RU2681649C1

RU2681649C1 - Composition on the basis of the praziquantel for the treatment of opisthorchosis

Info

Publication number: RU2681649C1
Application number: RU2017146514A
Authority: RU
Inventors: Николай Захарович Ляхов; Александр Валерьевич Душкин; Елизавета Сергеевна Метелёва; Юлия Сергеевна Чистяченко; Николай Эдуардович Поляков; Дамира Фаутовна Августинович; Галина Борисовна Вишнивецкая; Михаил Александрович Цыганов; Вячеслав Алексеевич Мордвинов; Ирина Васильевна Сорокина; Татьяна Генриховна Толстикова; Ирина Анатольевна Орловская; Людмила Борисовна Топоркова; Михаил Владимирович Хвостов
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2019-03-12

Abstract

FIELD: pharmaceuticals.SUBSTANCE: invention relates to the pharmaceutical industry, namely to a composition for the treatment of opisthorchosis. Composition based on praziquantel for the treatment of opisthorchosis, including the complex of praziquantel and the sodium salt of the plant saponin – glycyrrhizinic acid with the mass ratios of the components of praziquantel: sodium salt of glycyrrhizinic acid, respectively, 1:5–20, obtained by joint mechanical activation of the mixture of the starting components.EFFECT: above described composition can be used for the effective treatment of opisthorchosis at lower dosages of the active substance without toxic side effects, since it possesses enhanced anti-opisthorchid flukes action and reduced toxicity.1 cl, 8 dwg, 3 tbl

Description

Изобретение относится к фармацевтике, фармацевтической промышленности и может быть использовано при лечении гельминтного заболевания описторхоза, вызываемого Opisthorchis felineus.The invention relates to pharmaceuticals, the pharmaceutical industry and can be used in the treatment of helminth diseases of opisthorchiasis caused by Opisthorchis felineus.

У человека зарегистрировано 364 вида гельминтов. Гельминтозы распространены от арктических широт до экватора. Гельминтами заражено более миллиарда человек. По числу больных заражение кишечными гельминтами занимает третье место в мире. По данным ВОЗ, общее число заболеваний и смертей от гельминтозов выше, чем от бактериальных, вирусных инфекций и других паразитарных болезней, вместе взятых. Пораженность населения России гельминтозами составляет в среднем около 2%, в южных районах страны она достигает 7-10%. Особое место среди этих заболеваний занимает описторхоз, вызываемый трематодами Opisthorchis felineus. Так, пораженность описторхозом в эндемичных регионах Западной Сибири составляет не менее 30-60%, на Урале - 20-40% населения. Довольно часто практикуемое в настоящее время лечение описторхоза felinea недостаточно эффективно, что приводит к тяжелым последствиям заболевания - истощению иммунной системы и возникновению вторичного иммунодефицита, нарушениям механизмов гомеостаза, возникновениям аритмий, нарушениям психики, тяжелым поражениям печени и поджелудочной железы. Наиболее грозное осложнение описторхоза - малигнизация органов, заселяемых гельминтами.A person has registered 364 types of helminths. Helminthiasis is distributed from arctic latitudes to the equator. Helminths infected more than a billion people. In terms of the number of patients, intestinal helminth infection is the third largest in the world. According to WHO, the total number of diseases and deaths from helminthiases is higher than from bacterial, viral infections and other parasitic diseases combined. The prevalence of helminthiasis in the Russian population is about 2% on average, in the southern regions of the country it reaches 7-10%. A special place among these diseases is occupied by opisthorchiasis caused by trematodes of Opisthorchis felineus. Thus, the prevalence of opisthorchiasis in the endemic regions of Western Siberia is at least 30-60%, in the Urals - 20-40% of the population. Quite often, the currently practiced treatment of opisthorchiasis felinea is not effective enough, which leads to severe consequences of the disease - depletion of the immune system and the occurrence of secondary immunodeficiency, disturbances in the mechanisms of homeostasis, occurrences of arrhythmias, mental disorders, severe damage to the liver and pancreas. The most formidable complication of opisthorchiasis is malignancy of organs inhabited by helminths.

Празиквантел (ПЗК) - Международное наименование: Praziquantel, регистрационный номер CAS: 55268-74-1 - является противогельминтным лекарственным веществом (ЛВ), производным пиразинизохинолина. Структурная формула празиквантела представлена на Фиг. 1.Praziquantel (PZK) - International name: Praziquantel, registration number CAS: 55268-74-1 - is an anthelmintic drug (drug), a derivative of pyrazinisoquinoline. The structural formula of praziquantel is shown in FIG. one.

Обладает широким спектром действия, которое распространяется на многие виды трематод и цестод. Так, празиквантел активен в отношении всех патогенных для человека возбудителей шистосомозов, клонорхоза, парагонимоза, описторхоза, а также в отношении Fasciolopsisbuski, Hetorophyesheterophyes и Metagonimusyokogawai (кишечные сосальщики). Празиквантел быстро повышает проницаемость мембран клеток гельминтов для Са²⁺, что в свою очередь ведет к генерализованному сокращению мускулатуры, переходящему в стойкий паралич и ведущему к гибели. Кроме того, препарат вызывает вакуолизацию и последующее повреждение тегумента червей, что делает паразитов уязвимым перед иммунной системой хозяина и его пищеварительными ферментами.It has a wide spectrum of action, which extends to many types of trematodes and cestodes. So, praziquantel is active against all pathogens for humans of schistosomiasis, clonorchiasis, paragonimiasis, opisthorchiasis, as well as against Fasciolopsisbuski, Hetorophyesheterophyes and Metagonimusyokogawai (intestinal flukes). Praziquantel rapidly increases the permeability of helminth cell membranes for Ca ²⁺ , which in turn leads to generalized muscle contraction, which becomes permanent paralysis and leads to death. In addition, the drug causes vacuolization and subsequent damage to the worm’s tegument, which makes the parasites vulnerable to the host’s immune system and its digestive enzymes.

Для эффективного лечения инвазий, вызванных Opisthorchis felineus, а также близких видов печеночных сосальщиков (Opisthorchis viverrini и Clonorchis sinensis) приходится применять большие дозы препарата - 45-70 мг на 1 кг веса пациента, то есть до ~6 г препарата в сутки. Вследствие этого, велика вероятность возникновения нежелательных побочных явлений - тошноты, рвоты, боли в животе, диареи с примесью крови, головокружения, головной боли, сонливости, заторможенности, дезориентации, повышенной потливости, лихорадки, аллергических реакций (кожные высыпания, зуд). Однако при снижении дозы (в связи с противопоказаниями) снижается и антипаразитарная эффективность празиквантела: 40 мг/кг - 80%; 25 мг/кг - 60% (1. Удилов B.C. Борзунов В.М., Солдатов Д.А. Оценка эффективности антипаразитарной терапии при суперинвазии Opisthorchis felineus. Здоровье населения и среда обитания. 2013,9(246):40-42).For the effective treatment of invasions caused by Opisthorchis felineus, as well as related types of liver flukes (Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis), large doses of the drug have to be used - 45-70 mg per 1 kg of patient weight, i.e. up to ~ 6 g of the drug per day. As a result, undesirable side effects are very likely - nausea, vomiting, abdominal pain, diarrhea with an admixture of blood, dizziness, headache, drowsiness, lethargy, disorientation, excessive sweating, fever, allergic reactions (skin rashes, itching). However, when the dose is reduced (due to contraindications), the antiparasitic effectiveness of praziquantel decreases: 40 mg / kg - 80%; 25 mg / kg - 60% (1. Udilov B.C. Borzunov V.M., Soldatov D.A. Evaluation of the effectiveness of antiparasitic therapy for superinvasion of Opisthorchis felineus. Public health and environment. 2013.9 (246): 40-42).

Следует отметить, что празиквантел является основным лекарственным средством для лечения описторхоза у человека, вследствие этого весьма важно повысить безопасность и эффективность его применения. По нашему мнению, необходимо повышение его антигельминтной активности и снижение действующих доз.It should be noted that praziquantel is the main drug for the treatment of opisthorchiasis in humans, therefore it is very important to increase the safety and effectiveness of its use. In our opinion, it is necessary to increase its anthelmintic activity and reduce the current dose.

Аналогами нашего изобретения являются ряд патентов, описывающих получение и использование комбинированных препаратов, содержащих празиквантел и другие антигельминтные и вспомогательные вещества и предназначенные в основном для лечения с/х и домашних животных. Среди них: (2. Патент РФ 2417101 «Эндопаразитицидное средство» опубл. 27.04.2011 г., 3. Патент РФ 2100022 «Антигельминтное средство "азинокс плюс" опубл. 27.12.1997 г., 4. Патент РФ 2412700 - «Способ лечения паразитарных болезней водоплавающих птиц и лекарственное средство для его осуществления» опубл. 27.12.2011 г., 5. Патент РФ 2611387 «Способ получения противопаразитарного препарата пролонгированного действия для животных» опубл. 21.02.2017 г.и др.) В указанных документах отсутствуют сведения о повышении эффективности действия патентуемых препаратов против описторхоза и о возможности снижения его действующих доз.Analogs of our invention are a number of patents that describe the preparation and use of combined preparations containing praziquantel and other anthelmintic and auxiliary substances and intended mainly for the treatment of agricultural and domestic animals. Among them: (2. RF patent 2417101 "Endoparasiticidal agent" publ. 04/27/2011, 3. RF patent 2100022 "Anthelmintic agent" azinox plus "publ. 12/27/1997, 4. RF patent 2412700 -" Method of treatment parasitic diseases of waterfowl and a medicine for its implementation "published on 12/27/2011, 5. Patent of the Russian Federation 2611387" Method for producing an antiparasitic drug of prolonged action for animals "published on 02/21/2017, etc.) There is no information in these documents about increasing the effectiveness of patented drugs against opisthorchiasis and about in zmozhnosti reduce its current doses.

Ближайшим аналогом нашего изобретения, является (6. Патент РФ 2613490 «Композиция на основе R(-)-празиквантела для лечения и профилактики гельминтозов у теплокровных» опубл. 20.08.2016). Авторы изобретения включили в лекарственную композицию R(-)энантиомер празиквантеля вместо обычно используемой рацемической смеси. Кроме празиквантеля в состав композиции входили - другое антигельминтное средство пирантелапамоат, бета-циклодекстрин, наполнители и вспомогательные добавки. Препарат использовался в виде водно-масленой эмульсии. Учитывая, что именно R(-) изомер проявляет антигельминтную активность, удалось продемонстрировать повышенную антигельминтную активность препарата по празиквантелю при испытаниях на домашних животных. Недостатком заявляемого подхода является необходимость использования именно R(-)энантиомера празиквантеля. Это вещество существенно дороже субстанции празиквантеля, так как требует дополнительного разделения энантиомеров. Указанный энантиомер не зарегистрирован в качестве лекарственного средства, а разработанная авторами патента лекарственная форма (водно-масляная эмульсия) имеет недостатки в виде невысокой физико-химической стабильности при хранении. Кроме того, заявленная композиция не испытывалась на противоописторхозное действие, в последнем случае показанное на других гельминтозах повышение целевого действия против Opisthorchis felineus и Opisthorchis viverrini не очевидно.The closest analogue of our invention is (6. RF Patent 2613490 "Composition based on R (-) - praziquantel for the treatment and prevention of helminthiases in warm-blooded" publ. 08/20/2016). The inventors included the R (-) enantiomer of praziquantel in the drug composition in place of the commonly used racemic mixture. In addition to praziquantel, the composition included - another anthelmintic agent pyrantelapamoate, beta-cyclodextrin, fillers and auxiliary additives. The drug was used as an oil-in-water emulsion. Considering that it is the R (-) isomer that exhibits anthelmintic activity, it was possible to demonstrate increased anthelmintic activity of the drug according to praziquantel when tested in domestic animals. The disadvantage of the proposed approach is the need to use exactly the R (-) enantiomer of praziquantel. This substance is significantly more expensive than praziquantel substance, since it requires additional separation of enantiomers. The specified enantiomer is not registered as a medicine, and the dosage form developed by the authors of the patent (water-oil emulsion) has drawbacks in the form of low physical and chemical stability during storage. In addition, the claimed composition was not tested for antipisthorchiasis effect, in the latter case, the increase in the target action against Opisthorchis felineus and Opisthorchis viverrini shown on other helminthiases is not obvious.

Известно изобретение (7. Патент РФ 2545797 «Композиция на основе албендазола с противоописторхозной фармакологической активностью» опубл. 10.04.2017 г.) которое относится к композиции на основе албендазола и способу ее получения. Указанная композиция состоит из субстанции албендазола и полисахарида арабиногалактана из лиственницы сибирской или Гмелина при массовых соотношениях компонентов албендазол: арабиногалактан 1:5-20, Заявленная композиция обладает более высокой противоописторхозной активностью, чем албендазол, а также не вызывает токсического повреждения гепатоцитов. Суть изобретения состоит в составе композиции и способе ее получения. Разработанная композиция в водных растворах образует межмолекулярные комплексы типа гость-хозяин, за счет чего достигается повышенная водорастворимость албендазола и усиление его фармакологического действия.The invention is known (7. RF patent 2545797 "Composition based on albendazole with antipisthorchiasis pharmacological activity" publ. 04/10/2017) which relates to a composition based on albendazole and the method for its preparation. The specified composition consists of the substance albendazole and the polysaccharide of arabinogalactan from Siberian larch or Gmelin with mass ratios of the components of albendazole: arabinogalactan 1: 5-20, The claimed composition has a higher anti-opisthorchosis activity than albendazole, and also does not cause toxic damage to hepatocytes. The essence of the invention consists in the composition and the method for its preparation. The developed composition in aqueous solutions forms guest-host-type intermolecular complexes, due to which increased water solubility of albendazole and an increase in its pharmacological effect are achieved.

Известны также изобретения (8. Патенты РФ №2546535 «Противопаразитарное средство на основе альбендазола и способ его использования для лечения кишечных гельминтозов млекопитающих» опубл. 10.04.2015 г., 9. Патент РФ №2558922 «Антигельминтное средство и способ его получения» опубл. 10.08.2015 г., 10. Патент РФ №2588368 «Супрамолекулярный комплекс с никлозамидом и способ его получения» опубл. 27.06.2016 г..) в которых описано получение и испытания композиций антигельминтного действия на основе албендазола, фенбендазола и никлозамида с водорастворимыми полимерами природного и синтетического происхождения - арабиногалактаном, гидроксиэтилкрахмалом, поливинилпирролидоном, полиэтиленгликолем и т.д. Разработанные композиции в водных растворах также образует межмолекулярные комплексы малорастворимых антигельминтных веществ с используемыми полимерами типа гость-хозяин, за счет чего достигается их повышенная водорастворимость и усиление его антигельминтного действия (снижения действующих доз до 10 раз), изученного на широком спектре гельминтозов на лабораторных и с/х животных. Однако противоописторхозное действие полученных композиций не проверялось. Кроме того, использованные антигельминтные вещества - албендазол, фенбендазол, никлозамид - отличаются крайне малой растворимостью (1-5 мг/л) и, вследствие этого низкой биодоступностью. В следствие свой высокой липофильности их молекулы способны образовывать «прочные» комплексы включения типа гость-хозяин с гидрофильными полимерами, что обеспечивает многократное повышение (в 10¹-10² раз) растворимости действующих веществ и биологической доступности антигельминтной активности. В противоположность этому, молекулы празиквантеля менее липофильны, его водорастворимость составляет 0,2-0,3 г/л. Он хорошо абсорбируется в ЖКТ и его биодоступность составляет 75-100%. Наши предварительно проведенные исследования показали, что использованный в вышеописанных аналогах нашего изобретения феномен комплесообразования с гидрофильными полимерами оказался неэффективен для повышения растворимости ПЗК.Also known are inventions (8. Patents of the Russian Federation No. 2546535 "Antiparasitic agent based on albendazole and the method of its use for the treatment of intestinal helminthiasis in mammals" publ. 04/10/2015, 9. Patent of the Russian Federation No. 2558922 "Anthelmintic agent and method for its preparation" publ. August 10, 2015, 10. RF patent No. 2588368 "Supramolecular complex with niclosamide and method for its preparation" published on June 27, 2016 ..) which describe the preparation and testing of anthelmintic compositions based on albendazole, fenbendazole and niclosamide with water-soluble polymers etc native and synthetic origin - arabinogalactan, hydroxyethyl starch, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, etc. The developed compositions in aqueous solutions also form intermolecular complexes of sparingly soluble anthelmintic substances with used guest-host polymers, due to which their increased water solubility and enhancement of its anthelmintic effect (reduction of effective doses up to 10 times), studied on a wide range of helminthiases in laboratory and / x animals. However, the antipisthorchiasis effect of the obtained compositions was not tested. In addition, the anthelmintic substances used - albendazole, fenbendazole, and niclosamide - are characterized by extremely low solubility (1-5 mg / l) and, as a result, low bioavailability. Owing to their high lipophilicity, their molecules are able to form “strong” guest-host inclusion complexes with hydrophilic polymers, which provides a multiple increase (by 10 ¹ -10 ² times) of the solubility of active substances and the bioavailability of anthelmintic activity. In contrast, praziquantel molecules are less lipophilic, its water solubility is 0.2-0.3 g / L. It is well absorbed in the digestive tract and its bioavailability is 75-100%. Our preliminary studies showed that the complex formation phenomenon with hydrophilic polymers used in the above analogues of our invention was ineffective for increasing the solubility of PZK.

Известно также исследование (11. А.В. Душкин, Е.С. Метелева, Т.Г. Толстикова, М.В. Хвостов, М.П. Долгих, Г.А. Толстиков. Комплексирование фармаконов с глицирризиновой кислотой - путь создания лекарственных препаратов повышенной эффективности // Химия в интересах устойчивого развития. 2010. - Т. 18. №4 - С. 517-525.). В этой работе исследовались физико-химические свойства и фармакологическая активность комплексов малорастворимых лекарственных веществ из классов НПВС (ибупрофен, бутадион) и транквилизаторов (сибазона и азалептина) с растительным сапонином - глицирризиновой кислотой (ГК). Во всех случаях наблюдалось определенное повышении растворимости указанных соединений. Однако фармакологические испытания на лабораторных животных не дали объяснимых однородных результатов. Так, для композиций на основе ибупрофена и азалептина была показана возможность снижения их действующих доз при сохранении базовой активности препаратов. В то же время комплексирование бутадиона и сибазона не изменили их фармакологической активности. Аналогичные результаты были также продемонстрированы для комплексов ГК с нифедипином (гипотензивное средство), варфарином (антикоагулянт) ипропранололом (антиаритмическое средство). Где только в случае нифедипина и пропранолола было обнаружено значительное улучшение фармакологических свойств.A study is also known (11. A.V. Dushkin, E.S. Meteleva, T.G. Tolstikova, M.V. Khvostov, M.P. Dolgikh, G.A. Tolstikov. Combining pharmacons with glycyrrhizic acid is the way of creation high-efficiency drugs // Chemistry for Sustainable Development. 2010. - V. 18. No. 4 - S. 517-525.). In this work, we studied the physicochemical properties and pharmacological activity of complexes of sparingly soluble drugs from the classes of NSAIDs (ibuprofen, butadione) and tranquilizers (sibazon and azaleptin) with plant saponin - glycyrrhizic acid (HA). In all cases, a certain increase in the solubility of these compounds was observed. However, pharmacological tests in laboratory animals did not give explainable homogeneous results. So, for compositions based on ibuprofen and azaleptin, the possibility of lowering their effective doses while maintaining the basic activity of the drugs was shown. At the same time, the combination of butadione and sibazon did not change their pharmacological activity. Similar results were also demonstrated for complexes of HA with nifedipine (an antihypertensive agent), warfarin (an anticoagulant), ipropranolol (an antiarrhythmic agent). Where only in the case of nifedipine and propranolol a significant improvement in pharmacological properties was found.

В работах (12. Т.Г. Толстикова, И.В. Сорокина, А.О. Брызгалов, Г.И. Лифшиц, М.В. Хвостов. «Использование подхода комплексообразования с глицирризиновой кислотой для создания новых кардиотропных средств» Биомедицина, 2006, №4, С. 115-117.; 13. T.G. Tolstikova, А.О. Bryzgalov, I.V. Sorokina, M.V. Hvostov, A.S. Ratushnyak, T.A. Zapara, O.G. Simonova. Increase in Pharmacological activity of drugs in their clathrates with plant glycoside Lett. Drug.Des.Discov., 2007, V. 4, №3, 168-170.; 14. Т.Г. Толстикова, Г.И. Лифшиц, М.В. Хвостов, А.О. Брызгалов, И.В. Сорокина Комплексообразование в создании низкодозных Р-адреноблокаторов (экспериментальное исследование) Вестник НГУ, 2007, Т. 5, N.2, 70-73.; 15. T.G. Tolstikova, M.V. Khvostov, А.О. Bryzgalov, A.V. Dushkin, E.S. Meteleva Complex of nifedipine with Glycyrrhizic Acid as a novel water-soluble antihypertensive and antiarrhythmic agent Lett. Drug Des.Discov., 2009, V. 6, N 2, 155-158; 16. T.G. Tolstikova, M.V. Khvostov, A.O. Bryzgalov The Complexes of drugs with carbohydrate-containing plant metabolites as pharmacologically promising agents (обзор) Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2009, V. 9, N 11, pp 1317-1328; 17. A.B. Душкин, E.C. Метелева, Т.Г. Толстикова, М.В. Хвостов, М.П. Долгих, Г.А. Толстяков Комплексирование фармаконов с глицирризиновой кислотой путь создания лекарственных препаратов повышенной эффективности Химия в интересах устойчивого развития, 2010, Т. 18, №4, С. 517-525; 18. Т.Г. Толстикова, М.В. Хвостов, А.О. Брызгалов, А.В. Душкин Улучшение фармакологических свойств нифедипина путем механохимического комплексирования с глицирризиновой кислотой Биомедицинская химия, 2010, Т. 56, N 2, С. 187-194.; 19. Т.Г. Толстикова, М.В. Хвостов, А.О. Брызгалов, И.Ф. Беленичев, С.В. Павлов Глицидипин - перспективный гипотензивный и кардиопротективный агент Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 2011, V. 151, # 5, 532-535.; 20.T.G. Tolstikova, M.V. Khvostov, G.I. Lifshits, A.V. Dushkin, E.S. Meteleva Alteration of Warfarin's Pharmacologic Properties in Clathrates with Glycyrrhizic Acid and Arabinogalactan Lett. DrugDes.Discov., 2011, V. 8, N 3, 201-204) было показано, что ГК может использоваться для повышения растворимости и фармакологической активности малорастворимых ЛВ. Однако, направление изменения фармакологического действия таких комплексов не предсказуемо. Комплексы ГК с противогельминтными препаратами не синтезировались и не испытывались, следовательно, их действие в качестве антигельминтиков и в особенности против описторхоза, неизвестно. Кроме того, ГК как вспомогательное вещество имеет существенный недостаток, заключающий в «желируемости» ее растворов, что затрудняет их аналитический контроль и применение. В медицинской практике используются, как правило, не сама ГК, а ее соли с аммонием и щелочными металлами. Какие-либо данные о возможности комплексообразования этих солей с малорастворимыми ЛВ отсутствуют.In the works (12. T.G. Tolstikova, I.V. Sorokina, A.O. Bryzgalov, G.I. Lifshits, M.V. Khvostov. “Using the complexation approach with glycyrrhizic acid to create new cardiotropic drugs” Biomedicine, 2006, No. 4, pp. 115-117 .; 13. TG Tolstikova, A.O. Bryzgalov, IV Sorokina, MV Hvostov, AS Ratushnyak, TA Zapara, OG Simonova. Increase in Pharmacological activity of drugs in their clathrates with plant glycoside Lett. Drug.Des.Discov., 2007, V. 4, No. 3, 168-170 .; 14. T.G. Tolstikova, G.I. Lifshits, M.V. Khvostov, A.O. Bryzgalov, I .V. Sorokina Complexation in the creation of low-dose P-blockers (experimental study) Vestnik NSU, 20 07, T. 5, N.2, 70-73 .; 15. TG Tolstikova, MV Khvostov, A.O. Bryzgalov, AV Dushkin, ES Meteleva Complex of nifedipine with Glycyrrhizic Acid as a novel water-soluble antihypertensive and antiarrhythmic agent Lett. Drug Des.Discov., 2009, V. 6, N 2, 155-158; 16. TG Tolstikova, MV Khvostov, AO Bryzgalov The Complexes of drugs with carbohydrate-containing plant metabolites as pharmacologically promising agents (review) Mini- Reviews in Medicinal Chemistry, 2009, V. 9, N 11, pp 1317-1328; 17. A.B. Dushkin, E.C. Meteleva, T.G. Tolstikova, M.V. Khvostov, M.P. Dolgikh, G.A. Tolstyakov Integration of Pharmacons with Glycyrrhizic Acid A Way of Creating High-Efficiency Drugs Chemistry for Sustainable Development, 2010, Vol. 18, No. 4, P. 517-525; 18.T.G. Tolstikova, M.V. Khvostov, A.O. Bryzgalov, A.V. Dushkin Improving the pharmacological properties of nifedipine by mechanochemical complexing with glycyrrhizic acid Biomedical Chemistry, 2010, T. 56, No. 2, P. 187-194 .; 19.T.G. Tolstikova, M.V. Khvostov, A.O. Bryzgalov, I.F. Belenichev, S.V. Pavlov Glycidipine - a promising antihypertensive and cardioprotective agent Bull. Exp. Biol. Med., 2011, V. 151, # 5, 532-535 .; 20.T.G. Tolstikova, M.V. Khvostov, G.I. Lifshits, A.V. Dushkin, E.S. Meteleva Alteration of Warfarin's Pharmacologic Properties in Clathrates with Glycyrrhizic Acid and Arabinogalactan Lett. DrugDes.Discov., 2011, V. 8, N 3, 201-204), it was shown that HA can be used to increase the solubility and pharmacological activity of poorly soluble drugs. However, the direction of changes in the pharmacological action of such complexes is not predictable. Complexes of HA with anthelmintic drugs have not been synthesized and tested, therefore, their effect as anthelmintics and especially against opisthorchiasis is unknown. In addition, HA as an auxiliary substance has a significant drawback, which consists in the “gelability” of its solutions, which complicates their analytical control and use. In medical practice, as a rule, not the HA itself is used, but its salts with ammonium and alkali metals. There are no data on the possibility of complexation of these salts with sparingly soluble drugs.

В основу нашего изобретения положено получение и фармакологические исследования противоописторхозного действия механохимически полученных твердых композиций празиквантеля с натриевой солью ГК.The basis of our invention is the preparation and pharmacological studies of the anti-opisthorchoz action of mechanochemically obtained solid praziquantel compositions with the sodium salt of HA.

По сравнению с известными заявляемое техническое решение обладает новизной поскольку именно заявляемый состав композиции обеспечивает высокую противоописторхозную активность и пониженную токсичность.Compared with the known, the claimed technical solution has novelty since the claimed composition of the composition provides high anti-opisthorchiasis activity and reduced toxicity.

Проведенный патентный поиск позволил установить, что аналогичных составов композиций, обладающих повышенной фармакологической активностью и пониженным токсическим действием не обнаружено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».The patent search made it possible to establish that no similar compositions with increased pharmacological activity and reduced toxic effects were found, which allows us to conclude that the claimed technical solution meets the criterion of "inventive step".

Заявляемая порошкообразная композиция легко может смешиваться с равным количеством или избытком вспомогательных веществ из классов фармакологически нейтральных моно-, ди- и полисахаридов и растительных сапонинов для облегчения смачиваемости при суспендировании в водных растворах для последующего перорального приема.The inventive powder composition can easily be mixed with an equal amount or excess of excipients from the classes of pharmacologically neutral mono-, di- and polysaccharides and plant saponins to facilitate wettability when suspended in aqueous solutions for subsequent oral administration.

Задачей заявляемого технического решения является создание композиции на основе празиквантеля, которая может быть использована для эффективного лечения описторхоза felinea при пониженных дозировках действующего вещества без побочных токсических эффектов.The objective of the proposed technical solution is to create a composition based on praziquantel, which can be used to effectively treat opisthorchiasis felinea at reduced dosages of the active substance without toxic side effects.

Поставленная задача решается благодаря тому, что композиция включает комплекс празиквантеля и натриевой соли растительного сапонина-глициризиновой кислоты при массовых соотношениях компонентов празиквантел : натриевая соль глициризиновой кислоты, соответственно, 1:5-20, полученный путем совместной механоактивации смеси порошкообразных исходных компонентов.The problem is solved due to the fact that the composition includes a complex of praziquantel and the sodium salt of vegetable saponin-glycyrrhizic acid with mass ratios of the components of praziquantel: sodium salt of glycyrrhizic acid, respectively, 1: 5-20, obtained by joint mechanical activation of a mixture of powdered starting components.

Глицирризиновая кислота (ГК), структурная формула которой изображена на Фиг. 2, - хорошо растворимый растительный сапонин, который экстрагируется из корня солодки. ГК является конъюгатом двух молекул глюкуроновой кислоты и молекулы глицирретовой кислоты и способна к самоассоциации в водных растворах по причине своих амфифильных свойств. В широком диапазоне концентраций она образует мицеллы с молекулярной массой 50-100 кДа. ГК обладает определенным спектром биологической активности и оказывает противовирусное, противовоспалительное и даже противоопухолевое действие. Также используется в качестве подсластителя в пищевой промышленности. ГК способна образовывать нековалентные межмолекулярные комплексы с молекулами лекарственных веществ, либо включать их в супрамолекулярные образования - мицеллы. Это в ряде случаев позволяет повысить водорастворимость малорастворимых ЛВ, увеличить их биодоступность и усилить фармакологическое действие. В этом случае ГК не выступает как терапевтический агент, а только как вспомогательное вещество - средство доставки. В литературе отсутствует информация о ее токсичности при таком использовании. Недостатком ГК при ее применении в качестве вспомогательного вещества является образование желеобразных не текучих растворов, что затрудняет технологические и аналитические процедуры. В нашем изобретении вместо ГК мы впервые использовали ее двунатриевую соль Na₂ГК. Это вещество также формирует мицеллы при растворении, хорошо растворяется, образуя маловязкие растворы, при этом не происходит их «желирование». Возможно также применение всего спектра натриевых и калиевых солей ГК с различными степенями замещения.Glycyrrhizic acid (HA), the structural formula of which is depicted in FIG. 2, - a well soluble plant saponin, which is extracted from licorice root. HA is a conjugate of two molecules of glucuronic acid and a glycyrrhetic acid molecule and is capable of self-association in aqueous solutions due to its amphiphilic properties. In a wide range of concentrations, it forms micelles with a molecular weight of 50-100 kDa. HA has a certain spectrum of biological activity and has an antiviral, anti-inflammatory and even antitumor effect. Also used as a sweetener in the food industry. HA is able to form non-covalent intermolecular complexes with molecules of drugs, or to include them in supramolecular formations - micelles. In some cases, this makes it possible to increase the water solubility of sparingly soluble drugs, increase their bioavailability, and enhance the pharmacological effect. In this case, HA does not act as a therapeutic agent, but only as an auxiliary substance - a delivery vehicle. In the literature there is no information about its toxicity with such use. The disadvantage of HA when it is used as an auxiliary substance is the formation of gel-like non-fluid solutions, which complicates the technological and analytical procedures. In our invention, instead of HA, we first used its disodium salt Na ₂ HA. This substance also forms micelles upon dissolution, dissolves well, forming low-viscosity solutions, while their "gelation" does not occur. It is also possible to use the entire spectrum of sodium and potassium salts of HA with various degrees of substitution.

Целесообразность использования массовых соотношений празиквантеля и Na₂ГКот 1:5 до 1:20 обусловлена следующим:The feasibility of using mass ratios of praziquantel and Na ₂ GKot 1: 5 to 1:20 due to the following:

- при увеличении относительного содержания празиквантеля (>1:5) в композиции, достигаемое увеличение растворимости за счет образования водорастворимых комплексов недостаточно для усиления биологической активности;- with an increase in the relative content of praziquantel (> 1: 5) in the composition, the achieved increase in solubility due to the formation of water-soluble complexes is insufficient to enhance biological activity;

- при понижении относительного содержания празиквантеля (<1:20) -композиция оказывается «перегружена» вспомогательным веществом(Na₂ГК), что приводит к нежелательному увеличению массы препарата, а также к увеличению его себестоимости.- with a decrease in the relative content of praziquantel (<1:20), the composition is “overloaded” with an auxiliary substance (Na ₂ HA), which leads to an undesirable increase in the mass of the drug, as well as to an increase in its cost.

Для получения композиции используют механохимический подход, заключающийся в обработке смеси твердых компонентов интенсивными механическими воздействиями - давлением и сдвиговыми деформациями, реализуемыми преимущественно в мельницах различного типа, осуществляющих ударно-истирающие воздействия на вещества. В нашем случае смесь субстанций празиквантеля и Na₂ГК подвергается механической обработке в шаровых мельницах. Однако можно использовать мельницы других конструкции, как и выбирать другие формы мелющих тел. При растворении в водных растворах полученных композиций, молекулы действующего вещества (ПЗК) включаются в мицеллы, образованные Na₂ГК и ГК, образовавшейся в результате гидролиза натриевой соли. При этом происходит увеличение растворимости ПЗК, а также снижение вращательной диффузионной подвижности его молекул за счет их «присоединения» к высокомолекулярным структурам - мицеллам. Снижение подвижности отражается в укорочении времен спин-спиновой релаксации протонов ПЗК в спектрах ¹Н ЯМР водных растворах. Именно факторы увеличения растворимости и сокращение времени спин-спиновой релаксации доказывают включение молекул ПЗК в высокомолекулярные супрамолекулярные образования - комплексы, мицеллы - что, по нашему мнению, должно способствовать ускорению его абсорбции в ЖКТ из твердой лекарственной формы, тем самым усиливая противоописторхозное действие. Необходимо отметить, что наше предположение об увеличении фармакологической активности не является очевидным, так как биодоступность ПЗК, по литературным данным составляет 75-100%, то есть практически вся доза препарата всасывается в ЖКТ без необходимости увеличения его растворимости. Таким образом, в качестве количественных критериев условий механохимической обработки нами были выбраны показатели увеличения растворимости и сокращения времен спин-спиновой релаксации протонов ПЗК.To obtain the composition, a mechanochemical approach is used, which consists in processing a mixture of solid components by intense mechanical stresses - pressure and shear deformations, which are realized mainly in mills of various types that carry out shock-abrasive effects on substances. In our case, the mixture of praziquantel and Na ₂ HA substances is subjected to mechanical treatment in ball mills. However, you can use mills of other designs, as well as choose other forms of grinding media. When dissolved in aqueous solutions of the resulting compositions, the molecules of the active substance (PZK) are included in the micelles formed by Na ₂ HA and HA formed as a result of hydrolysis of the sodium salt. In this case, there is an increase in the solubility of PZK, as well as a decrease in the rotational diffusion mobility of its molecules due to their "attachment" to high molecular structures - micelles. The decrease in mobility is reflected in the shortening of the times of spin-spin relaxation of SAC protons in the spectra of ¹ H NMR aqueous solutions. It is the factors of increased solubility and a reduction in spin-spin relaxation time that prove the inclusion of PZK molecules in high molecular weight supramolecular formations - complexes, micelles - which, in our opinion, should help accelerate its absorption in the gastrointestinal tract from a solid dosage form, thereby enhancing the antipisthorchiasis effect. It should be noted that our assumption of an increase in pharmacological activity is not obvious, since the bioavailability of PZK, according to published data, is 75-100%, that is, almost the entire dose of the drug is absorbed into the digestive tract without the need to increase its solubility. Thus, as quantitative criteria for the conditions of mechanochemical processing, we selected indicators of an increase in solubility and a decrease in the times of spin-spin relaxation of SAC protons.

Техническим результатом нашего изобретения является получение композиции на основе празиквантеля с усиленным противоописторхозным действием и пониженной токсичностью.The technical result of our invention is to obtain a composition based on praziquantel with enhanced antipisthorchiasis action and reduced toxicity.

Предлагаемое техническое решение иллюстрируется нижеследующими примерами его применения.The proposed technical solution is illustrated by the following examples of its application.

Пример 1. Получение и физико-химические свойства композиций.Example 1. Obtaining and physico-chemical properties of the compositions.

Смеси субстанций празиквантеля с Na₂ГК, взятые в весовых соотношениях 1:5, 1:10 и 1:20 были подвергнуты обработке ударно-истирающими воздействиями в шаровой ротационной/валковой мельнице ВМ-1, в течение 2-24 часов (механическая активация). Затем были определены водорастворимость празиквантеля и измерены времена спин-спиновой релаксации его протонов в водных растворах исходной субстанции и полученных комплексов. Для исследования водорастворимости, 0,6 г навески исследуемого материала суспендировали в 10 мл дистиллированной воды при +25°С на орбитальном шейкере (170об/мин) в течение 4 часов. Концентрация празиквантеля в растворе определялась хроматографированием на хроматографе Agilent 1200 (колонка ZorbaxEclipseXDB-C18, 4.6×50 мм; температура колонки 30°С, элюент - система ацетонитрил/вода 1/1, скорость потока 1 мл/мин., объем пробы 5 мкл, детектирование на длинах волн 230,8 и 290,8 нм) относительно приготовленных калибровочных образцов спиртовых растворов.Mixtures of praziquantel substances with Na ₂ HA, taken in weight ratios of 1: 5, 1:10 and 1:20, were subjected to shock-abrasion treatment in a ball-mill / roller mill VM-1, for 2-24 hours (mechanical activation) . Then, the water solubility of praziquantel was determined and the times of spin-spin relaxation of its protons in aqueous solutions of the starting substance and the resulting complexes were measured. To study water solubility, 0.6 g of a sample of the test material was suspended in 10 ml of distilled water at + 25 ° C on an orbital shaker (170 rpm) for 4 hours. The praziquantel concentration in the solution was determined by chromatography on an Agilent 1200 chromatograph (ZorbaxEclipseXDB-C18 column, 4.6 × 50 mm; column temperature 30 ° C, eluent — acetonitrile / water system 1/1, flow rate 1 ml / min., Sample volume 5 μl, detection at wavelengths of 230.8 and 290.8 nm) relative to the prepared calibration samples of alcohol solutions.

¹Н ЯМР спектры растворов празиквантеля и его комплексов регистрировались в растворах D20 на спектрометре Avance III 500 MHz (Bruker, Германия). Измерение времен спин-спиновой релаксации Т2 проводилось с использованием стандартной последовательности Кара-Парсела-Мебума-Гилла (CPMG). Растворы готовились путем перемешивания на магнитной мешалке в течение 1 часа при комнатной температуре. Времена спин-спиновой релаксации измерялись при одинаковой концентрации Na2ГК=5 мМ, при Т=30 С.Полученные физико-химические данные композиций приведены в Таблице 1. ¹ H NMR spectra of solutions of praziquantel and its complexes were recorded in D20 solutions on an Avance III 500 MHz spectrometer (Bruker, Germany). The spin-spin relaxation times T2 were measured using the standard Kara-Parsel-Mebum-Gill sequence (CPMG). The solutions were prepared by stirring on a magnetic stirrer for 1 hour at room temperature. Spin-spin relaxation times were measured at the same concentration of Na2HK = 5 mM, at T = 30 ° C. The obtained physicochemical data of the compositions are shown in Table 1.

м/а - механически активированнаяm / a - mechanically activated

Во всех случаях имеет место увеличение водорастворимости празиквантеля из механохимически полученных композиций с Na2ГК, по сравнению с исходной субстанцией до~2,4-3,5 раз. Эти характеристики композиций доказывают образование межмолекулярных ассоциатов молекул празиквантеляи Na₂ГК в водных растворах, которые и обеспечивают противоописторхозное действие заявляемых композиций, (см. пример реализации 2).In all cases, there is an increase in the water solubility of praziquantel from mechanochemically prepared compositions with Na2HA, up to ~ 2.4-3.5 times in comparison with the initial substance. These characteristics of the compositions prove the formation of intermolecular associates of praziquantel and Na ₂ HA molecules in aqueous solutions, which provide the anti-opisthorchosis effect of the claimed compositions (see implementation example 2).

Образование ассоциатов празиквантела с динатриевой солью глицирризиновой кислоты (Na₂ГК) в водных растворах подтверждено методом динамического 1Н ЯМР по уменьшению времени спин-спиновой релаксации протонов празиквантела в присутствие Na₂ГК (Таблица 1) не менее, чем в 1,7 раза. Наблюдаемое время релаксации зависит от концентрации комплекса. Увеличение концентрации комплекса до 7 мМ (по ГК) приводит к сокращению времени спин-спиновой релаксации более, чем в 10 раз по сравнению с исходной субстанцией празиквантеля.The formation of associates of praziquantel with the disodium salt of glycyrrhizic acid (Na ₂ HA) in aqueous solutions was confirmed by dynamic 1H NMR to reduce the spin-spin relaxation time of protons of praziquantel in the presence of Na ₂ HA (Table 1) by no less than 1.7 times. The observed relaxation time depends on the concentration of the complex. An increase in the complex concentration to 7 mM (according to the HA) leads to a decrease in the spin-spin relaxation time by more than 10 times compared with the initial praziquantel substance.

Интересно отметить, что повышение растворимости, а также сокращение времен релаксации Т2 также наблюдается в растворах не обработанных смесей ПЗК и Na₂ГК, что также указывает на их комплексирование в водных растворах. Однако прочность таких комплексов существенно ниже, если судить по разнице величин, приведенных в Таблице 1. Это указывает на эффективность механохимичсекого пути заявляемых композиций.It is interesting to note that an increase in solubility, as well as a decrease in T2 relaxation times, are also observed in solutions of untreated mixtures of PZK and Na ₂ HA, which also indicates their complexation in aqueous solutions. However, the strength of such complexes is significantly lower, judging by the difference in the values given in Table 1. This indicates the effectiveness of the mechanochemical path of the claimed compositions.

Пример 2. Исследование противоописторхозной активности in vitro Проведено сравнительное тестирование ПЗК, глицирризината натрия и заявляемого комплекса ПЗК с глицирризинатом натрия (ПЗК: Na₂ГК, 1:10).Тестирование препаратов ПЗК, Na₂ГК и комплекса ПЗК: Na₂ГК (1:10) проводили на живых интактных паразитах Opisthorchis felineus, добавляя исследуемые препараты в инкубационную среду и оценивая их эффективность в течение 24 часов. Жизнеспособность паразитов определяли по степени их подвижности (21. Keiser J., Manneck Т., Vargas М. Interactions of mefloquine with praziquantel in the Schistosoma mansoni mouse model and in vitro. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2011. doi:10.1093/jac/dkri78.). Кроме того, использовали морфологические методы оценки. Для вычисления IC₅₀ каждого вещества использовали не менее 4 концентраций. Для каждой концентрации использовали по 6-10 взрослых марит Opisthorchis felineus. Опыт повторяли не менее 2 раз. Значения IC₅₀ вычисляли с помощью программы CompuSyn (22. Chou ТС and Martin N. CompuSyn for Drug Combinations: PC Software and User's Guide: A Computer Program for Quantitation of Synergism and Antagonism in Drug Combinations, and the Determination of IC50and ED50 and LD50 Values, ComboSynlnc, Paramus, (NJ), 2005).Example 2. In vitro study of anti-opisthorchiasis activity Comparative testing of PZK, sodium glycyrrhizinate and the inventive PZK complex with sodium glycyrrhizinate (PZK: Na ₂ HA, 1:10). Testing of preparations of PZK, Na ₂ HA and complex of PZK: Na ₂ HA (1 : 10) was carried out on live intact parasites of Opisthorchis felineus, adding the studied drugs to the incubation medium and evaluating their effectiveness for 24 hours. Viability of parasites was determined by the degree of their mobility (21. Keiser J., Manneck T., Vargas M. Interactions of mefloquine with praziquantel in the Schistosoma mansoni mouse model and in vitro. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2011. doi: 10.1093 / jac / dkri78 .). In addition, morphological assessment methods were used. At least 4 concentrations were used to calculate the IC _{50 of} each substance. For each concentration, 6-10 adult marrows of Opisthorchis felineus were used. The experiment was repeated at least 2 times. IC ₅₀ values were calculated using the CompuSyn program (22. Chou TC and Martin N. CompuSyn for Drug Combinations: PC Software and User's Guide: A Computer Program for Quantitation of Synergism and Antagonism in Drug Combinations, and the Determination of IC50and ED50 and LD50 Values , ComboSynlnc, Paramus, (NJ), 2005).

Глицирризинат натрия не влиял на подвижность взрослых паразитов (IС₅₀=12899 мкг/мл), не изменял их форму, цвет и перистальтику кишечника (Фиг. 3а). Празиквантел дозозависимо угнетал двигательную активность, приводил к изменению формы паразитов (укорачивание и «складывание пополам»), начиная с первой минуты после добавления препарата (Фиг. 3б). Подобный эффект оказывал и комплекс ПЗК: Na₂ГК. При этом черви принимали вытянутую форму, сворачивались, становились малоподвижными или полностью неподвижными, в зависимости от концентрации комплекса (Фиг. 3в).Sodium glycyrrhizinate did not affect the mobility of adult parasites (IC ₅₀ = 12899 μg / ml), did not change their shape, color and intestinal motility (Fig. 3a). Praziquantel dose-dependently suppressed motor activity, led to a change in the shape of parasites (shortening and “folding in half”), starting from the first minute after adding the drug (Fig. 3b). A similar effect was exerted by the complex of PZK: Na ₂ HA. In this case, the worms took an elongated shape, curled up, became inactive or completely motionless, depending on the concentration of the complex (Fig. 3c).

Зависимость ингибирующего действия на подвижность марит Opisthorchis felineus препаратов ПЗК, Na₂ГК и комплекса ПЗК: Na₂ГК (1:10) от их концентрации.The dependence of the inhibitory effect on motility marrows Opisthorchis felineus of preparations of PZK, Na ₂ GK and a complex of PZK: Na ₂ GK (1:10) on their concentration.

На Фиг. 4 показана зависимость ингибирующего действия на подвижность марит Opisthorchis felineus препаратов ПЗК, Na₂ГК и комплекса ПЗК: Na₂ГК (1:10) от их концентрации.In FIG. Figure 4 shows the dependence of the inhibitory effect on the mobility of marrows Opisthorchis felineus of preparations of PZK, Na ₂ GK and the complex of PZK: Na ₂ GK (1:10) on their concentration.

Эффективность комплекса существенно не отличалась от эффективности ПЗК (см. Фиг. 4). Действие обоих препаратов выражалось в длительном угнетении подвижности паразитов (не менее 24 ч) и снижении их жизнеспособности в дальнейшем. Полуэффективная концентрация (IC₅₀), приводящая к угнетению подвижности червей на 50%, для комплекса была равна 1.4 мкг/мл, а для ПЗК - 0.291 мкг/мл (Фиг. 4), то есть эффективность комплекса в 4.8 раза меньше. Однако при пересчете на концентрацию действующего вещества (празиквантела), входящего в состав комплекса, полуэффективная концентрация равна 0.127 мкг/мл. Таким образом, можно утверждать, что эффективность ПЗК, применяемого в комплексе с глицирризинатом натрия (1:10) более чем в 2 раза превышает эффективность «чистого» ПЗК.The effectiveness of the complex did not differ significantly from the effectiveness of the PZK (see Fig. 4). The action of both drugs was expressed in prolonged inhibition of parasite mobility (at least 24 hours) and a decrease in their viability in the future. The semi-effective concentration (IC ₅₀ ), which leads to inhibition of worm motility by 50%, was 1.4 μg / ml for the complex, and 0.291 μg / ml for PZK (Fig. 4), that is, the complex’s efficiency is 4.8 times lower. However, when converted to the concentration of the active substance (praziquantel), which is part of the complex, the semi-effective concentration is 0.127 μg / ml. Thus, it can be argued that the effectiveness of PZK used in combination with sodium glycyrrhizinate (1:10) is more than 2 times higher than the efficiency of “pure” PZK.

Пример 3. Исследование противоописторхозной активности in vivo.Example 3. The study of antipisthorchiasis activity in vivo.

Инфицирование хомячков (100 метацеркарий на животное) осуществляли перорально. На стадии хронического описторхоза (через 3 мес после инфицирования) животных разделили на три группы (в каждой по 8 хомячков) и однократно вводили: 1) 400 мг/кг ПЗК, разведенный в 10% твине 80; 2) 400 мг/кг комплекса ПЗК: Na₂ГК (1:10), разведенный на питьевой воде; 3) растворитель - 10% твин 80. Доза препарата была выбрана из предварительных исследований (23. Pakharukova M.Y., Shilov A.G., Pirozhkova D.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A. The first comprehensive study of praziquantel effects in vivo and in vitro on European liver fluke Opisthorchis felineus (Trematoda). Int. J. Antimicrob. Agents. 2015, 46(1):94-100). Через месяц после введения препаратов оценивали эффекты: количество червей в желчных протоках печени и относительную массу печени и селезенки, биохимические параметры, клеточный состав крови, костномозговой гемопоэз, а также ежемесячно контролировали динамику веса хомячков (см. Фиг. 2-4, Таблицу 3).Hamster infection (100 metacercariae per animal) was administered orally. At the stage of chronic opisthorchiasis (3 months after infection), the animals were divided into three groups (8 hamsters each) and were administered once: 1) 400 mg / kg of PZK diluted in 10% Tween 80; 2) 400 mg / kg of PZK complex: Na ₂ HA (1:10), diluted in drinking water; 3) solvent - 10% tween 80. The dose of the drug was selected from preliminary studies (23. Pakharukova MY, Shilov AG, Pirozhkova DS, Katokhin AV, Mordvinov VA The first comprehensive study of praziquantel effects in vivo and in vitro on European liver fluke Opisthorchis felineus (Trematoda). Int. J. Antimicrob. Agents. 2015, 46 (1): 94-100). A month after the administration of the drugs, the effects were evaluated: the number of worms in the bile ducts of the liver and the relative mass of the liver and spleen, biochemical parameters, the cellular composition of the blood, bone marrow hematopoiesis, and the dynamics of the weight of hamsters was monitored monthly (see Fig. 2-4, Table 3) .

Клеточный состав крови хомячков оценивали с помощью гематологического анализатора РСЕ-90 (ERMAInc, Япония). Относительное количество форменных элементов крови подсчитывали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, затем рассчитывали их абсолютную численность.The hamster blood cell composition was evaluated using a PCE-90 hematology analyzer (ERMAInc, Japan). The relative amount of blood cells was counted in smears stained according to Romanovsky-Giemsa, then their absolute number was calculated.

Для гемопоэтического анализа костный мозг животных вымывали из бедренной кости средой для культуральных исследований RPMI1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки. Подсчитывали количество клеток костного мозга в 1 мл среды с помощью гематологического анализатора. Для определения числа коммитированных (запрограммированных на определенный путь дифференцировки) предшественников клетки костного мозга в концентрации 2,0×10⁴/мл инкубировали в метилцеллюлозной среде М3434 (StemCellTechnology, Canada), содержащей цитокины - фактор стволовых клеток (SCF), эритропоэтин (ЕРО), интерлейкин-3, интерлейкин-6. Гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ГМ), эритроидные (БОЕ-Э, КОЕ-Э), гранулоцитарно-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарные (КОЕ-ГЭММ) колонии подсчитывали под инвертированным микроскопом после 14-дневной инкубации при температуре 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂.For hematopoietic analysis, the bone marrow of the animals was washed from the femur with RPMI1640 culture medium containing 10% fetal calf serum. The number of bone marrow cells in 1 ml of medium was counted using a hematological analyzer. To determine the number of committed (programmed for a specific differentiation pathway) precursors, bone marrow cells at a concentration of 2.0 × 10 ⁴ / ml were incubated in M3434 methylcellulose medium (StemCellTechnology, Canada) containing cytokines - stem cell factor (SCF), erythropoietin (EPO) , interleukin-3, interleukin-6. Granulocyte-macrophage (CFU-GM), erythroid (PFU-E, CFU-E), granulocyte-erythroid-macrophage-megakaryocyte (CFU-GEM) colonies were counted under an inverted microscope after 14-day incubation at 37 ° C in humid atmosphere containing 5% CO ₂ .

При биохимическом анализе с помощью стандартных наборов реактивов («Biocon») в сыворотке крови определяли активность ферментов аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), содержание глюкозы, общего белка, холестерина и малонового диальдегида (МДА). Активность каталазы определяли в реакции с молибдатом аммония против стандарта (каталаза печени быка 38,08 ед/мл, «ICN Biomedicals))). Измерения были выполнены на биохимическом полуавтоматическом анализаторе «Фотометр-5010» («Boehringer Mannheim», Germany).During biochemical analysis using standard reagent kits ("Biocon") in the blood serum, the activity of the enzymes alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (ACT), glucose, total protein, cholesterol and malondialdehyde (MDA) were determined. Catalase activity was determined by reaction with ammonium molybdate against the standard (bovine liver catalase 38.08 u / ml, ICN Biomedicals)). The measurements were performed on a semi-automatic analyzer "Photometer-5010" ("Boehringer Mannheim", Germany).

Показано, что комплекс ПЗК: Na₂ГК, в котором содержание празиквантела было приблизительно 36 мг/кг оказывал сопоставимый с ПЗК (400 мг/кг) излечивающий от описторхоза эффект на животных (р<0.001 - для обоих веществ) (См. Фиг. 2). В обоих случаях полностью излечить животных от описторхоза не удалось: 2.9±1.23 червей после ПЗК и 8.0±1.78 червей после комплекса выжило. Однако высокая эффективность действия заявляемого мицеллярного комплекса ПЗК: Na₂ГК (1:10) на выживаемость червей in vivo говорит о том, что данный комплекс может быть использован для лечения описторхозной инвазии Opisthorchis felineus.It was shown that the PZK: Na ₂ HA complex, in which the praziquantel content was approximately 36 mg / kg, exerted a curing effect on opisthorchiasis in animals comparable to PZK (400 mg / kg) (p <0.001 for both substances) (See Fig. 2). In both cases, the animals could not be completely cured of opisthorchiasis: 2.9 ± 1.23 worms after PZK and 8.0 ± 1.78 worms survived after the complex. However, the high efficiency of the claimed micellar complex of PZK: Na ₂ HA (1:10) on the survival of worms in vivo suggests that this complex can be used to treat opisthorchiasis invasion of Opisthorchis felineus.

Обнаружено, что комплекс не влиял на относительную массу печени, в отличие от празиквантела, на фоне которого масса печени снижалась, что можно объяснить меньшим содержанием оставшихся червей в печени после лечения и, соответственно, лучшим желчеотделением (см Фиг. 3). В то же время, и празиквантел, и новый комплекс не изменяли относительную массу основного периферического органа иммунной системы - селезенки. Таким образом, можно предположить, что новый комплекс, содержащий 36 мг/кг празиквантела, не оказывает заметного негативного влияния на функции печени и селезенки.It was found that the complex did not affect the relative mass of the liver, unlike praziquantel, against which the mass of the liver decreased, which can be explained by the lower content of the remaining worms in the liver after treatment and, accordingly, better bile secretion (see Fig. 3). At the same time, both praziquantel and the new complex did not change the relative mass of the main peripheral organ of the immune system - the spleen. Thus, it can be assumed that the new complex containing 36 mg / kg praziquantel does not have a noticeable negative effect on the functions of the liver and spleen.

Новый мицеллярный комплекс ПЗК:Na₂ГК (1:10), также как и ПЗК, не оказывал негативного влияния на такой физиологический показатель, как прирост массы тела. Животные всех трех сравниваемых групп хомячков одинаково набирали массу тела и имели статистически значимое увеличение этого параметра в конце эксперимента относительно результатов первого месяца. Таким образом, мицеллярный комплекс ПЗК:Na₂ГК (1:10), наравне с ПЗК, не ухудшает видимого физиологического состояния инфицированных хомячков, оцениваемого по массе тела.The new micellar complex of PZK: Na ₂ HA (1:10), as well as PZK, did not adversely affect such a physiological indicator as weight gain. Animals of all three compared groups of hamsters equally gained body weight and had a statistically significant increase in this parameter at the end of the experiment relative to the results of the first month. Thus, the micellar complex of PZK: Na ₂ HA (1:10), along with PZK, does not worsen the visible physiological state of infected hamsters, estimated by body weight.

Результатами исследования гемопоэтической активности показано снижение численности всех колониеобразующих клеток костного мозга после введения инфицированным хомячкам мицеллярного комплекса ПЗК:Na₂ГК (1:10). Действие комплекса было более эффективным, чем действие ПЗК, который оказал аналогичное влияние по двум из четырех оцениваемых параметров. Регуляция кроветворения зависит от многих внешних и внутренних факторов. Инфекционные заболевания, сопровождающиеся воспалительными процессами в организме, стимулируют пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток (24., King K.Y., Goodell М.А. Inflammatory modulation of HSCs: viewing the HSC as a foundation for the immune response. Nature. 2011, 11:685-692). Для хомячков, инфицированных Opisthorchis felineus, это было показано на сроке 2-недельного заражения (25.Avgustinovich D.F., Orlovskaya I.A., Toporkova L.B., Vishnivetskaya G.B., Katokhin A.V., Lvova M.N., Kashina E.V., Bondar N.P., Feofanova N.A., Mordvinov V.A. Experimental opisthorchiasis: study of blood cell composition, hematopoiesis, and startle reflex in laboratory animals. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 2017, 7:82-92). Однако, в приведенной работе не исследовались терапевтические эффекты празиквантела и, тем более, нового мицеллярного комплекса. Таким образом, впервые установлено снижение гемопоэза, отражающее, возможно, подавление воспаления у О. felineus-инфицированных хомячков на фоне антигельминтных препаратов. Причем новый комплекс ПЗК:Na₂ГК (1:10) был более эффективным.The results of a study of hematopoietic activity showed a decrease in the number of all colony-forming bone marrow cells after the introduction of infected hamsters to the micellar complex of PZK: Na ₂ HA (1:10). The action of the complex was more effective than the action of PZK, which had a similar effect in two of the four evaluated parameters. The regulation of hematopoiesis depends on many external and internal factors. Infectious diseases accompanied by inflammatory processes in the body stimulate the proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells (24., King KY, Goodell M.A. Inflammatory modulation of HSCs: viewing the HSC as a foundation for the immune response. Nature. 2011, 11: 685-692). For hamsters infected with Opisthorchis felineus, this was shown at 2 weeks of infection (25. Avgustinovich DF, Orlovskaya IA, Toporkova LB, Vishnivetskaya GB, Katokhin AV, Lvova MN, Kashina EV, Bondar NP, Feofanova NA, Mordvinov VA Experimental opistchias : study of blood cell composition, hematopoiesis, and startle reflex in laboratory animals. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 2017, 7: 82-92). However, in the cited work, the therapeutic effects of praziquantel and, especially, of the new micellar complex were not investigated. Thus, a decrease in hematopoiesis was first established, reflecting, possibly, suppression of inflammation in O. felineus-infected hamsters against the background of anthelmintic drugs. Moreover, the new complex of PZK: Na ₂ HA (1:10) was more effective.

Результаты оценки клеточного состава крови установили сравнимое действие празиквантела и комплекса ПЗК:Na₂ГК (1:10) на такие показатели, как абсолютное число эритроцитов и гематокрит. Оба препарата увеличивали эти показатели. При этом они снижали абсолютное число тромбоцитов, более выраженно оказывал эффект празиквантел. Комплекс ПЗК:Na₂ГК (1:10), содержание ПЗК в котором было в 11 раз меньше, оказывал эффект на уровне тенденции. Учитывая то, что при описторхозе черви могут питаться кровью млекопитающих, переводя гемоглобин в пигмент гемозоин (26. Lvova M.N., Zhukova M.V., Kiseleva E.V., Mayboroda O.A., Hensbergen P., Kizilova E.A., Besprozvannykh V.V., Sripa В., Katokhin A.V., Mordvinov V.A. Hemozoin is a product of heme detoxification in the gut of the most medically important species of the family Opisthorchiidae. Int. J. Parasitology. 2016, 46:147-156), а также то, что при инфекционных заболеваниях повышается абсолютное число тромбоцитов, может сделать заключение, что получены лечебные эффекты мицеллярного комплекса на некоторые показатели крови, сравнимые с действием лекарства - празиквантелем.The results of evaluating the cellular composition of the blood established a comparable effect of praziquantel and the complex of PZK: Na ₂ HA (1:10) on such indicators as the absolute number of red blood cells and hematocrit. Both drugs increased these rates. Moreover, they reduced the absolute number of platelets, more pronounced had the effect of praziquantel. The PZK complex: Na ₂ HA (1:10), the content of PZK in which was 11 times lower, had an effect at the level of the trend. Given that opisthorchiasis, worms can feed on the blood of mammals, converting hemoglobin into the pigment hemozoin (26. Lvova MN, Zhukova MV, Kiseleva EV, Mayboroda OA, Hensbergen P., Kizilova EA, Besprozvannykh VV, Sripa B., Katokhin AV, Mordvinov VA Hemozoin is a product of heme detoxification in the gut of the most medically important species of the family Opisthorchiidae. Int. J. Parasitology. 2016, 46: 147-156), as well as the fact that in infectious diseases the absolute platelet count rises, can conclude that the therapeutic effects of the micellar complex on some blood parameters are obtained, comparable to the action of the drug - praziquantel.

Результаты биохимического исследования показали, что новый комплекс ПЗК:Na₂ГК, также как и празиквантел, снижают уровни общего белка и холестерина в крови инфицированных хомячков, что может расцениваться как лечебное действие препаратов. В отношении ферментов АЛТ и ACT, отражающих состояние печени, лечебное действие оказал ПЗК, который снижал активность ферментов. Комплекс, содержащий в 11 раз меньшую дозу ПЗК, оказался неэффективным в отношении этих ферментов печени.The results of a biochemical study showed that the new complex of PZK: Na ₂ HA, as well as praziquantel, reduce the levels of total protein and cholesterol in the blood of infected hamsters, which can be regarded as the therapeutic effect of the drugs. With respect to ALT and ACT enzymes, which reflect the state of the liver, the therapeutic effect was exerted by PZK, which reduced the activity of enzymes. The complex, containing an 11-fold lower dose of PZK, was ineffective against these liver enzymes.

На Фиг. 5. показано влияние празиквантела (ПЗК) и комплекса празиквантела с глицирризинатом натрия (ПЗК:Na₂ГК) на количество червей в желчных протоках печени хомячков, инфицированных Opisthorchis felineus.In FIG. 5. The effect of praziquantel (PZK) and the complex of praziquantel with sodium glycyrrhizinate (PZK: Na ₂ HA) on the number of worms in the bile ducts of hamsters infected with Opisthorchis felineus is shown.

На Фиг 6. показано влияние празиквантела (ПЗК) и комплекса празиквантела с глицирризинатом натрия (ПЗК:Na₂ГК) на относительную массу печени и селезенки хомячков, инфицированных Opisthorchis felineus.Figure 6 shows the effect of praziquantel (PZK) and the complex of praziquantel with sodium glycyrrhizinate (PZK: Na ₂ HA) on the relative mass of the liver and spleen of hamsters infected with Opisthorchis felineus.

На Фиг. 7. показаны изменения массы тела у хомячков на фоне инфицирования Opisthorchis felineus (1-3 мес), а также после введения празиквантела (ПЗК) и комплекса празиквантела с глицирризинатом натрия (ПЗК:Na₂ГК) (4 мес).In FIG. 7. shows changes in body weight in hamsters on the background of infection with Opisthorchis felineus (1-3 months), as well as after administration of praziquantel (PZK) and a complex of praziquantel with sodium glycyrrhizinate (PZK: Na ₂ HA) (4 months).

Примечание: * р<0.05; ** р<0.01; (*) 0.05<р<0.1 - по сравнению с группой растворитель»; # р<0.05 - по сравнению с группой «празиквантел».Note: * p <0.05; ** p <0.01; (*) 0.05 <p <0.1 - in comparison with the solvent group "; # p <0.05 - compared with the praziquantel group.

Пример 4. Определение фармакокинетических параметров празиквантеля и его композиции с Na₂ГК в массовых соотношении 1:10.Example 4. Determination of the pharmacokinetic parameters of praziquantel and its composition with Na ₂ HA in a mass ratio of 1:10.

В эксперименте использовали самцов белых беспородных мышей массой 22-30 г по 5 шт.в группе. Празиквантел и комплекс ПЗК:Na₂ГК вводили внутрижелудочно, натощак, однократно в дозе 400 мг/кг в пересчете на чистый ПЗК. Через 5,15, 30, 60, 90 и 120 минут после введения, животных декапировали и собирали кровь для получения сыворотки. Сыворотку получали путем центрифугирования крови при 3000 об./мин в течение 15 мин. Затем образцы замораживали для дальнейшего определения концентрации празиквантеля.In the experiment, male white mongrel mice weighing 22-30 g of 5 pcs. In group were used. Praziquantel and the PZK complex: Na ₂ HA was administered intragastrically, on an empty stomach, once at a dose of 400 mg / kg in terms of pure PZK. 5.15, 30, 60, 90, and 120 minutes after administration, animals were decapitated and blood was collected to obtain serum. Serum was obtained by centrifuging blood at 3000 rpm./min for 15 minutes Then the samples were frozen to further determine the concentration of praziquantel.

Фармакокинетические параметры празиквантеля и его композиции с Na₂ГК представлены на фиг. 8 (Фармакокинетические кривые ПЗК и его комплекса с Na₂ГК) и в таблице 3.The pharmacokinetic parameters of praziquantel and its composition with Na ₂ HA are shown in FIG. 8 (Pharmacokinetic curves of PZK and its complex with Na ₂ HA) and in table 3.

Полученные результаты свидетельствуют о значительном повышении биодоступности пракзиквантеля из комплекса с Na₂ГК.The results obtained indicate a significant increase in the bioavailability of praxiquantel from the complex with Na ₂ HA.

Заявляемая композиция повышает водорастворимость празиквантеля не менее, чем в 2,4 раза, времена ¹Н ЯМР спин-спиновой релаксации протонов празиквантеля в водных растворах композиций сокращаются более, чем в 1,7 раз, при этом; биодоступность празиквантеля увеличивается в 3 раза.The inventive composition increases the water solubility of praziquantel no less than 2.4 times, the ¹ H NMR of the spin-spin relaxation of protons of praziquantel in aqueous solutions of the compositions is reduced by more than 1.7 times, while; the bioavailability of praziquantel is increased by 3 times.

Claims

A praziquantel-based composition for the treatment of opisthorchiasis, comprising a complex of praziquantel and the sodium salt of plant saponin - glycyrrhizic acid with mass ratios of praziquantel components: sodium salt of glycyrrhizic acid, respectively, 1: 5-20, obtained by joint mechanical activation of a mixture of powdered starting components.