RU2679082C1

RU2679082C1 - Method for extracting a tooth pulp for receiving culture of stem cells

Info

Publication number: RU2679082C1
Application number: RU2017143739A
Authority: RU
Inventors: Варвара Владимировна Багаева; Натэлла Иосифовна Енукашвили; Людмила Владимировна Елсукова; Александра Андреевна Айзенштадт; Анастасия Викторовна Котова; Мария Евгеньевна Урусова; Татьяна Леонидовна Золина; Шерзод Фархадович Адылов
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Покровский банк стволовых клеток"
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2017-12-13
Publication date: 2019-02-05

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology, in particular to a method for producing stem cells (SC) from a tooth. Method includes filling the internal cavity of the separated tooth through the apical part of its root canal with 0.1–0.4 % collagenase solution and keeping in the range from about 25 °C to about 39 °C for 20–120 minutes. Next, the contents of the internal cavities of the tooth are collected, centrifuged, after which the supernatant is removed, the precipitate is resuspended in a nutrient medium suitable for the cultivation of mesenchymal SC, and the resulting suspension is placed in a culture flask for subsequent cultivation.EFFECT: invention allows to simplify the production of SC from a tooth.6 cl, 4 dwg, 4 ex

Description

В последнее время стволовые клетки стали широко применять в регенеративной медицине. В качестве безопасного и эффективного средства используют мезенхимные стволовые клетки (МСК), которые, с одной стороны, обладают рядом полезных свойств, а с другой стороны относительно доступны для культивирования в любой современной лаборатории. Источниками МСК традиционно являются костный мозг, жировая ткань, пуповинная кровь, пупочный канатик, реже эндометрий и периферическая кровь. Способы получения МСК из этих источников имеют существенные недостатки, такие как инвазивность, малая доступность сырья и т.п., поэтому проблема поиска источника для неинвазивного и надежного способа получения стволовых клеток по-прежнему актуальна.Recently, stem cells have become widely used in regenerative medicine. As a safe and effective tool, mesenchymal stem cells (MSCs) are used, which, on the one hand, have a number of useful properties, and on the other hand are relatively accessible for cultivation in any modern laboratory. The sources of MSCs are traditionally bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood, umbilical cord, less commonly the endometrium and peripheral blood. The methods for obtaining MSCs from these sources have significant drawbacks, such as invasiveness, low availability of raw materials, etc., therefore, the problem of finding a source for a non-invasive and reliable method for obtaining stem cells is still relevant.

В последнее время привлекательным источником стволовых клеток (СК) стала пульпа зубов. Стволовые клетки пульпы зуба (СКП) - постнатальные эктодермальные стволовые клетки, происходящие из мигрирующих клеток нервного гребня. Несмотря на эктодермальное происхождение, СКП обладают свойствами мезенхимных стволовых клеток: фибробластоподобной морфологией, характерным набором поверхностных маркеров, способностью адгезировать к пластиковой подложке. Способны они и к дифференцировке в адипогенном (жировая ткань), хондрогенном (хрящевая ткань), остеогенном (костная ткань) направлениях. СКП способны к дифференцировке в одонтобласты: небольшие клетки полярного строения, участвующие в образовании дентина, имеющие клеточное тело и очень длинный отросток, который располагается в дентинной трубочке и распространяется на всю длину дентина, немного выходя в эмаль. Способность СКП дифференцироваться в преостеоциты, одонтобласты, прехондроциты делает их пригодными для использования в регенеративной терапии не менее эффективно, чем МСК.Recently, pulp of teeth has become an attractive source of stem cells (SC). Tooth pulp stem cells (UPC) are postnatal ectodermal stem cells originating from migratory neural crest cells. Despite their ectodermal origin, SKPs have the properties of mesenchymal stem cells: fibroblast-like morphology, a characteristic set of surface markers, and the ability to adhere to a plastic substrate. They are also capable of differentiation in adipogenic (adipose tissue), chondrogenic (cartilage tissue), osteogenic (bone tissue) directions. UPCs are capable of differentiating into odontoblasts: small cells of a polar structure involved in the formation of dentin, having a cell body and a very long process that is located in the dentin tube and extends over the entire length of the dentin, leaving a little enamel. The ability of UPC to differentiate into preosteocytes, odontoblasts, and prechondrocytes makes them suitable for use in regenerative therapy no less effectively than MSCs.

Заготовка СКП может производиться как из экстрагированных в стоматологической клинике постоянных и молочных зубов, так и из молочных зубов, выпавших естественным путем. В последнем случае процесс извлечения СК клеток из организма пациента очень удачно совпадает с естественными процессами взросления организма.Preparation of SKP can be made both from the permanent and primary teeth extracted in the dental clinic, and from the natural teeth that have fallen out. In the latter case, the process of extracting SK cells from the patient’s body very successfully coincides with the natural processes of the organism’s growth.

Существуют способы извлечения пульпы зуба, при которых коронку зуба раскалывают, пульпу отделяют механически и в дальнейшем получают из нее культуру СК. Все эти способы требуют специального дорогостоящего стоматологического оборудования, а также навыков для его использования и соответствующей квалификации сотрудников. Стандартная лаборатория для культивирования клеток не располагает ни подобным оборудованием, ни персоналом для его использования. В случае, когда источником СК являются молочные зубы, выпавшие в домашних условиях или вдали от стоматологических учреждений, такие способы извлечения пульпы зуба представляются тем более малопригодными.There are methods for extracting the pulp of the tooth, in which the tooth crown is split, the pulp is separated mechanically and subsequently receive a culture of SC from it. All of these methods require special expensive dental equipment, as well as skills for its use and appropriate qualifications of employees. The standard laboratory for culturing cells does not have such equipment or personnel for its use. In the case when the source of SC is milk teeth that have fallen out at home or away from dental institutions, such methods of extracting tooth pulp seem all the more unsuitable.

Существуют способы извлечения пульпы зуба без раскалывания зубной коронки.There are methods for extracting tooth pulp without splitting the tooth crown.

В статье:

, Soukup Т,

,

, et al. Human dental pulp stem cells - isolation and long term cultivation. Acta Medica (Hradec Kralove) 2007; 50:195e201 описан способ извлечения пульпы зуба для получения культуры СК, при котором интактные зубы транспортировали в сбалансированном солевом растворе Хэнкса в лабораторию. В лаборатории с помощью щипцов Луера разрушали корни зуба, чтобы проникнуть в корневые каналы. Если корни были еще недостаточно развиты, и апикальное отверстие было достаточно широким, использовали острую иглу для механического извлечения зубной пульпы. Если отверстие было узким, для механического извлечения пульпы использовали экстирпационную иглу. Описанный способ требует специального оборудования и инструментов для разрушения корней зуба и механического извлечения пульпы. В обычной лаборатории для культивирования клеток нет такого оборудования, а проведение подобного вскрытия корней требует специальных навыков. В противном случае, возможна утрата биологического материала. Кроме того, описанный способ рассчитан на извлечение пульпы из зубов с широкими, открытыми зубными каналами, в частности, из 3-х моляров. Описанный способ не применим к более мелким зубам, резцам, клыкам, особенно тем, которые имеют узкие и/или извитые каналы.In the article:

, Soukup T,

,

, et al. Human dental pulp stem cells - isolation and long term cultivation. Acta Medica (Hradec Kralove) 2007; 50: 195e201 describes a method for extracting tooth pulp to obtain an SC culture in which intact teeth were transported in Hanks balanced saline to a laboratory. In the laboratory, with the help of Luer's forceps, the roots of the tooth were destroyed in order to penetrate the root canals. If the roots were still not sufficiently developed and the apical opening was wide enough, a sharp needle was used to mechanically extract the tooth pulp. If the hole was narrow, an extirpation needle was used to extract the pulp mechanically. The described method requires special equipment and tools for the destruction of tooth roots and mechanical pulp extraction. In an ordinary laboratory, there is no such equipment for cultivating cells, and performing such an autopsy requires special skills. Otherwise, the loss of biological material is possible. In addition, the described method is designed to extract pulp from teeth with wide, open dental canals, in particular, from 3 molars. The described method is not applicable to smaller teeth, incisors, fangs, especially those that have narrow and / or convoluted canals.

В статье:

,

, Santibanez JF,

, Bugarski D. Mesenchymal Stem Cell Properties of Dental Pulp Cells from Deciduous Teeth. Arch. Biol. Sci., Belgrade, 2011; 63(4):933-942 описан способ извлечения пульпы зуба для получения культуры СК, при котором молочные зубы извлекали под местной анестезией, пульпу отделяли от зубной коронки соответствующим инструментом (черпалка, excavator). В дальнейшем извлеченную пульпу помещали в модифицированную Дюльбекко среду Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров (FBS) для транспортировки в лабораторию. Центрифугировали материал 10 мин при 1800 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, ткани пульпы выдерживали 45 минут при 37°С в 0,3% растворе коллагеназы I типа в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 20% FBS. Затем в клеточную суспензию добавляли PBS с 2% FBS, центрифугировали 10 мин при 1800 об/мин и подсчитывали количество живых клеток с помощью окрашивания трипановым синим. Клетки, полученные из одного зуба, помещали в культуральные флаконы, и инкубировали в среде, содержащей DMEM, 20% FBS, 200 мкМ 2-фосфата L-аскорбиновой кислоты, 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина при 37°С во влажной атмосфере с 5% CO₂. Описанный способ требует специальных инструментов для механического извлечения пульпы. Способ рассчитан на извлечение пульпы из зубов с широкими, открытыми зубными каналами. Он не пригоден для извлечения пульпы из зубов, которые имеют узкие и/или извитые каналы. Данный способ является наиболее близким к заявляемому изобретению и выбран в качестве прототипа.In the article:

,

, Santibanez JF,

, Bugarski D. Mesenchymal Stem Cell Properties of Dental Pulp Cells from Deciduous Teeth. Arch. Biol. Sci., Belgrade, 2011; 63 (4): 933-942 describes a method for extracting tooth pulp to obtain an SC culture, in which milk teeth were extracted under local anesthesia, the pulp was separated from the dental crown with a suitable tool (scoop, excavator). Subsequently, the extracted pulp was placed in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) for transport to the laboratory. The material was centrifuged for 10 min at 1800 rpm, the supernatant was removed, the pulp tissues were kept for 45 minutes at 37 ° C in 0.3% type I collagenase solution in phosphate-buffered saline (PBS) with the addition of 20% FBS. Then, PBS with 2% FBS was added to the cell suspension, centrifuged for 10 min at 1800 rpm, and the number of living cells was counted by trypan blue staining. Cells obtained from one tooth were placed in culture bottles and incubated in a medium containing DMEM, 20% FBS, 200 μM L-ascorbic acid 2-phosphate, 100 u / ml penicillin / streptomycin at 37 ° C in a humid atmosphere with 5 % CO ₂ . The described method requires special tools for the mechanical extraction of pulp. The method is designed to extract pulp from teeth with wide, open dental canals. It is not suitable for extracting pulp from teeth that have narrow and / or convoluted canals. This method is the closest to the claimed invention and is selected as a prototype.

Задачей настоящего изобретения является создание способа извлечения пульпы зуба для получения культуры СК, при котором используются инструменты, имеющиеся в стандартной лаборатории для культивирования клеток, без применения специального стоматологического оборудования для извлечения пульпы, без разрушения коронки зуба.An object of the present invention is to provide a method for extracting tooth pulp to obtain an SC culture, using tools available in a standard laboratory for culturing cells, without the use of special dental equipment for extracting pulp, without destroying the tooth crown.

Поставленная задача решается тем, что в способе извлечения пульпы зуба для получения культуры СК внутренние полости отделенного зуба заполняют через апикальную часть его корневых каналов 0,1-0,4% раствором коллагеназы и выдерживают при температуре в диапазоне от примерно 25°С до примерно 39°С в течение 20-120 минут. После этого содержимое внутренних полостей зуба собирают, центрифугируют, после чего удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования. Далее СК культивируют известным способом культивирования мезенхимных СК. Здесь и далее под внутренними полостями зуба мы понимаем пульпарную камеру, корневые каналы и другие полости зуба, заполненные мягкими тканями и окруженные твердым материалом зуба. При осуществлении настоящего способа можно использовать зуб, отделенный из полости рта любым доступным способом, как в результате экстракции, так и выпавший естественным путем.The problem is solved in that in the method of extracting tooth pulp to obtain a culture of SC, the internal cavities of the separated tooth are filled through the apical part of its root canals with a 0.1-0.4% collagenase solution and kept at a temperature in the range from about 25 ° C to about 39 ° C for 20-120 minutes. After that, the contents of the internal cavities of the tooth are collected, centrifuged, after which the supernatant is removed, the sediment is resuspended in a nutrient medium suitable for culturing SC, and the resulting suspension is placed in a culture vial for subsequent cultivation. Further, SC is cultivated by a known method of culturing mesenchymal SC. Hereinafter, by the internal cavities of the tooth, we mean the pulp chamber, root canals and other cavities of the tooth, filled with soft tissues and surrounded by hard tooth material. In the implementation of this method, you can use a tooth separated from the oral cavity by any available method, both as a result of extraction, and dropped out naturally.

В отличие от прототипа в заявляемом способе извлечения пульпы зуба для получения культуры СК проводят извлечение пульпы из зуба не механическим, а ферментативным способом. Во время выдерживания зуба, заполненного 0,1-0,4% раствором коллагеназы, происходит ферментативное разрушение соединительной ткани, удерживающей клетки и ткани пульпы внутри пульпарной камеры и корневых каналов зуба, клетки переходят в суспензию из прикрепленного состояния. При этом не требуется разрушения коронки либо корней зуба, поскольку раствор коллагеназы подается через открытое отверстие в апикальной части корня зуба.In contrast to the prototype, in the inventive method for extracting tooth pulp to obtain a culture of SC, pulp is extracted from the tooth not by a mechanical but by an enzymatic method. During the aging of a tooth filled with 0.1-0.4% collagenase solution, enzymatic destruction of the connective tissue that holds the cells and pulp tissue inside the pulp chamber and root canals of the tooth occurs, the cells transition into suspension from the attached state. In this case, the destruction of the crown or tooth roots is not required, since the collagenase solution is supplied through an open hole in the apical part of the tooth root.

При последующем сборе жидкости из внутренних полостей зуба выходят практически все клетки и кусочки ткани пульпы. При осуществлении настоящего способа клетки и ткани пульпы отделяются от зубной коронки не механически, а ферментативно, и извлекаются после этого без использования специального оборудования для вскрытия и разрушения зубной коронки или для вычерпывания пульпы. Кроме того, при осуществлении этого способа возможно извлечение пульпы из зубов, которые имеют узкие или извитые каналы, для которых невозможно осуществить механическое вычерпывание пульпы без разрушения коронки зуба.With the subsequent collection of fluid from the internal cavities of the tooth, almost all cells and pieces of pulp tissue exit. In the implementation of this method, the cells and tissues of the pulp are not separated from the dental crown mechanically, but enzymatically, and are removed after that without using special equipment to open and destroy the dental crown or to scoop out the pulp. In addition, when implementing this method, it is possible to extract the pulp from the teeth, which have narrow or convoluted channels, for which it is impossible to mechanically scoop out the pulp without destroying the crown of the tooth.

В одном из вариантов осуществления способа зуб после заполнения внутренних полостей раствором коллагеназы полностью помещают в 0,1-0,4% раствор коллагеназы. Это обеспечивает дополнительный эффект увлажнения, препятствуя высыханию наружных поверхностей зуба. В другом варианте осуществления способа зуб после заполнения пульпарной камеры и корневых каналов раствором коллагеназы выдерживают в упомянутых условиях при помешивании, независимо от того, помещен он в раствор коллагеназы или нет. Это дает дополнительный эффект перемешивания содержимого внутренних полостей и увеличивает эффективность ферментативного разрушения соединительных тканей и следовательно отделения пульпы от твердых тканей зуба.In one embodiment of the method, the tooth, after filling the internal cavities with a collagenase solution, is completely placed in a 0.1-0.4% collagenase solution. This provides an additional moisturizing effect, preventing the drying of the external surfaces of the tooth. In another embodiment of the method, the tooth after filling the pulp chamber and root canals with a collagenase solution is kept under the mentioned conditions with stirring, regardless of whether it is placed in a collagenase solution or not. This gives an additional effect of mixing the contents of the internal cavities and increases the efficiency of the enzymatic destruction of connective tissues and therefore the separation of the pulp from the hard tissues of the tooth.

Заполнение внутренних полостей зуба раствором коллагеназы производят любым известным способом подачи жидкости, например, при помощи шприца с иглой, вводя ее в корневой канал зуба с апикальной стороны, при этом предполагается, что канал зуба открыт в результате естественного процесса резорбции корня молочного зуба, либо в результате механического разрушения корня зуба, либо апикальное отверстие корня зуба достаточно широко для подачи жидкости.The internal cavities of the tooth are filled with a collagenase solution by any known method of supplying fluid, for example, using a syringe with a needle, introducing it into the root canal of the tooth from the apical side, it is assumed that the tooth canal is opened as a result of the natural process of resorption of the root of the milk tooth, or as a result of mechanical destruction of the tooth root, or the apical opening of the tooth root is wide enough to supply fluid.

В одном из вариантов осуществления изобретения внутренние полости зуба предварительно промывают 0,1-0,4% раствором коллагеназы через апикальную часть его корневого канала, собирают прошедший через внутренние полости зуба раствор, центрифугируют его, удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования мезенхимных СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования. Далее СК культивируют известным способом культивирования мезенхимных СК. При этом после предварительного промывания внутренних полостей зуба 0,1-0,4% раствором коллагеназы, отдельные клетки и кусочки ткани пульпы отрываются и вымываются током жидкости, обеспечивая дополнительный выход тканей пульпы. Кроме того, наиболее легко отделяемые ткани пульпы при этом не подвергаются длительному воздействию раствора коллагеназы, что дополнительно обеспечивает сохранность этих клеток. Промывание внутренних полостей зуба раствором коллагеназы производят любым известным способом подачи жидкости, например, при помощи шприца с иглой, вводя ее в корневой канал зуба с апикальной стороны, при этом предполагается, что канал зуба открыт в результате естественного процесса резорбции корня молочного зуба, либо в результате механического разрушения корня зуба, либо апикальное отверстие корня зуба достаточно широко для подачи жидкости.In one embodiment, the internal tooth cavities are pre-washed with a 0.1-0.4% collagenase solution through the apical part of its root canal, the solution passed through the internal tooth cavities is collected, centrifuged, the supernatant is removed, the sediment is resuspended in a nutrient medium suitable for the cultivation of mesenchymal SC, and the resulting suspension is placed in a culture bottle for subsequent cultivation. Further, SC is cultivated by a known method of culturing mesenchymal SC. Moreover, after preliminary washing of the internal cavities of the tooth with 0.1-0.4% collagenase solution, individual cells and pieces of pulp tissue are torn off and washed out by a fluid flow, providing an additional output of pulp tissues. In addition, the most easily detachable pulp tissues are not exposed to prolonged exposure to a collagenase solution, which further ensures the safety of these cells. The internal cavities of the tooth are rinsed with a collagenase solution by any known method of supplying liquid, for example, using a syringe with a needle, introducing it into the root canal of the tooth from the apical side, it is assumed that the tooth canal is opened as a result of the natural process of resorption of the root of the milk tooth, or as a result of mechanical destruction of the tooth root, or the apical opening of the tooth root is wide enough to supply fluid.

Сбор содержимого внутренних полостей зуба производят любым доступным способом удаления жидкостей, например, промывая пульпарную камеру и корневые каналы зуба током жидкости, продувая камеру током газа, например, воздуха, либо центрифугируя зуб, сориентировав его в пробирке таким образом, чтобы центробежная сила была направлена от пульпарной камеры к апикальным отверстиям корней. В одном из вариантов осуществления изобретения, чтобы собрать содержимое внутренних полостей зуба, их промывают сбалансированным солевым раствором, подавая его через апикальную часть корневого канала зуба, затем собирают всю жидкость, прошедшую через внутренние полости зуба, центрифугируют ее, после чего надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования. Далее СК культивируют известным способом культивирования мезенхимных СК.The contents of the internal cavities of the tooth are collected by any available method of removing fluids, for example, washing the pulp chamber and root canals of the tooth with a fluid flow, blowing the chamber with a gas flow, such as air, or centrifuging the tooth, orienting it in a test tube so that the centrifugal force is directed away the pulp chamber to the apical openings of the roots. In one embodiment of the invention, to collect the contents of the internal cavities of the tooth, they are washed with a balanced saline solution, feeding it through the apical part of the root canal of the tooth, then all the fluid that has passed through the internal cavities of the tooth is collected, centrifuged, and then the supernatant is removed, the sediment resuspended in a culture medium suitable for the cultivation of SC, and the resulting suspension is placed in a culture bottle for subsequent cultivation. Further, SC is cultivated by a known method of culturing mesenchymal SC.

Вместо тока жидкости возможно использовать ток газа. При этом внутренние полости через апикальную часть корневых каналов зуба продувают любым доступным газом, например воздухом, собирают извлеченную из внутренних полостей жидкость, и далее центрифугируют ее, после чего надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования.Instead of fluid flow, it is possible to use a gas flow. In this case, the internal cavities are blown through the apical part of the root canals of the tooth with any available gas, for example, air, the fluid extracted from the internal cavities is collected, and then centrifuged, after which the supernatant is removed, the sediment is resuspended in a nutrient medium suitable for culturing SC, and the suspension obtained placed in a culture bottle for subsequent cultivation.

Также содержимое внутренних полостей зуба можно собирать центрифугированием - разместить зуб в пробирке для центрифугирования, сориентировав его таким образом, чтобы центробежная сила была направлена от пульпарной камеры к апикальным отверстиям корней. При этом дополнительно осаждается клеточный материал, и таким образом одновременно осуществляются этапы сбора содержимого и его центрифугирования. После такого центрифугирования зуб и надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в питательной среде, пригодной для культивирования СК, и полученную суспензию помещают в культуральный флакон для последующего культивирования.Also, the contents of the internal cavities of the tooth can be collected by centrifugation - place the tooth in a centrifugation tube, orienting it so that the centrifugal force is directed from the pulp chamber to the apical root openings. In this case, cellular material is additionally precipitated, and thus the steps of collecting the contents and centrifuging are simultaneously carried out. After such centrifugation, the tooth and supernatant are removed, the sediment is resuspended in a culture medium suitable for culturing SC, and the resulting suspension is placed in a culture bottle for subsequent cultivation.

При необходимости допускается отламывание корней зуба для получения доступа к корневому каналу, в случае если апикальное отверстие корня зуба закрыто или очень мало. Упомянутое отламывание не требует специального оборудования и легко производится в условиях лаборатории для культивирования клеток при помощи любого подходящего инструмента, например, педикюрных кусачек, ножниц для стрижки когтей животных, и т.п.If necessary, breaking off of the tooth roots is allowed to gain access to the root canal if the apical opening of the tooth root is closed or very small. The said breaking-off does not require special equipment and is easily carried out in a laboratory for culturing cells using any suitable tool, for example, pedicure nippers, scissors for cutting animal claws, etc.

Активность коллагеназы зависит от температуры реакционной смеси. Обычно диссоциацию ткани растворами ферментов проводят при 37°С, что оптимально для активности используемых протеолитических ферментов, однако эта процедура осуществима и при комнатной температуре [Wittenberg В.A., Robinson Т.F. Oxygen requirements, morphology, cell coat and membrane permeability of calcium tolerant myocytes from hearts of adult rats // Cell Tissue Res. 1981. Vol. 216. P. 231-251; Frangakis C. Bahl J. McDaniel H., Bressler R. Tolerance to physiological calcium by isolated myocytes from the adult rat heart; an improved cellular preparation // Life Sci. 1980. Vol. 27. P. 815-825]. Поэтому в заявляемом изобретении выдерживание в 0,2% растворе коллагеназы проводят при температуре не ниже 25°С. Повышение температуры оказывает влияние на скорость ферментативной реакции в результате влияния температуры на любую химическую реакцию. С повышением температуры ускоряется движение молекул, что приводит к повышению вероятности взаимодействия реагирующих веществ. Кроме того, температура может повышать энергию реагирующих молекул, что также приводит к ускорению реакции. Однако скорость химической реакции, катализируемая ферментами, имеет свой температурный оптимум, превышение которого сопровождается понижением ферментативной активности, возникающим из-за термической денатурации белковой молекулы [Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с. ISBN 5-9231-0254-4]. Для коллагеназы оптимальна температура 37-38°С. При повышении температуры скорость реакции замедляется, однако верхняя граница температуры в заявляемом изобретении определяется температурной толерантностью получаемых из пульпы зуба клеток. СК при температуре выше 39°С претерпевают изменения, связанные с тепловым шоком. Поэтому в заявляемом изобретении выдерживание в 0,1-0,4% растворе коллагеназы проводят при температуре не выше 39°С.Collagenase activity depends on the temperature of the reaction mixture. Typically, tissue dissociation with enzyme solutions is carried out at 37 ° C, which is optimal for the activity of the used proteolytic enzymes, however, this procedure is feasible at room temperature [Wittenberg B.A., Robinson T.F. Oxygen requirements, morphology, cell coat and membrane permeability of calcium tolerant myocytes from hearts of adult rats // Cell Tissue Res. 1981. Vol. 216. P. 231-251; Frangakis C. Bahl J. McDaniel H., Bressler R. Tolerance to physiological calcium by isolated myocytes from the adult rat heart; an improved cellular preparation // Life Sci. 1980. Vol. 27. P. 815-825]. Therefore, in the claimed invention, aging in a 0.2% collagenase solution is carried out at a temperature of at least 25 ° C. An increase in temperature affects the rate of the enzymatic reaction as a result of the influence of temperature on any chemical reaction. With increasing temperature, the movement of molecules accelerates, which leads to an increase in the probability of interaction of reacting substances. In addition, temperature can increase the energy of reacting molecules, which also leads to an acceleration of the reaction. However, the rate of a chemical reaction catalyzed by enzymes has its own temperature optimum, the excess of which is accompanied by a decrease in enzymatic activity arising from thermal denaturation of the protein molecule [Biochemistry: Textbook. for universities, Ed. E.S. Severin., 2003.779 s. ISBN 5-9231-0254-4]. For collagenase, the optimum temperature is 37-38 ° C. With increasing temperature, the reaction rate slows down, however, the upper temperature limit in the claimed invention is determined by the temperature tolerance of the cells obtained from the tooth pulp. SC at temperatures above 39 ° C undergo changes associated with heat shock. Therefore, in the claimed invention, aging in a 0.1-0.4% collagenase solution is carried out at a temperature not exceeding 39 ° C.

Описанная в заявляемом способе последовательность операций обработки зуба, выбранные режимы и вещества, используемые при этом, обеспечивают решение поставленной задачи.Described in the claimed method, the sequence of operations of tooth processing, the selected modes and substances used in this case, provide a solution to the problem.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.The invention is illustrated by the following graphic materials.

На Фиг. 1 представлен общий вид культуры стволовых клеток пульпы зуба, полученных, как описано в примере 1.In FIG. 1 presents a General view of the culture of stem cells of the pulp of the tooth, obtained as described in example 1.

На Фиг. 2 представлен общий вид культуры стволовых клеток пульпы зуба, полученных, как описано в примере 2.In FIG. 2 presents a General view of the culture of stem cells of the pulp of the tooth, obtained as described in example 2.

На Фиг. 3 представлен общий вид культуры стволовых клеток пульпы зуба, полученных, как описано в примере 4.In FIG. 3 presents a General view of the culture of stem cells of the pulp of the tooth, obtained as described in example 4.

На Фиг. 4 представлена таблица сравнения иммунофенотипов СК пульпы зуба и мезенхимных стволовых клеток.In FIG. Figure 4 presents a comparison table of immunophenotypes of SC of tooth pulp and mesenchymal stem cells.

Способ осуществляли следующим образом.The method was carried out as follows.

Пример 1. Зуб 54 по принятой в России классификации ВОЗ с сохранной пульпой, соблюдая условия асептики, помещали в пробирку, содержащую 5 мл транспортировочной среды, состоящей из физиологического раствора с антибиотиками. Образец в среде помещали в изотермический контейнер при комнатной температуре и транспортировали в лабораторию.Example 1. Tooth 54 according to the WHO classification in Russia with preserved pulp, observing aseptic conditions, was placed in a test tube containing 5 ml of a transport medium consisting of physiological saline with antibiotics. The sample in the medium was placed in an isothermal container at room temperature and transported to the laboratory.

Тщательно промывали зуб сбалансированным солевым раствором, например раствором PBS, для удаления крови. Помещали образец на чашку Петри диаметром 10 см. Отбирали всю лишнюю жидкость из чашки Петри. Промывали при помощи шприца с иглой внутренние полости зуба 0,2% раствором коллагеназы в PBS, вводя его в отверстие корневого канала в апикальной части корня зуба, вымывая оттуда содержимое внутренних полостей зуба. Собирали раствор после промывки, помещали в коническую центрифужную пробирку и центрифугировали, например, на центрифуге СМ-6М (Elmi, Латвия) при 1100 об/мин в течение 7 минут.The tooth was thoroughly washed with a balanced saline solution, such as PBS, to remove blood. The sample was placed on a Petri dish with a diameter of 10 cm. All excess fluid was taken from the Petri dish. The internal cavities of the tooth were washed with a syringe with a needle with a 0.2% solution of collagenase in PBS, introducing it into the hole of the root canal in the apical part of the tooth root, washing out the contents of the internal cavities of the tooth. The solution was collected after washing, placed in a conical centrifuge tube and centrifuged, for example, in a SM-6M centrifuge (Elmi, Latvia) at 1100 rpm for 7 minutes.

Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в 10 мл питательной среды, например, среды Advanced Stem Cell Media (HyClone, Германия) с добавлением 20% фетальной коровьей сыворотки для СК или заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells (HyClone, Германия) и 10 мкг/мл раствора пенициллина-стрептомицина (HyClone, Германия). Помещали суспензию клеток в культуральный флакон площадью 25 см². Помещали флаконы в CO₂-инкубатор, например, BBD 6220 (Thermo, Германия) при температуре 37°С, время экспозиции 3-5 суток в зависимости от состояния клеток. Далее СК культивировали известным способом культивирования мезенхимных СК.The supernatant was removed, the pellet was resuspended in 10 ml of growth medium, for example, Advanced Stem Cell Media (HyClone, Germany) supplemented with 20% fetal bovine serum for SK or Advanced Supplement for Stem Cells serum substitute (HyClone, Germany) and 10 μg / ml of penicillin-streptomycin solution (HyClone, Germany). A cell suspension was placed in a 25 cm ² culture vial. The vials were placed in a CO ₂ incubator, for example, BBD 6220 (Thermo, Germany) at a temperature of 37 ° C, exposure time 3-5 days depending on the state of the cells. Further, SCs were cultivated by a known method for culturing mesenchymal SCs.

Внутренние полости промытого образца зуба заполняли свежим 0,2% раствором коллагеназы при помощи шприца с иглой, вводя его в отверстие корневого канала в апикальной части корня зуба, помещали в центрифужную пробирку, добавляли 1 мл раствора коллагеназы. Помещали пробирку с образцом в шейкер-инкубатор, например, ES-20 (Biosan, Латвия), при температуре 37°С и помешивании со скоростью 90 об/мин, и выдерживали в течение 30 минут. Затем промывали внутренние полости зуба при помощи шприца с иглой раствором, например фосфатно-солевым раствором, вымывая оттуда содержимое внутренних полостей зуба. Собирали полученную жидкость, помещали в коническую центрифужную пробирку и центрифугировали при 1100 об/мин в течение 7 минут.The internal cavity of the washed tooth sample was filled with a fresh 0.2% collagenase solution using a syringe with a needle, introducing it into the hole of the root canal in the apical part of the tooth root, was placed in a centrifuge tube, 1 ml of collagenase solution was added. The test tube with the sample was placed in a shaker incubator, for example, ES-20 (Biosan, Latvia), at a temperature of 37 ° C and stirring at a speed of 90 rpm, and kept for 30 minutes. Then, the internal cavities of the tooth were washed with a syringe with a needle with a solution, for example, phosphate-saline solution, washing out the contents of the internal cavities of the tooth. The resulting liquid was collected, placed in a conical centrifuge tube and centrifuged at 1100 rpm for 7 minutes.

Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в 10 мл вышеупомянутой питательной среды. Помещали суспензию клеток на флакон площадью 25 см². Помещали флаконы в CO₂-инкубатор, например, BBD 6220 (Thermo, Германия) при температуре 37°С, время экспозиции 3-5 суток в зависимости от состояния клеток. Далее СК культивировали известным способом культивирования мезенхимных СК. В результате получена однородная клеточная культура, представленная фибробластоподобными адгезивными клетками, как показано на Фиг. 1а. Иммунофенотип полученных клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием цитометра, например FC500 (Beckman Coulter, США). Клетки прижизненно окрашивали антителами к поверхностным маркерам CD90, CD105, CD73, CD10, CD44, CD45, CD34, CD117, CD14. Для каждой из исследуемых популяций клеток определяли количество окрашенных клеток и среднюю интенсивность флюоресценции. Процентное соотношение клеток, несущих определенный фенотип относительно общего количества клеток, представлено на Фиг. 4 и соответствует иммунофенотипу мезенхимных СК. Таким образом, СК из пульпы зуба, извлеченной с помощью настоящего способа, имеют иммунофенотип мезенхимных СК.The supernatant was removed, the pellet was resuspended in 10 ml of the above-mentioned culture medium. A cell suspension was placed on a 25 cm ² vial. The vials were placed in a CO ₂ incubator, for example, BBD 6220 (Thermo, Germany) at a temperature of 37 ° C, exposure time 3-5 days depending on the state of the cells. Further, SCs were cultivated by a known method for culturing mesenchymal SCs. The result is a homogeneous cell culture represented by fibroblast-like adhesive cells, as shown in FIG. 1a. The immunophenotype of the obtained cells was determined by flow cytometry using a cytometer, for example, FC500 (Beckman Coulter, USA). In vivo cells were stained with antibodies to surface markers CD90, CD105, CD73, CD10, CD44, CD45, CD34, CD117, CD14. For each of the studied cell populations, the number of stained cells and the average fluorescence intensity were determined. The percentage of cells bearing a specific phenotype relative to the total number of cells is shown in FIG. 4 and corresponds to the immunophenotype of mesenchymal SC. Thus, SCs from tooth pulp extracted using the present method have an immunophenotype of mesenchymal SCs.

Пример 2. Извлечение пульпы зуба для получения культуры СК проводили по схеме, приведенной в примере №1, отличающейся тем, что для извлечения пульпы брали зуб 12 по принятой в России классификации ВОЗ, а также выдерживание проводили в 0,4% растворе коллагеназы в течение 20 минут.Example 2. The extraction of tooth pulp to obtain a culture of SC was carried out according to the scheme shown in example No. 1, characterized in that tooth 12 was taken according to the WHO classification adopted in Russia for pulp extraction, and aging was carried out in a 0.4% collagenase solution for 20 minutes.

Пример 3. Извлечение пульпы зуба для получения культуры СК проводили по схеме, приведенной в примере №1, отличающейся тем, что для извлечения пульпы брали зуб 28 по принятой в России классификации ВОЗ, а также отламывали кончик корня зуба при помощи педикюрных кусачек.Example 3. The extraction of tooth pulp to obtain a culture of SC was carried out according to the scheme shown in example No. 1, characterized in that tooth 28 was taken to extract the pulp according to the WHO classification adopted in Russia, and the tip of the tooth root was broken off using pedicure nippers.

Пример 4. Извлечение пульпы зуба для получения культуры СК проводили по схеме, приведенной в примере №1, отличающейся тем, что для извлечения пульпы брали зуб 75 по принятой в России классификации ВОЗ, а также выдерживание проводили в 0,1% растворе коллагеназы в течение 120 минут.Example 4. The extraction of tooth pulp to obtain a culture of SC was carried out according to the scheme shown in example No. 1, characterized in that tooth 75 was taken to extract the pulp according to the WHO classification adopted in Russia, and aging was carried out in a 0.1% collagenase solution for 120 minutes

Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток» на предмет выдачи патента РФ на изобретение.The applicant asks to consider the submitted materials of the application "Method for extracting tooth pulp to obtain a stem cell culture" for the issue of a patent of the Russian Federation for the invention.

Claims

1. A method of obtaining stem cells (SC) from a tooth, in which the internal cavity of the separated tooth is filled through the apical part of its root canal with a 0.1-0.4% collagenase solution and kept at a temperature in the range from about 25 ° to about 39 ° C for 20-120 minutes, then the contents of the internal cavities of the tooth are collected, centrifuged, after which the supernatant is removed, the sediment is resuspended in a nutrient medium suitable for culturing mesenchymal SC, and the resulting suspension is placed in a culture bottle for subsequent present cultivation.

2. The method according to p. 1, in which a tooth filled with a collagenase solution is placed in a 0.1-0.4% collagenase solution.

3. The method according to p. 1, in which the aging of a tooth filled with a collagenase solution is carried out with stirring.

4. The method according to p. 1, in which the filling of the internal cavities of the tooth with a collagenase solution is carried out using a syringe with a needle, introducing it into the apical part of the root canal of the tooth.

5. The method according to p. 1, in which the internal cavity of the extracted tooth is pre-washed with a 0.1-0.4% collagenase solution through the apical part of its root canal, the solution passed through the internal cavity of the tooth is collected, centrifuged, the supernatant is removed, the sediment is resuspended in a nutrient medium suitable for the cultivation of mesenchymal SC, and the resulting suspension is placed in a culture bottle for subsequent cultivation.

6. The method according to p. 5, in which the internal cavity of the tooth is washed with a syringe with a needle, introducing it into the apical part of the root canal of the tooth.