RU2679512C2

RU2679512C2 - Method of nontransparent multilayer mask hydrobionts application to eye

Info

Publication number: RU2679512C2
Application number: RU2016143855A
Authority: RU
Inventors: Гульнара Зульфатовна Михайлова; Рашид Шамильевич Штанчаев; Губидат Абдулкадировна Алилова
Priority date: 2016-11-09
Filing date: 2016-11-09
Publication date: 2019-02-11
Also published as: RU2016143855A; RU2016143855A3

Abstract

FIELD: biology.SUBSTANCE: invention relates to the field of biological and ecological studies and concerns the protocol conditions for the eye gluing of aquatic animals without eyelids. Method consists in that, after anesthetizing and immobilizing the fish, an antimicrobial agent for the eyes is applied to the pupil. Then prepare the skin around the eye by drying the skin for 1–2 hours with filter paper and blowing through a plastic thin needle connected to the syringe, while periodically moistening the eye with water. Next, the skin around the eye is treated with hydrogen peroxide and alcohol, while applying to the pupil and around it hydrocortisone in the form of ophthalmic ointment on a vaseline basis. Then, the Dermabond skin glue is applied to the completely dried skin around the eye. After that, the first layer of the mask, consisting of a liquid base on the Ardell Lash Grip Adhesive Dark cellulose-rubber base, is applied with the help of a pointed stick around the eye and on the eye itself, completely closing it. After drying, the second layer of the mask, consisting of a waterproof glue on a polyurethane base, is applied over the entire surface of the first layer, and also along the dry edge of the skin of the fish around the first layer of the mask.EFFECT: method excludes the entry of light rays into the visual analyzer and provides a prolonged, up to 1 month retention of the eye mask on the skin of an aquatic animal that does not have eyelids, in a water-air environment when examining vision and visual-motor reactions.1 cl, 3 dwg, 3 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к области биологических исследований и касается способа заклейки глаза и оценки зрительно-моторного поведения гидробионтов.The invention relates to the field of biological research and relates to a method for gluing the eye and assessing the visual-motor behavior of aquatic organisms.

Данное открытие относится, в общем виде, к созданию экспериментальных моделей с использованием животных, и, в частности, к способам заклейки глаз экспериментальных водных животных для изучения зрения и зрительно-двигательных реакций in vivo.This discovery relates, in general, to the creation of experimental models using animals, and, in particular, to methods for gluing the eyes of experimental aquatic animals to study vision and visual-motor reactions in vivo.

Работа поддержана грантом номер №16-04-01759 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский фонд фундаментальных исследований». Права на изобретение принадлежат Федеральному государственному бюджетному учреждению науки Институту теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.This work was supported by grant No. 16-04-01759 of the Federal State Budgetary Institution Russian Foundation for Basic Research. The rights to the invention belong to the Institute of Theoretical and Experimental Biophysics of the Russian Academy of Sciences.

Экспериментальные модели с использованием животных в биомедицинских исследованиях необходимы для оценки степени заболеваний, их протекания и поиска возможных способов лечения. Заклейка глаза (в результате травмы, после хирургической операции или вследствие болезни) привлекает внимание широкого круга исследователей, поскольку связана с широко известным в офтальмологической практике заболеванием, носящим название депривационная амблиопия. Восстановление зрения после хирургического вмешательства не происходит, слепота и глубокие дефекты зрения (например, неспособность отличать геометрические фигуры и т.п.) сохраняются, несмотря на месяцы и годы попыток «научить видеть». «Отключение» зрения с одной стороны тела влияет, в первую очередь, на механизмы нейронной пластичности, лежащие в основе зрительно-моторной интеграции (Prusky et al., 2006; Niechwiej-Szwedo et al., 2012; Kaneko, Stryker, 2015). Исследования в данном направлении проводятся преимущественно на высших позвоночных животных с бинокулярным зрением, которым зашивают или заклеивают глазное веко на длительный период. К сожалению, функциональная межполушарная асимметрия мозга позвоночных и сложность его организации препятствуют выявлению связи между функциональной нагрузкой на афферентный вход конкретного нейрона, его морфологическими характеристиками (размером его отдельных частей и состоянием актинового цитоскелета) и особенностями моторного поведения животного (Tailby et al., 2005). Конструктивной модельной тест-системой, которая позволяет обнаружить нарушения сенсомоторной интеграции, служат низшие позвоночные, в частности, костистые рыбы. Асимметрия зрительной функции рыб подробно изучена во взаимосвязи с латерализацией моторного поведения (Sovrano et al., 2001; Dadda et al., 2012), а также в связи с выполнением рыбами зрительно-двигательных реакций, например, оптокинетической реакции (Shtanchayev et al., 2007). Механизмы определения движения, которые рыбы используют при осуществлении оптокинетических реакций, сходны с теми, которые используют приматы (Orger et al., 2000). Более того, в продолговатом мозге костистых рыб находятся два парных ретикулоспинальных Маутнеровских нейрона, которые относятся к числу немногочисленных модельных объектов, на которых возможно тестирование потенциальных агентов, способных влиять на зрительно-моторное поведение рыб in vivo (Moshkov et al., 2013). Наиболее ценно то, что пластичность этих нейронов отображается в моторном поведении с помощью коэффициента моторной асимметрии рыб, который свидетельствует об экспериментально вызванном перераспределении значимости левого и правого Маутнеровских нейронов в реализации двигательных актов (Korn, Faber, 2005). Визуализируя Маутнеровские нейроны рыб с помощью методики трехмерной компьютерной реконструкции по серийным гистологическим срезам мозга (Михайлова и др., 2012), можно определить структурные субстраты, ответственные за сохранение функционального сдвига, то есть нейропластические перестройки (Moshkov et al., 2009).Experimental models using animals in biomedical research are necessary to assess the degree of disease, their course and search for possible treatment options. The gluing of the eye (as a result of an injury, after a surgical operation or as a result of an illness) attracts the attention of a wide circle of researchers, since it is associated with a disease commonly known in ophthalmic practice called deprivation amblyopia. The restoration of vision after surgery does not occur, blindness and deep visual defects (for example, inability to distinguish geometric shapes, etc.) persist despite months and years of attempts to “teach to see." The “disconnection” of vision from one side of the body primarily affects the mechanisms of neuronal plasticity that underlie the visual-motor integration (Prusky et al., 2006; Niechwiej-Szwedo et al., 2012; Kaneko, Stryker, 2015). Research in this direction is carried out mainly on higher vertebrates with binocular vision, which suture or seal the eyelid for a long period. Unfortunately, the functional interhemispheric asymmetry of the vertebral brain and the complexity of its organization hinder the identification of the relationship between the functional load on the afferent input of a particular neuron, its morphological characteristics (the size of its individual parts and the state of the actin cytoskeleton) and the motor behavior of the animal (Tailby et al., 2005) . The lower model vertebrates, in particular, bony fishes, serve as a constructive model test system that allows detecting sensorimotor integration disorders. The asymmetry of the fish’s visual function has been studied in detail in relation to the lateralization of motor behavior (Sovrano et al., 2001; Dadda et al., 2012), as well as in connection with the fish performing visual-motor reactions, for example, the optokinetic reaction (Shtanchayev et al., 2007). The mechanisms of motion determination that fish use in carrying out optokinetic reactions are similar to those used by primates (Orger et al., 2000). Moreover, in the medulla oblongata of bony fish there are two paired reticulospinal Mautner neurons, which are among the few model objects that can test potential agents that can affect the visual-motor behavior of fish in vivo (Moshkov et al., 2013). Most valuable is the fact that the plasticity of these neurons is displayed in motor behavior using the fish motor asymmetry coefficient, which indicates an experimentally induced redistribution of the importance of the left and right Mautner neurons in the implementation of motor acts (Korn and Faber, 2005). By visualizing the Mautner fish neurons using the method of three-dimensional computer reconstruction using serial histological sections of the brain (Mikhailova et al., 2012), it is possible to determine the structural substrates responsible for maintaining the functional shift, i.e., neuroplastic rearrangements (Moshkov et al., 2009).

Использовать традиционный подход к долговременному закрытию глаза, основанный на зашивании или заклеивании века (Wiesel et Hubel, 1963; Prusky et al., 2006), на рыбах не представляется возможным, поскольку не у всех видов рыб есть глазные веки. Кроме того, рыбы живут в водной среде и для заклеивания глаза нужна водостойкая, длительно удерживающаяся на коже животного маска. Поэтому на сегодняшний день метод монокулярной депривации рыб (или закрывания глаза) используют только в краткосрочных экспериментах (Easter, 1972; Fritsches and Marshall, 2002; Qian et al., 2005; Cameron et al., 2013). Так, с помощью заклейки глаза рыб можно моделировать нарушения остроты зрения, контрастной чувствительности и асимметрии оптокинетического ответа, характерные для таких заболеваний как амблиопия и врожденный горизонтальный нистагм (Maurer et al., 2011; Tappeiner et al., 2012; Cameron et al., 2013). Кратковременную обратимую депривацию костистых рыб используют для оценки зависимости скорости оптокинетического ответа от зрительной функции. При этом проводят оптокинетическую стимуляцию иммобилизованных рыб как в назо-темпоральном (против часовой стрелки), так и в темпоро-назальном (по часовой стрелке) направлении (Rick et al., 2000; Qian et al., 2005). Qian с сотр., изучая асимметрию оптокинетических реакций у рыбок-зебр, закрепляли черную пластиковую крышку впереди глаза рыбы в том же растворе метицеллюлозы, в котором находилось иммобилизованное животное (Qian et al., 2005). Аналогичный способ зрительной депривации описан в работе Cameron с сотр., который был использован для измерения остроты зрения каждого глаза рыбок-зебр (Cameron et al., 2013). Вышеперечисленные способы позволяют получить достоверные экспериментальные данные, однако обладают своими недостатками. В первую очередь, способы не исключают попадания световых лучей в глаз и не обеспечивают прекращения притока зрительной информации. Как следствие, сходимость (повторяемость) результатов при использовании данного способа депривации довольно низкая. Так, исследователям приходится прикладывать значительные усилия для перекрывания притока зрительной информации при моделировании катаракты на генетических мутантах рыб rp2/bugeye с асимметричным развитием глаза (Stujenske et al., 2011). Точность этого метода сумели повысить исследователи Kerstin A. Fritsches and N. Justin Marshall, которые, изучая движения глаз, впервые заклеили глаз некоторых видов костистых рыб (отр. пучкожаберных, морская игла Corythoichthyes intestinalis, песчанка Limnichthyes fasciatus, отр. щетинозубые Chaetodon rainfordi). Они использовали в качестве окклюдатора маленький диск непрозрачного черного пластика, который приклеивали на один глаз животного с использованием суперклея (Fritsches and Marshall, 2002). Для рыб с небольшими выступающими глазами, был изготовлен окклюдатор конической формы из алюминиевой фольги. Преимуществом работы было то, что окклюдатор полностью закрывал зрачок, что исключило бинокулярное зрение рыб и позволило успешнее оценивать зрительно-моторные реакции животных. Однако анестезия гвоздичным маслом в концентрации 0.2 Моль/л (базовый раствор 85-95%, Sigma), недостаточная подготовка кожи к приклеиванию окклюдатора и его состав могут привести к отклейке окклюдатора и не гарантируют получения данных на большом объеме животных в условиях ведения длительных экспериментов в водно-воздушной среде, особенно при исследовании оптомоторного ответа животных. Таким образом, ограничением всех перечисленных способов (Fritsches and Marshall, 2002; Qian et al., 2005; Cameron et al., 2013) является то, что они не позволяют животному перемещаться в пространстве и выполнять оптомоторный рефлекс.It is not possible to use the traditional approach to long-term eye closure based on suturing or gluing the eyelid (Wiesel et Hubel, 1963; Prusky et al., 2006) on fish, because not all fish species have eye eyelids. In addition, fish live in an aquatic environment and to seal the eyes you need a waterproof, long-lasting mask on the skin of the animal. Therefore, to date, the method of monocular deprivation of fish (or closing the eyes) is used only in short-term experiments (Easter, 1972; Fritsches and Marshall, 2002; Qian et al., 2005; Cameron et al., 2013). Thus, by gluing fish eyes, it is possible to simulate visual acuity, contrast sensitivity and asymmetry of the optokinetic response, typical for diseases such as amblyopia and congenital horizontal nystagmus (Maurer et al., 2011; Tappeiner et al., 2012; Cameron et al., 2013). Short-term reversible deprivation of bony fish is used to assess the dependence of the rate of optokinetic response on visual function. In this case, optokinetic stimulation of immobilized fish is performed both in the naso-temporal (counterclockwise) and in the temporal-nasal (clockwise) directions (Rick et al., 2000; Qian et al., 2005). Qian et al., Studying the asymmetry of optokinetic reactions in zebra fish, fixed a black plastic cover in front of the fish’s eye in the same solution of methicellulose in which the immobilized animal was located (Qian et al., 2005). A similar method of visual deprivation is described in the work of Cameron et al., Which was used to measure the visual acuity of each eye of zebra fish (Cameron et al., 2013). The above methods allow you to obtain reliable experimental data, however, have their drawbacks. First of all, the methods do not exclude the penetration of light rays into the eye and do not ensure the cessation of the flow of visual information. As a result, the convergence (repeatability) of the results when using this deprivation method is quite low. Thus, researchers have to make significant efforts to block the flow of visual information when modeling cataracts on rp2 / bugeye fish genetic mutants with asymmetric eye development (Stujenske et al., 2011). Researchers at Kerstin A. Fritsches and N. Justin Marshall, who, studying eye movements, first sealed the eyes of some species of bony fish (neg. Bunch-gill, marine needle Corythoichthyes intestinalis, gerbil Limnichthyes fasciatus, neg. Bristle-toothed Chaetodon rainford), were able to improve the accuracy of this method. They used a small disc of opaque black plastic as an occluder, which was glued to one eye of an animal using superglue (Fritsches and Marshall, 2002). For fish with small protruding eyes, a conical shaped occluder was made from aluminum foil. The advantage of the work was that the occluder completely covered the pupil, which excluded the binocular vision of the fish and made it possible to more successfully evaluate the visual-motor reactions of animals. However, anesthesia with clove oil at a concentration of 0.2 mol / L (stock solution 85-95%, Sigma), inadequate preparation of the skin for gluing the occluder and its composition can lead to peeling of the occluder and do not guarantee the receipt of data on a large volume of animals under long-term experiments in water-air environment, especially when studying the optomotor response of animals. Thus, a limitation of all of the above methods (Fritsches and Marshall, 2002; Qian et al., 2005; Cameron et al., 2013) is that they do not allow the animal to move in space and perform an optomotor reflex.

Данное ограничение сумел преодолеть только исследователь Easter, который в 1972 г. впервые предложил методику краткосрочного (на время эксперимента) закрытия глаза для изучения зрительно-моторного поведения золотых рыбок Carassius auratus (Easter, 1972). В этих экспериментах к роговице глаза с помощью присоски прикрепляли полиэтиленовую трубку (РЕ 240) шириной 2 мм, длиной 11 мм, плотно закрытую с одного конца, расширяющуюся к другому концу и наполненную черным красителем. Преимуществом этого устройства было то, что окклюдатор не мешал рыбе свободно перемещаться в водном пространстве и выполнять оптокинетический рефлекс. Недостатком устройства являлось неполное закрывание зрачка, поэтому о полноценной монокулярной депривации говорить нельзя.Only Easter researcher was able to overcome this limitation, who in 1972 first proposed a method of short-term (for the duration of the experiment) eye closure for studying the visual-motor behavior of Carassius auratus goldfish (Easter, 1972). In these experiments, a polyethylene tube (PE 240) 2 mm wide, 11 mm long, tightly closed at one end, expanding to the other end and filled with black dye was attached to the cornea of the eye using a suction cup. The advantage of this device was that the occluder did not prevent the fish from moving freely in the water and performing an optokinetic reflex. The disadvantage of this device was the incomplete closure of the pupil, so it is impossible to talk about full-fledged monocular deprivation.

Таким образом, методики, предлагаемые данными авторами, могут использоваться лишь для краткосрочных исследований. Между тем, заклейка глаза на продолжительное время имеет свои преимущества. Во-первых, заклейка глаза на длительное время открывает новые возможности для фундаментальных исследований асимметрии оптомоторного ответа генетических мутантов рыбок-зебр (Neuhauss et al., 1999). Заклейка глаза полностью исключает бинокулярное зрение, обеспечивает подвижность рыб и позволяет интерпретировать данные, полученные на генетических мутантах рыб с помощью других методик и трудно поддающиеся объяснению (Burgess et al., 2010). Во-вторых, учитывая современный уровень развития научных исследований и возможность исследовать in vivo, какие именно нейроны задействованы при выполнении оптокинетической реакции (Ahrens et al., 2012), метод заклейки глаза открывает перспективы для исследования механизмов нарушений глазодвигательных реакций человека и животных, особенно выраженных в таких условиях сенсорной депривации, как микрогравитация и депривационная амблиопия. Кроме того, метод заклейки глаза на длительное время является перспективным при создании экспериментальных моделей в биомедицинских целях. Так, можно использовать оптокинетические реакции рыб как основу для изучения механизмов нейропластичности (Shtanchayev et al., 2007; Grigorieva et al., 2010), аналогично тому, как на сегодняшний день используют зрительные стимуляции грызунов, подвергнутых временной монокулярной депривации на ранних этапах жизни (Kaneko et Stryker, 2014). Необходимо учитывать также, что заклейка глаза может способствовать уменьшению методической ошибки при проведении эксперимента, так как обеспечивает, во-первых, полное прекращение притока зрительной информации в одно из полушарий мозга, а во-вторых, снимает возникновение побочных эффектов от иммобилизационного стресса. Последний возникает при проведении сеансов оптокинетической стимуляции, когда животное иммобилизуют с помощью различных приспособлений, а в случае неудачной иммобилизации эксперимент продлевается в ряде случаев до 30 минут (Rick et al., 2000). Стрессовый характер эксперимента, безусловно, влияет как на поведение рыбок, так и на структуру мозга и его отделов, перестраивающихся при стрессе (Штанчаев, 2008), и эти влияния, далеко не однозначные, требуют специальных исследований. Так, иммобилизация рыбок с помощью механических приспособлений в течение нескольких часов способна привести к разбалансировке морфофункционального гомеостаза Маутнеровских нейронов, в том числе и к изменениям объемов тех или иных участков клеток, в частности латеральных дендритов (Штанчаев, 2008). Все эти вопросы невозможно изучить подробно без использования заклейки глаза на длительное время. Задачей предлагаемого способа является обеспечение монокулярной депривации, то есть «отключения» зрения с одной стороны тела животного на срок, достаточный для проявления компенсаторных нейропластических изменений, и стандартизация условий приклеивания глазной маски к коже животного. Предлагаемый метод заклейки одного глаза прост в использовании, удобен в работе с большим количеством животных и позволяет интерпретировать данные, полученные с помощью других методик. Предлагаемая методика позволяет готовить многослойные маски площадью требуемого размера, в которых основным слоем, контактирующим с глазом, является безопасная жидкая основа для маски на целлюлозно-каучуковой основе. Этот слой с одной стороны соприкасается с внутренним слоем (кожным клеем), с другой стороны с водостойким клеем (внешняя поверхность маски). Протокол выполнения исследований по заклейке глаза включает в себя следующие этапы: анестезия животного и его обездвиживание, процедуры по защите глаза животного от высыхания, подготовка кожи животного к приклеиванию глазной маски, послойное приклеивание маски на глаз, постоперационная реабилитация. Чем дольше рыбка находится в установке с заклеенным глазом, тем более качественным будет эффект операции. Поэтому мы вводили рыбе под холодовой анестезией внутрибрюшинно миорелаксант тубокурарин (1 мкг на 1 г веса тела) (тубокурарина гидрохлорид, Sigma), что способствовало обездвиживанию рыб на полный рабочий день. Fritsches и Marshall в своих исследованиях использовали анестезию гвоздичным маслом в концентрации 0.2 Моль/л (базовый раствор 85-95%, Sigma), что подразумевает быструю анестезию животного и некачественное приклеивание окклюдатора к его коже. Другие исследователи (Easter, 1972; Qian et al., 2005) совсем не использовали анестезии для приклеивания окклюдатора к коже вокруг глаза животного. Предлагаемый нами способ требует длительного нахождения рыбки в установке под анестезией. На рисунке (фиг.1, слева) показано, что рыбку (1) укладывали на подложку (2) требуемой стороной вверх и подключали с помощью пластиковой трубки (3), вставляемой в ротовое отверстие (фиг. 1, слева), к перистальтическому насосу (4) для промывания жабр (скорость протока воды 15-20 мл/мин). Тело рыбки накрывали мокрой тряпочкой (за исключением головы). Далее выполняли процедуры по подготовке кожи животного к приклеиванию маски (5) (фиг. 1, справа). С помощью медицинской груши (спринцовка) с самодельным острым наконечником на зрачок аккуратно наносили небольшое количество сульфацетамида, либо другого противомикробного, обеззараживающего средства для глаз. В течение 1-2 часов кожа вокруг глаза подсушивали фильтровальной бумагой и обдуванием через пластиковую тонкую иглу, соединенную со спринцовкой. Периодически (раз в 10-20 мин) глаз смачивают водой, причем важно, чтобы вода не стекала с глаза на кожу. Устройство для защиты глаза экспериментального животного от высыхания описывалось в заявке на изобретение US 2014352703 (A1), однако имелись в виду не водные животные, а мыши или крысы. Затем, кожу вокруг глаза прижигали перекисью водорода, избегая попадания ее на глаз, при этом кожу зачищали скальпелем и повторно прижигали перекисью водорода. Предварительно подсушив, то же самое проводили, используя спирт. Для предотвращения воспалительной реакции наносили на зрачок небольшое количество гидрокортизона в виде глазной мази на вазелиновой основе, аккуратно размазывая ее по зрачку и вокруг зрачка. Затем послойно наносили клеевую маску специального состава. В первую очередь наносили 8 мкл (эмпирически подобранный объем для 4-6 см рыбок) кожного клея Dermabond на цианакриловой основе (Ethicon Inc.) на полностью высушенную кожу вокруг глаза с помощью дозатора. Клей аккуратно распределяли по всей коже, преимущественно на костяную преджаберную основу под глазом и черепную основу над глазом, избегая попадания клея на ухо, предротовую область и хоану. С помощью заостренной палочки наносили жидкую основу для маски на целлюлозно-каучуковой основе (Ardell Lash Grip Adhesive Dark, American International Industries), прежде всего, поверх кожного клея, то есть вокруг глаза. Потом каплю целлюлозно-каучукового клея наносили на сам глаз, полностью закрывая его. С помощью той же палочки аккуратно разравнивали маску (5) по глазу и коже вокруг него (фиг. 1, справа). После того, как маска окончательно подсохнет, наносили на нее дополнительную водоизоляцию в виде водостойкого клея на полиуретановой основе, который наносится по всей поверхности маски, а также по сухой кромке кожи рыбки вокруг маски. После проведенной операции оставляли рыбку минимум на час в установке. Возвращали оперированную рыбку в индивидуальный мини аквариум, убедившись в том, что она окончательно проснулась. Это проверяли, отсоединяя трубку для подачи воды в жабры - проснувшаяся рыбка активно двигала ртом и шевелилась. После операции рыбку следует содержать в течение недели в слабом растворе метиленового синего (не более 3 мг на 1 л) или любом другом специализированном обеззараживающем растворе для профилактики развития инфекций. Тестировать рыбку можно на вторые-третьи сутки после операции. Однако более оптимальным временем для начала многодневного тестирования следует считать 13-14 дни после операции, если исходить из опытов по необратимой монокулярной депривации (Grigorieva et al., 2010), показавших поведенческий эффект от операции спустя две недели после энуклеации глаза. Заклеенная таким способом глазная маска прочно удерживается в течение 3 недель и более. Временем окончания монокулярной депривации считали день самопроизвольного отклеивания маски. Следует отметить, что оперированный глаз в большинстве случаев выглядит интактным после отклеивания маски. Тестирование моторного поведения рыбок в ходе реабилитационного периода проводили в узком прямолинейном коридоре через десять дней после отклеивания маски и начала бинокулярного зрения.Thus, the techniques proposed by these authors can be used only for short-term studies. Meanwhile, gluing eyes for a long time has its advantages. Firstly, gluing the eye over a long period of time opens up new possibilities for fundamental studies of the asymmetry of the optomotor response of genetic mutants of zebra fish (Neuhauss et al., 1999). Bonding the eye completely eliminates binocular vision, provides fish mobility, and allows interpretation of data obtained on fish genetic mutants using other techniques and difficult to explain (Burgess et al., 2010). Secondly, given the current level of development of scientific research and the ability to investigate in vivo which neurons are involved in performing the optokinetic reaction (Ahrens et al., 2012), the gluing method opens up prospects for studying the mechanisms of disturbances in the oculomotor reactions of humans and animals, especially pronounced in conditions of sensory deprivation, such as microgravity and deprivation amblyopia. In addition, the method of gluing the eyes for a long time is promising when creating experimental models for biomedical purposes. Thus, optokinetic reactions of fish can be used as a basis for studying the mechanisms of neuroplasticity (Shtanchayev et al., 2007; Grigorieva et al., 2010), similar to how visual stimulations of rodents subjected to temporary monocular deprivation in the early stages of life are used today ( Kaneko et Stryker, 2014). It must also be taken into account that gluing the eye can help to reduce the methodological error during the experiment, as it provides, firstly, a complete cessation of the flow of visual information into one of the cerebral hemispheres, and secondly, it eliminates the occurrence of side effects from immobilization stress. The latter occurs during optokinetic stimulation sessions, when the animal is immobilized using various devices, and in case of unsuccessful immobilization, the experiment is prolonged in some cases up to 30 minutes (Rick et al., 2000). The stressful nature of the experiment, of course, affects both the behavior of fish and the structure of the brain and its parts, which are rearranged under stress (Shtanchaev, 2008), and these effects, which are far from unambiguous, require special studies. Thus, immobilization of fish using mechanical devices for several hours can lead to an imbalance in the morphofunctional homeostasis of the Mautner neurons, including changes in the volumes of certain cell sections, in particular lateral dendrites (Shtanchaev, 2008). All these questions cannot be studied in detail without using eye tapes for a long time. The objective of the proposed method is to ensure monocular deprivation, that is, "turning off" the vision on one side of the animal’s body for a period sufficient for the manifestation of compensatory neuroplastic changes, and standardizing the conditions for gluing the eye mask to the skin of the animal. The proposed method for gluing one eye is easy to use, convenient to work with a large number of animals and allows you to interpret data obtained using other methods. The proposed method allows to prepare multilayer masks with the required size, in which the main layer in contact with the eye is a safe liquid base for a mask on a cellulose-rubber basis. This layer is on one side in contact with the inner layer (skin glue), on the other hand with waterproof glue (outer surface of the mask). The protocol for performing eye gluing studies includes the following stages: anesthesia of the animal and its immobilization, procedures for protecting the animal’s eyes from drying out, preparation of the animal’s skin for gluing an eye mask, layer-by-layer gluing of the mask on the eye, postoperative rehabilitation. The longer the fish is in the installation with a sealed eye, the better the effect of the operation will be. Therefore, we introduced fish under cold anesthesia intraperitoneally muscle relaxant tubocurarine (1 μg per 1 g of body weight) (tubocurarine hydrochloride, Sigma), which contributed to immobilization of fish for a full day. Fritsches and Marshall in their studies used anesthesia with clove oil at a concentration of 0.2 mol / L (stock solution 85-95%, Sigma), which implies rapid anesthesia of the animal and poor adhesion of the occluder to its skin. Other researchers (Easter, 1972; Qian et al., 2005) did not use anesthesia at all to glue the occluder to the skin around the animal’s eye. Our proposed method requires a long stay of the fish in the installation under anesthesia. The figure (Fig. 1, left) shows that the fish (1) was laid on the substrate (2) with the required side up and connected with a plastic tube (3) inserted into the mouth opening (Fig. 1, left) to the peristaltic pump (4) for washing the gills (water flow rate of 15-20 ml / min). The body of the fish was covered with a wet cloth (except for the head). Next, the procedures were carried out to prepare the skin of the animal for gluing the mask (5) (Fig. 1, right). Using a medical pear (syringe) with a homemade sharp tip, a small amount of sulfacetamide, or another antimicrobial, disinfectant for the eyes, was gently applied to the pupil. For 1-2 hours, the skin around the eye was dried with filter paper and blown through a thin plastic needle connected to a syringe. Periodically (every 10-20 minutes) the eyes are moistened with water, and it is important that the water does not drain from the eye to the skin. A device for protecting the eyes of an experimental animal from drying out was described in the application for the invention US 2014352703 (A1), however, it was not aquatic animals, but mice or rats. Then, the skin around the eye was burned with hydrogen peroxide, avoiding contact with the eye, while the skin was cleaned with a scalpel and re-burned with hydrogen peroxide. After pre-drying, the same was carried out using alcohol. To prevent an inflammatory reaction, a small amount of hydrocortisone was applied to the pupil in the form of an ointment on a vaseline basis, gently smearing it around the pupil and around the pupil. Then a layer-by-layer adhesive mask of a special composition was applied. First, 8 μl (empirically selected volume for 4-6 cm of fish) was applied of Dermabond cyanoacrylic-based skin glue (Ethicon Inc.) onto completely dried skin around the eye using a dispenser. The glue was neatly distributed over the entire skin, mainly on the bone pre-gill base under the eye and the skull base over the eye, avoiding the glue getting on the ear, pre-oral area and choana. Using a pointed stick, a liquid base for a cellulose-rubber mask (Ardell Lash Grip Adhesive Dark, American International Industries) was applied, primarily on top of the skin glue, that is, around the eye. Then a drop of cellulose-rubber glue was applied to the eye itself, completely covering it. Using the same wand, the mask (5) was neatly aligned with the eye and the skin around it (Fig. 1, right). After the mask has finally dried up, additional waterproofing was applied to it in the form of a waterproof adhesive on a polyurethane base, which is applied over the entire surface of the mask, as well as on the dry edge of the fish skin around the mask. After the operation, the fish was left for at least an hour in the installation. They returned the operated fish to an individual mini aquarium, making sure that it finally woke up. This was checked by disconnecting the tube for supplying water to the gills - the awakened fish actively moved its mouth and moved. After the operation, the fish should be kept for a week in a weak solution of methylene blue (not more than 3 mg per 1 liter) or any other specialized disinfecting solution to prevent the development of infections. You can test the fish on the second or third day after the operation. However, the best time to start a multi-day test should be considered 13-14 days after surgery, based on experiments on irreversible monocular deprivation (Grigorieva et al., 2010), which showed the behavioral effect of the operation two weeks after eye enucleation. The eye mask sealed in this way is firmly held for 3 weeks or more. The time of the end of monocular deprivation was considered the day of spontaneous peeling of the mask. It should be noted that the operated eye in most cases looks intact after peeling off the mask. Testing of the motor behavior of fish during the rehabilitation period was carried out in a narrow rectilinear corridor ten days after peeling off the mask and the beginning of binocular vision.

Пример 1. Влияние заклейки глаза (или монокулярной депривации) и дальнейшей отклейки на параметры моторного поведения золотых рыбок и структуру их Маутнеровских нейронов.Example 1. The effect of gluing the eye (or monocular deprivation) and further gluing on the parameters of motor behavior of goldfish and the structure of their Mautner neurons.

Степень латерализации рыб оценивали с помощью коэффициента моторной асимметрии (КМА), который представляет собой отношение числа полных поворотов в предпочитаемую сторону к сумме поворотов в обе стороны, совершенных рыбкой за 5 минут тестирования в узком прямолинейном коридоре (Михайлова и др., 2005). Сдвиг КМА до значений ниже 0,47-0,50 в ходе эксперимента указывает на инверсию моторной асимметрии, т.е. смену предпочтения стороны поворотов. В данной части работы было показано, что заклейка глаза рыб - амбидекстров, изначально не имевших предпочтения стороны поворотов, приводит к развитию предпочтения поворотов в сторону депривации, причем уже на первые сутки после операции. Сдвиг моторной асимметрии в ослепленную сторону составлял более 30% (n=8, р<0,001). Заклейка правого глаза у рыбок-правшей и заклейка левого глаза у рыбок-левшей приводила к обострению исходной моторной асимметрии и, как следствие, к достоверному увеличению КМА приблизительно на 30%. Спустя 9±2 суток¹ (¹ Указано среднее ±95% доверительный интервал. В целом, разброс дней тестирования моторной асимметрии рыбок составлял от 2 до 23 суток после операции.) после операции степень латерализации моторного поведения рыбок увеличивается (n=6; р<0,001). Монокулярная депривация правшей и левшей, осуществленная с другой стороны тела, спустя 3-6 суток приводила к инверсии моторного предпочтения (фиг. 2, под цифрой 3; * звездочкой указаны статистически значимые различия, р<0,001).The degree of lateralization of fish was assessed using the coefficient of motor asymmetry (KMA), which is the ratio of the number of complete turns in the preferred direction to the sum of the turns in both directions made by the fish in 5 minutes of testing in a narrow rectilinear corridor (Mikhailova et al., 2005). A shift in the KMA to values below 0.47-0.50 during the experiment indicates an inversion of motor asymmetry, i.e. change of preference for side turns. In this part of the work, it was shown that gluing the eyes of fish - ambidextras, which initially did not have a preference for the side of turns, leads to the development of a preference for turns in the direction of deprivation, and already on the first day after the operation. The shift of motor asymmetry to the blinded side was more than 30% (n = 8, p <0.001). Bonding of the right eye in right-handed fish and bonding of the left eye in left-handed fish exacerbated the initial motor asymmetry and, as a result, a significant increase in KMA by approximately 30%. After 9 ± 2 days ¹ ( ¹ Average ± 95% confidence interval is indicated. In general, the scatter of days of testing fish motor asymmetry ranged from 2 to 23 days after surgery.) After surgery, the degree of lateralization of fish motor behavior increases (n = 6; p < 0.001). Monocular deprivation of right-handed and left-handed people, carried out on the other side of the body, after 3-6 days led to an inversion of motor preference (Fig. 2, under the number 3; * statistically significant differences are indicated with an asterisk, p <0.001).

В процессе наблюдения за поведением рыбок после отклеивания глазной маски было обнаружено, что предпочтение поворачиваться в сторону оперированного глаза, в целом, сохранялось. Очевидно, что сразу после депривации степень латерализации моторного поведения рыбок увеличивается и остается на высоком уровне через 18 дней после отклеивания глазной маски (n=10;*, р<0,05). Величина КМА в восстановительный период свидетельствовала о сохранении латерализованного состояния животных. Снижение среднего КМА после восстановительного периода относительно того же параметра после монокулярной депривации составляло от 9 до 15% у разных особей, оставаясь на 4-32% выше дооперационного значения КМА. Скорость совершения рыбками поворотов после операции статистически значимо снижалась с 4.4±0.6 до 2.4±0.4 пов./мин (p<0.001, n=8). При этом скорость поворотов возвращалась к исходному уровню и даже несколько превышала его через 17-18 дней после отклеивания глазной маски (5.7±1.3 пов./мин; р<0,05).In the process of observing the behavior of the fish after peeling off the eye mask, it was found that the preference to turn toward the operated eye, in general, remained. Obviously, immediately after deprivation, the degree of lateralization of the motor behavior of the fish increases and remains at a high level 18 days after peeling off the eye mask (n = 10; *, p <0.05). The value of KMA in the recovery period indicated the preservation of the lateralized state of animals. The decrease in average KMA after the recovery period relative to the same parameter after monocular deprivation was from 9 to 15% in different individuals, remaining 4-32% higher than the preoperative value of KMA. The rate of fish turning after surgery was statistically significantly reduced from 4.4 ± 0.6 to 2.4 ± 0.4 ppm (p <0.001, n = 8). In this case, the turning speed returned to the initial level and even slightly exceeded it 17-18 days after the eye mask was peeled off (5.7 ± 1.3 ppm; p <0.05).

Обнаруженная нами латерализация моторного поведения у золотых рыбок, подвергнутых монокулярной депривации, является, вероятнее всего, вариантом адаптивной стратегии головного мозга в ответ на одностороннее лишение зрительного опыта. Главными кандидатами на роль нейрональной мишени депривации в ЦНС, которая может быть вовлечена в изменение относительной частоты спонтанных поворотов, могут служить Маутнеровские нейроны и другие ретикулоспинальные клетки ствола мозга. Эти клетки принимают непосредственное участие в контроле моторной активности рыб и амфибий, преобразуя поступающую в головной мозг сенсорную информацию в командные сигналы для двигательных нейронов спинного мозга. В настоящее время известно, что Маутнеровская клетка рыб состоит из клеточного тела (сомы), имеющего максимальный диаметр 80 мкм, а длину 100 и более мкм, аксона, и двух дендритов, латерального и вентрального, отходящих от сомы под углом около 900 друг к другу. Кроме того, с вентральной стороны от тела клетки отходит несколько маленьких (медиальных) дендритов. Латеральный, самый крупный из дендритов, простирается от клеточного тела в латеро-каудальном направлении на расстояние около 360 мкм в область мозга, которую образуют входящие волокна VIII-го нерва. Вентральный дендрит отходит от тела клетки вблизи аксонного холмика в вентральном направлении на расстояние более 500 мкм. Сома и латеральный дендрит каждого Маутнеровского нейрона получают слуховую и вестибулярную, а вентральный дендрит - зрительную афферентацию. Аксон иннервирует через мотонейроны мускулатуру противоположной стороны тела. Слуховая (вестибулярная) или зрительная стимуляция одного из Маутнеровских нейронов, благодаря полному анатомическому перекресту зрительных нервов и аксонов, вызывает поворот тела рыбки. Примечательно, что Маутнеровские нейроны являются связующим звеном между зрительной информацией, поступающей в мозг, и спинальными мотонейронами, активирующими туловищную мускулатуру. В нашем случае развитие моторной асимметрии в ослепленную сторону можно объяснить перераспределением функциональной активности одного Маутнеровского нейрона относительно его напарника вследствие резкого изменения зрительного притока к этим нейронам. Поэтому вклад нейрона, испытавшего депривацию, в осуществление поворотов при свободном плавании рыбки усиливается. Исходя из этого, можно заключить, что стойкое увеличение моторной асимметрии в слепую сторону при энуклеации глаза, а, следовательно, и после заклеивания повязки, является характерным признаком посттравматических изменений сенсорно-двигательного аппарата именно на уровне Маутнеровских клеток.The lateralization of motor behavior that we discovered in goldfish subjected to monocular deprivation is, most likely, an option for an adaptive brain strategy in response to one-sided deprivation of visual experience. The main candidates for the role of a neuronal target for deprivation in the central nervous system, which may be involved in changing the relative frequency of spontaneous turns, are Mautner neurons and other reticulospinal cells of the brain stem. These cells are directly involved in the control of motor activity of fish and amphibians, transforming sensory information entering the brain into command signals for motor neurons of the spinal cord. Currently, it is known that the Mautner fish cell consists of a cell body (soma) having a maximum diameter of 80 μm, and a length of 100 or more μm, an axon, and two dendrites, lateral and ventral, extending from the soma at an angle of about 900 to each other . In addition, several small (medial) dendrites depart from the ventral side of the cell body. The lateral, the largest of the dendrites, extends from the cell body in the latero-caudal direction at a distance of about 360 microns to the area of the brain that the incoming fibers of the VIIIth nerve form. The ventral dendrite departs from the cell body near the axon knoll in the ventral direction to a distance of more than 500 microns. Soma and lateral dendrite of each Mautner neuron receive auditory and vestibular, and ventral dendrite - visual afferentation. Axon innervates through motor neurons the muscles of the opposite side of the body. Auditory (vestibular) or visual stimulation of one of the Mautner neurons, due to the complete anatomical intersection of the optic nerves and axons, causes the fish body to rotate. It is noteworthy that the Mautner neurons are the link between the visual information entering the brain and the spinal motor neurons that activate the trunk muscles. In our case, the development of motor asymmetry in the blinded direction can be explained by a redistribution of the functional activity of one Mautner neuron relative to its partner due to a sharp change in the visual influx to these neurons. Therefore, the contribution of the neuron that has experienced deprivation to the implementation of turns during free swimming of the fish is enhanced. Based on this, it can be concluded that a persistent increase in motor asymmetry to the blind side during enucleation of the eye, and, consequently, after gluing the dressing, is a characteristic sign of post-traumatic changes in the sensory-motor apparatus precisely at the level of Mautner cells.

Чтобы проверить предположение о вкладе Маутнеровских нейронов в развитие моторной асимметрии, был проведен анализ трехмерной структуры нейронов депривированных рыб с помощью трехмерной компьютерной реконструкции по серийным гистологическим срезам толщиной 3 мкм (Михайлова и др., 2012). Количественные данные, характеризующие объем сомы и дендритов нейронов, а также поведения рыбок до и после операции представлены в табл. 1. Буквами К и И в таблице обозначены Маутнеровский нейрон с повышенной частотой активации и менее активный Маутнеровский нейрон, соответственно. Нейрон с отметкой «К» является контралатеральным стороне операции и подвергается временному лишению зрительной афферентации, т.е. является временно депривированным. Видно, что объемы латеральных дендритов обоих нейронов, а также вентрального дендрита недепривированного нейрона сопоставимы в контроле и опыте; объемы соматических частей клеток также близки по своим значениям (различия составляют не более 25%). В то же время, объем стволового участка вентрального дендрита депривированного нейрона уменьшается почти в 2 раза по сравнению с объемом вентрального дендрита контрольных рыб (табл. 1). Еще одним структурным признаком депривации является увеличение объема медиальных дендритов депривированных Маутнеровских клеток (табл. 1).To verify the assumption of the contribution of the Mautner neurons to the development of motor asymmetry, an analysis was made of the three-dimensional structure of the neurons of deprived fish using three-dimensional computer reconstruction using serial histological sections 3 μm thick (Mikhailova et al., 2012). Quantitative data characterizing the volume of soma and dendrites of neurons, as well as the behavior of fish before and after surgery are presented in table. 1. The letters K and I in the table indicate the Mautner neuron with an increased activation frequency and the less active Mautner neuron, respectively. A neuron marked “K” is on the contralateral side of the operation and is temporarily deprived of visual afferentation, i.e. is temporarily deprived. It can be seen that the volumes of the lateral dendrites of both neurons, as well as the ventral dendrite of the non-priming neuron, are comparable in control and experiment; the volumes of the somatic parts of the cells are also close in their values (the differences are no more than 25%). At the same time, the volume of the stem section of the ventral dendrite of the deprived neuron is reduced by almost 2 times compared with the volume of the ventral dendrite of control fish (Table 1). Another structural feature of deprivation is an increase in the volume of medial dendrites of deprived Mautner cells (Table 1).

Обозначения: ЛД, ВД и МД - латеральный, вентральный и медиальные дендриты, соответственно, КМА - коэффициент моторной асимметрии. Звездочкой * отмечены статистически значимые различия объемов вентральных и медиальных дендритов именно депривированных нейронов. Звездочкой ** отмечены статистически значимые различия КМА после операции от КМА до операции, р<0,005; КМА рассчитывали по результатам тестирования на 2-11 сутки после операции (в среднем, 6±1 сут).Designations: LD, VD and MD - lateral, ventral and medial dendrites, respectively, KMA - coefficient of motor asymmetry. An asterisk * indicates statistically significant differences in the volumes of ventral and medial dendrites of precisely deprived neurons. An asterisk ** indicates statistically significant differences in KMA after surgery from KMA to surgery, p <0.005; KMA was calculated according to the test results on 2-11 days after surgery (on average, 6 ± 1 day).

Через 18 суток со дня отклеивания маски значение коэффициента латерализации моторной функции снижалось до 0,59±0,14. Мозг фиксировали на 18-е сутки после отклеивания глазной маски. Очевидно, что объем вентрального дендрита левого нейрона, временно переставшего принимать зрительную афферентацию вследствие операции, остается меньшим в сравнении с дендритом своего зеркального аналога (табл. 2). Кроме того, количество и объем медиальных дендритов у рыбок, подвергнутых монокулярной депривации (табл. 1), увеличивается, а впоследствии, после восстановительного периода, снова уменьшается до исходного уровня (табл. 1 и 2). Результат можно объяснить тем, что скорость поворотов рыб с заклеенным глазом снижается, а после восстановительного периода данный параметр возвращается к норме. Статистический анализ, проведенный на нескольких рыбках, чей мозг был зафиксирован спустя примерно 2 недели после отклеивания глазной маски, подтвердил указанное наблюдение (табл. 2). Медиальные и вентральные дендриты Маутнеровского нейрона содержат на своей поверхности многочисленные тормозные синапсы, и, судя по данным результатам, депривация вызывает увеличение общего количества синапсов на единицу поверхности дендрита, а, значит, и изменение эффективности тормозной синаптической передачи. В целом, полученные данные указывают на роль тормозных влияний, опосредуемых ингибиторными нейронами, главными нейромедиаторами которых являются ГАМК и глицин.After 18 days from the day the mask was peeled off, the lateralization coefficient of the motor function decreased to 0.59 ± 0.14. The brain was fixed on the 18th day after peeling off the eye mask. Obviously, the volume of the ventral dendrite of the left neuron, temporarily ceasing to accept visual afferentation due to surgery, remains smaller in comparison with the dendrite of its mirror analogue (Table 2). In addition, the number and volume of medial dendrites in fish subjected to monocular deprivation (Table 1) increases, and subsequently, after the recovery period, decreases again to the initial level (Tables 1 and 2). The result can be explained by the fact that the speed of rotation of fish with a sealed eye decreases, and after the recovery period, this parameter returns to normal. Statistical analysis performed on several fish, whose brain was recorded approximately 2 weeks after the eye mask was peeled off, confirmed this observation (Table 2). The medial and ventral dendrites of the Mautner neuron contain numerous inhibitory synapses on their surface, and, judging by these results, deprivation causes an increase in the total number of synapses per unit surface of the dendrite, and, therefore, a change in the efficiency of inhibitory synaptic transmission. In general, the obtained data indicate the role of inhibitory effects mediated by inhibitory neurons, the main neurotransmitters of which are GABA and glycine.

Обозначения в таблице 2 те же, что и в таблице 1. Звездочкой * указано значимое отличие объема дендрита от контроля, р<0,05. Звездочками ** отмечены статистически значимые отличия КМА после операции от КМА в контроле, р<0,001; КМА рассчитывали по результатам тестирования на 7-17 сутки со дня операции (в среднем, 11±2 сут). Звездочками *** отмечены значения КМА, которые рассчитывали по результатам тестирования на 6-18 сутки после окончания депривации (в среднем, 12±1 сут).The designations in table 2 are the same as in table 1. An asterisk * indicates a significant difference between the volume of the dendrite from the control, p <0.05. Asterisks ** indicate statistically significant differences in KMA after surgery from KMA in the control, p <0.001; KMA was calculated according to the results of testing on days 7-17 from the day of surgery (on average, 11 ± 2 days). Asterisks *** indicate KMA values, which were calculated according to the test results on 6-18 days after the end of deprivation (on average, 12 ± 1 day).

Пример 2. Изучение асимметрии оптомоторного ответа в условиях монокулярной депривации.Example 2. The study of the asymmetry of the optomotor response under conditions of monocular deprivation.

Логично было бы предположить, что возможной причиной неполного восстановления поведения рыбок и, следовательно, функции Маутнеровских нейронов является травмирующее воздействие депривации на оперируемый глаз, вследствие чего зрение само по себе не восстанавливается, или восстанавливается частично. Чтобы выяснить этот вопрос, было исследовано влияние оптокинетической стимуляции на плавание рыбок в правую и левую стороны. Такой способ оценки зрительного восприятия рыбки основан на оптомоторной реакции, инстинктивном следовании животных за движущимися ориентирами. Унилатеральную зрительную стимуляцию проводили с помощью оптомоторного барабана, вращающегося со скоростью 30 оборотов в мин, с наклеенными на него контрастными черно-белыми полосками (пространственная частота подачи сигнала 0,04 цикл/град). Для оценки сохранности зрительного восприятия рыбки был использован экспериментальный тест-аквариум, модифицированный внутренней непрозрачной стенкой с учетом преимущественно монокулярного зрения золотых рыбок, так, чтобы объект исследования мог видеть движущиеся полоски оптомоторного барабана только одним глазом, правым или левым (Штанчаев, 2008). Ширина импровизированного кольцевого канала в модифицированном экспериментальном контейнере составляла 3 см, длина (по центру) - 30 см. Регистрировали время, затраченное на совершение рыбкой полного круга вдоль канала тест-аквариума против часовой стрелки (в левую сторону, стимулируется правый глаз) и по часовой стрелке (в правую сторону, активен левый глаз). Каждое тестирование включало совершение 9 полных кругов вслед за оптомоторным барабаном, после чего подсчитывали среднее значение затраченного времени (сек) и, зная длину пройденного трека, считали среднюю скорость плавания рыбки при стимуляции правого и левого глаза. В ходе выполнения данной части исследования мы обнаружили взаимосвязь между степенью моторного предпочтения контрольных рыбок и скоростью их реакции на движущиеся полоски оптомоторного барабана. Из всех исследованных рыбок-«правшей» и «левшей» примерно три четверти (14 из 18) характеризовались тем, что плавали быстрее за движущимися полосками в ту сторону, в которую они предпочитали поворачиваться (табл. 3). Мы вычисляли для каждой рыбки коэффициент асимметрии оптомоторной реакции (КАОР) как отношение скорости в предпочитаемом направлении к сумме скоростей в обоих направлениях. Было показано, что КАОР и КМА амбидекстров близко соответствовали друг другу (табл.3), причем приблизительно у 80% нелатерализованных рыбок (14 из 17) наблюдалась прямая корреляция между средними значениями КМА и КАОР. В общем, из обследованных 35 рыбок 28 (80%) обладали выраженной взаимосвязью двух видов моторного поведения - оптомоторной реакцией и моторной асимметрией; коэффициент корреляции составлял 0.61 (р<0.001).It would be logical to assume that the traumatic effect of deprivation on the operated eye is a possible reason for the incomplete restoration of the behavior of fish and, therefore, the function of the Mautner neurons, as a result of which vision itself is not restored, or partially restored. To clarify this issue, the effect of optokinetic stimulation on the swimming of fish in the right and left sides was investigated. This method of assessing the visual perception of the fish is based on the optomotor reaction, the instinctive following of animals for moving landmarks. Unilateral visual stimulation was performed using an optomotor drum rotating at a speed of 30 revolutions per minute, with contrasting black and white strips glued on it (the spatial frequency of the signal was 0.04 cycle / deg). To assess the visual perception safety of the fish, we used an experimental test aquarium modified with an internal opaque wall, taking into account the predominantly monocular vision of goldfish, so that the object of study could see the moving strips of the optomotor drum with only one eye, right or left (Shtanchaev, 2008). The width of the makeshift ring channel in the modified experimental container was 3 cm, the length (in the center) was 30 cm. The time spent making a fish full circle along the channel of the test aquarium counter-clockwise (to the left, the right eye is stimulated) was recorded and clockwise arrow (to the right side, the left eye is active). Each test involved 9 complete laps following an optomotor drum, after which the average time spent (s) was calculated and, knowing the length of the track traveled, the average swimming speed of the fish was counted during stimulation of the right and left eyes. In the course of this part of the study, we found a relationship between the degree of motor preference of control fish and the speed of their reaction to the moving strips of the optomotor drum. Of all the studied “right-handed” and “left-handed” fish, approximately three quarters (14 of 18) were characterized by the fact that they swam faster behind the moving strips in the direction they preferred to turn (Table 3). For each fish, we calculated the asymmetry coefficient of the optomotor reaction (KAOR) as the ratio of the speed in the preferred direction to the sum of the speeds in both directions. It was shown that KAOR and KMA of ambidextras closely corresponded to each other (Table 3), and approximately 80% of non-lateralized fish (14 of 17) showed a direct correlation between the average values of KMA and KAOR. In general, of the 35 fish examined, 28 (80%) had a pronounced relationship between the two types of motor behavior - optomotor reaction and motor asymmetry; the correlation coefficient was 0.61 (p <0.001).

Обозначения: *, значимое отличие скорости плавания в разных направлениях (р<0.01). КАОР - коэффициент асимметрии оптомоторной реакции, КМА - коэффициент моторной асимметрииDesignations: *, significant difference in swimming speed in different directions (p <0.01). KAOR - coefficient of asymmetry of optomotor reaction, KMA - coefficient of motor asymmetry

Был проведен анализ влияния зрительной депривации на зрительно-моторное поведение рыбок-амбидекстров, а именно, на асимметрию оптомоторных реакций. Обнаружено, что время совершения полного оборота вокруг внутренней стенки тест-аквариума у рыбок, подвергнутых зрительной депривации, не отличается существенно при стимуляции оперированного глаза и при стимуляции интактного глаза. При пересчете измеренного времени на скорость было обнаружено, что скорость следования за оптомоторным барабаном в темпоро-назальную и назо-темпоральную стороны у интактных рыбок, не обладающих моторной асимметрией, практически не отличается. Примерно такое же поведение демонстрируют рыбки-амбидекстры после заклейки правого глаза и дальнейшей реабилитации, хотя скорость плавания по часовой стрелке (стимулируется левый, неоперированный глаз) незначительно выше. И, наконец, как и следовало ожидать, рыбки, потерявшие правый глаз в раннем возрасте в результате естественной травмы и попавшие в лабораторию фактически уже как одноглазые, очень неохотно плыли в темпоро-назальном направлении, соответствующем «слепой» стороне (против часовой стрелки), часто поворачивались, легко теряли интерес к полоскам, не могли за ними уследить. Значения КМА депривированных рыбок после депривации не снижаются, в отличие от значений КАОР для тех же рыбок (р<0,01). Полученные результаты дают основание предполагать, что глаз животного, подвергшийся операции, сохраняет свое морфофункциональное состояние на уровне, близком к интактному. Более того, анализ моторной реакции рыбок после периода реабилитации на визуальную стимуляцию наводит на мысль о том, что, по крайней мере, базовые зрительные функции мозга, связанные с активностью первичного зрительного анализатора - тектума, после операции не нарушены. После депривации способность выполнять оптомоторный рефлекс не меняется, однако при этом, степень моторной латерализации рыб растет и не падает до первоначального уровня даже после восстановительного периода. Следовательно, необходимо восстанавливать именно моторную функцию животного, подвергнутого депривации.An analysis was made of the effect of visual deprivation on the visual-motor behavior of ambidextrous fish, namely, on the asymmetry of optomotor reactions. It was found that the time of a complete revolution around the inner wall of the test aquarium in fish subjected to visual deprivation does not differ significantly during stimulation of the operated eye and during stimulation of the intact eye. When converting the measured time to speed, it was found that the speed following the optomotor drum to the temporal-nasal and naso-temporal sides in intact fish that do not have motor asymmetry is practically the same. Approximately the same behavior is shown by ambidextra fish after gluing the right eye and further rehabilitation, although the swimming speed in a clockwise direction (the left, unoperated eye is stimulated) is slightly higher. And finally, as one would expect, fish that lost their right eye at an early age as a result of natural trauma and got into the laboratory almost as one-eyed ones, were very reluctant to swim in the tempo-nasal direction corresponding to the “blind” side (counterclockwise), often turned, easily lost interest in the strips, could not keep track of them. The KMA values of deprived fish after deprivation do not decrease, in contrast to the KAOR values for the same fish (p <0.01). The results obtained suggest that the animal’s eye, which has undergone surgery, retains its morphofunctional state at a level close to intact. Moreover, analysis of the fish motor reaction after a period of rehabilitation for visual stimulation suggests that at least the basic visual functions of the brain associated with the activity of the primary visual analyzer - tectum, are not disturbed after the operation. After deprivation, the ability to perform the optomotor reflex does not change, however, the degree of motor lateralization of fish increases and does not drop to the initial level even after a recovery period. Therefore, it is necessary to restore the motor function of the animal subjected to deprivation.

Пример 3. Влияние тренировочных сеансов оптокинетической стимуляции в сочетании с системной аппликацией глицина на моторное поведение рыбок.Example 3. The effect of training sessions optokinetic stimulation in combination with systemic application of glycine on the motor behavior of fish.

В поиске способов восстановления моторного поведения после отклейки глазной маски мы остановились на традиционном в неврологии подходе к восстановлению после перенесенных повреждений нейронов и мозга в целом, основанном на сочетании терапевтической реабилитации («тренировка ослабленной функции») с фармакологическим лечением (Montey et al., 2013). Было предположено, что кратковременные тренировочные сеансы оптокинетической стимуляции в темпороназальном направлении (Tsaplina et al., 2010; Montey et al., 2013) в сочетании с глицином, нейротрофическим и нейропротекторным фактором (Cervetto et Taccola, 2008), способны привести к возвращению измененного двигательного поведения рыбок в дооперационное состояние. Учитывая преимущественно унилатеральный характер зрительной стимуляции (Shtanchayev et al., 2007), мы предположили, что в восприятии темпоро-назального вращения полосок оптомоторного барабана был задействован, прежде всего, оперированный глаз рыбки. Поэтому всех рыбок с оперированным правым глазом мы подвергали тренировочным сеансам оптокинетической стимуляции в направлении против часовой стрелки. Выбор глицина в качестве фармакологического агента объясняется, к тому же, тем, что он представлен в качестве одного из главных тормозных нейротрансмиттеров золотой рыбки наряду с ГАМК (Curtin et Preuss, 2015). Поскольку глицин слабо проникает через гематоэнцефалический барьер, применяли высокие концентрации препарата в сочетании с его пролонгированным действием. При этом тренировочные сеансы КОС проводили в емкости с раствором глицина (Helicon) в концентрации, соответствующей длительности сеанса. Тренировку рыбок начинали на следующие сутки после отклеивания глазной маски, ежедневно сеанс стимуляции удлинялся на 40 мин, достигая на 15-ый день 600 мин (10 часов). Рыбок тестировали с 1-х по 8-11-е сутки после окончания тренировочных сеансов. На рисунке треугольными маркерами отображены значения параметров КМА рыбок до депривации (фиг. 2), круговыми маркерами - после депривации и квадратными маркерами - после тренировочных сеансов оптокинетической стимуляции. Было обнаружено, что тренировочные сеансы оптокинетической стимуляции в сочетании с глицином снижали средний КМА до уровня предоперационного значения (фиг. 2). В данной серии экспериментов, также как и ранее, было выявлено уменьшение скорости поворотов рыбок после депривации по сравнению с предоперационными значениями скорости поворотов (фиг. 3). На рисунке треугольными маркерами отображены значения параметров скорости совершения рыбками поворотов до депривации, круговыми маркерами - после депривации и квадратными маркерами - после тренировочных сеансов оптокинетической стимуляции (фиг. 3). Характерно, что после прекращения действия монокулярной депривации (отклейки глазной маски) на фоне тренировочных сеансов скорость совершения поворотов рыбками увеличивалась по сравнению со значениями скорости рыбок с заклеенным глазом, достигая уровня, характерного для предоперационных значений. При анализе моторного поведения индивидуальных рыбок в динамике восстановления после перенесенной операции были выявлены некоторые специфические особенности. У одной рыбки, средняя величина КМА которой до операции составляла 0.49±0.14 (что характеризует ее как амбидекстра), после закрытия правого глаза наблюдалось ожидаемое развитие предпочтения правой стороны поворотов (правосторонний КМА составлял 0.70±0.11). После терапии с помощью оптокинетических стимуляций средний КМА составлял 0.55±0.04, что характеризует рыбку как слабо латерализованную правшу. Можно заметить, что моторное поведение данной рыбки не сильно отличалось от поведения рыбок, после депривации не подвергавшихся лечению. Такой же результат наблюдался у другой рыбки, средний КМА которой, рассчитанный по правой стороне, до операции был равен 0.49±0.13, после заклейки правого глаза поднимался до 0.66±0.07, а после отклейки глазной маски и тренировочных сеансов оптокинетической стимуляции составлял 0.59±0.10. В то же время, у других рыбок-амбидекстров после заклеивания правого глаза степень латерализации увеличивалась до 0.66±0.06 и 0.80±0.09, соответственно, а после тренировочных сеансов снижалась до 0.44±0.06 и 0.51±0.10, соответственно. Таким образом, анализ моторного поведения оперированных рыбок показал, что оптокинетическая стимуляция, проводимая в усиленном режиме (Dektyareva et al., 2008), в сочетании с глицином повышенной концентрации снижала среднее значение КМА до предоперационного уровня. Однако, исходя из особенностей моторного поведения рыбок, можно заметить, что тренировочные сеансы выявили две группы рыбок. В одной группе рыбки сильнее реагировали на тренировочные сеансы: КМА таких рыбок снижался значительнее. Этот результат согласуется с полученными ранее данными по оптокинетической стимуляции в темпоро-назальном направлении (Shtanchaev et al., 2007). Скорее всего, у рыбок глаза функционально асимметричны: один них является доминантным и обеспечивает активное слежение за полосками, другой - субдоминантным, которым рыбка при следовании за оптокинетическим барабаном пользуется в гораздо меньшей степени. Таким образом, при исследовании вопроса о снижении зрительной функции недепривированного глаза после монокулярной депривации необходимо принимать во внимание не только моторное предпочтение животных, но и исходную латерализацию зрения.In the search for ways to restore motor behavior after removing the eye mask, we stopped at a neurological approach to recovering from injuries of neurons and the brain as a whole, based on a combination of therapeutic rehabilitation (“training of weakened function”) with pharmacological treatment (Montey et al., 2013 ) It was suggested that short-term training sessions of optokinetic stimulation in the temporonasal direction (Tsaplina et al., 2010; Montey et al., 2013) in combination with glycine, a neurotrophic and neuroprotective factor (Cervetto et Taccola, 2008), can lead to the return of an altered motor behavior of fish in the preoperative state. Given the predominantly unilateral nature of visual stimulation (Shtanchayev et al., 2007), we suggested that the operated eye of a fish was primarily involved in the perception of the temporal-nasal rotation of the strips of the optomotor drum. Therefore, we subjected all the fish with the operated right eye to training sessions of optokinetic stimulation in the counterclockwise direction. The choice of glycine as a pharmacological agent is also explained by the fact that it is presented as one of the main inhibitory neurotransmitters of a goldfish along with GABA (Curtin et Preuss, 2015). Since glycine weakly penetrates the blood-brain barrier, high concentrations of the drug were used in combination with its prolonged action. At the same time, training sessions of CBS were carried out in a container with a solution of glycine (Helicon) in a concentration corresponding to the duration of the session. The fish training began on the next day after peeling off the eye mask, the stimulation session was prolonged daily by 40 minutes, reaching 600 minutes (10 hours) on the 15th day. The fish was tested from 1 to 8-11 days after the end of training sessions. In the figure, the triangular markers show the values of the KMA parameters of the fish before deprivation (Fig. 2), with circular markers after deprivation and square markers after training sessions of optokinetic stimulation. It was found that training sessions of optokinetic stimulation in combination with glycine reduced the average KMA to the level of preoperative values (Fig. 2). In this series of experiments, as before, a decrease in the speed of rotation of the fish after deprivation was detected compared with the preoperative values of the speed of rotation (Fig. 3). In the figure, the triangular markers show the speed parameters of the fish making turns before deprivation, the circular markers after deprivation and the square markers after training sessions of optokinetic stimulation (Fig. 3). It is characteristic that after the termination of the action of monocular deprivation (peeling off the eye mask) on the background of training sessions, the speed of turning the fish increased compared to the speed of the fish with a glued eye, reaching the level characteristic of preoperative values. When analyzing the motor behavior of individual fish in the dynamics of recovery after surgery, some specific features were revealed. In one fish, the average KMA of which before the operation was 0.49 ± 0.14 (which characterizes it as ambidextra), after closing the right eye, the expected development of preference for the right side of the turns was observed (right-sided KMA was 0.70 ± 0.11). After therapy with optokinetic stimulations, the average KMA was 0.55 ± 0.04, which characterizes the fish as a weakly lateralized right-hander. It can be noted that the motor behavior of this fish did not differ much from the behavior of the fish that had not been treated after deprivation. The same result was observed in another fish, the average KMA of which, calculated on the right side, before the operation was 0.49 ± 0.13, after gluing the right eye rose to 0.66 ± 0.07, and after peeling off the eye mask and training sessions of optokinetic stimulation it was 0.59 ± 0.10. At the same time, in other ambidextra fish, after gluing the right eye, the degree of lateralization increased to 0.66 ± 0.06 and 0.80 ± 0.09, respectively, and after training sessions it decreased to 0.44 ± 0.06 and 0.51 ± 0.10, respectively. Thus, an analysis of the motor behavior of the operated fish showed that optokinetic stimulation performed in an enhanced mode (Dektyareva et al., 2008), in combination with increased concentration of glycine, reduced the average KMA to a preoperative level. However, based on the characteristics of the motor behavior of the fish, it can be noted that the training sessions revealed two groups of fish. In one group, the fish responded more strongly to training sessions: the KMA of such fish decreased more significantly. This result is consistent with previously obtained data on optokinetic stimulation in the temporanasal direction (Shtanchaev et al., 2007). Most likely, the eyes of the fish are functionally asymmetric: one of them is dominant and provides active tracking of the strips, the other is subdominant, which the fish uses to a much lesser extent when following the optokinetic drum. Thus, when studying the question of reducing the visual function of an undigested eye after monocular deprivation, it is necessary to take into account not only the motor preference of animals, but also the initial lateralization of vision.

Взятые в целом, результаты, полученные в настоящей работе, на наш взгляд, могут послужить основой для создания биомедицинской модели монокулярной депривации, которая будет способствовать расшифровке механизмов сенсомоторной интеграции при депривационной амблиопии и поиску способов коррекции указанных нарушений у человека.Taken as a whole, the results obtained in this work, in our opinion, can serve as the basis for creating a biomedical model of monocular deprivation, which will help to decipher the mechanisms of sensorimotor integration during deprivation amblyopia and to find ways to correct these disorders in humans.

Источники информацииInformation sources

1. G.T. Prusky, N.M. Alam, R.M. Douglas, Enhancement of vision by monocular deprivation in adult mice. J. Neurosci. 26, 11554-11561, 2006.1. G.T. Prusky, N.M. Alam, R.M. Douglas, Enhancement of vision by monocular deprivation in adult mice. J. Neurosci. 26, 11554-11561, 2006.

2. E. Niechwiej-Szwedo, H.C. Goltz, M. Chandrakumar, A.M. F. Wong, The Effect of Sensory Uncertainty Due to Amblyopia (Lazy Eye) on the Planning and Execution of Visually-Guided 3D Reaching Movements. PLoS ONE, 2012, Vol. 7, No. 2, P. 1-12.2. E. Niechwiej-Szwedo, H.C. Goltz, M. Chandrakumar, A.M. F. Wong, The Effect of Sensory Uncertainty Due to Amblyopia (Lazy Eye) on the Planning and Execution of Visually-Guided 3D Reaching Movements. PLoS ONE, 2012, Vol. 7, No. 2, P. 1-12.

3. K. Iny, A.J. Heynen, E. Sklar, and M.F. Bear, BidirectionalModifications of Visual Acuity Induced by Monocular Deprivation in Juvenile and Adult Rats. The Journal of Neuroscience, 2006, Vol. 26, No. 28, P. 7368-7374.3. K. Iny, A.J. Heynen, E. Sklar, and M.F. Bear, Bidirectional Modifications of Visual Acuity Induced by Monocular Deprivation in Juvenile and Adult Rats. The Journal of Neuroscience, 2006, Vol. 26, No. 28, P. 7368-7374.

4. M. Kaneko, M.P. Stryker, Sensory experience during locomotion promotes recovery of function in adult visual cortex. Elife, 2014, P. 1-16.4. M. Kaneko, M.P. Stryker, Sensory experience during locomotion promotes recovery of function in adult visual cortex. Elife, 2014, p. 1-16.

5. С. Tailby, L.L. Wright, A.B. Metha, and M.B. Calford, Activity-dependent maintenance and growth of dendrites in adult cortex. PNAS, 2005, Vol. 102, No. 12, P. 4631-4636.5.C. Tailby, L.L. Wright, A.B. Metha, and M.B. Calford, Activity-dependent maintenance and growth of dendrites in adult cortex. PNAS, 2005, Vol. 102, No. 12, P. 4631-4636.

6. V.A. Sovrano, A. Bisazza, and G. Vallortigara, Lateralization of response to social stimuli in fishes: A comparison between different methods and species. Physiology and Behavior, 2001, Vol. 74, P. 237-244.6. V.A. Sovrano, A. Bisazza, and G. Vallortigara, Lateralization of response to social stimuli in fishes: A comparison between different methods and species. Physiology and Behavior, 2001, Vol. 74, P. 237-244.

7. M. Dadda, V.A. Nepomnyashchikh, E.I. Izvekov, and A. Bisazza, Individual-Level Consistency of Different Laterality Measures in the Goldbelly Topminnow. Behavioral Neuroscience, 2012, Vol. 126, No. 6, P. 845-849.7. M. Dadda, V.A. Nepomnyashchikh, E.I. Izvekov, and A. Bisazza, Individual-Level Consistency of Different Laterality Measures in the Goldbelly Topminnow. Behavioral Neuroscience, 2012, Vol. 126, No. 6, P. 845-849.

8. R.S. Shtanchayev, G.Z. Mikhailova, N.Y. Dektyareva, N.A. Kokanova, N.R. Tiras, D.A. Moshkov, Effects of optokinetic stimulation on motor asymmetry in the goldfish. Neurophysiology, 2007, Vol. 39, P. 118-129.8. R.S. Shtanchayev, G.Z. Mikhailova, N.Y. Dektyareva, N.A. Kokanova, N.R. Tiras, D.A. Moshkov, Effects of optokinetic stimulation on motor asymmetry in the goldfish. Neurophysiology, 2007, Vol. 39, P. 118-129.

9. M.B. Orger, M.C. Smear, S.M. Anstis, H. Baier, Perception of Fourier and non-Fourier motion by larval zebrafish. Nat Neurosci, 2000, Vol. 3, P. 1128-1133.9. M.B. Orger, M.C. Smear, S.M. Anstis, H. Baier, Perception of Fourier and non-Fourier motion by larval zebrafish. Nat Neurosci, 2000, Vol. 3, P. 1128-1133.

10. D.A. Moshkov, R.S. Shtanchaev, I.B. Mikheeva, E.N. Bezgina, N.A. Kokanova, G.Z. Mikhailova, N.R. Tiras, L.L. Pavlik, Visual input controls the functional activity of goldfish Mauthner neuron through the reciprocal synaptic mechanism. J. Integr. Neurosci., 2013, Vol. 12, P. 17-34.10. D.A. Moshkov, R.S. Shtanchaev, I.B. Mikheeva, E.N. Bezgina, N.A. Kokanova, G.Z. Mikhailova, N.R. Tiras, L.L. Pavlik, Visual input controls the functional activity of goldfish Mauthner neuron through the reciprocal synaptic mechanism. J. Integr. Neurosci., 2013, Vol. 12, P. 17-34.

11. H. Korn, D.S. Faber, The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making? Neuron, 2005, Vol. 47, P. 13-28.11. H. Korn, D.S. Faber, The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making? Neuron, 2005, Vol. 47, p. 13-28.

12. Г.З. Михайлова, H.A. Коканова, H.P. Тирас, Д.А. Мошков, Трехмерная реконструкция и определение объема нейрона, Москва: Книжный дом "ЛИБРОКОМ", 2012, 80 С.12. G.Z. Mikhailova, H.A. Kokanova, H.P. Tiras, D.A. Moshkov, Three-dimensional reconstruction and determination of the volume of a neuron, Moscow: Book House "LIBROKOM", 2012, 80 S.

13. D.A. Moshkov, G.Z. Mikhailova, Е.Е. Grigorieva, R.S. Shtanchaev, Role of different dendrites in the functional activity of the central neuron controlling goldfish behavior. J. Integr. Neurosci.,2009, Vol. 8, P. 441-451.13. D.A. Moshkov, G.Z. Mikhailova, E.E. Grigorieva, R.S. Shtanchaev, Role of different dendrites in the functional activity of the central neuron controlling goldfish behavior. J. Integr. Neurosci., 2009, Vol. 8, P. 441-451.

14. T.N. Wiesel, D.H. Hubel, Effects of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body. J. Neurophysiol, 1963, Vol. 26, P. 978-993.14. T.N. Wiesel, D.H. Hubel, Effects of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body. J. Neurophysiol, 1963, Vol. 26, P. 978-993.

15. S.S. Easter, Pursuit eye movements in goldfish (Carassius auratus). Vision Res, 1972, Vol. 12, P. 673-688.15. S.S. Easter, Pursuit eye movements in goldfish (Carassius auratus). Vision Res, 1972, Vol. 12, P. 673-688.

16. K.A. Fritsches, N.J. Marshall, Independent and conjugate eye movements during optokinesis in teleost fish. J. Exp. Biol, 2002, Vol. 205, P. 1241-1252.16. K.A. Fritsches, N.J. Marshall, Independent and conjugate eye movements during optokinesis in teleost fish. J. Exp. Biol, 2002, Vol. 205, P. 1241-1252.

17. H. Qian, Y. Zhu, D. J. Ramsey, R.L. Chappell, J.E. Dowling and H. Ripps, Directional Asymmetries in the Optokinetic Response of Larval Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish, 2005, Vol. 2, No. 3, P. 189-196.17. H. Qian, Y. Zhu, D. J. Ramsey, R. L. Chappell, J.E. Dowling and H. Ripps, Directional Asymmetries in the Optokinetic Response of Larval Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish, 2005, Vol. 2, No. 3, P. 189-196.

18. D.J. Cameron, F. Rassamdana, P. Tarn, K. Dang, C. Yanez, S. Ghaemmaghami, M.I. Dehkordi, The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish. J. Vis. Exp., 2013, Vol. 80, P. 1-6.18. D.J. Cameron, F. Rassamdana, P. Tarn, K. Dang, C. Yanez, S. Ghaemmaghami, M.I. Dehkordi, The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish. J. Vis. Exp., 2013, Vol. 80, P. 1-6.

19. C.M. Maurer, Y.-Yu Huang, and S.C. F. Neuhauss, Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev. Neurosci., Vol. 22, No. 1, P. 5-16, 2011.19. C.M. Maurer, Y.-Yu Huang, and S.C. F. Neuhauss, Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev. Neurosci., Vol. 22, No. 1, P. 5-16, 2011.

20. C. Tappeiner, S. Gerber, V. Enzmann, J. Balmer, A. Jazwinska and M. Tschopp, Visual Acuity and Contrast Sensitivity of Adult Zebrafish. Front. Zool., 2012, Vol. 9, No. 10, P. 1-6.20. C. Tappeiner, S. Gerber, V. Enzmann, J. Balmer, A. Jazwinska and M. Tschopp, Visual Acuity and Contrast Sensitivity of Adult Zebrafish. Front Zool., 2012, Vol. 9, No. 10, P. 1-6.

21. J.M. Rick, I. Horschke and S.C.F. Neuhauss, Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae. Current Biology, 2000, Vol. 10, No. 10, P. 595-598.21. J.M. Rick, I. Horschke and S.C.F. Neuhauss, Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae. Current Biology, 2000, Vol. 10, No. 10, P. 595-598.

22. J.M. Stujenske, J.E. Dowling, and F. Emran, The bugeye mutant zebrafish exhibits visual deficits that arise with the onset of an enlarged eye phenotype. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci, 2011, Vol.52, P. 4200-4207.22. J.M. Stujenske, J.E. Dowling, and F. Emran, The bugeye mutant zebrafish exhibits visual deficits that arise with the onset of an enlarged eye phenotype. Invest. Ophthalmol. Vis Sci, 2011, Vol. 52, P. 4200-4207.

23. S.C.F. Neuhauss, O. Biehlmaier, M.W. Seeliger, T. Das, K. Kohler, W.A. Harris, and H. Baier, Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci, 1999, Vol.19, P.8603-8615.23. S.C.F. Neuhauss, O. Biehlmaier, M.W. Seeliger, T. Das, K. Kohler, W.A. Harris, and H. Baier, Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci, 1999, Vol.19, P.8603-8615.

24. E.E. Grigorieva, R.S. Shtanchayev, G.Z. Mikhailova, N.R. Tiras, D.A. Moshkov, Changes in the motor asymmetry and structure of Mauthner neurons of the goldfish resulting from unilateral visual deprivation. Neurophysiology, 2010, Vol. 42, P. 185-196.24. E.E. Grigorieva, R.S. Shtanchayev, G.Z. Mikhailova, N.R. Tiras, D.A. Moshkov, Changes in the motor asymmetry and structure of Mauthner neurons of the goldfish resulting from unilateral visual deprivation. Neurophysiology, 2010, Vol. 42, P. 185-196.

25. R.S. Shtanchayev, G.Z. Mikhailova, N.Y. Dektyareva, N.A. Kokanova, N.R. Tiras, D.A. Moshkov, Effects of optokinetic stimulation on motor asymmetry in the goldfish. Neurophysiology, 2007, Vol. 39, P. 118-129.25. R.S. Shtanchayev, G.Z. Mikhailova, N.Y. Dektyareva, N.A. Kokanova, N.R. Tiras, D.A. Moshkov, Effects of optokinetic stimulation on motor asymmetry in the goldfish. Neurophysiology, 2007, Vol. 39, P. 118-129.

26. Р.Ш. Штанчаев, Разработка физиологических моделей для исследования морфофункциональной асимметрии маутнеровских нейронов золотой рыбки. Дисс.на соиск. уч. ст. канд. биол. наук, Пущино, 2008.26. R.Sh. Shtanchaev, Development of physiological models for the study of morphofunctional asymmetry of Mautner goldfish neurons. Diss. For the competition. student Art. Cand. biol. Sciences, Pushchino, 2008.

27. A. Burgess, Н. Schoch, and М. Granato, Distinct Retinal Pathways Drive Spatial Orientation Behaviors in Zebrafish Navigation. Current Biology, 2010, Vol. 20, P. 381-386.27. A. Burgess, N. Schoch, and M. Granato, Distinct Retinal Pathways Drive Spatial Orientation Behaviors in Zebrafish Navigation. Current Biology, 2010, Vol. 20, P. 381-386.

28. M.B. Ahrens, J.M. Li, M.B. Orger, D.N. Robson, A.F., Schier, F. Engert and R. Portugues, Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish, Nature, 2012, Vol. 485, P. 471-477.28. M.B. Ahrens, J.M. Li, M.B. Orger, D.N. Robson, A.F., Schier, F. Engert and R. Portugues, Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish, Nature, 2012, Vol. 485, P. 471-477.

29. B. Brent, Apparatus and methods for preventing ocular dehydration in anesthetized small animals, US2014352703 Patent Application Publication, 2014.29. B. Brent, Apparatus and methods for preventing ocular dehydration in anesthetized small animals, US2014352703 Patent Application Publication, 2014.

30. K.L. Montey, N.C. Eaton, E.M. Quinlan, Repetitive visual stimulation enhances recovery from severe amblyopia. Learn. Mem., 2013, Vol.20, P. 311-317.30. K.L. Montey, N.C. Eaton, E.M. Quinlan, Repetitive visual stimulation enhances recovery from severe amblyopia. Learn. Mem., 2013, Vol. 20, P. 311-317.

31. N.Y. Tsaplina, G.Z. Mikhailova, R.S. Shtanchaev, D.A. Moshkov, Stabilization of mauthner neuron structure on adaptation of goldfish to contralateral optokinetic stimulation. Neurosci. Behav. Physiol., 2010, Vol. 40, P. 767-771.31. N.Y. Tsaplina, G.Z. Mikhailova, R.S. Shtanchaev, D.A. Moshkov, Stabilization of mauthner neuron structure on adaptation of goldfish to contralateral optokinetic stimulation. Neurosci. Behav. Physiol., 2010, Vol. 40, P. 767-771.

32. N.Y. Dektyareva, R.S. Shtanchayev, G.Z. Mikhailova, D.A. Moshkov, Stabilization of motor asymmetry in the goldfish under the influence of optokinetic stimulation. Neurophysiology, 2008, Vol. 40, P. 178-186.32. N.Y. Dektyareva, R.S. Shtanchayev, G.Z. Mikhailova, D.A. Moshkov, Stabilization of motor asymmetry in the goldfish under the influence of optokinetic stimulation. Neurophysiology, 2008, Vol. 40, P. 178-186.

33. P.C. Curtin, Т. Preuss, Glycine and GABA_A receptors mediate tonic and phasic inhibitory processes that contribute to prepulse inhibition in the goldfish startle network. Front. Neural Circuits, 2015, Vol. 9, P. 1-10.33. PC Curtin, T. Preuss, Glycine and GABA _A receptors mediate tonic and phasic inhibitory processes that contribute to prepulse inhibition in the goldfish startle network. Front Neural Circuits, 2015, Vol. 9, P. 1-10.

34. C. Cervetto, G. Taccola, GABA_A and strychnine-sensitive glycine receptors modulate N-methyl-D-aspartate-evoked acetylcholine release from rat spinal motoneurons: a possible role in neuroprotection. Neuroscience, 2008, Vol. 154, P. 1517-1524.34. C. Cervetto, G. Taccola, GABA _A and strychnine-sensitive glycine receptors modulate N-methyl-D-aspartate-evoked acetylcholine release from rat spinal motoneurons: a possible role in neuroprotection. Neuroscience, 2008, Vol. 154, P. 1517-1524.

Claims

A method of attaching a mask to the eye of a fish, characterized in that after anesthesia and immobilization of the fish, an antimicrobial agent for the eyes is applied to the pupil, then the skin around the eye is prepared by drying the skin for 1-2 hours with filter paper and blowing it through a plastic thin needle connected to with a syringe, while periodically wetting the eye with water, followed by treating the skin around the eye with hydrogen peroxide and alcohol, applying hydrocortisone to the pupil and around it in the form of an eye ointment on a vaseline newer, then Dermabond skin glue is applied to the completely dried skin around the eye, after which the first layer of the mask, consisting of the Ardell Lash Grip Adhesive Dark liquid based on cellulose-rubber base, is applied using a pointed stick around the eye and onto the eye itself completely closing it, and after drying, the second layer of the mask, consisting of waterproof glue on a polyurethane basis, is applied over the entire surface of the first layer, as well as on the dry edge of the skin of the fish around the first layer of the mask.