる。
In the present invention, for example, porous cellulose particles are crosslinked with a polyvalent crosslinking agent containing at least one epoxide group to obtain crosslinked porous cellulose particles,
Hydrolysis of the epoxide group derived from the polyvalent crosslinking agent bonded to the obtained crosslinked porous cellulose particles to generate a diol group, the diol group is cleaved by periodate oxidation to form a formyl group, Obtaining a formylated crosslinked porous cellulose particle having a formyl group bonded to the porous cellulose particle;
By reacting the obtained formylated crosslinked porous cellulose particles with polymyxin, the polymyxin can be immobilized on the crosslinked porous cellulose particles by a simple method.
According to the above method, a formyl group can be added to porous cellulose particles without cutting the cellulose skeleton. In addition, the highly reactive formyl group added to the crosslinked porous cellulose particles and the amino group of the polymyxin are easily covalently bonded to each other, so that the polymyxin is hardly detached and is crosslinked in a chemically stable state. Polymyxin can be immobilized on the modified cellulose particles. Furthermore, as shown in the examples of the present invention, the polymyxin can be bound to the crosslinked porous cellulose particles via the formyl group with high efficiency relative to the amount of polymyxin used.
架橋多孔質セルロース粒子の製造方法については前述したとおりである。本発明においては、得られた架橋多孔質セルロース粒子を溶媒中、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、酢酸鉛（ＩＶ）、α−ヒドロキシケトンなどの酸化剤の存在下で反応させることで、エポキシド基を加水分解してジオール基を生成させ、該ジオール基を過ヨウ素酸酸化によって開裂させてホルミル基を生成することができるが、特に中性付近で純水中に溶解できる過ヨウ素酸ナトリウムが酸化剤として好ましい。
上記反応に用いる溶媒としては、純水が好ましい。
酸化剤の使用量は、架橋多孔質セルロース粒子の乾燥重量１ｇに対して０．０３ｇ以上が好ましく、０．１０ｇ以上がより好ましく、０．１５ｇ以上がさらに好ましい。また、０．５ｇ以下が好ましく、０．３５ｇ以下がより好ましく、０．２５ｇ以下がさらに好ましい。
反応温度は４℃以上が好ましく、２０℃以上がより好ましく、２５℃以上がさらに好ましい。また、５０℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましく、３５℃以下がさらに好ましい。
また、反応時間は、通常、０．５時間から４時間が好ましく、１．５時間から２．５時間がより好ましい。
上記のようにして得られるホルミル化架橋多孔質セルロース粒子は、そのまま続いて行う固定化反応に用いてもよいが、純水等により洗浄した後で固定化反応に用いることが好ましい。
The method for producing the crosslinked porous cellulose particles is as described above. In the present invention, by reacting the obtained crosslinked porous cellulose particles in a solvent in the presence of an oxidizing agent such as sodium periodate, potassium periodate, lead (IV) acetate, α-hydroxyketone, Sodium periodate that can hydrolyze epoxide groups to form diol groups and cleave the diol groups by periodate oxidation to form formyl groups, but is particularly soluble in pure water Are preferred as oxidizing agents.
As a solvent used in the above reaction, pure water is preferable.
The amount of the oxidizing agent used is preferably 0.03 g or more, more preferably 0.10 g or more, and further preferably 0.15 g or more with respect to 1 g of the dry weight of the crosslinked porous cellulose particles. Moreover, 0.5 g or less is preferable, 0.35 g or less is more preferable, and 0.25 g or less is further more preferable.
The reaction temperature is preferably 4 ° C or higher, more preferably 20 ° C or higher, and further preferably 25 ° C or higher. Moreover, 50 degrees C or less is preferable, 40 degrees C or less is more preferable, and 35 degrees C or less is further more preferable.
The reaction time is usually preferably 0.5 hours to 4 hours, more preferably 1.5 hours to 2.5 hours.
The formylated crosslinked porous cellulose particles obtained as described above may be used in the subsequent immobilization reaction, but are preferably used in the immobilization reaction after washing with pure water or the like.
本発明においては、上記のように架橋多孔質セルロース粒子にホルミル基を付加した後、ポリミキシンを架橋多孔質セルロース粒子に存在するホルミル基を介して共有結合させることにより固定化する。ポリミキシンには、ポリミキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅなどが含まれる。これらの中でも、本発明の固定化方法においては、医療分野において実績のあるポリミキシンＢ又はその塩を用いることが好ましく、ポリミキシンＢ硫酸塩を用いることがより好ましい。 In the present invention, after formyl groups are added to the crosslinked porous cellulose particles as described above, polymyxin is immobilized by covalent bonding via formyl groups present in the crosslinked porous cellulose particles. Polymyxin includes polymyxin A, B, C, D, E and the like. Among these, in the immobilization method of the present invention, it is preferable to use polymyxin B or a salt thereof proven in the medical field, and it is more preferable to use polymyxin B sulfate.
ポリミキシンは環状の立体構造をもつポリペプチドであることから、強酸性、強アルカリ性又は変性を伴うような有機溶媒の存在下での固定化反応は望ましくない。この点、本発明においては、ポリミキシンを純水中で且つ中性付近で反応させることができるので、変性を伴わない最適な固定化反応を行うことができる。固定化反応におけるｐＨの条件は、７以上９以下が好ましく、７．５以上８．５以下がより好ましく、約８．５がさらに好ましい。反応液中のｐＨの維持は塩酸等の酸、水酸化ナトリウム等の塩基を用いて機械的に自動制御してもよいし、緩衝液等を用いて制御してもよい。ホルミル基はアミノ基と容易にシッフ塩基を形成しやすいため、本発明においては、ポリミキシンが変性しないような温和な反応温度の条件で反応させることができる。 Since polymyxin is a polypeptide having a cyclic three-dimensional structure, an immobilization reaction in the presence of an organic solvent such as strongly acidic, strongly alkaline, or denaturing is not desirable. In this regard, in the present invention, since polymyxin can be reacted in pure water and near neutrality, an optimal immobilization reaction without denaturation can be performed. The pH condition in the immobilization reaction is preferably 7 or more, 9 or less, more preferably 7.5 or more and 8.5 or less, and even more preferably about 8.5. Maintenance of the pH in the reaction solution may be automatically controlled mechanically using an acid such as hydrochloric acid or a base such as sodium hydroxide, or may be controlled using a buffer solution or the like. Since a formyl group easily forms a Schiff base with an amino group, in the present invention, the reaction can be performed under conditions of a mild reaction temperature that does not denature polymyxin.
固定化反応における反応温度は４℃以上５０℃以下が好ましく、２０℃以上４０℃以下がより好ましく、約３０℃がさらに好ましい。 The reaction temperature in the immobilization reaction is preferably 4 ° C. or more and 50 ° C. or less, more preferably 20 ° C. or more and 40 ° C. or less, and further preferably about 30 ° C.
固定化反応に必要な反応時間はポリミキシンの変性を考慮するとなるべく短い時間が好ましい。この点、本発明においては１時間から２時間で架橋多孔質セルロース粒子にポリミキシンを固定化させることが可能である。 The reaction time required for the immobilization reaction is preferably as short as possible in consideration of denaturation of polymyxin. In this regard, in the present invention, it is possible to immobilize polymyxin on the crosslinked porous cellulose particles in 1 to 2 hours.
本発明においては、ホルミル化架橋多孔質セルロース粒子に仕込むポリミキシン量を変化させることによって、ポリミキシンの結合量を制御することができる。
ポリミキシンの結合量は、目的や用途等に応じて選択すればよく、特に制限されないが、本発明のエンドトキシン吸着体の体積１ｍＬ当たり１ｍｇ以上１０ｍｇ以下が好ましい。ここで「エンドトキシン吸着体の体積」とは、カラムにエンドトキシン吸着体を充填した際のカラム体積を意味する。該ポリミキシンの結合量は、本発明のエンドトキシン吸着体の体積１ｍＬ当たり１ｍｇ以上がより好ましく、４ｍｇ以上がさらに好ましい。また、１０ｍｇ以下がより好ましく、６ｍｇ以下がさらに好ましい。例えば、ポリミキシンの結合量は、本発明のエンドトキシン吸着体の体積１ｍＬ当たり４．０ｍｇ以上５．６ｍｇ以下が好ましい。
In the present invention, the amount of polymyxin bound can be controlled by changing the amount of polymyxin charged in the formylated crosslinked porous cellulose particles.
The binding amount of polymyxin may be selected according to the purpose and application, and is not particularly limited, but is preferably 1 mg or more and 10 mg or less per 1 mL of the volume of the endotoxin adsorbent of the present invention. Here, the “volume of the endotoxin adsorbent” means the column volume when the column is filled with the endotoxin adsorbent. The binding amount of the polymyxin is more preferably 1 mg or more per 1 mL of the endotoxin adsorbent of the present invention, and more preferably 4 mg or more. Moreover, 10 mg or less is more preferable, and 6 mg or less is further more preferable. For example, the binding amount of polymyxin is preferably 4.0 mg or more and 5.6 mg or less per 1 mL of the volume of the endotoxin adsorbent of the present invention.
以上述べたように本発明においては、産業上有用なエンドトキシン吸着体を簡便な工程で、且つ、効率よく製造できる。即ち、本発明の好ましい態様によれば、セルロース粒子に強度を付与する架橋を行うのと同時に反応点であるジオール基を生成させることができ、さらには、該ジオール基より生成させたホルミル基に対し、高い効率でポリミキシンを任意に結合させることが可能である。特に、本発明において製造されたエンドトキシン吸着体は、同様な性状を有している市販のポリミキシンＢ固定化アガロース担体（商品名：アフィプレップポリミキシン、バイオ・ラッド社製）及びポリリジンを固定化した担体（商品名：ＥＴクリーンＬ、チッソ社製）に対し、製造工程が簡便であったり、リガンドの固定化率が高かったりするなどの点で利点がある。 As described above, in the present invention, an industrially useful endotoxin adsorbent can be produced efficiently in a simple process. That is, according to a preferred embodiment of the present invention, it is possible to generate a diol group that is a reaction point at the same time as performing crosslinking for imparting strength to cellulose particles, and further to formyl groups generated from the diol group. On the other hand, it is possible to arbitrarily bind polymyxin with high efficiency. In particular, the endotoxin adsorbent produced in the present invention includes a commercially available polymyxin B-immobilized agarose carrier (trade name: Affiprep polymyxin, manufactured by Bio-Rad) having the same properties and a carrier on which polylysine is immobilized. (Product name: ET Clean L, manufactured by Chisso Corporation) is advantageous in that the manufacturing process is simple and the ligand immobilization rate is high.
本発明のエンドトキシン吸着体は、エンドトキシンの除去を必要とする様々な用途に好適に用いることができる。 The endotoxin adsorbent of the present invention can be suitably used for various applications that require removal of endotoxin.
遺伝子工学的に宿主細胞内で製造された有用なタンパク質は、一般的に高濃度の塩や界面活性剤によって細胞を破壊してタンパク質を回収する。その後、回収したタンパク質をイオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーによって複数回精製することを要する。例えばイオン交換クロマトグラフィーを用いる場合はタンパク質を低濃度の塩で吸着させた後にイオン強度を高く変化させて目的のタンパク質を溶出させる。溶出されたタンパク質は高イオン強度の溶液に存在しているため、この溶液からエンドトキシンを除去するためには高イオン強度で使用可能なエンドトキシン吸着体が必要である。この点、本発明のエンドトキシン吸着体は、実施例の表３に示したとおりイオン強度が０．６μという高塩濃度の条件においても使用可能である。また実施例の表４に示したとおり、ｐＨが５から８という環境においても効率的にエンドトキシンを除去することができる。このように本発明のエンドトキシン吸着体は、タンパク質などの医薬品の精製工程における様々な環境下での使用に十分耐え得る。さらに、本発明のエンドトキシン吸着体においては、架橋多孔質セルロース粒子にポリミキシンを固定化するときにアミド結合などの化学的に不安定な構造を用いていないため、長期の使用に十分耐え得る。これらのことから、本発明のエンドトキシン吸着体は、製薬メーカーでの医薬品の精製工程及び医療現場における輸液又は透析液などからのエンドトキシンを除去するための医薬品精製用クロマトグラフィー充填剤として好適に用いることができる。本発明のエンドトキシン吸着体を他の機能を有する充填剤と併用してもよい。 Useful proteins produced in host cells by genetic engineering are generally recovered by destroying the cells with a high concentration of salt or surfactant. Thereafter, it is necessary to purify the recovered protein multiple times by various types of chromatography such as ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography and gel filtration chromatography. For example, when ion exchange chromatography is used, the protein is adsorbed with a low-concentration salt, and then the target protein is eluted by changing the ionic strength to be high. Since the eluted protein is present in a solution with high ionic strength, an endotoxin adsorbent that can be used with high ionic strength is required to remove endotoxin from this solution. In this regard, the endotoxin adsorbent of the present invention can be used even under conditions of high salt concentration where the ionic strength is 0.6 μm as shown in Table 3 of the Examples. Further, as shown in Table 4 of the Examples, endotoxin can be efficiently removed even in an environment where the pH is 5 to 8. Thus, the endotoxin adsorbent of the present invention can sufficiently withstand use in various environments in the purification process of pharmaceutical products such as proteins. Furthermore, since the endotoxin adsorbent of the present invention does not use a chemically unstable structure such as an amide bond when immobilizing polymyxin on crosslinked porous cellulose particles, it can sufficiently withstand long-term use. From these facts, the endotoxin adsorbent of the present invention is preferably used as a chromatographic packing material for pharmaceutical purification to remove the endotoxin from a pharmaceutical purification process at a pharmaceutical manufacturer and an infusion solution or a dialysate at a medical site. Can do. The endotoxin adsorbent of the present invention may be used in combination with a filler having other functions.
また、本発明のエンドトキシン吸着体は、実施例の表３に示したとおり、生理食塩水のイオン強度において効率的にエンドトキシンを除去することが可能であり、生体内の環境下においてもエンドトキシンを効率よく除去することができるため、本発明のエンドトキシン吸着体を全血灌流型体外循環用カラムに充填して用いることができる。
本発明のエンドトキシン吸着体を全血灌流型体外循環用カラムに充填して用いる場合は、架橋多孔質セルロース粒子の粒子径は、上記用途に好適な範囲、すなわち２００μｍ以上、さらには３００μｍ以上６００μｍ以下を選択して用いることが好ましい。本発明のエンドトキシン吸着体を充填してなる全血灌流型体外循環用カラムは、敗血症の治療やエンドトキシンの体内への混入に伴う多臓器不全、免疫系の活性化に伴う諸症状の治療に好適に用いることができる。
The endotoxin adsorbent of the present invention can efficiently remove endotoxin at the ionic strength of physiological saline as shown in Table 3 of the examples. Since it can be removed well, the endotoxin adsorbent of the present invention can be packed into a whole blood perfusion type extracorporeal circulation column and used.
When the endotoxin adsorbent of the present invention is packed into a whole blood perfusion type extracorporeal circulation column, the particle diameter of the crosslinked porous cellulose particles is in a range suitable for the above-mentioned use, that is, 200 μm or more, further 300 μm or more and 600 μm or less. It is preferable to select and use. The whole blood perfusion type extracorporeal circulation column packed with the endotoxin adsorbent of the present invention is suitable for treatment of sepsis, multiple organ failure associated with endotoxin contamination in the body, and various symptoms associated with activation of the immune system. Can be used.
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら制限されない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not restrict | limited at all to these.
本実施例で用いた分析方法について解説する。 The analysis method used in this example will be described.
＜分析方法１ Ｋａｖ測定＞
（１）使用機器及び試薬
カラム ： エンプティカラム１／４×４．０ｍｍ Ｉ．Ｄ×３００ｍｍ、１０Ｆ（東ソー）
リザーバー ： パッカ・３／８（東ソー）
<Analysis Method 1 Kav Measurement>
(1) Equipment and reagents used Column: Empty column 1/4 × 4.0 mm D x 300mm, 10F (Tosoh)
Reservoir: Packer 3/8 (Tosoh)
（２）カラム充填法
カラムとリザーバーを接続し、カラム下部にエンドフィッティングを接続した。Ｋａｖを測定するセルロース粒子を減圧濾過した湿ゲルの状態で１５ｇはかり取り、１００ｍＬビーカーに入れた。そこへ超純水４０ｍＬを加えて軽く攪拌した。これをセルロース粒子が超純水に分散した状態でリザーバーの壁を伝わるようにカラムにゆっくりと加えた。ビーカーに残ったセルロース粒子を少量の超純水ですすぎ、ゆっくりとカラムに加えた。その後、リザーバーの上部ぎりぎりまで超純水を加え、リザーバーの蓋をした。リザーバーの上部にアダプターを接続し、ポンプで３０分間超純水を送液しながら充填した。充填が終わったらポンプを止め、アダプターとリザーバーの蓋を外した。次に、リザーバーの中の超純水をピペットで吸いだした。リザーバーを外し、カラムからはみ出したセルロース粒子を除いて、エンドフィッティングを接続した。
(2) Column packing method A column and a reservoir were connected, and an end fitting was connected to the bottom of the column. 15 g of cellulose particles for measuring Kav was weighed out in a wet gel state filtered under reduced pressure, and placed in a 100 mL beaker. The ultrapure water 40mL was added there and it stirred lightly. This was slowly added to the column so that the cellulose particles were dispersed in the ultrapure water and transmitted along the wall of the reservoir. Cellulose particles remaining in the beaker were rinsed with a small amount of ultrapure water and slowly added to the column. Then, ultrapure water was added to the top of the reservoir, and the reservoir was covered. An adapter was connected to the upper part of the reservoir, and it was filled while pumping ultrapure water for 30 minutes. When filling was completed, the pump was stopped, and the adapter and reservoir cover were removed. Next, the ultrapure water in the reservoir was sucked out with a pipette. The reservoir was removed, the cellulose particles protruding from the column were removed, and an end fitting was connected.
（３）Ｋａｖ測定装置
システム ： ＳＣＬ−１０ＡＰＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
ワークステーション ： ＣＬＡＳＳ−ＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
ＲＩ検出器 ： ＲＩＤ−１０Ａ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
ポンプ ： ＬＣ−１０ＡＴ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
オートインジェクター ： ＳＩＬ−１０ＡＤＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
(3) Kav measuring device system: SCL-10APVP (SHIMAZU)
Workstation: CLASS-VP (SHIMAZU)
RI detector: RID-10A (SHIMAZU)
Pump: LC-10AT (SHIMAZU)
Autoinjector: SIL-10ADVP (SHIMAZU)
（４）Ｋａｖ測定サンプル
表１に示したＫａｖ測定サンプルを用いた。
（５）Ｋａｖ測定
セルロース粒子を充填したカラムをＫａｖ測定装置にセットした。流量０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で６０分間、超純水を通液した。Ｋａｖ測定サンプル１０μＬをカラムにアプライして、４５分間超純水で通液した。Ｋａｖ測定サンプルの検出はＲＩ検出器を用いて行い、測定チャートを記録した。これらの操作をＫａｖ測定サンプルごとに実施した。得られた測定チャートは縦軸にＲＩ検出強度、横軸に時間をとっているが、チャートは正規分布を示した。ＲＩ検出強度が極大になるような時間を記録した。
(5) Kav measurement A column packed with cellulose particles was set in a Kav measuring device. Ultrapure water was passed for 60 minutes at a flow rate of 0.4 mL / min. 10 μL of Kav measurement sample was applied to the column and passed through ultrapure water for 45 minutes. Detection of the Kav measurement sample was performed using an RI detector, and a measurement chart was recorded. These operations were performed for each Kav measurement sample. The obtained measurement chart has RI detection intensity on the vertical axis and time on the horizontal axis, and the chart showed a normal distribution. The time at which the RI detection intensity was maximized was recorded.
（６）Ｋａｖ導出式
Ｋａｖ測定で得られた、ＲＩ検出強度が極大になるような時間と、そのときの通液した流量から、Ｋａｖ測定サンプルの保持容量（ｍＬ）を算出した。
Ｋａｖは以下の式にて算出する。
Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍＬ）、Ｖｔは空カラム体積（ｍＬ）、Ｖ０はブルーデキストラン２０００保持容量（ｍＬ）である。］
Ｋａｖ値を縦軸にとり、分子量を横軸においてＫａｖ値とプロットしたときに、Ｋａｖ値がゼロになる分子量が排除限界分子量である。
(6) Kav Derivation Formula The retention volume (mL) of the Kav measurement sample was calculated from the time when the RI detection intensity was maximized and the flow rate at that time, which was obtained by the Kav measurement.
Kav is calculated by the following equation.
Kav = (Ve−V 0 ) / (Vt−V 0 )
[In the formula, Ve is a sample holding capacity (mL), Vt is an empty column volume (mL), and V 0 is Blue Dextran 2000 holding capacity (mL). ]
The molecular weight at which the Kav value becomes zero when the Kav value is plotted on the vertical axis and the molecular weight is plotted on the horizontal axis as the Kav value is the exclusion limit molecular weight.
＜分析方法２ ホルミル基の定量＞
セルロース粒子１．４２ｇ（湿潤重量）を１５ｍＬのメモリ付ポリプロピレン製チューブにはかり取った。純水をチューブのメモリが３ｍＬになるまで加えた。このチューブに純水で１５０μｍｏｌ／ｍＬ濃度に調製したフェニルヒドラジン溶液を１ｍＬ加えて、４０℃で１時間攪拌して吸着させた。吸着後の上清を１ｍＬ回収して適度に希釈した後、分光光度計にて波長２７８ｎｍでの吸光度を測定して未吸着のフェニルヒドラジン量を測定した。フェニルヒドラジンの仕込み量との差し引きから、セルロース粒子に吸着したフェニルヒドラジン量を計算し、その値をセルロース粒子に付加したホルミル基量と定義した。なお、ホルミル基量は、セルロース粒子の乾燥重量に換算して、セルロース粒子１ｇ（乾燥重量）に吸着したフェニルヒドラジンの量（μｍｏｌ）とした。
<Analysis Method 2 Determination of Formyl Group>
1.42 g (wet weight) of cellulose particles were weighed into a 15 mL polypropylene tube with memory. Pure water was added until the tube memory was 3 mL. 1 mL of a phenylhydrazine solution prepared to a concentration of 150 μmol / mL with pure water was added to the tube, and the mixture was adsorbed by stirring at 40 ° C. for 1 hour. After 1 mL of the adsorbed supernatant was collected and diluted appropriately, the absorbance at a wavelength of 278 nm was measured with a spectrophotometer to measure the amount of unadsorbed phenylhydrazine. The amount of phenylhydrazine adsorbed on the cellulose particles was calculated from the amount subtracted from the amount of phenylhydrazine charged, and the value was defined as the amount of formyl group added to the cellulose particles. The amount of formyl group was defined as the amount (μmol) of phenylhydrazine adsorbed on 1 g (dry weight) of cellulose particles in terms of the dry weight of cellulose particles.
＜分析方法３ ホルマリンの定量＞
試験溶液２ｍＬを５０ｍＬ三角フラスコにはかり取り、この三角フラスコに５規定の水酸化カリウム溶液を２ｍＬ加えた。この三角フラスコにさらに４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１，２，４−トリアゾール（ＡＨＭＴ）０．５ｇに０．５規定の塩酸１００ｍＬを加えて溶解したＡＨＭＴ溶液を２ｍＬ加えて、軽く振とうした後、２０分間静置した。その後、この三角フラスコに、過ヨウ素酸カリウム０．７５ｇに０．２規定の水酸化カリウムを１００ｍＬ加えて加熱溶解した過ヨウ素酸カリウム溶液を２ｍＬ加えて、気泡がなくなるまで３分間振とうした。得られた液について、分光光度計を用いて波長５５０ｎｍの吸光度を測定し、濃度既知のホルマリンを用いて作成した検量線から、ホルマリン量を計算した。
<Analysis Method 3 Formalin Quantification>
2 mL of the test solution was weighed into a 50 mL Erlenmeyer flask, and 2 mL of 5N potassium hydroxide solution was added to this Erlenmeyer flask. To this Erlenmeyer flask was further added 2 mL of an AHMT solution prepared by adding 100 mL of 0.5N hydrochloric acid to 0.5 g of 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole (AHMT), After gently shaking, it was allowed to stand for 20 minutes. Thereafter, 2 mL of a potassium periodate solution obtained by adding 100 mL of 0.2N potassium hydroxide to 0.75 g of potassium periodate and dissolving by heating was added to this Erlenmeyer flask and shaken for 3 minutes until no bubbles were found. About the obtained liquid, the light absorbency of wavelength 550nm was measured using the spectrophotometer, and the amount of formalins was calculated from the calibration curve created using formalin with a known density | concentration.
［参考例１］
セルロース粒子の作製
重量パーセント濃度６０％のチオシアン酸カルシウム水溶液３５２ｇを反応容器にはかり取り、これに結晶セルロース（重合度２４０）２３ｇを加え、これを１１０℃まで昇温して結晶セルロースを溶解した。このセルロース溶解液を、１２０℃まで昇温した、１．８ｇのソルビタンモノオレイトが入った１．５Ｌのオルト−ジクロロベンゼン中に投入して攪拌して造粒した。直ちに反応溶液の温度を４０℃まで低下させた後に、０．６Ｌのメタノールをゆっくり加えた。０．６Ｌのメタノールを加えて、５分間を攪拌した後に、攪拌を停止して、ビフネルロートを用いて反応溶液をろ過し、ろ液を除去した。このような洗浄を５回繰り返した。続いて、同様の洗浄を次は純水を用いて５回繰り返した。その後、篩を用いて３００〜６００μｍの篩幅で分級して多孔質セルロース粒子を得た。なお、セルロース粒子の粒子径は、架橋の前後で変化しない。
[Reference Example 1]
Preparation of Cellulose Particles 352 g of a calcium thiocyanate aqueous solution having a weight percent concentration of 60% was weighed in a reaction vessel, 23 g of crystalline cellulose (degree of polymerization 240) was added thereto, and this was heated to 110 ° C. to dissolve the crystalline cellulose. This cellulose solution was put into 1.5 L of ortho-dichlorobenzene containing 1.8 g of sorbitan monooleate, heated to 120 ° C., and granulated by stirring. Immediately after the temperature of the reaction solution was lowered to 40 ° C., 0.6 L of methanol was slowly added. After adding 0.6 L of methanol and stirring for 5 minutes, stirring was stopped, the reaction solution was filtered using a bifunnel funnel, and the filtrate was removed. Such washing was repeated 5 times. Subsequently, the same washing was repeated five times using pure water. Then, it classified with the sieve width of 300-600 micrometers using the sieve, and obtained the porous cellulose particle. In addition, the particle diameter of a cellulose particle does not change before and after bridge | crosslinking.
［参考例２］
多孔質セルロース粒子の架橋
参考例１で得た多孔質セルロース粒子を湿潤ゲルで１２１ｇ、１Ｌ容量フラスコにはかり取り、これに純水１４２ｇを加えた。攪拌羽で攪拌しながら７１．２ｇの硫酸ナトリウムをこれに加えて溶解した。反応溶液を５０℃まで昇温した後、重量パーセント濃度４８％の水酸化ナトリウム水溶液を３．７ｇ、水素化ホウ素ナトリウムを０．６ｇ加えて攪拌した。続いてこれに重量パーセント濃度４８％の水酸化ナトリウム水溶液を２ｇ、エピクロロヒドリンを２．４ｇ加えた。その後１３分置きに合計１０回、重量パーセント濃度４８％の水酸化ナトリウム水溶液を２ｇ、エピクロロヒドリンを２．４ｇそれぞれ加えた。その後、反応溶液を２０時間攪拌して付加したエピクロロヒドリンのうち、架橋に使用されなかったエポキシド基を開裂させた。
反応が終了した後、ビフネルロートを用いて多孔質セルロース粒子を吸わないように反応ろ液を除去した。担体を洗浄するために、担体の２倍量の純水を加えて５分間攪拌した。５分間の攪拌が終了した後、ビフネルロートを用いて洗浄ろ液を除去した。このような洗浄を洗浄ろ液が中性になるまで複数回繰り返して、高度に架橋した多孔質セルロース粒子を得た。
[Reference Example 2]
Crosslinking of porous cellulose particles The porous cellulose particles obtained in Reference Example 1 were weighed into a 121 g, 1 L volumetric flask with a wet gel, and 142 g of pure water was added thereto. While stirring with a stirring blade, 71.2 g of sodium sulfate was added and dissolved. After raising the temperature of the reaction solution to 50 ° C., 3.7 g of an aqueous sodium hydroxide solution having a weight percent concentration of 48% and 0.6 g of sodium borohydride were added and stirred. Subsequently, 2 g of an aqueous sodium hydroxide solution having a weight percent concentration of 48% and 2.4 g of epichlorohydrin were added thereto. Thereafter, 2 g of sodium hydroxide aqueous solution having a weight percent concentration of 48% and 2.4 g of epichlorohydrin were added 10 times every 13 minutes. Then, the epoxide group which was not used for bridge | crosslinking among the epichlorohydrin added by stirring the reaction solution for 20 hours was cleaved.
After the reaction was completed, the reaction filtrate was removed using a bifunnel funnel so as not to suck the porous cellulose particles. In order to wash the carrier, pure water twice the amount of the carrier was added and stirred for 5 minutes. After 5 minutes of stirring, the washing filtrate was removed using a bifunnel funnel. Such washing was repeated a plurality of times until the washing filtrate became neutral to obtain highly crosslinked porous cellulose particles.
［参考例３］
セルロース粒子の排除限界分子量の測定
参考例２で得たセルロース粒子について分析方法１に示した方法により、Ｋａｖを測定したところ、図１に示すように排除限界分子量は１６万となり、多孔質であることが判った。
[Reference Example 3]
Measurement of Exclusion Limit Molecular Weight of Cellulose Particles When the Kav of the cellulose particles obtained in Reference Example 2 was measured by the method shown in Analysis Method 1, the exclusion limit molecular weight was 160,000 as shown in FIG. I found out.
［実施例１］
（１）架橋多孔質セルロース粒子へのホルミル基の付加
参考例２で調製した架橋多孔質セルロース粒子を湿潤ゲルで３０ｇはかり取り２００ｍＬ容量の三角フラスコに加えた。これに純水６６ｍＬを加えた後に、過ヨウ素酸ナトリウムを０．７ｇ加えた。反応溶液を３０℃に昇温した後に振とう攪拌で２時間反応させて架橋多孔質セルロース粒子にホルミル基を付加させた。反応が終了した後、上澄みから反応溶液の一部を回収して、ホルマリンの定量に用いた。ビフネルロートを用いて多孔質セルロース粒子を吸わないように反応ろ液を除去した。担体を洗浄するために、担体の２倍量の純水を加えて１分間攪拌した。１分間の攪拌が終了した後、ビフネルロートを用いて洗浄ろ液を除去した。このような洗浄を１０回繰り返して、ホルミル基を付加した架橋多孔質セルロース粒子を得た。
分析方法２に示される方法にて、架橋多孔質セルロース粒子に付加したホルミル基量を測定したところ、ホルミル基量はセルロース乾燥重量１ｇ当たりに換算して６８０μｍｏｌ／ｇ乾燥重量であった。
また、分析方法３に示される方法にて、過ヨウ素酸ナトリウムでの酸化反応終了後の上澄み液中のホルマリンを定量したところ、セルロース乾燥重量１ｇ当たりに換算して６４５μｍｏｌ／ｇ乾燥重量のホルマリンを検出した。参考例１で得た架橋されていないセルロース粒子を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した場合、ホルマリンを検出しないことから、架橋剤として使用したエピクロロヒドリンが、架橋されずに加水分解されてジオール基を生成し、該ジオール基が過ヨウ素酸ナトリウムで開裂し、その結果ホルマリンが生じたものと判明した。従って、ここで付加したホルミル基はエピクロロヒドリンが、架橋に用いられずに加水分解されて形成したジオール基が酸化されて生じた官能基である。
[Example 1]
(1) Addition of formyl group to crosslinked porous cellulose particles 30 g of the crosslinked porous cellulose particles prepared in Reference Example 2 were weighed with a wet gel and added to a 200 mL Erlenmeyer flask. After adding 66 mL of pure water, 0.7 g of sodium periodate was added thereto. The reaction solution was heated to 30 ° C. and then reacted for 2 hours with shaking and stirring to add formyl groups to the crosslinked porous cellulose particles. After the reaction was completed, a part of the reaction solution was recovered from the supernatant and used for formalin quantification. The reaction filtrate was removed so as not to suck the porous cellulose particles using a bifunnel funnel. In order to wash the carrier, pure water twice the amount of the carrier was added and stirred for 1 minute. After stirring for 1 minute, the washing filtrate was removed using a bifunnel funnel. Such washing was repeated 10 times to obtain crosslinked porous cellulose particles having a formyl group added thereto.
When the amount of formyl group added to the crosslinked porous cellulose particles was measured by the method shown in Analysis Method 2, the amount of formyl group was 680 μmol / g dry weight in terms of 1 g of cellulose dry weight.
Further, when formalin in the supernatant liquid after completion of the oxidation reaction with sodium periodate was quantified by the method shown in Analysis Method 3, 645 μmol / g dry weight of formalin was converted to 1 g of dry weight of cellulose. Detected. When the non-crosslinked cellulose particles obtained in Reference Example 1 are oxidized with sodium periodate, formalin is not detected, so that epichlorohydrin used as a cross-linking agent is hydrolyzed without cross-linking and becomes a diol group. It was found that the diol group was cleaved with sodium periodate, resulting in formalin. Therefore, the formyl group added here is a functional group formed by oxidizing a diol group formed by hydrolysis of epichlorohydrin without being used for crosslinking.
（２）ホルミル基を付加した架橋多孔質セルロース粒子へのポリミキシンＢの固定化
上記（１）で得たホルミル基を付加した架橋多孔質セルロース粒子（ホルミル化架橋多孔質セルロース粒子）を湿潤ゲルで２９ｇはかり取り、２００ｍＬ容量の栓付三角フラスコに加えた。これに、ホウ酸を０．１ｍｏｌ／Ｌ濃度になるように溶解し、ｐＨを８．５に調節した０．１ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液を４６．７ｇ加えた。これにさらにポリミキシンＢ硫酸塩（和光純薬製）を２３６ｍｇ加えた後に、スターラーを用いて３０℃、１時間反応させた。１時間の反応の後に反応溶液に水素化ホウ素ナトリウムを１１６ｍｇ加えて、３０℃、１時間反応させた。反応終了後に上清を回収し、ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ１２０Ｔカラム（東ソー製）を用いて逆相クロマトグラフィーを行い、得られたピーク面積から未固定のポリミキシンＢの定量を行った。ポリミキシンＢを加えた量との差し引きによって架橋多孔質セルロース粒子に固定化されたポリミキシンＢの量を計算したところ、担体（架橋多孔質セルロース粒子）体積１ｍＬ当たり４．６ｍｇ／ｍＬのポリミキシンＢが固定化された担体を得た。ポリミキシンＢの仕込み量に対する固定化効率は高く９３％であった。反応が終了した後の担体は、ビフネルロートを用いて架橋多孔質セルロース粒子を吸わないように反応ろ液を除去した。担体を洗浄するために、担体の２倍量の純水を加えて１分間攪拌した。１分間の攪拌が終了した後、ビフネルロートを用いて洗浄ろ液を除去した。このような洗浄を１０回繰り返して、ポリミキシンＢを固定化した架橋多孔質セルロース粒子を得た。
同様の方法で、ポリミキシンＢの仕込み量を変更して固定化した場合、図２に示されるように仕込み量に比例してポリミキシンＢの固定化量が増加した。この結果からポリミキシンＢの固定化量は仕込み量によって変更することが可能であることが判った。
(2) Immobilization of polymyxin B to crosslinked porous cellulose particles to which formyl groups have been added The crosslinked porous cellulose particles to which formyl groups have been added obtained in (1) above (formylated crosslinked porous cellulose particles) are wet gel. 29 g was weighed and added to a 200 mL conical flask with stopper. To this was added 46.7 g of a 0.1 mol / L borate buffer solution in which boric acid was dissolved to a concentration of 0.1 mol / L and the pH was adjusted to 8.5. Further, 236 mg of polymyxin B sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, followed by reaction at 30 ° C. for 1 hour using a stirrer. After 1 hour of reaction, 116 mg of sodium borohydride was added to the reaction solution and reacted at 30 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, the supernatant was collected and subjected to reverse phase chromatography using a TSK-GEL ODS120T column (manufactured by Tosoh Corporation), and unfixed polymyxin B was quantified from the obtained peak area. When the amount of polymyxin B immobilized on the crosslinked porous cellulose particles was calculated by subtracting the amount of polymyxin B added, 4.6 mg / mL of polymyxin B was immobilized per mL of carrier (crosslinked porous cellulose particles) volume. A modified carrier was obtained. The immobilization efficiency relative to the charged amount of polymyxin B was 93%. The reaction filtrate was removed from the carrier after the reaction was completed using a bifunnel funnel so as not to suck the crosslinked porous cellulose particles. In order to wash the carrier, pure water twice the amount of the carrier was added and stirred for 1 minute. After stirring for 1 minute, the washing filtrate was removed using a bifunnel funnel. Such washing was repeated 10 times to obtain crosslinked porous cellulose particles on which polymyxin B was immobilized.
In the same manner, when the amount of polymyxin B charged was changed and immobilized, the amount of polymyxin B immobilized increased in proportion to the amount charged as shown in FIG. From this result, it was found that the immobilization amount of polymyxin B can be changed depending on the charged amount.
［比較例１］
エポキシド基を付加した多孔質セルロース粒子へのポリミキシンＢの固定化
参考例１で得た多孔質セルロース粒子を湿潤ゲルで１５０ｇをフラスコにはかり取り、これに純水１２０ｇを加えた。攪拌羽で攪拌しながらこの溶液の温度を３０℃に昇温した。水酸化ナトリウム５．２ｇを純水７．４ｇに溶解した水酸化ナトリウム水溶液を多孔質セルロース粒子の入ったフラスコ内に加えた。その後、６９ｇのエピクロロヒドリンを加えて２時間攪拌反応させた。反応が終了した後、ビフネルロートを用いて多孔質セルロース粒子を吸わないように反応ろ液を除去した。担体を洗浄するために、担体の２倍量の純水を加えて５分間攪拌した。５分間の攪拌が終了した後、ビフネルロートを用いて洗浄ろ液を除去した。このような洗浄を洗浄ろ液が中性になるまで複数回繰り返して、エポキシド基を導入した多孔質セルロース粒子を得た。
エポキシド基の導入量を測定するために湿潤ゲル１ｇを５０ｍＬの三角フラスコにはかり取り、これに１．３ｍｏｌ／Ｌ濃度になるようにチオ硫酸ナトリウムを純水に溶解したチオ硫酸ナトリウム水溶液を３ｍＬ加えて１時間反応させた。その後、０．０１ｍｏｌ／Ｌの塩酸で反応液を中和滴定したところ、セルロース（湿潤ゲル）１ｇ当たり１８μｍｏｌ／ｇ湿潤重量、セルロース乾燥重量１ｇ当たりに換算して１９０μｍｏｌ／ｇ乾燥重量のエポキシド基が付加した多孔質セルロース粒子を得た。
次に、エポキシド基を付加した多孔質セルロース粒子を湿潤ゲルで５ｇはかり取り、５０ｍＬの三角フラスコに加えた。このフラスコにホウ酸を０．１ｍｏｌ／Ｌ濃度になるように溶解し、ｐＨを８．５に調節した０．１ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液を８ｇ加えた。さらにこのフラスコにポリミキシンＢ硫酸塩を１８ｍｇ加えた後、スターラーを用いて攪拌しながら３０℃で２０時間反応させた。反応終了後に上清を回収した。回収した上清をＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ１２０Ｔカラム（東ソー製）を用いて逆相クロマトグラフィーによって得たピーク面積から、未固定のポリミキシンＢを定量した。ポリミキシンＢの仕込み量との差し引きから多孔質セルロース粒子に固定化されたポリミキシンＢの量を計算したところ、担体（架橋多孔質セルロース粒子）体積１ｍＬ当たり１．４ｍｇ／ｍＬのポリミキシンＢを固定化した担体を得た。
同様にポリミキシンＢの仕込み量を変えて固定化させた場合、図２に示されるように、仕込み量の増加に対して、ポリミキシンＢの固定化量は、ホルミル基と比較して非常に緩慢で非効率的であった。
[Comparative Example 1]
Immobilization of polymyxin B to porous cellulose particles to which epoxide groups were added 150 g of the porous cellulose particles obtained in Reference Example 1 were weighed into a flask with a wet gel, and 120 g of pure water was added thereto. The temperature of this solution was raised to 30 ° C. while stirring with a stirring blade. A sodium hydroxide aqueous solution in which 5.2 g of sodium hydroxide was dissolved in 7.4 g of pure water was added to the flask containing the porous cellulose particles. Thereafter, 69 g of epichlorohydrin was added and allowed to react with stirring for 2 hours. After the reaction was completed, the reaction filtrate was removed using a bifunnel funnel so as not to suck the porous cellulose particles. In order to wash the carrier, pure water twice the amount of the carrier was added and stirred for 5 minutes. After 5 minutes of stirring, the washing filtrate was removed using a bifunnel funnel. Such washing was repeated a plurality of times until the washing filtrate became neutral to obtain porous cellulose particles into which epoxide groups had been introduced.
In order to measure the amount of epoxide groups introduced, 1 g of wet gel was weighed into a 50 mL Erlenmeyer flask, and 3 mL of an aqueous sodium thiosulfate solution in which sodium thiosulfate was dissolved in pure water to a concentration of 1.3 mol / L was added. For 1 hour. Thereafter, the reaction solution was neutralized and titrated with 0.01 mol / L hydrochloric acid. As a result, 18 μmol / g wet weight per gram of cellulose (wet gel) and 190 μmol / g dry weight epoxide group converted per 1 g of cellulose dry weight were obtained. Added porous cellulose particles were obtained.
Next, 5 g of porous cellulose particles to which epoxide groups were added were weighed with a wet gel and added to a 50 mL Erlenmeyer flask. To this flask, 8 g of 0.1 mol / L borate buffer solution in which boric acid was dissolved to a concentration of 0.1 mol / L and the pH was adjusted to 8.5 was added. Further, 18 mg of polymyxin B sulfate was added to the flask, and the mixture was reacted at 30 ° C. for 20 hours with stirring using a stirrer. After completion of the reaction, the supernatant was collected. Unfixed polymyxin B was quantified from the peak area obtained by reverse phase chromatography using TSK-GEL ODS120T column (manufactured by Tosoh Corporation). When the amount of polymyxin B immobilized on the porous cellulose particles was calculated from the subtraction from the charged amount of polymyxin B, 1.4 mg / mL polymyxin B was immobilized per mL of carrier (crosslinked porous cellulose particles) volume. A carrier was obtained.
Similarly, when the amount of polymyxin B charged was changed and immobilized, as shown in FIG. 2, the amount of polymyxin B immobilized was very slow compared to the formyl group as the amount charged increased. It was inefficient.
［実施例２］
生体内を模したイオン強度の条件下でのエンドトキシンの除去効果
実施例１で得たポリミキシンＢを固定化した架橋多孔質セルロース担体４ｇを１００ｍＬ容量のビーカーに秤量し、担体重量の１０倍量のメタノールで懸濁した。懸濁した担体を１７Ｇ３ガラスフィルター（小孔サイズ：３０μｍ）上に移し、スパーテルで攪拌した。攪拌後、懸濁した担体を２０〜３０秒間静置し、吸引ろ過した。これを５回繰り返した。メタノール洗浄後の担体に１０倍量の０．２規定の水酸化ナトリウム水溶液を加えて、スパーテルで攪拌した。攪拌後、懸濁した担体を２０〜３０秒間静置し、吸引ろ過した。これを５回繰り返した。以上の操作で、担体に吸着しているであろうエンドトキシンを除去した。
この担体を蒸留水で中性になるまで洗浄し、５０倍量の０．０２ｍｏｌ／ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７）に０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを加えた溶液を加えて１０〜１５分間平衡化した。平衡化した担体を１７Ｇ３ガラスフィルター上に移し、吸引ろ過した。この担体を５０ｍＬ栓付三角フラスコに０．５ｇずつはかり取った。日本薬局方で定められたエンドトキシンの活性単位ＥＵが既知であるエンドトキシン（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１３：Ｈ１０由来）を、表２で示されるような溶液ごとに溶解し、エンドトキシン汚染液を調製した。各エンドトキシン汚染液を担体の入った５０ｍＬ容量の栓付三角フラスコに加えて、２０℃、１６時間で攪拌しながらエンドトキシンを吸着させた。吸着後の上清をシリンジで回収して、０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過した。ろ過液を測定サンプルとし、後述するリムルス試験によるエンドトキシン吸着能の測定に用いた。
エンドトキシン量を測定するリムルス試験ではエンドスペシー ＥＳ−５０Ｍセット（生化学工業製）を用いた。まず、エンドスペシーに入っているＬＡＬ試薬のバイアルに、備え付けの緩衝液２．８ｍＬを加えて穏やかに溶解した。エンドトキシンが混入していない９６ウェルのマイクロプレート（生化学工業製）に、調製したろ過液を５０μＬずつ加えていった。その後、溶解したＬＡＬ試薬を５０μＬずつ加えていった。プレートに蓋をかぶせて生化学工業製ウェルリーダーＳＫ６０３にセットしてエンドトキシン量を測定した。測定条件は日本薬局方エンドトキシン試験法におけるカイネティック比色法で測定した。表２に示すように、０．０２ｍｏｌ／ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ７に０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを加えた、生体内を模したイオン強度において、エンドトキシンが効率的に除去されていることがわかった。
Removal effect of endotoxin under conditions of ionic strength imitating the living body 4 g of the crosslinked porous cellulose carrier on which polymyxin B obtained in Example 1 was immobilized was weighed into a beaker having a capacity of 100 mL, and was 10 times the weight of the carrier. Suspended with methanol. The suspended carrier was transferred onto a 17G3 glass filter (small pore size: 30 μm) and stirred with a spatula. After stirring, the suspended carrier was allowed to stand for 20 to 30 seconds and suction filtered. This was repeated 5 times. A 10-fold amount of 0.2N aqueous sodium hydroxide solution was added to the carrier after washing with methanol, and the mixture was stirred with a spatula. After stirring, the suspended carrier was allowed to stand for 20 to 30 seconds and suction filtered. This was repeated 5 times. By the above operation, endotoxin that would be adsorbed on the carrier was removed.
The carrier was washed with distilled water until neutral, and a solution of 0.15 mol / L sodium chloride in 50 times the amount of 0.02 mol / mL sodium phosphate buffer (pH 7) was added. Equilibrated for ˜15 minutes. The equilibrated carrier was transferred onto a 17G3 glass filter and suction filtered. 0.5 g of this carrier was weighed out into a 50 mL conical flask with a stopper. Endotoxin (from E. coli O113: H10) whose endotoxin activity unit EU defined by the Japanese Pharmacopoeia is known was dissolved for each solution as shown in Table 2 to prepare an endotoxin-contaminated solution. Each endotoxin-contaminated solution was added to a 50 mL conical flask with a stopper containing a carrier, and endotoxin was adsorbed while stirring at 20 ° C. for 16 hours. The adsorbed supernatant was collected with a syringe and filtered through a 0.45 μm syringe filter. The filtrate was used as a measurement sample, and used for measuring endotoxin adsorption ability by the limulus test described later.
In the Limulus test for measuring the amount of endotoxin, Endspecy ES-50M set (manufactured by Seikagaku Corporation) was used. First, 2.8 mL of the provided buffer solution was added to the LAL reagent vial contained in the endospecies and gently dissolved. 50 μL of the prepared filtrate was added to a 96-well microplate (Seikagaku Kogyo) without endotoxin. Thereafter, 50 μL of the dissolved LAL reagent was added. The plate was covered and set on a well reader SK603 manufactured by Seikagaku Corporation, and the amount of endotoxin was measured. The measurement conditions were measured by the kinetic colorimetric method in the Japanese Pharmacopoeia endotoxin test method. As shown in Table 2, endotoxin was efficiently removed at an ionic strength imitating the living body by adding 0.15 mol / L sodium chloride to 0.02 mol / mL sodium phosphate buffer solution pH 7. I found out.
［実施例３］
イオン強度、ｐＨの異なる環境下でのエンドトキシンの吸着能力
実施例１で得たポリミキシンＢを固定化した架橋多孔質セルロース担体４ｇを１００ｍＬ容量のビーカーに秤量し、担体重量の１０倍量のメタノールで懸濁した。懸濁した担体を１７Ｇ３ガラスフィルター上に移し、スパーテルで攪拌した。攪拌後、懸濁した担体を２０〜３０秒間静置し、吸引ろ過した。これを５回繰り返した。メタノール洗浄後の担体に１０倍量の０．２規定の水酸化ナトリウム水溶液を加えて、スパーテルで攪拌した。攪拌後、懸濁した担体を２０〜３０秒静置し、吸引ろ過した。これを５回繰り返した。以上の操作で、担体に吸着しているであろうエンドトキシンを除去した。
この担体を蒸留水で中性になるまで洗浄した。イオン強度またはｐＨの異なるリン酸ナトリウム緩衝液にＮａＣｌを加えた溶液をそれぞれ、担体に５０倍量加えて１０〜１５分間平衡化した。平衡化した担体を１７Ｇ３ガラスフィルター上に移し、吸引ろ過した。担体を１０ｍＬ容量のガラス瓶に０．２ｇずつはかり取った。日本薬局方で定められたエンドトキシンの活性単位ＥＵが既知であるエンドトキシン（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：B4由来）を用いて、各緩衝液に溶解し、エンドトキシン汚染液を調製した。各エンドトキシン汚染液を担体の入った１０ｍＬのガラス瓶に加えて、２０℃、１６時間で攪拌しながらエンドトキシンを吸着させた。吸着後の上清をシリンジで回収して、０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過した。ろ過液を測定サンプルとし、実施例２と同様にリムルス試験にてエンドトキシン吸着能を測定した。
表３及び４に示すように、様々な環境においてもエンドトキシンが効果的に吸着されていた。さらに市販されて購入可能なポリミキシンＢ固定化アガロース担体（商品名：アフィプレップポリミキシン、バイオ・ラッド社製）や、ポリリジンを固定化した担体（商品名：ＥＴクリーンＬ、チッソ社製）と同等のエンドトキシン吸着能力をもっていた。
[Example 3]
Adsorption ability of endotoxin in environments with different ionic strength and pH 4 g of the crosslinked porous cellulose carrier on which polymyxin B obtained in Example 1 was immobilized was weighed in a 100 mL beaker, and 10 times the weight of the methanol in the carrier. Suspended. The suspended carrier was transferred onto a 17G3 glass filter and stirred with a spatula. After stirring, the suspended carrier was allowed to stand for 20 to 30 seconds and suction filtered. This was repeated 5 times. A 10-fold amount of 0.2N aqueous sodium hydroxide solution was added to the carrier after washing with methanol, and the mixture was stirred with a spatula. After stirring, the suspended carrier was allowed to stand for 20 to 30 seconds and suction filtered. This was repeated 5 times. By the above operation, endotoxin that would be adsorbed on the carrier was removed.
The carrier was washed with distilled water until neutral. A solution obtained by adding NaCl to a sodium phosphate buffer having a different ionic strength or pH was added to the carrier in an amount 50 times, and equilibrated for 10 to 15 minutes. The equilibrated carrier was transferred onto a 17G3 glass filter and suction filtered. 0.2 g of the carrier was weighed into a 10 mL glass bottle. An endotoxin-contaminated solution was prepared by dissolving in each buffer using endotoxin (derived from E. coli O111: B4) whose endotoxin activity unit EU defined by the Japanese Pharmacopoeia was known. Each endotoxin-contaminated solution was added to a 10 mL glass bottle containing a carrier, and endotoxin was adsorbed while stirring at 20 ° C. for 16 hours. The adsorbed supernatant was collected with a syringe and filtered through a 0.45 μm syringe filter. Using the filtrate as a measurement sample, endotoxin adsorption ability was measured by the Limulus test in the same manner as in Example 2.
As shown in Tables 3 and 4, endotoxin was effectively adsorbed in various environments. Furthermore, it is equivalent to a commercially available polymyxin B-immobilized agarose carrier (trade name: Affiprep polymyxin, manufactured by Bio-Rad) or a carrier on which polylysine is immobilized (trade name: ET Clean L, manufactured by Chisso). It had endotoxin adsorption ability.
参考までに、ポリミキシンＢ固定化アガロース担体（商品名：アフィプレップポリミキシン、バイオ・ラッド社製）及びポリリジンを固定化した担体（商品名：ＥＴクリーンＬ、チッソ社製）のエンドトキシン吸着能力を表５及び６に示す。 For reference, the endotoxin adsorption capacities of polymyxin B-immobilized agarose carrier (trade name: Affiprep polymyxin, manufactured by Bio-Rad) and polylysine-immobilized carrier (trade name: ET Clean L, manufactured by Chisso) are shown in Table 5. And 6.
［実施例４］
圧力損失の測定
参考例２で得た架橋多孔質セルロース粒子を内径２．２ｃｍ、高さ２０ｃｍの低圧液クロ用樹脂カラム（ＥＹＥＬＡ製）に充填して圧力損失を測定した。まずカラムにリザーバーを取り付け、ポンプと連結した。３ｍＬ／分の流速で超純水を６０分間の時間でリザーバー付のカラムに流し、架橋多孔質セルロース粒子を充填した。架橋多孔質セルロース粒子を充填した後、リザーバーを外して、カラムをパッキングした。ポンプを用いて、一定圧力下における純水の流量を測定し、圧力に対する線速度の関係を調べたところ、図３に示す結果が得られた。
比較例としてカラムのみの圧力損失を測定した。この結果、架橋多孔質セルロース粒子をカラムに充填しても圧力損失に変化は見られないことが判った。つまり、架橋多孔質セルロース粒子に掛かる圧力損失は検出されなかった。以上の結果から本発明に用いる架橋多孔質セルロース粒子は高圧に耐えられ、圧力損失が著しく少ない性能をもっていることが判った。架橋多孔質セルロース粒子にホルミル基を付加しポリミキシンＢを導入した後も線速は基材である上記架橋多孔質セルロース粒子と同等であると考えられる。したがって、本発明のエンドトキシン吸着体は、機械的強度が高く、耐流速性に優れているといえる。
[Example 4]
Measurement of Pressure Loss The crosslinked porous cellulose particles obtained in Reference Example 2 were packed into a low pressure liquid chromatographic resin column (manufactured by EYELA) having an inner diameter of 2.2 cm and a height of 20 cm, and the pressure loss was measured. First, a reservoir was attached to the column and connected to a pump. Ultrapure water was allowed to flow through a column with a reservoir at a flow rate of 3 mL / min for 60 minutes, and filled with crosslinked porous cellulose particles. After filling with the crosslinked porous cellulose particles, the reservoir was removed and the column was packed. When the flow rate of pure water under a constant pressure was measured using a pump and the relationship between the linear velocity and the pressure was examined, the result shown in FIG. 3 was obtained.
As a comparative example, the pressure loss of only the column was measured. As a result, it was found that there was no change in pressure loss even when the column was filled with crosslinked porous cellulose particles. That is, no pressure loss applied to the crosslinked porous cellulose particles was detected. From the above results, it was found that the crosslinked porous cellulose particles used in the present invention can withstand high pressure and have a performance with extremely low pressure loss. Even after adding a formyl group to the crosslinked porous cellulose particles and introducing polymyxin B, the linear velocity is considered to be equivalent to that of the crosslinked porous cellulose particles as the base material. Therefore, it can be said that the endotoxin adsorbent of the present invention has high mechanical strength and excellent flow rate resistance.
本発明のエンドトキシン吸着体は、製薬メーカーでの医薬品の精製工程及び医療現場における輸液又は透析液などからのエンドトキシンの除去、あるいは体外循環治療における敗血症などのエンドトキシンによって生じる様々な疾患の治療に好適に利用できる。 The endotoxin adsorbent of the present invention is suitable for the treatment of various diseases caused by endotoxins such as sepsis in the purification process of pharmaceuticals and removal of endotoxin from infusion fluids or dialysates in the medical field, or in extracorporeal circulation treatment. Available.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011143079A JP2013010701A (en) | 2011-06-28 | 2011-06-28 | Endotoxin adsorbent,column for whole blood perfusion type extracorporeal circulation using the same, and chromatography filler for purifying pharmaceutical drug |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011143079A JP2013010701A (en) | 2011-06-28 | 2011-06-28 | Endotoxin adsorbent,column for whole blood perfusion type extracorporeal circulation using the same, and chromatography filler for purifying pharmaceutical drug |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013010701A true JP2013010701A (en) | 2013-01-17 |
Family
ID=47684929
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011143079A Pending JP2013010701A (en) | 2011-06-28 | 2011-06-28 | Endotoxin adsorbent,column for whole blood perfusion type extracorporeal circulation using the same, and chromatography filler for purifying pharmaceutical drug |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2013010701A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108579698A (en) * | 2018-04-11 | 2018-09-28 | 成都艾伟孚生物科技有限公司 | A kind of preparation of endotoxin Specific adsorption film and its application in supplementary reproduction field |
| JPWO2018139415A1 (en) * | 2017-01-25 | 2019-11-14 | ナガセケムテックス株式会社 | Endotoxin adsorbent |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5813519A (en) * | 1981-07-16 | 1983-01-26 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Endotoxin adsorbent and removing method of endotoxin using the same |
| JPH01265972A (en) * | 1988-10-29 | 1989-10-24 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Removing method of harmful component in humors |
| JPH01275601A (en) * | 1988-04-27 | 1989-11-06 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Cellulose particle |
| JP2002263486A (en) * | 2001-03-14 | 2002-09-17 | Chisso Corp | Endotoxin adsorbent and method of removing endotoxin by using the same |
| US20090017445A1 (en) * | 2005-01-21 | 2009-01-15 | Profos Ag | Method For Detecting And Removing Endotoxin |
| WO2010064437A1 (en) * | 2008-12-03 | 2010-06-10 | 株式会社カネカ | Formyl group-containing porous support, adsorbent using same, method for producing same, and method for producing the adsorbent |
| JP2010145240A (en) * | 2008-12-18 | 2010-07-01 | Tosoh Corp | Liquid chromatography filler for immobilizing hydrophobic amino acid or aminomethyl benzoic acid, and method for separating, refining, collecting and recovering biological polymer using the same |
| JP2010532864A (en) * | 2007-07-06 | 2010-10-14 | ケンブリッジ エンタープライズ リミテッド | Biomolecule-binding ligand |
-
2011
- 2011-06-28 JP JP2011143079A patent/JP2013010701A/en active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5813519A (en) * | 1981-07-16 | 1983-01-26 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Endotoxin adsorbent and removing method of endotoxin using the same |
| JPH01275601A (en) * | 1988-04-27 | 1989-11-06 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Cellulose particle |
| JPH01265972A (en) * | 1988-10-29 | 1989-10-24 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Removing method of harmful component in humors |
| JP2002263486A (en) * | 2001-03-14 | 2002-09-17 | Chisso Corp | Endotoxin adsorbent and method of removing endotoxin by using the same |
| US20090017445A1 (en) * | 2005-01-21 | 2009-01-15 | Profos Ag | Method For Detecting And Removing Endotoxin |
| JP2010532864A (en) * | 2007-07-06 | 2010-10-14 | ケンブリッジ エンタープライズ リミテッド | Biomolecule-binding ligand |
| WO2010064437A1 (en) * | 2008-12-03 | 2010-06-10 | 株式会社カネカ | Formyl group-containing porous support, adsorbent using same, method for producing same, and method for producing the adsorbent |
| JP2010145240A (en) * | 2008-12-18 | 2010-07-01 | Tosoh Corp | Liquid chromatography filler for immobilizing hydrophobic amino acid or aminomethyl benzoic acid, and method for separating, refining, collecting and recovering biological polymer using the same |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2018139415A1 (en) * | 2017-01-25 | 2019-11-14 | ナガセケムテックス株式会社 | Endotoxin adsorbent |
| JP7080186B2 (en) | 2017-01-25 | 2022-06-03 | ナガセケムテックス株式会社 | Endotoxin adsorbent |
| CN108579698A (en) * | 2018-04-11 | 2018-09-28 | 成都艾伟孚生物科技有限公司 | A kind of preparation of endotoxin Specific adsorption film and its application in supplementary reproduction field |
| CN108579698B (en) * | 2018-04-11 | 2021-08-31 | 成都艾伟孚生物科技有限公司 | Preparation of endotoxin specific adsorption membrane and application of membrane in assisted reproduction field |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7279106B2 (en) | Adsorbent and method for adsorbing a chemokine in body fluid | |
| JP5017848B2 (en) | Endotoxin adsorbent and method for removing endotoxin using the same | |
| CN104394964A (en) | Filter device combining beads and fibers | |
| US11826724B2 (en) | Use of a hemocompatible porous polymer bead sorbent for removal of endotoxemia-inducing molecules | |
| EP0993834B1 (en) | Adsorbents for toxic shock syndrome toxin-1, method for eliminating the toxin by adsorption | |
| JPH0434451B2 (en) | ||
| EP3298129B1 (en) | Method of preparing universal blood product | |
| JP3901216B2 (en) | Tumor necrosis factor-α adsorbent, adsorption removal method, and adsorber using the adsorbent | |
| EP0819439B1 (en) | Apparatus comprising an adsorbent for adsorptive elimination of disease-related factors in body fluids | |
| JPH0116389B2 (en) | ||
| JP2013010701A (en) | Endotoxin adsorbent,column for whole blood perfusion type extracorporeal circulation using the same, and chromatography filler for purifying pharmaceutical drug | |
| JPH01181875A (en) | Adsorptive body of immune complex and removing device for immune complex with it | |
| RU2694883C1 (en) | Method of lysocyme covalent immobilization for subsequent application of immobilized lysozyme to reduce bacterial population of biological fluids | |
| JP2006320729A (en) | Adsorbent of toxic shock syndrome toxin-1, use of the adsorbent and adsorber filled with the adsorbent | |
| JPS58165860A (en) | Carrier of adsorbing material for purifying body liquid | |
| RU2684639C1 (en) | Method of removing endotoxins from biological fluids using covalently immobilized lysozyme as ligand | |
| JPH0622632B2 (en) | Adsorbent and removal device | |
| JPH0771632B2 (en) | Adsorbent and removal device using the same | |
| JP3251547B2 (en) | Immune complex removal device | |
| JP3084436B2 (en) | Anti-DNA antibody removal device | |
| JP2009178523A (en) | Adsorbent, adsorbing method and adsorbing device for soluble tumor necrosis factor receptor | |
| JP6064402B2 (en) | Separation agent and method for separation of antibody monomer | |
| JPS63178106A (en) | Preparation of wholly porous, activated gel | |
| JP2983955B2 (en) | Device for removing glomerular basement membrane adhering protein | |
| JPH0623042A (en) | Blood purifying adsorbent and blood purifying method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140326 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20150130 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150203 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150623 |