RU2768024C1 - Method of producing biological products from primary teeth - Google Patents
Method of producing biological products from primary teeth Download PDFInfo
- Publication number
- RU2768024C1 RU2768024C1 RU2021107377A RU2021107377A RU2768024C1 RU 2768024 C1 RU2768024 C1 RU 2768024C1 RU 2021107377 A RU2021107377 A RU 2021107377A RU 2021107377 A RU2021107377 A RU 2021107377A RU 2768024 C1 RU2768024 C1 RU 2768024C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- intensity
- line
- cells
- solution
- ratio
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 210000004489 deciduous teeth Anatomy 0.000 title abstract 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 27
- 210000004268 dentin Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000005115 demineralization Methods 0.000 claims abstract description 14
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 12
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims abstract description 7
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims abstract description 6
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 claims abstract description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims abstract description 5
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000004568 cement Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000003298 dental enamel Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000010432 diamond Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 4
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims abstract description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 17
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 17
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 17
- 230000002328 demineralizing effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 6
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000670727 Amida Species 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 2
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101001008874 Homo sapiens Mast/stem cell growth factor receptor Kit Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 2
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000278 osteoconductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0664—Dental pulp stem cells, Dental follicle stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологий, получению биоматериалов для регенеративной медицины, а именно -одновременному получению культуры мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и деминерализованного дентина из молочных зубов.The invention relates to the field of biotechnology, the production of biomaterials for regenerative medicine, namely, the simultaneous production of a culture of mesenchymal stromal cells (MSCs) and demineralized dentin from milk teeth.
Известен способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток [1], включающий забор и подготовку материала, его отмывку, ферментативную обработку, выделение суспензии клеток, их идентификациюA known method of extracting the dental pulp to obtain a culture of stem cells [1], including the collection and preparation of material, its washing, enzymatic treatment, isolation of cell suspension, their identification
Недостатком метода является снижение качества получаемого клеточного материала из-за агрессивности ряда технологий обработки, утилизация ценного ювенильного биоматериала - дентина, который может быть использован для нужд регенеративной медицины.The disadvantage of the method is a decrease in the quality of the resulting cellular material due to the aggressiveness of a number of processing technologies, the utilization of valuable juvenile biomaterial - dentin, which can be used for the needs of regenerative medicine.
Известен способ получения фибробластоподобных клеток из пульпы молочных зубов [2], включающий получение, транспортировку, отмывку материала, инкубирование с сывороткой плодов коровы, контроль стерильности забора, ферментативную обработку и забор содержимого канала молочного зуба с центрифугированием и инкубированием при комнатной температуре; инактивацию фермента, удаление надосадочной жидкости, ресуспендирование осадка клеток в полной питательной среде; культивирование в CO2-инкубаторе со сменой питательных сред, центрифугирование кондиционированной культуральной среды.A known method for obtaining fibroblast-like cells from the pulp of milk teeth [2], including obtaining, transporting, washing the material, incubation with the serum of the fetuses of a cow, sterility control of the fence, enzymatic treatment and sampling of the contents of the milk tooth canal with centrifugation and incubation at room temperature; inactivation of the enzyme, removal of the supernatant, resuspension of the cell sediment in a complete nutrient medium; cultivation in CO 2 -incubator with the change of nutrient media, centrifugation of the conditioned culture medium.
Недостатком способа является высокая частота контаминации материала из-за его недостаточной первичной обработки. Инкубирование при комнатной температуре не обеспечивает полноценной ферментативной обработки биоматериала, снижает выход клеток и качество биологических продуктов в целом. При этом способе также происходит утилизация ценного ювенильного биоматериала- дентина, который может быть использован для нужд регенеративной медицины. Данный способ взят нами за прототип.The disadvantage of this method is the high frequency of material contamination due to its insufficient primary processing. Incubation at room temperature does not provide a complete enzymatic processing of the biomaterial, reduces the yield of cells and the quality of biological products in general. This method also results in the utilization of valuable juvenile biomaterial - dentin, which can be used for the needs of regenerative medicine. This method is taken by us as a prototype.
Целью изобретения является разработка технологииThe purpose of the invention is to develop technology
одновременного получения культуры мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и деминерализованного дентина из молочных зубов.simultaneous production of a culture of mesenchymal stromal cells (MSCs) and demineralized dentin from milk teeth.
Эта цель достигается тем, что из молочных зубов получают МСК и деминерализованный дентин, при этом используют также молочные зубы, удаленные по ортодонтическим показаниям в условиях стоматологических учреждений при добровольном согласии родителей детей; после первичной трехкратной отмывки зуба стерильным раствором Хенкса с антибиотиками его дополнительно обрабатывают при помощи ультразвуковой ванны с частотой ультразвуковых волн 40 кГц в течение 2 минут, используя стерильный раствор Хенкса с Гентамицином 8 мкг/ мл; после аспирации содержимого канала зуба в шприц с ферментом его переносят в центрифужную пробирку и инкубируют ее в течение 2 минут в термошейкере при температуре 37°; полная питательная среда, в которой ресуспендируют осадок клеток, включает 10% FBS, тестированную на поддержание роста МСК; после помещения клеток в культуральный флакон его помещают на 1 час в термошейкер при температуре +37°С, скорости 50 об/ мин; осматривают состояние клеток при помощи инвертированного микроскопа; при культивировании в CO2-инкубаторе смену среды проводят каждые 5 суток; на 4 пассаже определяют количество и жизнеспособность клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; проводят криоконсервацию МСК; после аспирации содержимого канала для получения МСК зуб обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% раствором перекиси водорода; убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением; подвергают материал низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24-40 кГц; перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1, которое имеет значение от 11 до 17, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1, которое имеет значение от 2,6 до 3,3; деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты; после деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1, которое принимает значение от 0,25 до 0,65, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1, которое принимает значение от 0,4 до 0,55; деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.This goal is achieved by the fact that MSCs and demineralized dentin are obtained from milk teeth, while milk teeth are also used, removed for orthodontic reasons in dental institutions with the voluntary consent of the children's parents; after the initial three-time washing of the tooth with a sterile Hanks solution with antibiotics, it is additionally treated with an ultrasonic bath with a frequency of ultrasonic waves of 40 kHz for 2 minutes, using a sterile Hanks solution with Gentamicin 8 μg / ml; after aspiration of the contents of the canal of the tooth into a syringe with an enzyme, it is transferred to a centrifuge tube and incubated for 2 minutes in a thermoshaker at a temperature of 37 °; the complete nutrient medium in which the cell pellet is resuspended includes 10% FBS tested to support MSC growth; after placing the cells in a culture flask, it is placed for 1 hour in a thermoshaker at a temperature of +37°C, a speed of 50 rpm; examine the condition of the cells using an inverted microscope; when cultivating in a CO 2 incubator, the medium is changed every 5 days; at passage 4, the number and viability of cells in the Goryaev chamber are determined using a 0.4% solution of trypan blue; carry out cryopreservation of MSCs; after aspiration of the contents of the channel to obtain MSCs, the tooth is treated with 3% sodium hypochlorite solution, 3% hydrogen peroxide solution; remove enamel, cement, expose near-pulp dentin with a water-cooled diamond bur; subjecting the material to low-frequency ultrasonic treatment with a frequency of 24-40 kHz; before demineralization, the state of the material surfaces is monitored using Raman spectroscopy, determining the ratio of the intensity of the phosphate ion line 960 cm-1 to the intensity of the Amida I line 1660 cm-1, which has a value from 11 to 17, and the ratio of the intensity of the carbonate ion line 1070 cm-1 to the intensity of the line Amida 1 1660 cm-1, which has a value from 2.6 to 3.3; demineralize the material in a 2.4N-4.8N hydrochloric acid solution; after demineralization, its effectiveness is evaluated by examining the surface of the material using Raman spectroscopy, determining the ratio of the intensity of the 960 cm-1 phosphate ion line to the intensity of the 1660 cm-1 Amide 1 line, which takes a value from 0.25 to 0.65, and the ratio the intensity of the carbonate ion line 1070 cm-1 to the intensity of the line Amida 1 1660 cm-1, which takes a value from 0.4 to 0.55; demineralized dentine is washed in pyrogen-free water, frozen at a temperature of -60°C, lyophilized, packaged, packaged and sterilized by radiation.
Предлагаемый способ одновременного безотходного получения МСК и деминерализованного дентина значительно оптимизирует производственный цикл, снижает время, расход сырья и трудозатраты, позволяя получить продукты для регенеративной медицины, в частности обладающие оптимальными остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами для успешной регенерации костной ткани.The proposed method for the simultaneous waste-free production of MSCs and demineralized dentin significantly optimizes the production cycle, reduces time, raw material consumption and labor costs, making it possible to obtain products for regenerative medicine, in particular, with optimal osteoinductive and osteoconductive properties for successful bone tissue regeneration.
Использование помимо естественно выпавших молочных зубов, зубы у детей, удаленные по ортодонтическим показаниям расширяет возможности получения биоматериала.The use, in addition to naturally fallen milk teeth, of children's teeth removed for orthodontic indications, expands the possibilities of obtaining biomaterial.
Дополнительная обработка зуба при помощи ультразвуковой ванны значительно снижает количество случаев контаминации материала.Additional treatment of the tooth with an ultrasonic bath significantly reduces the number of cases of contamination of the material.
Инкубирование содержимого канала зуба в шприце с ферментом в центрифужной пробирке в течение 2 минут в термошейкере при температуре 37° повышает качество ферментной обработки, выход клеток и качество получаемых биопродуктов в целом.Incubation of the contents of the tooth canal in a syringe with an enzyme in a centrifuge tube for 2 minutes in a thermoshaker at a temperature of 37° improves the quality of the enzyme treatment, the yield of cells and the quality of the obtained bioproducts in general.
Низкочастотная ультразвуковая обработка с частотой 24-40 кГц позволяет выполнить первичную стерилизацию будущих биоматериалов. Этапный контроль эффективности деминерализации материала с помощью оптического метода, спектральная оценка поверхностей дентина до и после деминерализации стандартизирует характеристики получаемого продукта.Low-frequency ultrasonic treatment with a frequency of 24-40 kHz allows you to perform the primary sterilization of future biomaterials. Step-by-step control of the efficiency of material demineralization using an optical method, spectral evaluation of dentine surfaces before and after demineralization standardizes the characteristics of the resulting product.
Способ реализуется следующим образом. Забор удаленных по ортодонтическим показаниям или естественно выпавших молочных зубов проводят как в домашних условиях, так и в условиях стоматологических учреждений при добровольном согласии родителей детей. Молочный зуб помещают в транспортировочный флакон со стерильным раствором Хенкса с антибиотиком.The method is implemented as follows. The collection of teeth removed for orthodontic reasons or naturally fallen out milk teeth is carried out both at home and in dental institutions with the voluntary consent of the parents of the children. The milk tooth is placed in a transport bottle with a sterile Hank's solution with an antibiotic.
После доставки в лабораторию зуб изымают из флакона, переносят в культуральную чашку Петри, проводят первичную отмывку биоматериала сначала трижды стерильным раствором Хенкса с антибиотиками, затем при помощи ультразвуковой ванны с частотой ультразвуковых волн 40 кГц в течение 2 минут, используя стерильный раствор Хенкса с Гентамицином 8 мкг/ мл.After delivery to the laboratory, the tooth is removed from the vial, transferred to a culture Petri dish, the primary washing of the biomaterial is carried out first three times with a sterile Hanks solution with antibiotics, then using an ultrasonic bath with a frequency of ultrasonic waves of 40 kHz for 2 minutes, using a sterile Hanks solution with Gentamicin 8 mcg / ml.
После отмывки зуб переносят при помощи стерильных инструментов в стерильную пробирку с раствором Хенкса и помещают в медицинский холодильник на 24 часа. Параллельно исследуют качество забора биоматериала на стерильность, для чего в транспортировочный флакон с раствором вносят 10 мкл эмбриональной телячьей сыворотки, герметично закрывают флакон крышкой и переносят ее в термостат на 24 часа при температуре 37°.After washing, the tooth is transferred using sterile instruments into a sterile test tube with Hank's solution and placed in a medical refrigerator for 24 hours. At the same time, the quality of biomaterial sampling for sterility is examined, for which 10 μl of fetal calf serum is added to the transport vial with the solution, the vial is hermetically sealed with a lid and transferred to a thermostat for 24 hours at a temperature of 37°C.
При отсутствии признаков контаминации в инсулиновый шприц набирают 0,2 мл 0,1% коллагеназы из панкреаса краба ООО «БиолоТ». Иглу шприца вводят в канал молочного зуба и аспирируют его содержимое в шприц; переносят полученный материал в центрифужную пробирку и инкубируют ее в течение 2 мин в термошейкере при температуре 37°.In the absence of signs of contamination, 0.2 ml of 0.1% collagenase from the crab pancreas of Biolot Ltd. is collected into the insulin syringe. The syringe needle is inserted into the canal of the milk tooth and its contents are aspirated into the syringe; transfer the obtained material into a centrifuge tube and incubate it for 2 minutes in a thermoshaker at a temperature of 37°.
Инактивируют действие фермента, добавляя в пробирку 2 мл стерильного 0,02% раствора Версена и 1 мл 10% полной ростовой среды α-МЕМ с глютамином; центрифугируют в холодовой центрифуге при температуре+4°С, скорости вращения 1200 об./мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость утилизируют; осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, тестированную на поддержание роста МСК, 8 мкг/мл гентамицина. Подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего.Inactivate the action of the enzyme by adding 2 ml of sterile 0.02% solution of Versene and 1 ml of 10% complete growth medium α-MEM with glutamine to the tube; centrifuged in a cold centrifuge at a temperature of +4°C, rotation speed of 1200 rpm for 5 minutes. The supernatant is disposed of; the cell pellet is resuspended in complete nutrient medium containing αMEM with glutamine, 10% FBS tested to support MSC growth, 8 μg/ml gentamicin. The number of isolated viable cells is counted in the Goryaev chamber using 0.4% trypan blue solution.
Высевают клетки в дозе 1×10 жизнеспособных кл./см2 в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой. Для равномерного распределения клеток по дну культурального пластика флакон помещают на 1 час в термошейкер, например, ES-20 Biosan Латвия, при температуре +37°С, скорости вращения 50 об/ мин. Осматривают состояние клеток при помощи инвертированного микроскопа.Cells are seeded at a dose of 1×10 viable cells/cm 2 in a culture flask with a similar complete nutrient medium. For uniform distribution of cells along the bottom of the culture plastic, the bottle is placed for 1 hour in a thermoshaker, for example, ES-20 Biosan Latvia, at a temperature of +37°C, a rotation speed of 50 rpm. Examine the condition of the cells using an inverted microscope.
Культивирование проводят в СО2-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО2 и постоянной влажности. Смену среды проводят каждые 5 суток, при этом кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками полностью отбирают пипеткой; центрифугируют ее в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об./мин в течение 10 минут, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую среду в соотношении 1:1. По достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2. На 4 пассаже при получении в достаточном количестве клеток определяют их количество и жизнеспособность в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; проводят криоконсервацию МСК.Cultivation is carried out in CO 2 -incubator at a temperature of +37°C, 5% CO 2 and constant humidity. The change of medium is carried out every 5 days, while the conditioned culture medium is completely removed from the vial with cells with a pipette; it is centrifuged in a cold centrifuge at a temperature of +4°C, a rotation speed of 1500 rpm for 10 minutes, after which it is returned to the culture flask and fresh medium is added in a ratio of 1:1. Upon reaching 80% confluence of the cell monolayer, cells are reseeded at the rate of 1:2. At passage 4, when a sufficient number of cells are obtained, their number and viability are determined in the Goryaev chamber using a 0.4% solution of trypan blue; carry out cryopreservation of MSCs.
После аспирации содержимого канала для получения МСК зуб обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% раствором перекиси водорода. Убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением. Подвергают материал низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24-40 кГц.After aspiration of the contents of the channel to obtain MSCs, the tooth is treated with 3% sodium hypochlorite solution, 3% hydrogen peroxide solution. Enamel and cement are removed, and peripulpal dentin is exposed with a water-cooled diamond bur. The material is subjected to low-frequency ultrasonic treatment with a frequency of 24-40 kHz.
Перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1, которое имеет значение от 11 до 17, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1, которое имеет значение от 2,6 до 3,3. Деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты. После деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1, которое принимает значение от 0,25 до 0,65, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1, которое принимает значение от 0,4 до 0,55. Деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.Before demineralization, the state of the material surfaces is monitored using Raman spectroscopy, determining the ratio of the intensity of the phosphate ion line 960 cm-1 to the intensity of the Amida I line 1660 cm-1, which has a value from 11 to 17, and the ratio of the intensity of the carbonate ion line 1070 cm-1 to the intensity of the line Amida I 1660 cm-1, which has a value from 2.6 to 3.3. The material is demineralized in a 2.4N-4.8N hydrochloric acid solution. After demineralization, its effectiveness is evaluated by examining the surface of the material using Raman spectroscopy, determining the ratio of the intensity of the 960 cm-1 phosphate ion line to the 1660 cm-1 Amide I line intensity, which takes a value from 0.25 to 0.65, and the ratio intensity of the carbonate ion line 1070 cm-1 to the intensity of the line Amida 1 1660 cm-1, which takes a value from 0.4 to 0.55. Demineralized dentin is washed in pyrogen-free water, frozen at -60°C, lyophilized, packaged, packaged and sterilized by radiation.
Способ иллюстрируется клиническими примерами.The method is illustrated by clinical examples.
Пример 1. У ребенка П, 9 лет выпал молочный зуб. Мама ребенка переложила его в транспортный флакон и доставила его в биотехнологический центр. По предложенному способу была получена культура МСК и деминерализованный дентин. Клетки прижизненно окрашивали антителами к поверхностным маркерам CD90, CD105, CD73, CD10, CD44, CD45, CD34, CD117, CD14. Для каждой из исследуемых популяций клеток определяли количество окрашенных клеток и среднюю интенсивность флюоресценции. Клетки соответствовали иммунофенотипу МСК.Example 1. Child P, 9 years old lost a baby tooth. The mother of the child transferred him to a transport bottle and delivered him to the biotechnology center. According to the proposed method, a culture of MSCs and demineralized dentin were obtained. Cells were stained in vivo with antibodies to surface markers CD90, CD105, CD73, CD10, CD44, CD45, CD34, CD117, CD14. For each of the studied cell populations, the number of stained cells and the average fluorescence intensity were determined. The cells corresponded to the MSC immunophenotype.
Характеристика полученных линий МСК: Клеток имели высокий индекс адгезии (90±0,2% - 96±0,5%), относительно одинаковый индекс пролиферации (1,8±0,3), процент жизнеспособных клеток в культуре был от 90 до 97,8%. Клетки использовали для создания клеточно- тканевых трансплантатов.Characteristics of the obtained MSC lines: Cells had a high adhesion index (90±0.2% - 96±0.5%), relatively the same proliferation index (1.8±0.3), the percentage of viable cells in culture was from 90 to 97 ,8%. The cells were used to create cell-tissue transplants.
Для получения дентина материал подвергали низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24 кГц. Перед деминерализацией отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 11, отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 2,6. После деминерализации в 2,4Н растворе соляной кислоты отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 0,25; отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1 0,4. Деминерализованный дентин использовали для выполнения костной пластики в стоматологии.To obtain dentin, the material was subjected to low-frequency ultrasonic treatment with a frequency of 24 kHz. Before demineralization, the ratio of the intensity of the 960 cm-1 phosphate ion line to the 1660 cm-1 Amida I line intensity was 11, the ratio of the 1070 cm-1 carbonate ion line intensity to the 1660 cm-1 Amida I line intensity was 2.6. After demineralization in a 2.4 N hydrochloric acid solution, the ratio of the intensity of the 960 cm-1 phosphate ion line to the 1660 cm-1 Amida I line intensity was 0.25; the ratio of the intensity of the line of the carbonate ion 1070 cm-1 to the intensity of the line Amida 1 1660 cm-1 0.4. Demineralized dentin was used to perform bone grafting in dentistry.
Пример 2. У ребенка Л, 10 лет в стоматологической клинике по ортодонтическим показаниям был удален молочный зуб. Врач переложил его в транспортный флакон и служба доставила его в биотехнологический центр. По предложенному способу была получена культура МСК и деминерализованный дентин.Example 2. In a child L, 10 years old, a milk tooth was removed in a dental clinic for orthodontic indications. The doctor transferred it to a transport bottle and the service delivered it to the biotechnology center. According to the proposed method, a culture of MSCs and demineralized dentin were obtained.
Клетки прижизненно окрашивали антителами к поверхностным маркерам CD90, CD105, CD73, CD10, CD44, CD45, CD34, CD117, CD14. Для каждой из исследуемых популяций клеток определяли количество окрашенных клеток и среднюю интенсивность флюоресценции. Клетки соответствовали иммунофенотипу МСК. Характеристика полученных линий МСК: Клеток имели высокий индекс адгезии (90 ±0,2% - 96 ±0,5%), относительно одинаковый индекс пролиферации (1,8 ±0,3), процент жизнеспособных клеток в культуре был от 90 до 97,8%>. Клетки использовали для создания клеточно-тканевых трансплантатов.Cells were stained in vivo with antibodies to surface markers CD90, CD105, CD73, CD10, CD44, CD45, CD34, CD117, CD14. For each of the studied cell populations, the number of stained cells and the average fluorescence intensity were determined. The cells corresponded to the MSC immunophenotype. Characteristics of the obtained MSC lines: Cells had a high adhesion index (90 ± 0.2% - 96 ± 0.5%), relatively the same proliferation index (1.8 ± 0.3), the percentage of viable cells in culture was from 90 to 97 .8%>. The cells were used to create cell-tissue transplants.
Для получения дентина материал подвергали низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 40 кГц. Перед деминерализацией отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 17, отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 3,3.To obtain dentin, the material was subjected to low-frequency ultrasonic treatment with a frequency of 40 kHz. Before demineralization, the ratio of the intensity of the 960 cm-1 phosphate ion line to the 1660 cm-1 Amida I line intensity was 17, the ratio of the 1070 cm-1 carbonate ion line intensity to the 1660 cm-1 Amida I line intensity was 3.3.
После деминерализации в 4,8Н растворе соляной кислоты отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 0,65; отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1 0,55. Деминерализованный дентин использовали для выполнения костной пластики в стоматологии.After demineralization in a 4.8 N hydrochloric acid solution, the ratio of the intensity of the 960 cm-1 phosphate ion line to the 1660 cm-1 Amida I line intensity was 0.65; the ratio of the intensity of the carbonate ion line 1070 cm-1 to the intensity of the line Amida 1 1660 cm-1 0.55. Demineralized dentin was used to perform bone grafting in dentistry.
Способ может использоваться в специализированных биотехнологических центрах для получения культур клеток, биоматериалов для доклинической и клинической практики в области регенеративной медицины.The method can be used in specialized biotechnological centers to obtain cell cultures, biomaterials for preclinical and clinical practice in the field of regenerative medicine.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИSOURCES OF INFORMATION
1. Патент RU 2679082 С1 от 05.02.2019 «Способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток »1. Patent RU 2679082 C1 dated 02/05/2019 "Method of extracting dental pulp to obtain a stem cell culture"
2. Патент RU 2726554 С1 от 27.02.2020 « Способ получения и культивирования фибробластоаподобных клеток из пульпы молочных зубов».2. Patent RU 2726554 C1 dated February 27, 2020 “Method for obtaining and cultivating fibroblast-like cells from the pulp of milk teeth.”
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021107377A RU2768024C1 (en) | 2021-03-19 | 2021-03-19 | Method of producing biological products from primary teeth |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021107377A RU2768024C1 (en) | 2021-03-19 | 2021-03-19 | Method of producing biological products from primary teeth |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2768024C1 true RU2768024C1 (en) | 2022-03-23 |
Family
ID=80819182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021107377A RU2768024C1 (en) | 2021-03-19 | 2021-03-19 | Method of producing biological products from primary teeth |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2768024C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2679082C1 (en) * | 2017-12-13 | 2019-02-05 | Общество с ограниченной ответственностью "Покровский банк стволовых клеток" | Method for extracting a tooth pulp for receiving culture of stem cells |
| RU2726554C1 (en) * | 2020-02-27 | 2020-07-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for producing and culturing fibroblast-like cells from milk tooth pulp |
-
2021
- 2021-03-19 RU RU2021107377A patent/RU2768024C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2679082C1 (en) * | 2017-12-13 | 2019-02-05 | Общество с ограниченной ответственностью "Покровский банк стволовых клеток" | Method for extracting a tooth pulp for receiving culture of stem cells |
| RU2726554C1 (en) * | 2020-02-27 | 2020-07-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for producing and culturing fibroblast-like cells from milk tooth pulp |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KENGO NAKAJIMA et al., Success rates in isolating mesenchymal stem cells from permanent and deciduous teeth, Scientific Reports, 2019, 9, 16764, doi.org/10.1038/s41598-019-53265-4. * |
| ЗЫБИН М.А. и др. Оценка возможности использования дентинных материалов для костной пластики, Эндодонтия today, 2019, 17(3), 43-46, DOI: 10.36377/1683-2981-2019-17-3-43-46. * |
| ЗЫБИН М.А. и др. Оценка возможности использования дентинных материалов для костной пластики, Эндодонтия today, 2019, 17(3), 43-46, DOI: 10.36377/1683-2981-2019-17-3-43-46. KENGO NAKAJIMA et al., Success rates in isolating mesenchymal stem cells from permanent and deciduous teeth, Scientific Reports, 2019, 9, 16764, doi.org/10.1038/s41598-019-53265-4. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102127522B (en) | Human umbilical mesenchymal stem cell and preparation method thereof | |
| US7060494B2 (en) | Growth of human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) using umbilical cord blood serum and the method for the preparation thereof | |
| CN105238751B (en) | Isolated culture method of umbilical cord tissue mesenchymal stem cells | |
| US20210301258A1 (en) | Method for Producing Dental Pulp-Derived Cells | |
| CN105062959A (en) | Isolated culture method of human amnia mesenchymal stem cells | |
| CN101591644A (en) | Preparation and storage of umbilical cord mesenchymal stem cells for clinical treatment | |
| CN104560872A (en) | In-vitro separation and cultivation method for tooth-sourced mesenchymal stem cells | |
| CN105907711A (en) | Preparation method of deciduous tooth mesenchymal stem cells and used kit | |
| CN106318906A (en) | Method for large-scale culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| CN108220229A (en) | A kind of preparation method for improving umbilical cord derived mesenchymal stem cell primary cell yield | |
| CN104651305A (en) | Method for acquiring bioactive proteins by utilizing umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| CN108315297A (en) | A method of it detached from adipose tissue, purify fat stem cell | |
| CN110475855A (en) | Method for preparing dental pulp stem cells from cells derived from dental pulp tissue | |
| CN110747164A (en) | Preparation method of dental pulp stem cells | |
| RU2768024C1 (en) | Method of producing biological products from primary teeth | |
| CN108277202A (en) | A kind of cultural method of dental pulp mescenchymal stem cell | |
| CN106591230A (en) | Human umbilical cord mesenchymal stem cell culture solution and culture method thereof | |
| CN107236705B (en) | Human placenta chorion mesenchymal stem cell culture system | |
| CN101525596A (en) | Method for obtaining stem cell by using serum of same cord blood | |
| RU2679082C1 (en) | Method for extracting a tooth pulp for receiving culture of stem cells | |
| EP4677071A1 (en) | System and method for converting adipose derived mesenchymal stem cells to hematopoietic stem/progenitor cells and differentiating into blood cells and applications of same | |
| CN111909898A (en) | Separation and amplification method of human dental pulp stem cells and application thereof | |
| RU2726554C1 (en) | Method for producing and culturing fibroblast-like cells from milk tooth pulp | |
| REZENDE et al. | Dental Pulp Stem Cells from Natal Teeth: Isolation and Morphological Study. | |
| RU2517112C2 (en) | Method of cultivating mesenchymal stem cells, isolated from bone marrow |