RU2678569C1 - Method of pressing the tumors metastasis - Google Patents
Method of pressing the tumors metastasis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2678569C1 RU2678569C1 RU2018138338A RU2018138338A RU2678569C1 RU 2678569 C1 RU2678569 C1 RU 2678569C1 RU 2018138338 A RU2018138338 A RU 2018138338A RU 2018138338 A RU2018138338 A RU 2018138338A RU 2678569 C1 RU2678569 C1 RU 2678569C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- supernatant
- precipitate
- culture medium
- tumor cells
- minutes
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 title claims abstract description 10
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 30
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 29
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 22
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 12
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 7
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 10
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 claims description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 4
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 230000016507 interphase Effects 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 2
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 2
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001237 metamyelocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010015287 Erythropenia Diseases 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000610107 Homo sapiens Pre-B-cell leukemia transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100334107 Mus musculus F10 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100040171 Pre-B-cell leukemia transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 210000001167 myeloblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и может быть использовано для лечения пациентов с диагнозом - рак.The invention relates to medicine, in particular to oncology, and can be used to treat patients with a diagnosis of cancer.
Известен способ иммунотерапии опухолей, заключающийся в приеме пациентом экзомсодержащего препарата per os (патент: RU 2593003 С2, опубл. 27.07.2016, МПК A61K 35/54, А61Р 35/00, А61Р 37/00), в котором для лечения пациентов с онкологическими заболеваниями используют экзосомы, выделенные культурой клеток K562/i-S9, что не позволяет получить специфические экзосомы, вследствие чего не удается достигнуть высокой эффективности иммунного ответа, в отличие от экзосом, продуцируемых собственными опухолевыми клетками пациента - которые содержат специфические антигены, сходные с антигенами опухолевых клеток, ввиду чего позволяют достигнуть высоко эффективного иммунного ответа, в следствие чего известный способ недостаточно эффективен.A known method of immunotherapy of tumors, which consists in taking the patient exom-containing drug per os (patent: RU 2593003 C2, publ. 07.27.2016, IPC A61K 35/54, A61P 35/00, A61P 37/00), in which for the treatment of patients with cancer diseases use exosomes isolated by K562 / i-S9 cell culture, which does not allow specific exosomes to be obtained, and therefore it is not possible to achieve a high efficiency of the immune response, unlike exosomes produced by the patient’s own tumor cells - which contain specific antigens, are similar e with antigens of tumor cells, due to which they can achieve a highly effective immune response, as a result of which the known method is not effective enough.
Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего способа, является повышение эффективности лечения пациентов с диагнозом рак.The technical result achieved by the implementation of this method is to increase the effectiveness of the treatment of patients diagnosed with cancer.
Указанный технический результат достигается тем, что при реализации способа подавления метастазирования опухолей, согласно настоящему изобретению, для пациента с диагнозом - рак получают образец его биоматериала, содержащий опухолевые клетки, затем из полученного образца выделяют опухолевые клетки с выделением от них супернатанта, который далее культивируют в культуральной среде следующего состава: среда DMEM/F12 1:1с HEPES с добавлением 2 ммоль/мл или 3,65 мг/10 мл L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% эмбриональной сыворотки, в условиях Т=37°С и 5% CO2 в течение 48-72 часов, затем выделяют из полученной культуральной среды экзосомосодержащий осадок, растворяют его в фосфатно-солевом буфере в соотношении 1:5-1:20, и далее полученный раствор вводят пациенту перорально.The specified technical result is achieved by the fact that when implementing the method of suppressing metastasis of tumors according to the present invention, for a patient diagnosed with cancer, a sample of its biomaterial containing tumor cells is obtained, then tumor cells are isolated from the obtained sample with the release of supernatant from them, which are then cultured in culture medium of the following composition: DMEM / F12 1: 1c HEPES supplemented with 2 mmol / ml or 3.65 mg / 10 ml L-glutamine, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 10% fetal serum and, under conditions of T = 37 ° C and 5% CO2 for 48-72 hours, then an exosome-containing precipitate is isolated from the obtained culture medium, dissolved in phosphate-saline buffer in a ratio of 1: 5-1: 20, and then the resulting solution administered orally to the patient.
Известно, что экзосомы причастны к различным этапам иммунных реакций, в частности, экзосомы, выделяемые В-клетками, несут на своей поверхности рецепторы МНС II (главного комплекса гистосовместимости II), костимулирующие и адгезируюшие молекулы, что свидетельствует об их способности непосредственно стимулировать CD4 позитивные Т-клетки. [В lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Raposo G, Nijman HW, Stoorvogel W, Liejendekker R, Harding CV, Melief С J, Geuze HJ J Exp Med. 1996 Mar 1; 183(3): 1161-72.] Для усиления этого эффекта экзосомы концентрируют, например, с помощью магнитных бидсов и нагружают пептидами. Наряду со способностью активировать CD4 позитивные клетки, экзосомы, полученные от дендритных клеток и пулированные пептидами процессированных антигенов опухоли, способны активировать опухоль-специфические цитотоксические лимфоциты и тем самым подавлять рост опухоли. [Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, Wolfers J, Flament C, Tenza D, Ricciardi-Castagnoli P, Raposo G, Amigorena S Nat Med. 1998 May; 4(5):594-600.]It is known that exosomes are involved in various stages of immune reactions, in particular, exosomes secreted by B cells carry MHC II receptors (the main histocompatibility complex II) on their surface, which stimulate and adhere molecules, which indicates their ability to directly stimulate CD4 positive T -cells. [In lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Raposo G, Nijman HW, Stoorvogel W, Liejendekker R, Harding CV, Melief C J, Geuze HJ J Exp Med. 1996 Mar 1; 183 (3): 1161-72.] To enhance this effect, exosomes are concentrated, for example, using magnetic beads and loaded with peptides. Along with the ability to activate CD4 positive cells, exosomes derived from dendritic cells and peptulated by peptides of processed tumor antigens are able to activate tumor-specific cytotoxic lymphocytes and thereby suppress tumor growth. [Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, Wolfers J, Flament C, Tenza D, Ricciardi-Castagnoli P, Raposo G, Amigorena S Nat Med. 1998 May; 4 (5): 594-600.]
Таким образом, экзосомы, выделяемые опухолевыми клетками, также выступают в роли активаторов иммунной системы, однако с течением опухолевого процесса происходят трансформации, позволяющие атипичным клеткам избегать действия иммунокомпетентных клеток, к одной из подобных трансформаций относится неспособность лимфоцитов воспринимать экзосомы в качестве носителей опухолевого генетического материала. При использовании экзосом per os, полученных от пациента, происходит контакт между клетками иммунной системы и экзосомами, синтезированными опухолевыми клетками, что способно привести к активации противоопухолевого иммунитета.Thus, exosomes secreted by tumor cells also act as immune system activators, however, with the course of the tumor process, transformations occur that allow atypical cells to avoid the effects of immunocompetent cells; one of such transformations is the inability of lymphocytes to perceive exosomes as carriers of tumor genetic material. When using exosomes per os received from a patient, contact occurs between cells of the immune system and exosomes synthesized by tumor cells, which can lead to activation of antitumor immunity.
В качестве образца биоматериала предпочтительно использование венозной крови пациента, однако возможно использование и периферической крови пациента или опухолевой ткани, полученной интраоперационно, или асцистической / плевритной жидкости метастатического генеза, при этом в заявленном способе будет различаться процедура выделения опухолевых клеток с выделением от них супернатанта (данная процедура реализуется любым известным способом).The patient’s venous blood is preferably used as a sample of biomaterial, however, it is possible to use the patient’s peripheral blood or tumor tissue obtained intraoperatively or ascystic / pleuritic fluid of metastatic origin, while the claimed method will distinguish the procedure for isolating tumor cells with the release of supernatant from them (this the procedure is implemented in any known manner).
При использовании в качестве образца биоматериала венозной крови пациента предпочтительно выделение опухолевых клеток с выделением от них супернатанта реализовать следующим образом: забор венозной крови производят в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА, далее полученную кровь разбавляют в 2 раза раствором Хэнкса, после чего наслаивают на раствор фиколла-урографина плотностью 1,077 г/см2 в соотношении 1:4, далее проводят центрифугирование при 4°С на 2000 об/мин в течение 15 минут, затем собирают образовавшееся в ходе центрифугирования интерфазное кольцо к которому добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:10-1:15 и далее подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 минут, затем отделяют осадок к которому добавляют 1-2 мл лизирующего раствора и выдерживают полученную смесь в течение 10 минут при 15-25°С, далее к смеси добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:10 и перемешивают, после чего подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 минут, затем сливают супернатант и к осадку добавляют 3-4 мл фосфатно-солевого буфера, дополнительно содержащего 0,9М CaCl2 и перемешивают, далее из полученной суспензии выделяют опухолевые клетки в виде осадка посредством пропускания ее через микротрубку, затем полученный осадок с опухолевыми клетками культивируют в культуральной среде следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в условиях Т=37°С и 5% CO2 в течение 72 часов, при этом каждые 24 часа отбирают супернатант, а к оставшемуся осадку добавляют культуральную среду следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в объеме отобранного супернатанта.When using the patient’s venous blood biomaterial as a sample, it is preferable to isolate tumor cells with the isolation of supernatant from them as follows: venous blood is collected in a tube with an EDTA anticoagulant, then the resulting blood is diluted 2 times with Hanks' solution, and then layered onto a ficoll-urographin solution with a density of 1.077 g / cm 2 in a ratio of 1: 4, then centrifugation is carried out at 4 ° C at 2000 rpm for 15 minutes, then the interphase formed during centrifugation is collected the ring to which phosphate-buffered saline is added in a ratio of 1: 10-1: 15 and then subjected to centrifugation at 1500 rpm for 10 minutes, then the precipitate is separated to which 1-2 ml of lyse solution are added and the resulting mixture is kept for 10 minutes at 15-25 ° C, then add to the mixture phosphate-saline buffer in a ratio of 1:10 and mix, then centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes, then the supernatant is drained and 3-4 ml of phosphate is added to the precipitate -salt buffer additionally containing 0.9 M CaCl2 and mix they are then removed from the suspension obtained, tumor cells are isolated in the form of a precipitate by passing it through a microtube, then the obtained precipitate with tumor cells is cultured in a culture medium of the following composition: medium 79% RPMI, 20% FBS, 1% solution of penicillin streptomycin, at T = 37 ° С and 5% CO2 for 72 hours, a supernatant is taken every 24 hours, and the following culture medium is added to the remaining precipitate: 79% RPMI medium, 20% FBS, 1% streptomycin penicillin solution, in the volume of the selected supernatant.
Преимуществом такого способа выделения опухолевых клеток является возможность получить максимально в количественном отношении возможный пул опухолевых клеток с сохранением их жизнеспособности и стерильности. Наряду с этим данный способ позволяет с минимальными для опухолевых клеток потерями избавиться от клеток, не попадающих в интересующий пул, таких как эритроциты, лейкоциты и отчасти тромбоциты. Использование определенного рода ферментов, таких как аккутаза, позволяет минимизировать повреждение клеточных поверхностных рецепторов и антигенных детерминант. Условия центрифугирования подобраны таким образом, чтобы позволять дифференцировать дебрис (обломки клеток и продукты распада) с экзосомами от клеток, на этапах работы с супернатантом, содержащим осадок с обломками клеток, продуктами распада и экзосомами, описанные условия работы позволяют получить из всего осадка фракцию с наиболее высоким содержанием экзосом.The advantage of this method of isolating tumor cells is the ability to obtain the maximum possible quantitative pool of tumor cells while maintaining their viability and sterility. In addition, this method allows with minimal losses for tumor cells to get rid of cells that do not fall into the pool of interest, such as red blood cells, white blood cells and partly platelets. The use of certain types of enzymes, such as Accutase, can minimize damage to cell surface receptors and antigenic determinants. The centrifugation conditions are selected in such a way as to allow differentiating debris (cell debris and decay products) from exosomes from cells at the stages of work with a supernatant containing a sediment with cell debris, decay products and exosomes; the described operating conditions make it possible to obtain the fraction with the most high content of exosomes.
Преимущественно выделение из полученной культуральной среды экзосомосодержащего осадка осуществить путем дифференциального центрифугирования, а именно: центрифугируют полученную культуральную среду при 3000 об/мин в течение 10 мин., затем собирают образовавшийся супернатант далее проводят центрифугирование при 10000 об/мин в течение 30 минут, затем отбирают образовавшийся супернатант и проводят ультрацентрифугирование при 100000 об/мин в течение 2-х часов, далее отделяют образовавшийся осадок.It is preferable to isolate an exosome-containing precipitate from the obtained culture medium by differential centrifugation, namely, the resulting culture medium is centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, then the resulting supernatant is collected, then centrifuged at 10000 rpm for 30 minutes, then selected the resulting supernatant and conduct ultracentrifugation at 100,000 rpm for 2 hours, then the precipitate formed is separated.
Такой способ выделения экзосом позволяет максимально сконцинтрировать экзосомы и добиться очистки от фрагментов клеток, органелл и протеинов.This method of isolating exosomes makes it possible to concentrate exosomes as much as possible and achieve purification from fragments of cells, organelles, and proteins.
Алгоритм заявленного способа:The algorithm of the claimed method:
Получают образец биоматериала, содержащий опухолевые клетки, пациента с диагнозом- рак, а именно - образец венозной крови. Затем из полученного образца выделяют опухолевые клетки с выделением от них супернатанта: забор венозной крови производят в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА, далее полученную кровь разбавляют в 2 раза раствором Хэнкса, после чего наслаивают на раствор фиколла-урографина плотностью 1,077 г/см2 в соотношении 1:4, далее проводят центрифугирование при 4°С на 2000 об/мин в течение 15 минут, затем собирают образовавшееся в ходе центрифугирования интерфазное кольцо к которому добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:10-1:15 и далее подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 минут, затем отделяют осадок к которому добавляют 1-2 мл лизирующего раствора и выдерживают полученную смесь в течение 10 минут при 15-25°С, далее к смеси добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:10 и перемешивают, после чего подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 минут, затем сливают супернатант и к осадку добавляют 3-4 мл фосфатно-солевого буфера, дополнительно содержащего 0,9М CaCl2 и перемешивают, далее из полученной суспензии выделяют опухолевые клетки в виде осадка посредством пропускания ее через микротрубку, затем полученный осадок с опухолевыми клетками культивируют в культуральной среде следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в условиях Т=37°С и 5% CO2 в течение 72 часов, при этом каждые 24 часа отбирают супернатант, а к оставшемуся осадку добавляют культуральную среду следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в объеме отобранного супернатанта. Полученный супернатант с опухолевыми клетками культивируют в культуральной среде следующего состава: среда DMEM/F12 1:1 с HEPES с добавлением 2 ммоль/мл или 3,65 мг/10 мл L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% эмбриональной сыворотки, в условиях Т=37°С и 5% CO2 в течение 48-72 часов, затем выделяют из полученной культуральной среды экзосомосодержащий осадок путем дифференциального центрифугирования, а именно: центрифугируют полученную культуральную среду при 3000 об/мин в течение 10 мин., затем собирают образовавшийся супернатант далее проводят центрифугирование при 10000 об/мин в течение 30 минут, затем отбирают образовавшийся супернатант и проводят ультрацентрифугирование при 100000 об/мин в течение 2-х часов, далее отделяют образовавшийся осадок. Полученный экзосомосодержащий осадок растворяют в фосфатно-солевом буфере в соотношение 1:5-1:20, и далее полученный раствор вводят пациенту перорально.A sample of biomaterial containing tumor cells is obtained from a patient diagnosed with cancer, namely a venous blood sample. Then, tumor cells are isolated from the obtained sample with the release of the supernatant from them: venous blood is sampled in a test tube with the EDTA anticoagulant, then the resulting blood is diluted 2 times with Hanks solution, after which it is layered on a ficoll-urografin solution with a density of 1.077 g / cm 2 in the ratio 1 : 4, then centrifugation is carried out at 4 ° C at 2000 rpm for 15 minutes, then the interphase ring formed during centrifugation is collected to which phosphate-saline buffer is added in a ratio of 1: 10-1: 15 and then centered by suction at 1500 rpm for 10 minutes, then the precipitate is separated to which 1-2 ml of the lysing solution are added and the mixture is kept for 10 minutes at 15-25 ° С, then phosphate-saline buffer is added to the mixture in the ratio 1: 10 and mix, after which it is centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes, then the supernatant is drained and 3-4 ml of phosphate-saline buffer additionally containing 0.9 M CaCl2 is added to the precipitate and mixed, then tumor cells are isolated from the resulting suspension in the form of a precipitate by prop scanning it through a microtube, then the resulting pellet with tumor cells is cultured in a culture medium of the following composition: medium 79% RPMI, 20% FBS, 1% solution of penicillin streptomycin, at T = 37 ° C and 5% CO2 for 72 hours, at a supernatant is taken every 24 hours, and the following culture medium is added to the remaining precipitate: medium 79% RPMI, 20% FBS, 1% streptomycin penicillin solution, in the volume of the selected supernatant. The obtained tumor cell supernatant was cultured in a culture medium of the following composition: 1: 1 DMEM / F12 medium with HEPES supplemented with 2 mmol / ml or 3.65 mg / 10 ml L-glutamine, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 10% fetal serum, at T = 37 ° C and 5% CO2 for 48-72 hours, then an exosome-containing precipitate is isolated from the obtained culture medium by differential centrifugation, namely, the resulting culture medium is centrifuged at 3000 rpm in for 10 min., then collect the resulting supernatant further n centrifugation is carried out at 10,000 rpm for 30 minutes, then the formed supernatant is taken and ultracentrifugation is carried out at 100,000 rpm for 2 hours, then the precipitate formed is separated. The resulting exosome-containing precipitate is dissolved in phosphate-buffered saline in a ratio of 1: 5-1: 20, and then the resulting solution is administered orally to the patient.
Пример реализации заявленного способа:An example implementation of the claimed method:
Пациент, 14 лет, школьник, анамнез без особенностей, острый В лимфобластный лейкоз, цитогенетический вариант t (1;19)(q23;р13), Е2А/РВХ1. В пунктате костного мозга бласты (CD19+, CD79+, CD22cyt+, TdT+, HLADR+) 17,5%, все лейкоцитарное звено превышает верхнюю границу нормы, более всего повышены нейтрофильные метамиелоциты (до 67%), миелобласты не определяются. В гемограмме определяются бластные клетки 9%, метамиелоциты 3%, эритропения до 2,9*10∧12/л, лейкопения 2,3*10∧9/л. На этапе поддерживающей терапии наряду с 6-меркаптопурином проводился прием экзосом per os, полученных из аутологичных опухолевых клеток, 2 раза в неделю.A patient, 14 years old, a schoolboy, anamnesis without features, acute B lymphoblastic leukemia, cytogenetic variant t (1; 19) (q23; p13), E2A / PBX1. In bone marrow puncture, blasts (CD19 +, CD79 +, CD22cyt +, TdT +, HLADR +) are 17.5%, the whole leukocyte link exceeds the upper limit of the norm, neutrophilic metamyelocytes are highest (up to 67%), myeloblasts are not detected. In the hemogram, 9% blast cells, 3% metamyelocytes, erythropenia up to 2.9 * 10 ∧ 12 / L, leukopenia 2.3 * 10 ∧ 9 / L are determined. At the stage of maintenance therapy, along with 6-mercaptopurine, per os exosomes obtained from autologous tumor cells were taken 2 times a week.
Спустя 2 месяца после приема препарата и на поддерживающей терапии у пациента наблюдается снижение лейкопении с 2,3*10∧9 / л до 3,1*10∧9/л, что свидетельствует о постепенном повышении доли зрелых лейкоцитов в кровеносном русле; в пунктате костного мозга количество бластов снижается с 17,5% до 14%, в гемограмме перестают определяться бластные клетки. Среди иммунологических показателей наблюдается повышение цитотоксической активности NK (natural killer) клеток с 65% до приема препарата до 78% после приема препарата (при соотношении клеток-эффекторов к таргетнам клеткам 1:5). Данные изменения говорят в пользу улучшения состояния пациента и стабилизации процесса.2 months after taking the drug and on maintenance therapy, the patient has a decrease in leukopenia from 2.3 * 10 ∧ 9 / L to 3.1 * 10 ∧ 9 / L, which indicates a gradual increase in the proportion of mature white blood cells in the bloodstream; in bone marrow punctate, the number of blasts decreases from 17.5% to 14%; in the hemogram, blast cells cease to be detected. Among immunological parameters, there is an increase in the cytotoxic activity of NK (natural killer) cells from 65% before taking the drug to 78% after taking the drug (with a ratio of effector cells to target cells of 1: 5). These changes speak in favor of improving the patient's condition and stabilizing the process.
Опухолевые клетки были получены из венозной крови пациента, забор венозной крови производят в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА, далее полученную кровь разбавляют в 2 раза раствором Хэнкса, после чего наслаивают на раствор фиколла-урографина плотностью 1,077 г/см2 в соотношении 1:4, далее проводят центрифугирование при 4°С на 2000 об/мин в течение 15 минут, затем собирают образовавшееся в ходе центрифугирования интерфазное кольцо к которому добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:15 и далее подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 минут, затем отделяют осадок к которому добавляют 2 мл лидирующего раствора и выдерживают полученную смесь в течение 10 минут при 15°С, далее к смеси добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:10 и перемешивают, после чего подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 минут, затем сливают супернатант и к осадку добавляют 4 мл фосфатно-солевого буфера, дополнительно содержащего 0,9М CaCl2 и перемешивают, далее из полученной суспензии выделяют опухолевые клетки в виде осадка посредством пропускания ее через микротрубку, затем полученный осадок с опухолевыми клетками культивируют в культуральной среде следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в условиях Т=37°С и 5% CO2 в течение 72 часов, при этом каждые 24 часа отбирают супернатант, а к оставшемуся осадку добавляют культуральную среду следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в объеме отобранного супернатанта. выделение из полученной культуральной среды экзосомосодержащего осадка осуществить путем дифференциального центрифугирования, а именно: центрифугируют полученную культуральную среду при 3000 об/мин в течение 10 мин., затем собирают образовавшийся супернатант далее проводят центрифугирование при 10000 об/мин в течение 30 минут, затем отбирают образовавшийся супернатант и проводят ультрацентрифугирование при 100000 об/мин в течение 2-х часов, далее отделяют образовавшийся осадок.Tumor cells were obtained from the patient’s venous blood, venous blood was drawn into a tube with an EDTA anticoagulant, then the blood obtained was diluted 2 times with Hanks solution, after which it was layered on a ficoll-urografin solution with a density of 1.077 g / cm 2 in a ratio of 1: 4, then centrifugation is carried out at 4 ° C at 2000 rpm for 15 minutes, then the interphase ring formed during centrifugation is collected to which phosphate-saline buffer is added in a ratio of 1:15 and then centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes, then the precipitate is separated, to which 2 ml of the leading solution is added and the resulting mixture is kept for 10 minutes at 15 ° С, then phosphate-saline buffer is added to the mixture in the ratio of 1:10 and mixed, after which it is centrifuged at 1500 rpm / min for 10 minutes, then the supernatant is drained and 4 ml of phosphate-buffered saline, additionally containing 0.9 M CaCl2, are added to the precipitate and mixed, then tumor cells are isolated from the resulting suspension as a precipitate by passing it through a microtube, then the irradiated sediment with tumor cells was cultured in a culture medium of the following composition: medium 79% RPMI, 20% FBS, 1% solution of penicillin streptomycin, at T = 37 ° C and 5% CO2 for 72 hours, with the supernatant being taken every 24 hours and the culture medium of the following composition is added to the remaining precipitate: medium 79% RPMI, 20% FBS, 1% solution of penicillin streptomycin, in the volume of the selected supernatant. Isolation of the exosome-containing precipitate from the obtained culture medium is carried out by differential centrifugation, namely: the resulting culture medium is centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, then the resulting supernatant is collected, then centrifugation is carried out at 10000 rpm for 30 minutes, then the resulting supernatant and carry out ultracentrifugation at 100,000 rpm for 2 hours, then the precipitate formed is separated.
1.1. Для создания опухолевой модели, направленной на изучение процессов метастазирования и активации иммунного ответа, были взяты иммунокомпетентные мыши-самцы линии C57BL/6 возрастом не более 4 нед., n=27. В хвостовую вену всем животным были введены по 1×105 клеток мышиной меланомы линии F10/B16 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS, 100 000 клеток / 0,1 мл PBS). Процесс метастазирования до момента воздействия происходил в течение 8 дней.1.1. To create a tumor model aimed at studying the processes of metastasis and activation of the immune response, immunocompetent male C57BL / 6 mice of no more than 4 weeks old were taken, n = 27. All animals were injected into the tail vein with 1 × 105 cells of mouse melanoma of the F10 / B16 line in phosphate buffered saline (PBS, 100,000 cells / 0.1 ml PBS). The process of metastasis before exposure occurred within 8 days.
1.2. Для приготовления препарата клетки мышиной меланомы линии F10/B16 были разморожены и культивировались в течение 72 ч до достижения количества в 6000000, после чего были процентрифугированы при 3000 об/мин, супернатант передан Заказчику для подготовки Препарата.1.2. To prepare the preparation, mouse F10 / B16 mouse melanoma cells were thawed and cultured for 72 hours until the amount of 6000000 was reached, after which they were centrifuged at 3000 rpm, the supernatant was transferred to the Customer for preparation of the Preparation.
1.3. Животных разделили на 3 группы: №1 (в/в введение), №2 (пероральное введение), №3 (контроль).1.3. Animals were divided into 3 groups: No. 1 (iv administration), No. 2 (oral administration), No. 3 (control).
1.4. Мыши содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к брикетированному корму и воде. На 8-й и на 11-й день с момента инакуляции проводили введение Препарата:1.4. Mice were kept under standard vivarium conditions with free access to briquetted food and water. On the 8th and 11th day from the moment of inactivation, the drug was administered:
- группе №1 вводили в хвостовую вену 100 мкг Препарата- group No. 1 was injected into the tail vein 100 μg of the Drug
- группе №2 вводили перорально 100 мкг Препарата- group No. 2 was orally administered 100 μg of the Drug
- группе №3 вводили в хвостовую вену 100 мкг чистого PBS (без Препарата)- group No. 3 was injected into the tail vein 100 μg of pure PBS (without drug)
Забой происходил методом цервикальной дислокации через 16 дней после инакуляции опухолевых клеток. С целью оценки метастатического процесса проводилась визуальная оценка наличия и числа метастаз в печени и замерялась ее масса. Статистическая значимость оценивалась с помощью одностороннего анализа дисперсии в программе SPSS 22.Slaughter occurred by the method of cervical dislocation 16 days after the inoculation of tumor cells. In order to evaluate the metastatic process, a visual assessment was made of the presence and number of metastases in the liver and its mass was measured. Statistical significance was assessed using a one-way analysis of variance in SPSS 22.
- Среднее количество метастазов в печени в группе №1: 5,5+-0,5. Средняя масса печени: 1,2+-0,1- The average number of liver metastases in group No. 1: 5.5 + -0.5. Average liver mass: 1.2 + -0.1
- Среднее количество метастазов в печени в группе №2: 3,8+-0,3. Средняя масса печени: 1,1+-0,2- The average number of liver metastases in group No. 2: 3.8 + -0.3. Average liver mass: 1.1 + -0.2
- Среднее количество метастазов в печени в группе №3: 9,0+-2,1. Средняя масса печени: 1,4+-0,2- The average number of liver metastases in group 3: 9.0 + -2.1. Average liver mass: 1.4 + -0.2
Отличия количества метастазов в группах наблюдения от контроля достоверно (р<0,05). Различие в количестве метастаз между группами 1 и 2 на грани достоверности (р<0,1). Масса печени в группах наблюдения и в контроле различалась недостоверно (р>0,05).The differences in the number of metastases in the observation groups from the control were significant (p <0.05). The difference in the number of metastases between groups 1 and 2 is on the verge of significance (p <0.1). Liver mass in the observation groups and in the control did not differ significantly (p> 0.05).
С целью оценки активации иммунной системы из селезенок животных были выделены спленоциты, в которых определялся процент цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+ при помощи метода проточной цитометрии. С этой целью после выделения спленоциты отмывали в PBS и инкубировали в течение часа при 4С с антителами antiCD8, с дальнейшим анализом на проточном цитофлюориметре Beckman&Dickinson.In order to assess the activation of the immune system, splenocytes were isolated from animal spleens, in which the percentage of CD8 + cytotoxic T lymphocytes was determined using flow cytometry. For this purpose, after isolation, splenocytes were washed in PBS and incubated for 4 hours at 4C with antiCD8 antibodies, with further analysis on a Beckman & Dickinson flow cytometer.
В группе №1 средний процент Т-лимфоцитов CD8+: 27%In group No. 1, the average percentage of T-lymphocytes CD8 +: 27%
В группе №2 средний процент Т-лимфоцитов CD8+: 36%In group No. 2, the average percentage of CD8 + T-lymphocytes: 36%
В группе №2 средний процент Т-лимфоцитов CD8+: 17%In group No. 2, the average percentage of CD8 + T-lymphocytes: 17%
Значения «наблюдение-контроль» отличаются достоверно (р<0,05). Различие между группами 1 и 2 достоверно (р<0,05).The values of "observation-control" differ significantly (p <0.05). The difference between groups 1 and 2 was significant (p <0.05).
Применение Препарата перорально ингибирует процесс метастазирования более выраженно, чем применение внутривенно. Аналогичные наблюдения отмечены при анализе степени активации иммунной системы. Возможно, процесс связан с макрофаг-опосредованной антиген-презентацией опухоли Т-киллерам.The use of the drug orally inhibits the process of metastasis more pronounced than intravenous use. Similar observations were noted in the analysis of the degree of activation of the immune system. Perhaps the process is associated with macrophage-mediated antigen presentation of the tumor to T-killers.
Claims (4)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018138338A RU2678569C1 (en) | 2018-10-31 | 2018-10-31 | Method of pressing the tumors metastasis |
| US16/668,581 US20220105132A9 (en) | 2018-10-31 | 2019-10-30 | Method for Producing an Exosome Containing Agent for Metastasis Suppression |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018138338A RU2678569C1 (en) | 2018-10-31 | 2018-10-31 | Method of pressing the tumors metastasis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2678569C1 true RU2678569C1 (en) | 2019-01-30 |
Family
ID=65273553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018138338A RU2678569C1 (en) | 2018-10-31 | 2018-10-31 | Method of pressing the tumors metastasis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2678569C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090136999A1 (en) * | 2003-07-15 | 2009-05-28 | Michigan State University | Compositions and methods for immunotherapy of cancer and infectious diseases |
| RU2571224C2 (en) * | 2009-05-11 | 2015-12-20 | УЗ ФАРМА ГмбХ | Humanised anti-axl antibodies |
| US20170369829A1 (en) * | 2015-01-07 | 2017-12-28 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Microfluidic cell culture of patient-derived tumor cell spheroids |
-
2018
- 2018-10-31 RU RU2018138338A patent/RU2678569C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090136999A1 (en) * | 2003-07-15 | 2009-05-28 | Michigan State University | Compositions and methods for immunotherapy of cancer and infectious diseases |
| RU2571224C2 (en) * | 2009-05-11 | 2015-12-20 | УЗ ФАРМА ГмбХ | Humanised anti-axl antibodies |
| US20170369829A1 (en) * | 2015-01-07 | 2017-12-28 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Microfluidic cell culture of patient-derived tumor cell spheroids |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YANG L. et al. Gene therapy of metastatic pancreas cancer with intraperitoneal injections of concentrated retroviral herpes simplex thymidine kinase vector supernatant and ganciclovir. Ann Surg. 1996. Sep; 224(3): 405-14; discussion 414-7. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7282874B2 (en) | Exosome-based anti-tumor vaccine | |
| US8673296B2 (en) | Method and composition for producing a cellular allogeneic vaccine | |
| US20100111916A1 (en) | Materials and Method of Modulating the Immune Response | |
| JP2013507986A (en) | Method for the proliferation of antigen-specific T cells | |
| CN103533955A (en) | Method for priming of t cells | |
| WO2004055053A1 (en) | Tumor vaccine | |
| RU2678569C1 (en) | Method of pressing the tumors metastasis | |
| CN113521270B (en) | EBV composite antigen, dendritic cell vaccine and application thereof | |
| JP2002502880A (en) | Hapten-modified tumor cell membranes and uses thereof | |
| US10443040B2 (en) | Method for preparing antigen-specific cytotoxic T-cells by using activated B-cells and use thereof | |
| US20220105132A9 (en) | Method for Producing an Exosome Containing Agent for Metastasis Suppression | |
| US20090060946A1 (en) | Activation of antigen-specific T cells by virus/antigen-treated dendritic cells | |
| US20240252644A1 (en) | Person-tailored t cell composition targeting merkel cell carcinoma | |
| US6884413B1 (en) | Induction of antigen-specific unresponsiveness by glioblastoma culture supernatants (GCS) | |
| CN105219714A (en) | A kind of test kit for activating lung cancer specific immune response | |
| EP1577381A1 (en) | Tumor/B-cell hybrid cells and uses thereof | |
| CN116650629A (en) | Preparation of mouse dendritic cell exosome mediated liver cancer vaccine | |
| CZ20160U1 (en) | Individual immunotherapeutic antitumor vaccine | |
| CN111643525A (en) | Application of inducing immunological rejection reaction in tumor treatment and method thereof | |
| CN115246870A (en) | Activated dendritic cells and their use in the treatment of cancer | |
| CN106544319A (en) | A kind of compositionss for stimulating maturing dendritic cell and its method for stimulating maturing dendritic cell | |
| CZ29538U1 (en) | Kit for the preparation of antitumor vaccine, antitumor vaccine per se inclusive of efficiency intensification | |
| CN105219721A (en) | A kind of for activating the immunoreactive test kit of Pancreatic Cancer-Specific | |
| WO2014007667A1 (en) | Autologous vaccine for treating pulmonary tuberculosis and method for producing same |