RU2680833C1 - Method for determining salts of phytic acid in plant seeds - Google Patents
Method for determining salts of phytic acid in plant seeds Download PDFInfo
- Publication number
- RU2680833C1 RU2680833C1 RU2018102663A RU2018102663A RU2680833C1 RU 2680833 C1 RU2680833 C1 RU 2680833C1 RU 2018102663 A RU2018102663 A RU 2018102663A RU 2018102663 A RU2018102663 A RU 2018102663A RU 2680833 C1 RU2680833 C1 RU 2680833C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phytin
- mixture
- sample
- hcl
- supernatant
- Prior art date
Links
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical class OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 title claims abstract description 12
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims abstract description 8
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 7
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 title claims abstract description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims abstract 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 14
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 abstract 2
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 4
- DXTCFKRAUYBHRC-UHFFFAOYSA-L iron(2+);dithiocyanate Chemical compound [Fe+2].[S-]C#N.[S-]C#N DXTCFKRAUYBHRC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-n-(2-methyl-6-sulfanylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide;hydrate Chemical compound O.C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1S WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 235000011116 calcium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940083982 sodium phytate Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/34—Purifying; Cleaning
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к аналитической химии, предназначено для определения органического соединения фитина в семенах растений.The invention relates to analytical chemistry, is intended to determine the organic compounds of phytin in plant seeds.
Фитин является основным фосфорсодержащим компонентом клеток многих растений и играет значительную роль в процессах прорастания семян, ускоренного роста и накопления биомассы. Основными проблемами при определении содержания солей фитиновой кислоты является его труднодоступность в связи с плохой растворимостью как в спирте, так и водных растворах, а также большим содержанием жиров и белков в семенах.Fitin is the main phosphorus-containing component of the cells of many plants and plays a significant role in the processes of seed germination, accelerated growth and biomass accumulation. The main problems in determining the content of salts of phytic acid is its inaccessibility due to poor solubility in both alcohol and aqueous solutions, as well as a high content of fats and proteins in seeds.
Известен способ выделения концентрата фитина из рисовых отрубей (JPS 6058993, МПК C07C 27/00; C07C 29/12; C07C 35/16; C07C 67/00; C07F 9/117, опубл. 1985-04-05), согласно которому рисовые отруби перемешивают с растворителем, например, н-гексаном и оставляют до образования сверху белой суспензии, содержащей фитин. Известен способ экстракции и очистки фитина из рисовых отходов с помощью обработки 1% раствором азотной кислоты, с последующим осаждением 10% известковым молоком и фильтрацией на прессе (Патент №2171808 C07F 9/117, опубл. 10.08.2001). Полученный технический фитин перекристаллизовывают 10% азотной кислотой, затем осаждают, сушат. Недостатком метода является его многостадийность, не приводящая, однако, к получению высокоочищенного от органических и неорганических примесей препарата, что затрудняет точное определение его концентрации. При этом работы по очистке фитина проводятся на холоду для предотвращения действия фермента фитазы, расщепляющей фитин на низкомолекулярные компоненты.A known method of isolating phytin concentrate from rice bran (JPS 6058993, IPC C07C 27/00; C07C 29/12; C07C 35/16; C07C 67/00; C07F 9/117, publ. 1985-04-05), according to which rice bran is mixed with a solvent, for example, n-hexane, and left until a white suspension containing phytin is formed on top. A known method of extraction and purification of phytin from rice waste by treatment with a 1% solution of nitric acid, followed by precipitation with 10% milk of lime and filtering on a press (Patent No. 2171808 C07F 9/117, publ. 10.08.2001). The resulting technical phytin is recrystallized with 10% nitric acid, then precipitated, dried. The disadvantage of this method is its multi-stage, which does not lead, however, to the preparation of a preparation highly purified from organic and inorganic impurities, which makes it difficult to accurately determine its concentration. At the same time, phytin purification works are carried out in the cold to prevent the action of the phytase enzyme, which breaks down phytin into low molecular weight components.
Известен способ количественного определения фитина с применением реактива Вэйда, включающего сульфосалициловую кислоту в присутствии соли трехвалентного хлористого железа FeCl3⋅6Н2О (Latta М., Eskin М.А simple and rapid colorimetric method for phytate determination // J. Agric. Food Chem. 1980. №28. P. 1313-1315). Недостатком метода является зависимость окраски результирующей смеси от pH среды: в зависимости от кислотности применяется измерение концентрации фитина при трех разных длинах волн. Кроме того, метод не дает точных значений, приходится делать много повторностей, что не всегда возможно, а результирующая смесь имеет нестабильную окраску (не более 1-2 минут).A known method for the quantitative determination of phytin using the Wade reagent, including sulfosalicylic acid in the presence of ferric chloride FeCl3-6H 2 O salt (Latta M., Eskin M. A simple and rapid colorimetric method for phytate determination // J. Agric. Food Chem. 1980. No. 28. P. 1313-1315). The disadvantage of this method is the dependence of the color of the resulting mixture on the pH of the medium: depending on the acidity, a measurement of the concentration of phytin is applied at three different wavelengths. In addition, the method does not give exact values, you have to do many repetitions, which is not always possible, and the resulting mixture has an unstable color (no more than 1-2 minutes).
Известен метод определения фитина с помощью железо-тиоцианатного комплекса (Демьянов Н.Я. Общие приемы анализа растительных веществ. М.: Государственное издательство, 1923. 252 с.), измерение проводят при длине волны 470 нм. Недостатком данного метода является крайняя нестабильность окраски (не более 1 минуты), а также значительный разброс данных, что связано с отсутствием применения оптимальной длины поглощения продукта реакции.A known method for determining phytin using the iron-thiocyanate complex (Demyanov N.Ya. General methods of analysis of plant substances. M: State publishing house, 1923. 252 S.), the measurement is carried out at a wavelength of 470 nm. The disadvantage of this method is the extreme instability of the color (not more than 1 minute), as well as a significant spread of data, which is associated with the lack of application of the optimal absorption length of the reaction product.
Известен способ количественного анализа фитина в растительных кормах, взятый за прототип, по АС 1432399 (опубл. 23.10.1988), включающий экстракцию фитина соляной кислотой, отделение экстракта от нерастворившегося осадка центрифугированием, пропускание экстракта через хроматографическую колонку с сильнокислотным катеонитом, содержащим 0,1-1 мг-экв железа в 1 г катионита, элюирование фитинового комплекса с железом из колонки 0,4-0,8 MHCl и определение фитина спектрофотометрически в УФ-спектре по светопоглощению фитинового комплекса с железом, при этом используется раствор сравнения, при экстрагировании используется 0,33-0,35 M HCl, а спектрофотомерию проводят при 240 нм. К недостаткам метода можно отнести сложность и большую затратность за счет использования оборудования ЖХ (ВЭЖХ). Кроме того метод дает избыточную точность для сравнительного анализа объектов исследования.A known method for the quantitative analysis of phytin in plant feed, taken as a prototype, according to AC 1432399 (publ. 23.10.1988), including extraction of phytin with hydrochloric acid, separation of the extract from the insoluble precipitate by centrifugation, passing the extract through a chromatographic column with a strongly acidic cateonite containing 0.1 -1 mEq of iron in 1 g of cation exchange resin, elution of the phytin complex with iron from a 0.4-0.8 MHCl column and determination of phytin spectrophotometrically in the UV spectrum by light absorption of the phytin complex with iron, while This is used reference solution used in the extraction 0,33-0,35 M HCl, and the spectrophotometry is performed at 240 nm. The disadvantages of the method include the complexity and high cost due to the use of LC equipment (HPLC). In addition, the method provides excessive accuracy for a comparative analysis of the objects of study.
Заявленное изобретение решает задачу выделения из семян, очищенных от жиров и белков, соединений фитиновой кислоты (фитинатов), определения содержания фитина в семенах получением стойкой окраски при использовании железо-тиоцианатного комплекса, снижения погрешности измерения до ±10% абсолютной массы фитина в навеске, работать при комнатной температуре.The claimed invention solves the problem of isolating from seeds purified from fats and proteins, phytic acid compounds (phytinates), determining the phytin content in seeds by obtaining a stable color when using the iron-thiocyanate complex, reducing the measurement error to ± 10% of the absolute weight of phytin in a sample, to work at room temperature.
Технический результат заключается в повышении точности и упрощении измерения количественного содержания фитина за счет получения абсолютно прозрачных образцов, стабилизации окраски до 10 минут, а также в разработке способа, пригодного для определения фитина при низкой концентрации от 0,08 до 4 мг на 1 г сырья.The technical result consists in increasing the accuracy and simplifying the measurement of the quantitative content of phytin by obtaining completely transparent samples, stabilizing the color for up to 10 minutes, and also in developing a method suitable for determining phytin at a low concentration of 0.08 to 4 mg per 1 g of raw material.
Технический результат достигается тем, что в способе определения солей фитиновой кислоты в семенах растений, включающем экстракцию фитина из сырья соляной кислотой, центрифугирование полученной смеси, колориметрирование при длине волны 337 нм, согласно изобретению, проводится дополнительная очистка солянокислой вытяжки добавлением к ней в соотношение объемов 4:1 смеси изоамилового спирта с хлороформом (1:24 об. долей) и перемешиванием, к полученной после центрифугирования надосадочной жидкости добавляют раствор 0.03% роданида аммония NH4SCN в 6% HCl и раствор 0.86% FeCl3 и 0.2% HCl в дистилированой воде в объемном соотношении 1:1,5:1, колориметрирование проводят, принимая в качестве контроля смесь этих же растворов в тех же пропорциях, заменяя объем надосадочной жидкости равным объемом воды, определение абсолютной массы f (мг) фитина в навеске пробы проводят по градировочному графику, а концентрацию F (%) определяют по формуле F=100f/Mn, где Mn - масса навески пробы (мг).The technical result is achieved by the fact that in the method for determining salts of phytic acid in plant seeds, including extraction of phytin from raw materials with hydrochloric acid, centrifugation of the mixture, colorimetry at a wavelength of 337 nm, according to the invention, an additional purification of hydrochloric acid extract is carried out by adding to it a volume ratio of 4 : 1 mixture of isoamyl alcohol and chloroform (. about 1:24 parts) and mixing, to the resulting supernatant, after centrifugation, a solution of ammonium thiocyanate 0.03% NH 4 SCN 6% HCl solution and 0.86% FeCl 3 and 0.2% HCl in demineralized water in a volume ratio of 1: 1.5: 1, colorimetry is performed by taking as a control mixture was the same solution in the same proportions, replacing the volume of the supernatant an equal volume of water , determination of the absolute mass f (mg) of phytin in the sample sample is carried out according to the calibration chart, and the concentration F (%) is determined by the formula F = 100f / Mn, where M n is the sample sample weight (mg).
Авторами настоящего изобретения на Международной научной конференции по биологической химии «XII чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова» (Москва, ИБХ РАН, 18-22 сентября) был сделан доклад с примером осуществления заявляемого способа на плодах ореха (Измерение содержания фитина в плодах четырех видов ореха на основе модифицированного колориметрического метода. Ф, Р. Аль Хачами, О.А. Землянухина, В.Н. Епринцев, В.Н. Калаев, Н.Н. Черкасова, В.А. СлавскийThe authors of the present invention at the International Scientific Conference on Biological Chemistry "XII reading memory of academician Yu.A. Ovchinnikova "(Moscow, Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, September 18-22) a report was made with an example of the implementation of the proposed method on the fruit of a nut (Measurement of phytin content in the fruits of four types of nuts based on a modified colorimetric method. F, R. Al Khachami, O.A. Zemlyanukhina, V.N. Eprintsev, V.N. Kalaev, N.N. Cherkasova, V.A. Slavsky
// под ред. В.Т. Иванова, А.Г. Габибова. - М.: Издательство «Перо», 2017. - с. 179).// ed. V.T. Ivanova, A.G. Gabibova. - M.: Publishing House "Pero", 2017. - p. 179).
В заявляемом изобретении использован метод очистки семян от содержания жиров и белков, применяемый обычно при выделении растительной ДНК.In the claimed invention used a method of cleaning seeds from the content of fats and proteins, usually used in the isolation of plant DNA.
Определение содержания фитина в полученной надосадочной жидкости проводят с использованием железо-тиоцианатного комплекса. На нанофотометре IMPLEN Р330 (Германия) был определен максимум поглощения тиоцианата. Он составляет 337 нм, что позволяет продлить стабильность окраски реакции до 10 мин и повысить точность измерения с использованием меньшего числа повторностей.Determination of phytin content in the obtained supernatant is carried out using an iron-thiocyanate complex. An absorption maximum of thiocyanate was determined on an IMPLEN P330 nanophotometer (Germany). It is 337 nm, which allows to prolong the stability of the color of the reaction up to 10 min and to increase the measurement accuracy using fewer replicates.
Метод основан на способности анионов солей фитиновой кислоты конкурировать с анионом роданида, дающим в растворе окрашенное труднорастворимое соединение с трехвалентным железом (тиоцианат). Таким образом, концентрация фитина обратно пропорциональна концентрации образованного тиоцианата железа (оптической плотности окрашенного раствора). Зная соотношение взаимодействующих компонентов реакции (4 Fe:l фитинат), можно определить концентрацию фитина по концентрации остаточного железа согласно стехиометрическому закону.The method is based on the ability of the anions of phytic acid salts to compete with the anion of thiocyanate, which in solution gives a colored, slightly soluble compound with ferric iron (thiocyanate). Thus, the concentration of phytin is inversely proportional to the concentration of the formed iron thiocyanate (optical density of the colored solution). Knowing the ratio of the interacting components of the reaction (4 Fe: l phytate), it is possible to determine the phytin concentration from the concentration of residual iron according to the stoichiometric law.
Пример осуществления способа.An example implementation of the method.
Для очистки растительного материала (20-300 мг) к 2 мл гомогената, растертого для лучшего разрушения семян с битым стеклом в 0.5 М HCl (раствор №1), добавляется 0.5 мл раствора изоамилового спирта с хлороформом (1:24) (раствор №2). После чего смесь переносили в эппендорфы и энергично встряхивали в течение 1 мин, после чего центрифугировали в течение 3 мин при 20000 g на центрифуге СМ50 ELMI (Латвия). При этом получали абсолютно прозрачную, очищенную от примесей надосадочную жидкость, содержащую соли фитиновой кислоты.To clean plant material (20-300 mg), 2 ml of a homogenate, ground for better seed destruction with broken glass in 0.5 M HCl (solution No. 1), is supplemented with 0.5 ml of a solution of isoamyl alcohol with chloroform (1:24) (solution No. 2 ) After that, the mixture was transferred to eppendorfs and shaken vigorously for 1 min, after which it was centrifuged for 3 min at 20,000 g in a centrifuge СМ50 ELMI (Latvia). In this case, a completely transparent, purified from impurities supernatant containing phytic acid salts was obtained.
Ход измерения.Measurement progress.
К 1 мл надосадочной жидкости добавляют сначала 1.5 мл индикативного 0.03% кислого раствора роданида аммония NH4SCN в 6% HCl (раствор №3), затем прибавляли 50 мкл кислого конкурентного раствора хлорида железа(III) (раствор №4). Раствор хлорида железа готовят из соли FeCl3, высушенной в эксикаторе с концентрированной серной кислотой. Содержание раствора представляет собой 0.86% по FeCl3 в 0.2% по HCl. После добавления раствора №4 образцы колориметрируют в предварительно калиброваных кварцевых кюветах. Можно производить определение фитина в одной кювете для избегания разброса данных. В качестве контроля используют смесь растворов №3 и №4 в тех же пропорциях, что и для образцов, заменяя объем пробы равным объемом воды. Содержание фитина рассчитывают по заранее составленному градуировочному графику, используя в качестве стандарта водный раствор натриевой соли фитиновой кислоты (Sigma). По кривой зависимости величины оптической плотности при 337 нм от количества фитината натрия в образце видно, что линейная зависимость наблюдается при концентрации фитина 0.08-4 мг/г с.м. При больших концентрациях фитина необходимо производить разведение образцов, а при концентрациях меньше 0.08 мг/г с.м. результаты недостоверны. Снижение погрешности определения и сопоставимость данных нескольких определений достигается использованием свежих реактивов одной партии с чистотой не менее ЧДА.To 1 ml of the supernatant, first add 1.5 ml of an indicative 0.03% acidic solution of ammonium thiocyanate NH 4 SCN in 6% HCl (solution No. 3), then 50 μl of an acidic competitive solution of iron (III) chloride (solution No. 4) was added. A solution of iron chloride is prepared from a salt of FeCl 3 dried in a desiccator with concentrated sulfuric acid. The solution content is 0.86% for FeCl 3 in 0.2% for HCl. After adding solution No. 4, the samples are colorimetered in pre-calibrated quartz cuvettes. It is possible to determine phytin in one cuvette to avoid data scatter. As a control, use a mixture of solutions No. 3 and No. 4 in the same proportions as for the samples, replacing the sample volume with an equal volume of water. The phytin content is calculated according to a predefined calibration schedule using an aqueous solution of phytic acid sodium salt (Sigma) as a standard. The curve of the dependence of the optical density at 337 nm on the amount of sodium phytate in the sample shows that a linear dependence is observed at a phytin concentration of 0.08-4 mg / g cm At high concentrations of phytin, it is necessary to dilute the samples, and at concentrations less than 0.08 mg / g cm the results are unreliable. Reducing the error of determination and comparability of the data of several determinations is achieved using fresh reagents of the same batch with a purity of not less than PSA.
Расчет абсолютной массы (мг) фитина в образце с учетом разбавления в ходе анализа проводили по формуле:The calculation of the absolute mass (mg) of phytin in the sample, taking into account dilution during the analysis, was carried out according to the formula:
f=Cf*(Mn+2000)*1,275/Mn,f = C f * (M n +2000) * 1.275 / M n ,
где f - содержание фитина в пробе (мг); Cf - измеренная концентрация фитината (мг/мл); Mn - масса навески пробы (мг).where f is the phytin content in the sample (mg); C f is the measured concentration of phytinate (mg / ml); M n - sample weight (mg).
Расчет концентрации (в % масс.) фитина в образце с учетом разбавления в ходе анализа проводят по следующей формуле:The calculation of the concentration (in wt.%) Of phytin in the sample, taking into account dilution during the analysis, is carried out according to the following formula:
F=100f/Mn,F = 100f / M n ,
где F - содержание фитина в образце (%).where F is the phytin content in the sample (%).
Необходимым замечанием является то, что примеси двух- и трехвалентных катионов металлов могут вносить погрешность в точность определения в связи с большим их сродством к фитиновой кислоте, нежели у катиона железа(III). В связи с этим необходимо следить за чистотой используемых реактивов (ч.д.а.), посуды и воды (дистиллят или бидистиллят).A necessary observation is that impurities of divalent and trivalent metal cations can introduce errors in the accuracy of determination due to their greater affinity for phytic acid than that of iron (III) cation. In this regard, it is necessary to monitor the purity of the used reagents (analytical grade), dishes, and water (distillate or double distillate).
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018102663A RU2680833C1 (en) | 2018-01-23 | 2018-01-23 | Method for determining salts of phytic acid in plant seeds |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018102663A RU2680833C1 (en) | 2018-01-23 | 2018-01-23 | Method for determining salts of phytic acid in plant seeds |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2680833C1 true RU2680833C1 (en) | 2019-02-28 |
Family
ID=65632552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018102663A RU2680833C1 (en) | 2018-01-23 | 2018-01-23 | Method for determining salts of phytic acid in plant seeds |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2680833C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116337791A (en) * | 2023-05-31 | 2023-06-27 | 北京挑战生物技术有限公司 | In-vitro detection method for release rate of phosphorus phytate in feed raw material |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1432399A1 (en) * | 1987-04-07 | 1988-10-23 | Научно-исследовательский институт животноводства Лесостепи и Полесья УССР | Method of quantitative analysis of phytin in vegetable fodder |
| RU2171808C1 (en) * | 2000-05-18 | 2001-08-10 | Государственное учреждение - Институт химии Дальневосточного отделения РАН | Method of preparing phytic acid derivatives |
-
2018
- 2018-01-23 RU RU2018102663A patent/RU2680833C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1432399A1 (en) * | 1987-04-07 | 1988-10-23 | Научно-исследовательский институт животноводства Лесостепи и Полесья УССР | Method of quantitative analysis of phytin in vegetable fodder |
| RU2171808C1 (en) * | 2000-05-18 | 2001-08-10 | Государственное учреждение - Институт химии Дальневосточного отделения РАН | Method of preparing phytic acid derivatives |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| V.A. McKie et al. A Novel and Repid Colorimetric Method for Measuring Total Phosphorus and Phytic acid in Foods and Animal Feeds / Journal of AOAC International, 2016, vol.99, N3, pages 738-743. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116337791A (en) * | 2023-05-31 | 2023-06-27 | 北京挑战生物技术有限公司 | In-vitro detection method for release rate of phosphorus phytate in feed raw material |
| CN116337791B (en) * | 2023-05-31 | 2023-08-15 | 北京挑战生物技术有限公司 | In-vitro detection method for release rate of phosphorus phytate in feed raw material |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Brenner et al. | A quantitative test for copper using bicinchoninic acid | |
| Pehlivan et al. | Determination of some inorganic metals in edible vegetable oils by inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP-AES) | |
| Peterson | Improved spectrophotometric procedure for determination of serum iron using 4, 7-diphenyl-1, 10-phenanthroline | |
| Matei et al. | Determination of C vitamin and some essential trace | |
| Cardiano et al. | Study of Al3+ interaction with AMP, ADP and ATP in aqueous solution | |
| RU2680833C1 (en) | Method for determining salts of phytic acid in plant seeds | |
| CN107589099B (en) | Gold nanocluster-based 6-mercaptopurine detection method and kit thereof | |
| LeBlanc et al. | Quantitation of selenomethionine in multivitamins and selenium supplements by high performance liquid chromatography inductively-coupled plasma mass spectrometry | |
| Dux et al. | Spectrophotometric Determination of Sulfaquinoxaline | |
| Giri et al. | The influence of seawater calcium ions on coral calcification mechanisms: Constraints from boron and carbon isotopes and B/Ca ratios in Pocillopora damicornis | |
| Nury et al. | Dried Fruits Stability, Modified Direct Colorimetric Method for Determination of Sulfur Dioxide in Dried Fruits | |
| Drochioiu et al. | The breakdown of plant biostructure followed by amino acids determination | |
| Neidig et al. | Simultaneous estimation of threonine and serine | |
| Muginova et al. | Application of alkaline phosphatases from different sources in pharmaceutical and clinical analysis for the determination of their cofactors; zinc and magnesium ions | |
| CN116969852A (en) | Application of quaternary ammonium salt compound in preparation of derivatization reagent for detecting short-chain fatty acid | |
| Nagaraja et al. | Spectrophotometric determination of nitrate in polluted water using a new coupling reagent | |
| Anisimovich et al. | Spectrophotometric determination of proteins in biological fluids | |
| Bunch et al. | Lead poisoning: Clinical and laboratory considerations. | |
| Demir et al. | Determination of Boron in Grape (Vitis vinifera) by Azomethine H Spectrophotometric Method. | |
| Kohutiar et al. | Comparison of the effects of tert-butyl hydroperoxide and peroxynitrite on the oxidative damage to isolated beef heart mitochondria. | |
| DE4304728C2 (en) | Method and test kit for the determination of ascorbic acid in biological samples | |
| Onuorah et al. | Evaluation of heavy metals profile in different brands of infant food nutrition | |
| Mokrasch | Spectrophotometric determination of phosphate in the presence of highly labile phosphorus compounds | |
| Schetinger et al. | Aluminum: Interaction with nucleotides and nucleotidases and analytical aspects of its determination | |
| Huang et al. | Spectrophotometric Studies on the Proton Transfer from the Protonated DNA to 5, 10, 15, 20-Tetrakis [4-(trimethyammonio)-phenyl] porphine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210124 |