RU2677336C2 - Method for obtaining virus-like particles of human papillomavirus - Google Patents
Method for obtaining virus-like particles of human papillomavirus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2677336C2 RU2677336C2 RU2015149330A RU2015149330A RU2677336C2 RU 2677336 C2 RU2677336 C2 RU 2677336C2 RU 2015149330 A RU2015149330 A RU 2015149330A RU 2015149330 A RU2015149330 A RU 2015149330A RU 2677336 C2 RU2677336 C2 RU 2677336C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hpv
- protein
- type
- concentration
- nacl
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 title claims description 75
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 124
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 88
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 62
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 41
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 35
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 35
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 33
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 29
- 108700005307 Human papillomavirus HPV L1 Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 12
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 40
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 241000701828 Human papillomavirus type 11 Species 0.000 claims 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 2
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 abstract 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 41
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 29
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 22
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 22
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 16
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 14
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 14
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 14
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 13
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 13
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 13
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 11
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 8
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 8
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 8
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 6
- -1 NaCl) in step (c) Chemical class 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000641177 Human papillomavirus type 16 Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 3
- 101710132701 Protein L1 Proteins 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 3
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 241000883306 Huso huso Species 0.000 description 1
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 1
- 241000235088 Saccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000011295 pitch Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 125000004964 sulfoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к способу получения вирусоподобных частиц (VLP; от англ.: virus-like particles) на основе белка L1 папилломавируса человека (HPV; от англ.: human papillomavirus).The present invention relates to a method for producing virus-like particles (VLP; from the English: virus-like particles) based on the human papillomavirus L1 protein (HPV; from the English: human papillomavirus).
Предшествующий уровень техникиState of the art
Известно более 80 типов папилломавирусов человека (HPV), и более 30 типов вызывают цервикальную инфекцию при половом контакте, причем известно, что половина этих типов связана с раком шейки матки. Кроме того, заболеваемость раком у женщин, инфицированных HPV 16 и 18 типов, в 500 раз выше, чем у неинфицированных женщин, и известно, что HPV 16 и 18 типов инфицируют эпителиальные клетки полового органа, вызывая рак шейки матки вследствие злокачественной трансформации (Hausen, Biochemica. Biophysica. Acta, 1288: 55-78, 1996).More than 80 types of human papillomaviruses (HPV) are known, and more than 30 types cause cervical infection through sexual contact, and it is known that half of these types are associated with cervical cancer. In addition, cancer incidence in women infected with
Существующие в настоящее время вакцины для профилактики рака шейки матки разработаны с использованием вирусоподобных частиц (VLP) HPV высокого онкогенного риска. VLP состоят из основного капсидного белка (белка L1 с молекулярной массой, примерно равной 55 кДа) HPV и обладают способностью к самосборке с образованием VLP без продукта гена L1 или продуктов других вирусных генов, что очень сходно со свойствами природного вириона HPV. Кроме того, VLP вызывают долговременный иммунитет, и можно ожидать, что они обеспечат высокую эффективность в качестве экспериментальной вакцины вследствие специфичности типа гена.Current cervical cancer prevention vaccines have been developed using high oncogenic risk HPV virus-like particles (VLPs). VLPs consist of a basic capsid protein (L1 protein with a molecular weight of approximately 55 kDa) of HPV and are capable of self-assembly to form VLPs without the L1 gene product or the products of other viral genes, which is very similar to the properties of the natural HPV virion. In addition, VLPs induce long-term immunity, and they can be expected to provide high efficacy as an experimental vaccine due to the specificity of the gene type.
Были произведены попытки получения VLP HPV с использованием дрожжевых систем экспрессии. Известны способы очистки VLP HPV, полученных из Saccharomyces cerevisiae, до высокой степени чистоты, описанные ниже. В зарегистрированном корейском патенте №10-0959145 описан способ очистки L1 белка HPV посредством добавления сульфата аммония к лизату дрожжей, который получают посредством культивирования трансформированных дрожжей, экспрессирующих белок L1 HPV, и их лизиса, для осаждения белка и последующего выполнения эксклюзионной хроматографии и катионообменной хроматографии белковых преципитатов.Attempts have been made to obtain HPV VLPs using yeast expression systems. Known methods for purifying HPV VLPs obtained from Saccharomyces cerevisiae to a high degree of purity are described below. Registered Korean Patent No. 10-0959145 describes a method for purifying HPV L1 protein by adding ammonium sulfate to a yeast lysate, which is obtained by culturing transformed yeast expressing HPV L1 protein and lysing it, to precipitate the protein and then perform size exclusion chromatography and protein cation exchange chromatography precipitates.
В тексте публикации процитированы многочисленные статьи и патентные документы и приведены библиографические ссылки на них. Содержание процитированных статей и патентных документов полностью включено в данную публикацию посредством ссылки, а область техники, к которой относится настоящее изобретение, и детали настоящего изобретения разъяснены более подробно.The text of the publication cites numerous articles and patent documents and provides bibliographic references to them. The contents of the cited articles and patent documents are fully incorporated into this publication by reference, and the technical field to which the present invention relates, and the details of the present invention are explained in more detail.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияInformation confirming the possibility of carrying out the invention
Техническая проблемаTechnical problem
Авторы настоящего изобретения выполнили исследования условий очистки с целью повышения выхода продукции при получении и очистке белка L1 HPV в промышленном масштабе с использованием дрожжевой системы экспрессии. В результате, авторы настоящего изобретения подтвердили, что эффективность очистки белка L1 HPV может быть значительно повышена за счет обработки преципитата, полученного при осаждении сульфатом аммония дрожжевого продукта, содержащего белок L1, раствором соли с концентрацией, лежащей в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, для удаления загрязнений и последующей хроматографии, и таким образом осуществили настоящее изобретение.The authors of the present invention carried out studies of the purification conditions in order to increase the yield upon receipt and purification of HPV L1 protein on an industrial scale using a yeast expression system. As a result, the authors of the present invention have confirmed that the purification efficiency of HPV L1 protein can be significantly improved by treating the precipitate obtained by precipitation of ammonium sulfate yeast product containing protein L1, a salt solution with a concentration lying in the range from 0.35 M to 0 , 60 M, to remove contaminants and subsequent chromatography, and thus the present invention has been completed.
Поэтому первым аспектом настоящего изобретения является обеспечение способа получения вирусоподобных частиц на основе белка L1 HPV.Therefore, the first aspect of the present invention is the provision of a method for producing virus-like particles based on HPV L1 protein.
Другим аспектом настоящего изобретения является обеспечение вирусоподобных частиц на основе белка L1 HPV, полученных способом по настоящему изобретению.Another aspect of the present invention is the provision of virus-like particles based on HPV L1 protein obtained by the method of the present invention.
Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из приведенного ниже подробного описания настоящего изобретения, формулы изобретения и графических материалов.Other objectives and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the present invention, claims and graphic materials.
Техническое решениеTechnical solution
Согласно первому аспекту настоящего изобретения обеспечен способ получения вирусоподобных частиц (VPL) на основе белка L1 папилломавируса человека (HPV), который включает:According to a first aspect of the present invention, there is provided a method for producing virus-like particles (VPL) based on human papillomavirus L1 protein (HPV), which comprises:
(a) культивирование трансформированных дрожжей, экспрессирующих белок L1 HPV;(a) culturing transformed yeast expressing HPV L1 protein;
(b) выполнение осаждения сульфатом аммония в продукте трансформированных дрожжей, культивированных на стадии (а), с получением преципитата;(b) performing precipitation with ammonium sulfate in the product of the transformed yeast cultured in step (a) to obtain a precipitate;
(c) обработку преципитата, полученного посредством осаждения сульфатом аммония, раствором соли с концентрацией, лежащей в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, с последующей инкубацией и последующее удаление образовавшихся нерастворимых белков; и(c) treating the precipitate obtained by precipitation with ammonium sulfate, a salt solution with a concentration lying in the range from 0.35 M to 0.60 M, followed by incubation and subsequent removal of the formed insoluble proteins; and
(в) выполнение хроматографии продукта, полученного на стадии (с) с получением белка L1.(c) performing chromatography of the product obtained in step (c) to obtain L1 protein.
Авторы настоящего изобретения выполнили исследования условий очистки с целью повышения выхода продукции при получении и очистке белка L1 HPV в промышленном масштабе с использованием дрожжевой системы экспрессии. В результате авторы настоящего изобретения подтвердили, что эффективность очистки белка L1 HPV может быть значительно повышена за счет обработки преципитата, полученного при осаждении сульфатом аммония дрожжевого продукта, содержащего белок L1, раствором соли с концентрацией, лежащей в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, для удаления загрязнений и последующей хроматографии.The authors of the present invention carried out studies of the purification conditions in order to increase the yield upon receipt and purification of HPV L1 protein on an industrial scale using a yeast expression system. As a result, the authors of the present invention have confirmed that the purification efficiency of HPV L1 protein can be significantly improved by treating the precipitate obtained by precipitation of ammonium sulfate yeast product containing protein L1, a salt solution with a concentration lying in the range from 0.35 M to 0, 60 M, to remove contaminants and subsequent chromatography.
Далее соответствующие стадии настоящего изобретения будут описаны более подробно.Next, the corresponding steps of the present invention will be described in more detail.
(а) Культивирование трансформированных дрожжей, экспрессирующих белок L1 HPV(a) Cultivation of transformed yeast expressing HPV L1 protein
На стадии (а) настоящего изобретения культивируют трансформированные дрожжи, экспрессирующие белок L1 HPV.In step (a) of the present invention, transformed yeast expressing HPV L1 protein is cultured.
В данной публикации клетки, пригодные для экспрессии белка L1 HPV, являются дрожжами; например, могут быть использованы Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces pombe, пекарские дрожжи и т.п.In this publication, cells suitable for expression of the HPV L1 protein are yeast; for example, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces pombe, baker's yeast and the like can be used.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения трансформированными дрожжами по настоящему изобретению являются Saccharomyces cerevisiae.According to an embodiment of the present invention, the transformed yeast of the present invention is Saccharomyces cerevisiae.
Термин «трансформированные дрожжи, экспрессирующие белок L1 HPV» относится к дрожжевым клеткам, трансформированным вектором экспрессии, успешно экспрессирующим белок L1 HPV. Вектор экспрессии может содержать факторы, регулирующие транскрипцию или трансляцию, и другие маркерные гены, известные в данной области техники.The term "transformed yeast expressing HPV L1 protein" refers to yeast cells transformed with an expression vector that successfully expresses HPV L1 protein. The expression vector may contain transcriptional or translational regulatory factors and other marker genes known in the art.
Дрожжи, трансформированные для экспрессии белка L1 HPV по настоящему изобретению, можно легко получить с использованием способов, известных в данной области техники, и эти способы раскрыты в публикациях US 7250170, US 6613557, US 5888516, US 5871998, US 5618536 и US 5437951, содержание которых полностью включено в данную работу посредством ссылки.Yeast transformed to express the HPV L1 protein of the present invention can be easily obtained using methods known in the art, and these methods are disclosed in US 7250170, US 6613557, US 5888516, US 5871998, US 5618536 and US 5437951, content which are fully incorporated into this work by reference.
Трансформированные дрожжи можно культивировать способами, используемыми в данной области техники для получения белка L1 HPV с использованием дрожжей. Например, трансформированные дрожжи можно культивировать в среде с добавлением одного или более источников углерода - глюкозы и галактозы, и примером среды, используемой для культивирования трансформированных дрожжей, является среда YPDG (содержащая экстракт дрожжей, пептон, глюкозу и галактозу). Кроме того, трансформированные дрожжи можно культивировать в течение периода, составляющего менее 96 часов (например, 95 часов или менее, от 10 часов до 95 часов, от 20 часов до 95 часов или от 24 часов до 95 часов).Transformed yeast can be cultured by methods used in the art to produce HPV L1 protein using yeast. For example, transformed yeast can be cultured in a medium supplemented with one or more carbon sources — glucose and galactose, and an example of the medium used to cultivate transformed yeast is YPDG medium (containing yeast extract, peptone, glucose and galactose). In addition, transformed yeast can be cultured for a period of less than 96 hours (for example, 95 hours or less, from 10 hours to 95 hours, from 20 hours to 95 hours, or from 24 hours to 95 hours).
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, белок L1 HPV выбран из белков HPV 6а типа, HPV 6b типа, HPV 11 типа, HPV 16 типа, HPV 18 типа, HPV 31 типа, HPV 33 типа, HPV 35 типа, HPV 39 типа, HPV 45 типа, HPV 51 типа, HPV 52 типа, HPV 56 типа, HPV 58 типа и HPV 68 типа. Согласно более конкретному варианту осуществления настоящего изобретения, белок L1 HPV является белком HPV 16 типа или HPV 18 типа.According to an embodiment of the present invention, the HPV L1 protein is selected from
(b) Получение преципитата с использованием сульфата аммония(b) Obtaining precipitate using ammonium sulfate
На стадии (b) настоящего изобретения получают преципитат посредством обработки продукта (содержащего белок L1) трансформированных дрожжей, культивированных на стадии (а), сульфатом аммония. Например, на стадии (b) трансформированные дрожжи, культивированные на стадии (а), лизируют и обрабатывают лизат сульфатом аммония с получением преципитата.In step (b) of the present invention, a precipitate is obtained by treating a product (containing L1 protein) of the transformed yeast cultured in step (a) with ammonium sulfate. For example, in step (b), the transformed yeast cultured in step (a) is lysed and the lysate is treated with ammonium sulfate to form a precipitate.
Культивированные дрожжевые клетки можно лизировать с использованием способов получения лизата клеток, известных в данной области техники, например (но не ограничиваясь этим) - посредством обработки ультразвуком, разрушения стеклянными шариками и т.п.Cultured yeast cells can be lysed using methods known in the art for producing a cell lysate, for example (but not limited to) by sonication, destruction by glass beads, and the like.
После этого экспрессированные белки осаждают посредством обработки дрожжевого продукта сульфатом аммония (посредством добавления сульфата аммония) и удаляют загрязнения посредством центрифугирования или сходным способом.Subsequently, expressed proteins are precipitated by treating the yeast product with ammonium sulfate (by adding ammonium sulfate) and remove contaminants by centrifugation or a similar method.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, концентрация сульфата аммония для обработки на стадии (b) лежит в диапазоне от 20 масс. % до 60 масс. %. Согласно более конкретному варианту осуществления настоящего изобретения, концентрация сульфата аммония для обработки лежит в диапазоне от 40 масс. % до 50 масс. % или от 42 масс. % до 48 масс. %.According to a variant implementation of the present invention, the concentration of ammonium sulfate for processing in stage (b) lies in the range from 20 mass. % to 60 mass. % According to a more specific embodiment of the present invention, the concentration of ammonium sulfate for processing lies in the range from 40 masses. % to 50 mass. % or from 42 wt. % to 48 mass. %
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, преципитат, полученный посредством осаждения сульфатом аммония на стадии (b), инкубируют в растворе, содержащем соль (например, NaCl).According to an embodiment of the present invention, the precipitate obtained by precipitation with ammonium sulfate in step (b) is incubated in a solution containing a salt (e.g., NaCl).
Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения, преципитат, полученный посредством осаждения сульфатом аммония, разбавляют до концентрации, лежащей в диапазоне от 25 мг/мл до 65 мг/мл, посредством добавления буферного раствора, смешанного с 0,5 М или более (например, от 0,5 М до 0,9 М, от 0,6 М до 0,9 М или от 0,7 М до 0,9 М) раствором NaCl, перемешивают в течение предварительно заданного времени и затем инкубируют в течение 12 часов или более (например, в течение периода от 18 часов до 20 часов). Температура инкубации может лежать в диапазоне от 3°C до 5°C (например, она может быть равной 4°C).According to a specific embodiment of the present invention, the precipitate obtained by precipitation with ammonium sulfate is diluted to a concentration in the range of 25 mg / ml to 65 mg / ml by adding a buffer solution mixed with 0.5 M or more (for example, 0.5 M to 0.9 M, 0.6 M to 0.9 M, or 0.7 M to 0.9 M) with a NaCl solution, stirred for a predetermined time and then incubated for 12 hours or more (for example, during the period from 18 hours to 20 hours). The incubation temperature can range from 3 ° C to 5 ° C (for example, it can be equal to 4 ° C).
(с) Удаление загрязнений посредством обработки раствором соли с концентрацией, лежащей в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М(c) Removing contaminants by treatment with a salt solution with a concentration lying in the range from 0.35 M to 0.60 M
На стадии (с) способа по настоящему изобретению преципитат, полученный посредством обработки сульфатом аммония, обрабатывают раствором соли с концентрацией, лежащей в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, и полученный материал инкубируют для формирования загрязнений в форме нерастворимых белков. После этого сформированные нерастворимые белки удаляют, тем самым значительно повышая эффективность очистки белка L1 HPV.In step (c) of the method of the present invention, the precipitate obtained by treatment with ammonium sulfate is treated with a salt solution in a concentration ranging from 0.35 M to 0.60 M, and the resulting material is incubated to form impurities in the form of insoluble proteins. After that, the formed insoluble proteins are removed, thereby significantly increasing the efficiency of HPV L1 protein purification.
Как описано в примерах, приведенных ниже, способ обработки раствором соли с концентрацией, лежащей в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, является стадией, которая способствует значительному повышению эффективности очистки белка L1 HPV (см. Пример 3). То есть, в тех случаях, когда нерастворимые белки, образовавшиеся на этой стадии, удаляют посредством центрифугирования, степень чистоты VLP, элюируемых в процессе хроматографии на следующей стадии, может быть значительно повышена.As described in the examples below, a method for treating a salt solution with a concentration ranging from 0.35 M to 0.60 M is a step that contributes to a significant increase in the purification efficiency of HPV L1 protein (see Example 3). That is, in cases where the insoluble proteins formed in this step are removed by centrifugation, the purity of the VLPs eluted during chromatography in the next step can be significantly increased.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, раствор, содержащий преципитат, полученный посредством осаждения сульфатом аммония, который был инкубирован в течение предварительно заданного времени в присутствии указанной соли (например, NaCl) на стадии (с), диализируют в буферном растворе, содержащем соль в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, и затем инкубируют, тем самым удаляя загрязнения, находящиеся в нерастворимом состоянии. Буферный раствор, содержащий соль в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, может содержать неионогенное поверхностно-активное вещество. Например, неионогенное поверхностно-активное вещество может содержаться в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,001% до 0,1%.According to an embodiment of the present invention, a solution containing a precipitate obtained by precipitation with ammonium sulfate, which was incubated for a predetermined time in the presence of said salt (e.g., NaCl) in step (c), is dialyzed in a buffer solution containing a salt in a concentration lying in the range from 0.35 M to 0.60 M, and then incubated, thereby removing impurities in the insoluble state. A buffer solution containing salt in a concentration ranging from 0.35 M to 0.60 M may contain a nonionic surfactant. For example, a nonionic surfactant may be present in a concentration ranging from 0.001% to 0.1%.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, концентрация преципитата, полученного посредством осаждения сульфатом аммония, который подлежит обработке раствором соли с концентрацией, лежащей в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, лежит в диапазоне от 25 мг/мл до 65 мг/мл. Эта концентрация преципитата, полученного посредством осаждения сульфатом аммония, может быть отрегулирована посредством смешивания преципитата, полученного посредством осаждения сульфатом аммония, с буферным раствором.According to an embodiment of the present invention, the concentration of precipitate obtained by precipitation with ammonium sulfate, which is to be treated with a salt solution with a concentration lying in the range from 0.35 M to 0.60 M, lies in the range from 25 mg / ml to 65 mg / ml . This concentration of precipitate obtained by precipitation with ammonium sulfate can be adjusted by mixing the precipitate obtained by precipitation with ammonium sulfate with a buffer solution.
Согласно более конкретному варианту осуществления настоящего изобретения, концентрация преципитата, полученного посредством осаждения сульфатом аммония, лежит в диапазоне от 28 мг/мл до 62 мг/мл, от 28 мг/мл до 60 мг/мл, от 28 мг/мл до 55 мг/мл, от 28 мг/мл до 50 мг/мл, от 30 мг/мл до 62 мг/мл, от 30 мг/мл до 60 мг/мл, от 30 мг/мл до 55 мг/мл или от 30 мг/мл до 50 мг/мл.According to a more specific embodiment of the present invention, the concentration of precipitate obtained by precipitation with ammonium sulfate is in the range from 28 mg / ml to 62 mg / ml, from 28 mg / ml to 60 mg / ml, from 28 mg / ml to 55 mg / ml, from 28 mg / ml to 50 mg / ml, from 30 mg / ml to 62 mg / ml, from 30 mg / ml to 60 mg / ml, from 30 mg / ml to 55 mg / ml or 30 mg / ml to 50 mg / ml.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, солью является NaCl, KCl или Na2CO3.According to an embodiment of the present invention, the salt is NaCl, KCl or Na 2 CO 3 .
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, концентрация соли для обработки на стадии (с) лежит в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, от 0,35 М до 0,55 М, от 0,35 М до 0,50 М или от 0,35 М до 0,45 М; от 0,40 М до 0,60 М, от 0,40 М до 0,55 М, от 0,40 М до 0,50 М или от 0,40 М до 0,45 М; от 0,45 М до 0,60 М, от 0,45 М до 0,55 М или от 0,45 М до 0,50 М; или от 0,50 М до 0,60 М, или от 0,50 М до 0,55 М.According to an embodiment of the present invention, the concentration of the salt for processing in step (c) is in the range from 0.35 M to 0.60 M, from 0.35 M to 0.55 M, from 0.35 M to 0.50 M or from 0.35 M to 0.45 M; from 0.40 M to 0.60 M, from 0.40 M to 0.55 M, from 0.40 M to 0.50 M or from 0.40 M to 0.45 M; from 0.45 M to 0.60 M, from 0.45 M to 0.55 M or from 0.45 M to 0.50 M; or from 0.50 M to 0.60 M, or from 0.50 M to 0.55 M.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, солью для обработки на стадии (с) является NaCl, и концентрация NaCl для обработки лежит в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М или от 0,35 М до 0,55 М; от 0,40 М до 0,60 М или от 0,40 М до 0,55 М; или от 0,45 М до 0,60 М или от 0,45 М до 0,55 М.According to an embodiment of the present invention, the treatment salt in step (c) is NaCl, and the concentration of NaCl for treatment is in the range from 0.35 M to 0.60 M or from 0.35 M to 0.55 M; from 0.40 M to 0.60 M or from 0.40 M to 0.55 M; or from 0.45 M to 0.60 M or from 0.45 M to 0.55 M.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, солью для обработки на стадии (с) является KCl, и концентрация KCl для обработки лежит в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М или от 0,40 М до 0,60 М; от 0,35 М до 0,55 М; или от 0,55 М до 0,60 М.According to another embodiment of the present invention, the treatment salt in step (c) is KCl, and the concentration of KCl for the treatment is in the range of 0.35 M to 0.60 M, or from 0.40 M to 0.60 M; from 0.35 M to 0.55 M; or from 0.55 M to 0.60 M.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, солью для обработки на стадии (с) является Na2CO3, и концентрация Na2CO3 для обработки лежит в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М или от 0,40 М до 0,60 М; от 0,35 М до 0,55 М или от 0,40 М до 0,55 М; от 0,35 М до 0,50 М или от 0,40 М до 0,50 М; или от 0,35 М до 0,45 М.According to another embodiment of the present invention, the treatment salt in step (c) is Na 2 CO 3 , and the concentration of Na 2 CO 3 for treatment is in the range from 0.35 M to 0.60 M or from 0.40 M to 0.60 M; from 0.35 M to 0.55 M or from 0.40 M to 0.55 M; from 0.35 M to 0.50 M or from 0.40 M to 0.50 M; or from 0.35 M to 0.45 M.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, температура для инкубации на стадии (с) лежит в диапазоне от 25°C до 34°C.According to an embodiment of the present invention, the incubation temperature in step (c) is in the range of 25 ° C to 34 ° C.
Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения, температура для инкубации лежит в диапазоне от 26°C до 34°C, от 27°C до 34°C, от 28°C до 34°C, от 29°C до 34°C или от 29,5°C до 34°C, и согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, температура для инкубации лежит в диапазоне от 25°C до 33,5°C, от 26°C до 33,5°C, от 27°C до 33,5°C, от 28°C до 33,5°C, от 29°C до 33,5°C, от 29,5°C до 33,5°C или от 33°C до 33°C.According to a specific embodiment of the present invention, the incubation temperature is in the range of 26 ° C to 34 ° C, 27 ° C to 34 ° C, 28 ° C to 34 ° C, 29 ° C to 34 ° C, or 29.5 ° C to 34 ° C, and according to another embodiment of the present invention, the incubation temperature ranges from 25 ° C to 33.5 ° C, from 26 ° C to 33.5 ° C, from 27 ° C up to 33.5 ° C, 28 ° C to 33.5 ° C, 29 ° C to 33.5 ° C, 29.5 ° C to 33.5 ° C or 33 ° C to 33 ° C .
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, время для инкубации на стадии (с) лежит в диапазоне от 21 часа до 27 часов. Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения, время для инкубации лежит в диапазоне от 21 часа до 26 часов или от 22 часов до 26 часов.According to an embodiment of the present invention, the time for incubation in step (c) ranges from 21 hours to 27 hours. According to a specific embodiment of the present invention, the time for incubation is in the range from 21 hours to 26 hours or from 22 hours to 26 hours.
(d) Хроматография(d) Chromatography
На стадии (d) настоящего изобретения выполняют хроматографию раствора, из которого удалены загрязнения, для получения белка L1. В тех случаях, когда раствор, из которого удалены загрязнения, очищают посредством хроматографии, можно очень эффективно удалить остаточные загрязнения.In step (d) of the present invention, chromatography of a solution from which contaminants are removed is performed to obtain L1 protein. In those cases where the solution from which the impurities are removed is purified by chromatography, residual impurities can be very effectively removed.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, хроматография является аффинной хроматографией или катионообменной хроматографией. Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения, аффинная хроматография является хроматографией на гепарин-сефарозе.According to an embodiment of the present invention, chromatography is affinity chromatography or cation exchange chromatography. According to a specific embodiment of the present invention, affinity chromatography is chromatography on heparin sepharose.
Например, в тех случаях, когда выполняют хроматографию на гепарин-сефарозе, гепарин-сефарозную смолу вначале инкубируют с подходящим связывающим буфером перед нанесением материала, полученного на стадии (с), на колонку с гепарин-сефарозной смолой. Связывающий буфер предпочтительно содержит NaCl и неионогенное поверхностно-активное вещество (например, Твин 80), и концентрация NaCl предпочтительно является низкой (от 0,1 М до 0,4 М). Затем наносят пробу для хроматографии на гепарин-сефарозе, после чего элюируют белок из смолы. Для элюирования предпочтителен линейный градиент NaCl, и более предпочтительно загрязнения элюируют в линейном градиенте NaCl в диапазоне от 0,33 М до 0,66 М, а затем желаемый белок L1 элюируют в линейном градиенте NaCl в диапазоне от 0,66 М до 2 М.For example, in cases where heparin-Sepharose chromatography is performed, the heparin-Sepharose resin is first incubated with a suitable binding buffer before applying the material obtained in step (c) to a heparin-Sepharose resin column. The binding buffer preferably contains NaCl and a nonionic surfactant (e.g., Tween 80), and the concentration of NaCl is preferably low (0.1 M to 0.4 M). Then apply a sample for chromatography on heparin-sepharose, after which the protein is eluted from the resin. A linear NaCl gradient is preferred for elution, and more preferably contaminants elute in a linear NaCl gradient in the range of 0.33 M to 0.66 M, and then the desired L1 protein is eluted in a linear NaCl gradient in the range of 0.66 M to 2 M.
В качестве другого примера - в случаях, когда выполняют катионообменную хроматографию, смолу вначале инкубируют с подходящим связывающим буфером перед нанесением на колонку материала, полученного после удаления загрязнений посредством обработки раствором соли с концентрацией, лежащей в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М. Связывающий буфер предпочтительно содержит NaCl и неионогенное поверхностно-активное вещество (например, Твин 80), и концентрация NaCl предпочтительно является низкой (от 0,3 М до 0,6 М). Затем на колонку для катионообменной хроматографии наносят пробу, после чего элюируют белки из смолы. Для элюирования предпочтителен ступенчатый градиент NaCl, и, более предпочтительно, желаемый белок L1 элюируют с использованием элюирующего буфера, содержащего NaCl в концентрациях, равных 0,6 М, 0,7 М, 0,8 М и 1 М.As another example, in cases where cation exchange chromatography is performed, the resin is first incubated with a suitable binding buffer before applying to the column the material obtained after removal of contaminants by treatment with a salt solution with a concentration lying in the range from 0.35 M to 0.60 M The binding buffer preferably contains NaCl and a nonionic surfactant (eg, Tween 80), and the concentration of NaCl is preferably low (0.3 M to 0.6 M). Then, a sample is applied to the cation exchange chromatography column, after which proteins from the resin are eluted. For elution, a stepwise NaCl gradient is preferred, and more preferably, the desired L1 protein is eluted using an elution buffer containing NaCl at concentrations of 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M and 1 M.
Катионообменную хроматографию можно выполнить с использованием различных смол, и катионообменную хроматографию можно выполнить с использованием, предпочтительно, катионообменного материала, с которым связываются сульфогруппы, сульфоалкильные (например, сульфометильные, сульфоэтильные и сульфопропильные), фосфатные или фосфаталкильные функциональные группы, и наиболее предпочтительно - катионообменного материала, с которым связываются фосфатные функциональные группы.Cation exchange chromatography can be performed using various resins, and cation exchange chromatography can be performed using, preferably, a cation exchange material to which sulfo groups, sulfoalkyl (e.g. sulfomethyl, sulfoethyl and sulfopropyl), phosphate or phosphatalkyl functional groups, and most preferably cation exchange material, are bonded. with which phosphate functional groups bind.
Фракции белка L1, полученные с использованием процедуры хроматографии, можно сконцентрировать с использованием мембранного фильтра. Например, хроматографические фракции можно сконцентрировать с использованием мембраны, которая способна отсекать вещества с молекулярной массой, лежащей в диапазоне от 50 кДа до 100 кДа. Поскольку VLP, имеющие средний размер около 50 нм, крупнее остальных белков, VLP не могут пройти через мембрану и поэтому концентрируются, тогда как большая часть остаточных загрязнений удаляется за счет проникновения через мембрану.Fractions of L1 protein obtained using the chromatography procedure can be concentrated using a membrane filter. For example, chromatographic fractions can be concentrated using a membrane that is capable of cutting off substances with a molecular weight ranging from 50 kDa to 100 kDa. Since VLPs having an average size of about 50 nm are larger than the rest of the proteins, VLPs cannot pass through the membrane and therefore are concentrated, while most of the residual contaminants are removed by penetration through the membrane.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, в тех случаях, когда хроматография на стадии (d) является хроматографией на гепарин-сефарозе, солью для обработки на стадии (с) является NaCl, и концентрация NaCl для обработки лежит в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, от 0,40 М до 0,60 М, от 0,45 М до 0,60 М или от 0,45 М до 0,55 М.According to an embodiment of the present invention, in those cases where the chromatography in step (d) is heparin-Sepharose chromatography, the treatment salt in step (c) is NaCl, and the concentration of NaCl for treatment is in the range of 0.35 M to 0 , 60 M, from 0.40 M to 0.60 M, from 0.45 M to 0.60 M or from 0.45 M to 0.55 M.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, в тех случаях, когда хроматография на стадии (d) является хроматографией на гепарин-сефарозе, солью для обработки на стадии (с) является KCl, и концентрация KCl для обработки лежит в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, от 0,40 М до 0,60 М, от 0,45 М до 0,60 М, от 0,50 М до 0,60 М или от 0,55 М до 0,60 M.According to another embodiment of the present invention, in those cases where the chromatography in step (d) is heparin sepharose chromatography, the treatment salt in step (c) is KCl, and the concentration of KCl for treatment is in the range of 0.35 M to 0.60 M, from 0.40 M to 0.60 M, from 0.45 M to 0.60 M, from 0.50 M to 0.60 M or from 0.50 M to 0.60 M.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, в тех случаях, когда хроматография на стадии (d) является хроматографией на гепарин-сефарозе, солью для обработки на стадии (с) является Na2CO3, и концентрация Na2CO3 для обработки лежит в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М или от 0,40 М до 0,60 М; от 0,35 М до 0,45 М; или от 0,55 М до 0,60 М.According to another embodiment of the present invention, in those cases where the chromatography in step (d) is heparin sepharose chromatography, the treatment salt in step (c) is Na 2 CO 3 and the concentration of Na 2 CO 3 for treatment lies in the range from 0.35 M to 0.60 M or from 0.40 M to 0.60 M; from 0.35 M to 0.45 M; or from 0.55 M to 0.60 M.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, в тех случаях, когда хроматография на стадии (d) является катионообменной хроматографией, солью для обработки на стадии (с) является NaCl, и концентрация NaCl для обработки лежит в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, от 0,40 М до 0,60 М или от 0,45 М до 0,55 М.According to another embodiment of the present invention, in cases where the chromatography in step (d) is cation exchange chromatography, the salt for the treatment in step (c) is NaCl, and the concentration of NaCl for the treatment is in the range of 0.35 M to 0, 60 M, from 0.40 M to 0.60 M or from 0.45 M to 0.55 M.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, в тех случаях, когда хроматография на стадии (d) является катионообменной хроматографией, солью для обработки на стадии (с) является KCl, и концентрация KCl для обработки лежит в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, от 0,35 М до 0,55 М, от 0,35 М до 0,50 М или от 0,35 М до 0,45 М.According to another embodiment of the present invention, in those cases where the chromatography in step (d) is cation exchange chromatography, the salt for the treatment in step (c) is KCl, and the concentration of KCl for the treatment is in the range of 0.35 M to 0, 60 M, from 0.35 M to 0.55 M, from 0.35 M to 0.50 M or from 0.35 M to 0.45 M.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, в тех случаях, когда хроматография на стадии (d) является катионообменной хроматографией, солью для обработки на стадии (с) является Na2CO3, и концентрация Na2CO3 для обработки лежит в диапазоне от 0,35 М до 0,60 М, от 0,35 М до 0,55 М, от 0,35 М до 0,50 М или от 0,35 М до 0,45 М.According to another embodiment of the present invention, in those cases where the chromatography in step (d) is cation exchange chromatography, the salt for the treatment in step (c) is Na 2 CO 3 and the concentration of Na 2 CO 3 for treatment is in the range of 0 , 35 M to 0.60 M, from 0.35 M to 0.55 M, from 0.35 M to 0.50 M or from 0.35 M to 0.45 M.
Полезные эффектыBeneficial effects
Отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения кратко изложены ниже:Distinctive features and advantages of the present invention are summarized below:
(i) Настоящее изобретение обеспечивает способ получения вирусоподобных частиц (VLP) на основе белка L1 HPV.(i) The present invention provides a method for producing virus-like particles (VLPs) based on HPV L1 protein.
(ii) Настоящее изобретение может обеспечить белок L1 HPV с высокой степенью чистоты с использованием одного хроматографического процесса за счет способа, в котором загрязнения вначале удаляют посредством осаждения сульфатом аммония, а затем дополнительно удаляют из раствора, содержащего соль в концентрации от 0,35 М до 0,60 М, посредством диализа.(ii) The present invention can provide HPV protein L1 with a high degree of purity using a single chromatographic process by a method in which contaminants are first removed by precipitation with ammonium sulfate and then further removed from a solution containing a salt in a concentration of from 0.35 M to 0.60 M by dialysis.
(iii) Антигены HPV, полученные способом по настоящему изобретению, обладают превосходной стабильностью и поэтому пригодны для использования в качестве сырьевого материала для диагностического средства, выявляющего антитела к HPV, требующего высокой стабильности, а также для вакцин.(iii) The HPV antigens obtained by the method of the present invention have excellent stability and are therefore suitable as a raw material for a diagnostic agent that detects antibodies against HPV requiring high stability, as well as for vaccines.
Краткое описание графических материаловA brief description of the graphic materials
Фиг. 1 является диаграммой, относящейся к Примеру 1, и демонстрирует зависимость эффективности удаления нерастворимых белков от вида буферного раствора, используемого для фракционирования, и температуры инкубации при очистке белка L1 HPV 16 типа.FIG. 1 is a diagram related to Example 1, and shows the dependence of the removal efficiency of insoluble proteins on the type of buffer solution used for fractionation and the incubation temperature during the purification of
Фиг. 2 является диаграммой, относящейся к Примеру 1, и демонстрирует зависимость эффективности удаления нерастворимых белков от вида буферного раствора, используемого для фракционирования, и времени инкубации при очистке белка L1 HPV 16 типа.FIG. 2 is a diagram related to Example 1, and shows the dependence of the removal efficiency of insoluble proteins on the type of buffer solution used for fractionation and the incubation time during purification of
Фиг. 3 является диаграммой, относящейся к Примеру 2, и демонстрирует профили очистки соответствующих фракций в случае, когда инкубацию проводили при 35°C на стадии удаления нерастворимых белков при очистке белка L1 HPV 16 типа.FIG. 3 is a diagram related to Example 2, and shows the purification profiles of the respective fractions when the incubation was carried out at 35 ° C during the step of removing insoluble proteins during the purification of
Фиг. 4 является диаграммой, относящейся к Примеру 2, и демонстрирует изменение выхода белка L1 HPV 16 типа после очистки в зависимости от концентрации преципитата, полученного посредством осаждения сульфатом аммония.FIG. 4 is a diagram related to Example 2, and shows the change in yield of
Фиг. 5 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует результаты очистки посредством катионообменной хроматографии после стадии фракционирования с использованием NaCl в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,15 М до 0,6 М.FIG. 5 is a diagram related to Example 3, and shows the results of purification by cation exchange chromatography after a fractionation step using NaCl in a concentration lying in the range of 0.15 M to 0.6 M.
Фиг. 6 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует выходы белка после очистки посредством катионообменной хроматографии после стадии фракционирования с использованием NaCl в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,15 М до 0,6 М.FIG. 6 is a diagram related to Example 3, and shows the protein yields after purification by cation exchange chromatography after a fractionation step using NaCl at a concentration ranging from 0.15 M to 0.6 M.
Фиг. 7 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует результаты очистки посредством катионообменной хроматографии после стадии фракционирования с использованием KCl в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,15 М до 0,6 М.FIG. 7 is a diagram related to Example 3, and shows the results of purification by cation exchange chromatography after a fractionation step using KCl in a concentration lying in the range of 0.15 M to 0.6 M.
Фиг. 8 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует выходы белка после очистки посредством катионообменной хроматографии после стадии фракционирования с использованием KCl в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,15 М до 0,6 М.FIG. 8 is a diagram related to Example 3, and shows the protein yields after purification by cation exchange chromatography after a fractionation step using KCl in a concentration lying in the range of 0.15 M to 0.6 M.
Фиг. 9 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует результаты очистки посредством катионообменной хроматографии после стадии фракционирования с использованием Na2CO3 в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,15 М до 0,6 М.FIG. 9 is a diagram related to Example 3, and shows the results of purification by cation exchange chromatography after a fractionation step using Na 2 CO 3 in a concentration lying in the range of 0.15 M to 0.6 M.
Фиг. 10 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует выходы белка после очистки посредством катионообменной хроматографии после стадии фракционирования с использованием Na2CO3 в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,15 М до 0,6 М.FIG. 10 is a diagram related to Example 3, and shows the protein yields after purification by cation exchange chromatography after a fractionation step using Na 2 CO 3 in a concentration ranging from 0.15 M to 0.6 M.
Фиг. 11 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует результаты очистки посредством аффинной хроматографии после стадии фракционирования с использованием NaCl в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,15 М до 0,6 М.FIG. 11 is a diagram related to Example 3, and shows the results of purification by affinity chromatography after a fractionation step using NaCl in a concentration lying in the range of 0.15 M to 0.6 M.
Фиг. 12 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует выходы белка после очистки посредством аффинной хроматографии после стадии фракционирования с использованием NaCl в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,15 М до 0,6 М.FIG. 12 is a chart related to Example 3, and shows the protein yields after purification by affinity chromatography after a fractionation step using NaCl at a concentration ranging from 0.15 M to 0.6 M.
Фиг. 13 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует результаты очистки посредством аффинной хроматографии после стадии фракционирования с использованием KCl в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,15 М до 0,6 М.FIG. 13 is a diagram related to Example 3, and shows the results of purification by affinity chromatography after a fractionation step using KCl in a concentration lying in the range of 0.15 M to 0.6 M.
Фиг. 14 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует выходы белка после очистки посредством аффинной хроматографии после стадии фракционирования с использованием KCl в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,15 М до 0,6 М.FIG. 14 is a chart related to Example 3, and shows the protein yields after purification by affinity chromatography after a fractionation step using KCl in a concentration lying in the range of 0.15 M to 0.6 M.
Фиг. 15 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует результаты очистки посредством аффинной хроматографии после стадии фракционирования с использованием Na2CO3 в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,15 М до 0,6 М.FIG. 15 is a diagram related to Example 3, and shows the results of purification by affinity chromatography after a fractionation step using Na 2 CO 3 in a concentration ranging from 0.15 M to 0.6 M.
Фиг. 16 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует выходы белка после очистки посредством аффинной хроматографии после стадии фракционирования с использованием Na2CO3 в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,15 М до 0,6 М.FIG. 16 is a chart related to Example 3, and shows protein yields after purification by affinity chromatography after a fractionation step using Na 2 CO 3 at a concentration ranging from 0.15 M to 0.6 M.
Фиг. 17 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует результаты очистки посредством катионообменной хроматографии белков L1 HPV 16 и 18 типов. Дорожка 1: 0,5 М NaCl, Дорожка 2: 0,4 М KCl, Дорожка 3: 0,4 М Na2CO3.FIG. 17 is a diagram related to Example 3, and shows the results of purification by cation exchange chromatography of
Фиг. 18 является диаграммой, относящейся к Примеру 3, и демонстрирует результаты очистки посредством аффинной хроматографии белка L1 HPV 16 типа. Дорожка 1: 0,5 М NaCl, Дорожка 2: 0,4 М KCl, Дорожка 3: 0,4 М Na2CO3.FIG. 18 is a diagram related to Example 3, and shows purification results by affinity chromatography of
Фиг. 19 является диаграммой, относящейся к Примеру 4, и демонстрирует результаты оценки стабильности антигена HPV в зависимости от вида и концентрации соли и температуры реакции на стадии фракционирования. Дорожка 1: 0,5 М NaCl, Дорожка 2: 0,4 М KCl, Дорожка 3: 0,4 М Na2CO3, Дорожка 4: 0,15 М NaCl.FIG. 19 is a diagram related to Example 4, and shows the results of evaluating the stability of the HPV antigen depending on the type and concentration of salt and the reaction temperature in the fractionation step. Lane 1: 0.5 M NaCl, Lane 2: 0.4 M KCl, Lane 3: 0.4 M Na 2 CO 3 , Lane 4: 0.15 M NaCl.
Описание примеров осуществления изобретенияDescription of Embodiments
Далее настоящее изобретение будет описано подробно со ссылкой на примеры его осуществления. Эти примеры предназначены исключительно для более конкретной иллюстрации настоящего изобретения, и специалистам в данной области техники будет очевидно, что объем настоящего изобретения не ограничен этими примерами.The present invention will now be described in detail with reference to examples of its implementation. These examples are intended solely to more specifically illustrate the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples.
Пример 1Example 1
Определение температуры и времени для эффективного удаления нерастворимых белковDetermination of temperature and time for effective removal of insoluble proteins
1-1. Способы1-1. Ways
С целью определения температурных и временных диапазонов для эффективного удаления нерастворимых белков в способе получения белков L1 HPV 16 и 18 типов провели следующее испытание.In order to determine the temperature and time ranges for the effective removal of insoluble proteins in the method of producing
Дрожжевые клетки (Saccharomyces cerevisiae; КССМ11036Р и КССМ11037Р, соответственно), которые были трансформированы, соответственно, YEGα-HPV16L1-ROS и YEGα-HPV18L1-ROS, в которые были включены гены рекомбинантных белков L1 HPV 16 типа и HPV 18 типа, инокулировали в синтетические полные культуральные среды без урацила (SD-ura), находившиеся в колбах с ребрами, после чего производили встряхивание культуры при 30°C. Для экспрессии белков L1 HPV 16 типа и HPV 18 типа с промотора GAL10 использовали YPDG среды. Ко всем средам добавили 1% экстракта дрожжей (производства компании Duchefa Biochem, Нидерланды) и 2% пептона (производства компании Duchefa Biochem, Нидерланды), а также глюкозу и галактозу. После инокуляции трансформированного штамма дрожжей в YPDG среду клетки культивировали при 30°C с использованием ферментера. Время культивирования не превышало 96 часов.Yeast cells (Saccharomyces cerevisiae; KCCM11036P and KCCM11037P, respectively), which were transformed, respectively, YEGα-HPV16L1-ROS and YEGα-HPV18L1-ROS, which included genes of
Дрожжевые клетки смешали с буферным раствором (20 мМ фосфата натрия, pH 7,2, 100 мМ NaCl, 1,7 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,01% Твина 80). Затем клетки гомогенизировали гомогенизатором клеток и отделили супернатант посредством центрифугирования гомогената клеток. 45 масс. % сульфата аммония добавили к собранному супернатанту для осаждения, после чего выполнили центрифугирование при высокой скорости (24000 g), чтобы удалить супернатант и собрать только преципитат. Концентрацию белков в полученном преципитате измерили посредством анализа с бицинхониновой кислотой (ВСА; от англ.: bicinchoninic acid).Yeast cells were mixed with buffer solution (20 mM sodium phosphate, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.01% Tween 80). The cells were then homogenized with a cell homogenizer and the supernatant was separated by centrifugation of the cell homogenate. 45 mass. % ammonium sulfate was added to the collected supernatant for precipitation, and then centrifuged at high speed (24,000 g) to remove the supernatant and collect only the precipitate. The protein concentration in the obtained precipitate was measured by analysis with bicinchoninic acid (BCA; from the English: bicinchoninic acid).
Преципитат разбавили фосфатным буферным раствором с Твином 20 (1Х PBS-T; от англ.: phosphate buffer solution) до концентрации, равной 30 мг/мл, и к разбавленному раствору добавили NaCl до конечной концентрации, равной 0,8 М. После перемешивания в течение примерно 30 минут раствор инкубировали при 4°C в течение 18 часов, при этом он находился в покое.The precipitate was diluted with
После инкубации с NaCl суспензию разделили на четыре части и соответствующие части суспензии поместили в диализные мембраны для проведения диализа с буферами для фракционирования (PBS+0,01% Твина 80) с добавлением (0,15 М NaCl, 0,5 М NaCl, 0,4 М KCl, 0,4 М Na2CO3) трех видов солей (NaCl, KCl, Na2CO3). После завершения диализа добавили соответствующие буферные растворы для фракционирования для разбавления концентрации белка до 10 мг/мл или менее и инкубировали растворы в инкубаторе при температуре, лежавшей в диапазоне от 20°C до 35°C (±2°C) в течение 24 часов, при этом они находились в покое. Через 24 часа образовавшийся материал центрифугировали при высокой скорости (24000 g) для сбора супернатанта и затем измерили мутность собранного супернатанта с использованием спектрометра (определили оптическую плотность при длине волны, равной 600 нм).After incubation with NaCl, the suspension was divided into four parts and the corresponding parts of the suspension were placed in dialysis membranes for dialysis with fractionation buffers (PBS + 0.01% Tween 80) with the addition of (0.15 M NaCl, 0.5 M NaCl, 0 , 4 M KCl, 0.4 M Na 2 CO 3 ) of three types of salts (NaCl, KCl, Na 2 CO 3 ). After dialysis was completed, appropriate fractionation buffer solutions were added to dilute the protein concentration to 10 mg / ml or less and the solutions were incubated in an incubator at a temperature ranging from 20 ° C to 35 ° C (± 2 ° C) for 24 hours, however, they were at rest. After 24 hours, the resulting material was centrifuged at high speed (24000 g) to collect the supernatant, and then the turbidity of the collected supernatant was measured using a spectrometer (absorbance was determined at a wavelength of 600 nm).
Кроме того, пробы преципитата диализировали с буферными растворами для фракционирования, к которым были добавлены соли четырех типов, после чего их оставляли в инкубаторе при температуре, равной 30°C (±2°C), на 16-26 часов (с отбором проб с двухчасовыми интервалами) или на 48 часов для определения промежутка времени, во время которого мутность была минимальной.In addition, precipitate samples were dialyzed with fractionation buffers to which four types of salts were added, after which they were left in an incubator at a temperature of 30 ° C (± 2 ° C) for 16-26 hours (with sampling with at two-hour intervals) or 48 hours to determine the period of time during which the turbidity was minimal.
1-2. Результаты1-2. results
Процедуру удаления нерастворимых белков осуществляют посредством осаждения загрязнений при комнатной температуре для повышения степени чистоты во время очистки. Чем ниже значение оптической плотности супернатанта, отделенного посредством центрифугирования после инкубации, тем большее количество загрязнений удалено.The procedure for removing insoluble proteins is carried out by sedimentation of contaminants at room temperature to increase the degree of purity during purification. The lower the optical density of the supernatant separated by centrifugation after incubation, the greater the amount of contamination removed.
Как показано на Фиг. 1, значение мутности варьируется в зависимости от вида соли, содержащейся в буфере для фракционирования, однако, в целом, чем выше температура инкубации, тем ниже значение оптической плотности, измеренное при длине волны, равной 600 нм, и на основании этого результата можно сделать вывод о том, что удаление нерастворимых белков легче осуществить при более высокой температуре. Однако было установлено, что при слишком высокой температуре могут возникнуть проблемы со структурой белка. Поэтому при дальнейшем анализе, в ходе которого сравнили выходы белка L1 HPV 16 типа, который был очищен посредством удаления нерастворимых белков после инкубации в течения 24 часов при 30°C и 35°C, определили, что выход белка после очистки при 30°C был равен примерно 2,65 мг/л, тогда как выход белка после очистки при 35°C был равен примерно 1,24 мг/л, и также была продемонстрирована низкая степень чистоты. Эти результаты подтвердили, что удаление нерастворимых белков при превышении подходящего диапазона температур имело низкую эффективность, и температурный диапазон, обеспечивающий эффективную очистку, составлял от примерно 25°C до 34°C.As shown in FIG. 1, the turbidity value varies depending on the type of salt contained in the fractionation buffer, however, in general, the higher the incubation temperature, the lower the optical density measured at a wavelength of 600 nm, and based on this result we can conclude that the removal of insoluble proteins is easier to carry out at a higher temperature. However, it was found that at too high a temperature, problems with the structure of the protein may occur. Therefore, upon further analysis, during which the yields of
Что касается времени инкубации нерастворимых белков, то, как показано на Фиг. 2, по результатам измерения мутности в течение периода, лежащего в диапазоне от 16 часов до 26 часов, с 2-часовыми интервалами и через 48 часов при добавлении каждой соли установлено, что мутность суспензии увеличилась из-за осаждения нерастворимых белков и оставалась на определенном уровне в течение периода исследования. Мутность суспензии означает, что степень чистоты белка возрастает вследствие осаждения загрязнений. Тем не менее, поскольку инкубация в течение слишком длительного периода времени может привести к осаждению целевого белка, то определено, что диапазон периода инкубации, подходящего для удаления нерастворимых белков, составляет от 21 часа до 26 часов.Regarding the incubation time of insoluble proteins, as shown in FIG. 2, according to the results of measuring turbidity over a period ranging from 16 hours to 26 hours, with 2-hour intervals and after 48 hours with the addition of each salt, it was found that the turbidity of the suspension increased due to precipitation of insoluble proteins and remained at a certain level during the study period. The turbidity of the suspension means that the degree of purity of the protein increases due to the deposition of contaminants. However, since incubation for too long can lead to precipitation of the target protein, it has been determined that the incubation period suitable for removing insoluble proteins is from 21 hours to 26 hours.
Пример 2Example 2
Сравнение зависимости выходов белка после очистки от концентрации преципитата, полученного посредством осаждения сульфатом аммония 2-1.Comparison of the dependence of protein yields after purification on the concentration of precipitate obtained by precipitation with ammonium sulfate 2-1.
СпособыWays
Дрожжевые клетки из Примера 1 смешали с буферным раствором (20 мМ фосфата натрия, pH 7,2, 100 мМ NaCl, 1,7 мМ ЭДТА, 0,01% Твина 80). Затем клетки гомогенизировали гомогенизатором клеток и отделили супернатант посредством центрифугирования гомогената клеток при высокой скорости (24000 g). К собранному супернатанту добавили 5 масс. % сульфата аммония для осаждения, после чего выполнили центрифугирование с высокой скоростью (24000 g) для отделения супернатанта и получения только преципитата. Концентрацию белка в полученном преципитате измерили посредством анализа с бицинхониновой кислотой (ВСА), после чего добавили 1Х PBS-T для разбавления концентрации преципитата, полученного посредством осаждения сульфатом аммония, до концентраций, лежавших в диапазоне от 10 мг/мл до 60 мг/мл (с шагом, равным 10 мг/мл). К преципитатам в соответствующих концентрациях добавили NaCl до конечной концентрации, равной 0,8 М, с последующим перемешиванием в течение примерно 30 минут, и инкубировали смеси при 4°C в течение 18 часов, при этом раствор находился в покое. После инкубации с NaCl суспензии с соответствующими концентрациями поместили в мембраны для диализа и диализировали с буферными растворами для фракционирования. После завершения диализа добавили буферные растворы из Примера 1 для разбавления концентрации белка до 10 мг/мл или менее и инкубировали растворы в инкубаторе при температуре, равной 30°C (±2°C), в течение 24 часов, при этом они находились в покое. Через 24 часа образовавшийся материал центрифугировали при высокой скорости (24000 g) для отделения супернатанта. Собранный супернатант поместили в диализную мембрану и диализировали со связывающим буфером (PBS+0,35 М NaCl, pH 7,2, 0,01% Твина 80) при 4°C. Фильтрат очистили посредством катионообменной хроматографии. Более конкретно, колонку Poly-Prep размером 1,6 см × 5 см (производства компании GE Healthcare Life Science, США), заполненную смолой Р-11 на основе фосфата целлюлозы (производства компании Whatman, Соединенное Королевство), уравновесили со связывающим буфером (PBS+0,5 М NaCl), объем которого был в пять раз больше объема смолы. После завершения диализа раствор пропустили через колонку с Р-11 смолой для связывания, после чего промыли колонку связывающим буфером, объем которого был в пять раз больше объема смолы. После промывки белок L1 элюировали посредством пропускания 4-5 мл элюирующих буферов, содержавших 0,6 М, 0,7 М, 0,8 М и 1 М NaCl, через связывающий буфер. Фракции с подтвержденными целевыми полосами объединяли и количественно определяли содержание белка посредством анализа с ВСА, после чего рассчитывали выход белка после очистки.The yeast cells from Example 1 were mixed with a buffer solution (20 mM sodium phosphate, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80). The cells were then homogenized with a cell homogenizer and the supernatant was separated by centrifuging the cell homogenate at high speed (24000 g). 5 masses were added to the collected supernatant. % ammonium sulfate for precipitation, after which centrifugation was performed at high speed (24000 g) to separate the supernatant and obtain only precipitate. The protein concentration in the obtained precipitate was measured by analysis with bicinchoninic acid (BCA), after which 1X PBS-T was added to dilute the concentration of the precipitate obtained by precipitation with ammonium sulfate to concentrations ranging from 10 mg / ml to 60 mg / ml ( in increments of 10 mg / ml). NaCl was added to the precipitates at the appropriate concentrations to a final concentration of 0.8 M, followed by stirring for about 30 minutes, and the mixture was incubated at 4 ° C for 18 hours, while the solution was at rest. After incubation with NaCl, suspensions with appropriate concentrations were placed in dialysis membranes and dialyzed with fractionation buffer solutions. After dialysis was completed, buffer solutions from Example 1 were added to dilute the protein concentration to 10 mg / ml or less, and the solutions were incubated in an incubator at a temperature of 30 ° C (± 2 ° C) for 24 hours, while they were at rest . After 24 hours, the resulting material was centrifuged at high speed (24000 g) to separate the supernatant. The collected supernatant was placed on a dialysis membrane and dialyzed with binding buffer (PBS + 0.35 M NaCl, pH 7.2, 0.01% Tween 80) at 4 ° C. The filtrate was purified by cation exchange chromatography. More specifically, a 1.6 cm × 5 cm Poly-Prep column (manufactured by GE Healthcare Life Science, USA) filled with P-11 cellulose phosphate resin (Whatman, United Kingdom) was equilibrated with binding buffer (PBS +0.5 M NaCl), the volume of which was five times the volume of the resin. After dialysis, the solution was passed through a column of P-11 binding resin, and the column was washed with binding buffer, the volume of which was five times the volume of the resin. After washing, the L1 protein was eluted by passing 4-5 ml of elution buffers containing 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M and 1 M NaCl through the binding buffer. Fractions with confirmed target bands were pooled and the protein content was quantified by analysis with BCA, after which the protein yield after purification was calculated.
2-2. Результаты2-2. results
Как показано на Фиг. 4, по результатам сравнения выхода белка после очистки в зависимости от концентрации преципитата, полученного посредством осаждения солью аммония, выход белка после очистки был наивысшим и равным примерно 2,6 мг/л, если концентрация преципитата, полученного посредством осаждения солью аммония, была равна 30 мг/мл, а следующее значение было равно примерно 2,2 мг/л, если концентрация преципитата, полученного посредством осаждения солью аммония, была равна 40 мг/мл. По этим результатам определили, что диапазон концентраций преципитата, полученного посредством осаждения сульфатом аммония, обеспечивающий высокий выход антигена HPV после очистки, составляет от 25 мг/мл до 65 мг/мл.As shown in FIG. 4, by comparing the yield of protein after purification depending on the concentration of precipitate obtained by precipitation with an ammonium salt, the yield of protein after purification was the highest and equal to about 2.6 mg / L, if the concentration of precipitate obtained by precipitation with an ammonium salt was 30 mg / ml, and the next value was approximately 2.2 mg / l if the concentration of the precipitate obtained by precipitation with an ammonium salt was 40 mg / ml. From these results, it was determined that the concentration range of the precipitate obtained by precipitation with ammonium sulfate, providing a high yield of HPV antigen after purification, is from 25 mg / ml to 65 mg / ml.
Пример 3Example 3
Определение вида и концентрации оптимальной соли на стадии фракционированияDetermination of the type and concentration of optimal salt at the fractionation stage
3-1. Способы3-1. Ways
При получении белка L1 HPV стадию фракционирования выполняют для удаления загрязнений посредством инкубации с использованием соли. Для выбора вида соли, подходящей для очистки антигена VLP HPV, и исследования зависимости степени удаления загрязнений от концентрации соли провели следующее испытание. Основные соли показаны в Таблице 1.Upon receipt of the HPV L1 protein, the fractionation step is performed to remove contaminants by incubation using a salt. The following test was carried out to select the type of salt suitable for purification of HPV VLP antigen and to study the degree of removal of contaminants from salt concentration. Basic salts are shown in Table 1.
Дрожжевые клетки из Примера 1 смешали с буферным раствором (20 мМ фосфата натрия, pH 7,2, 100 мМ NaCl, 1,7 мМ ЭДТА, 0,01% Твина 80). Затем клетки гомогенизировали гомогенизатором клеток и отделили супернатант посредством центрифугирования гомогената клеток. К собранному супернатанту добавили 45 масс. % сульфата аммония и центрифугировали смесь при высокой скорости (24000 g), чтобы удалить супернатант и оставить только преципитат (в данном случае суспензию получили посредством добавления к преципитату небольшого количества 1Х PBS-T). Концентрацию белка в преципитате измерили посредством анализа с ВСА и добавили 1Х PBS-T для разбавления концентрации преципитата, полученного посредством осаждения сульфатом аммония, до 30 мг/мл или менее. К разбавленному преципитату при медленном перемешивании добавили NaCl до получения конечной концентрации, равной 0,8 М. После перемешивания в течение примерно 30 минут разбавленный раствор инкубировали при 4°C в течение 18 часов, при этом раствор находился в покое. После инкубации с NaCl суспензию поместили в мембрану для диализа и диализировали в буферных растворах для фракционирования с использованием компонентов из Таблицы 2. После завершения диализа добавили соответствующие фракционирующие буферы для разбавления концентрации белка до 10 мг/мл или менее и инкубировали раствор в инкубаторе при температуре, равной 30°C (±2°C), в течение 24 часов, при этом раствор находился в покое.The yeast cells from Example 1 were mixed with a buffer solution (20 mM sodium phosphate, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80). The cells were then homogenized with a cell homogenizer and the supernatant was separated by centrifugation of the cell homogenate. 45 masses were added to the collected supernatant. % ammonium sulfate and the mixture was centrifuged at high speed (24000 g) to remove the supernatant and leave only the precipitate (in this case, the suspension was obtained by adding a small amount of 1X PBS-T to the precipitate). The protein concentration in the precipitate was measured by analysis with BCA and 1X PBS-T was added to dilute the concentration of precipitate obtained by precipitation with ammonium sulfate to 30 mg / ml or less. NaCl was added to the diluted precipitate with slow stirring to obtain a final concentration of 0.8 M. After stirring for about 30 minutes, the diluted solution was incubated at 4 ° C for 18 hours, while the solution was at rest. After incubation with NaCl, the suspension was placed in a dialysis membrane and dialyzed in fractionation buffer solutions using the components from Table 2. After dialysis was completed, appropriate fractionation buffers were added to dilute the protein concentration to 10 mg / ml or less and the solution was incubated in an incubator at a temperature equal to 30 ° C (± 2 ° C) for 24 hours, while the solution was at rest.
Через 24 часа полученный материал центрифугировали при высокой скорости (24000 g), чтобы собрать супернатант. Собранный супернатант поместили в диализную мембрану и диализировали со связывающим буферным раствором (PBS+0,35 М NaCl, pH 7,2, 0,01% Твина 80) при 4°C. После диализа со связывающим буферным раствором супернатант профильтровали посредством центрифугирования при высокой скорости (24000 g). Как показано в Примере 2, фильтрат очистили посредством катионообменной хроматографии и затем собрали только фракции высокой степени чистоты для расчета выхода. Кроме того, чтобы исследовать, будут ли получены такие же результаты с другим типом смолы, провели испытание с очисткой посредством аффинной хроматографии с использованием соли, обеспечившей наивысший выход среди соответствующих солей, использованных в катионообменной хроматографии.After 24 hours, the resulting material was centrifuged at high speed (24000 g) to collect the supernatant. The collected supernatant was placed in a dialysis membrane and dialyzed with binding buffer solution (PBS + 0.35 M NaCl, pH 7.2, 0.01% Tween 80) at 4 ° C. After dialysis with binding buffer, the supernatant was filtered by centrifugation at high speed (24000 g). As shown in Example 2, the filtrate was purified by cation exchange chromatography and then only high purity fractions were collected to calculate the yield. In addition, to test whether the same results would be obtained with a different type of resin, a purification test was carried out by affinity chromatography using a salt that provided the highest yield among the corresponding salts used in cation exchange chromatography.
Более конкретно, для аффинной хроматографии колонку, заполненную гепарин-сефарозной смолой (производства компании GE Healthcare Life Sciences, США) уравновесили посредством пропускания через нее связывающего буфера (PBS-T, содержавший 0,33 М NaCl) в объеме, в десять раз превышавшем объем смолы. После завершения диализа раствор пропустили через колонку и дали ему возможность связаться с колонкой, заполненной гепарин-сефарозой, после чего промыли содержавшим 2 М NaCl элюирующим буфером, объем которого был в 50 раз больше объема смолы, с линейным градиентом NaCl, лежавшим в диапазоне от 0,33 М NaCl до 0,5 М NaCl. После промывки элюировали белок L1 элюирующим буфером, содержавшим 2 М NaCl, объем которого был в 20 раз больше объема смолы, с линейным градиентом NaCl, лежавшим в диапазоне от 0,5 М NaCl до 1,5 М NaCl. Фракции с подтвержденными целевыми полосами объединили и количественно оценили посредством анализа с ВСА, после чего рассчитали выход белка после очистки. Для аффинной хроматографии была использована колонка объемом 1 мл, заполненная гепарин-сефарозой (производства компании GE, США).More specifically, for affinity chromatography, a column filled with heparin-sepharose resin (manufactured by GE Healthcare Life Sciences, USA) was equilibrated by passing through it a binding buffer (PBS-T containing 0.33 M NaCl) in a volume ten times the volume pitches. After dialysis was completed, the solution was passed through a column and allowed it to contact a column filled with heparin-sepharose, and then washed with an eluting buffer containing 2 M NaCl, the volume of which was 50 times the volume of the resin, with a linear NaCl gradient lying in the range from 0 33 M NaCl to 0.5 M NaCl. After washing, L1 protein was eluted with an elution buffer containing 2 M NaCl, the volume of which was 20 times the volume of the resin, with a linear NaCl gradient lying in the range from 0.5 M NaCl to 1.5 M NaCl. Fractions with confirmed target bands were combined and quantified by analysis with the ICA, after which the protein yield after purification was calculated. For affinity chromatography, a 1 ml column filled with heparin-sepharose (manufactured by GE, USA) was used.
3-2. Результаты3-2. results
В результате расчета выхода белка после очистки с использованием катионообменной хроматографии с различными солями в различных концентрациях оказалось, что MgCl2 не обеспечивал очистки при всех концентрациях, a NaCl, KCl и Na2CO3 дали результаты, показанные на Фигурах с 5 по 10. Как и в случае катионообменной хроматографии, в случае дополнительно проведенной аффинной хроматографии оказалось, что высокие выходы были получены при высоких концентрациях соли - от 0,3 М и более.As a result of calculating the protein yield after purification using cation exchange chromatography with various salts at various concentrations, it turned out that MgCl 2 did not provide purification at all concentrations, and NaCl, KCl and Na 2 CO 3 gave the results shown in Figures 5 through 10. How and in the case of cation exchange chromatography, in the case of additionally performed affinity chromatography, it turned out that high yields were obtained at high salt concentrations - from 0.3 M or more.
Пробы, полученные с использованием каждой соли, которая обеспечивала наивысший выход, исходя из приведенных выше результатов, количественно оценили посредством анализа с ВСА, после чего 0,5 мкг пробы подвергли электрофорезу в двух 12%-ных акриламидных гелях при 150 В и 150 мА в течение 1,5 часов. Для подтверждения проявленных проб одну из них подвергли окрашиванию серебром, а другую - вестерн-блоттингу с использованием коммерчески доступных моноклональных антител, специфически реагирующих с антигенами HPV 16 и 18 типов.Samples obtained using each salt, which provided the highest yield, based on the above results, were quantified by analysis with ICA, after which 0.5 μg of the sample was subjected to electrophoresis in two 12% acrylamide gels at 150 V and 150 mA in within 1.5 hours. To confirm the developed samples, one of them was stained with silver, and the other was subjected to Western blotting using commercially available monoclonal antibodies that specifically react with
Как показано на Фиг. 17, результаты подтвердили, что все пробы имели высокую степень чистоты и достаточную реакционную способность при взаимодействии с антителами в условиях, когда использовали соответствующие буферные растворы для катионообменной хроматографии (Дорожка 1 : 0,5 М NaCl, Дорожка 2 : 0,4 М KCl, Дорожка 3 : 0,4 М Na2CO3).As shown in FIG. 17, the results confirmed that all samples had a high degree of purity and sufficient reactivity when interacting with antibodies under conditions when appropriate buffer solutions for cation exchange chromatography were used (Lane 1: 0.5 M NaCl, Lane 2: 0.4 M KCl, Lane 3: 0.4 M Na 2 CO 3 ).
На основании приведенных выше результатов было подтверждено, что солями, оказывающими благоприятные эффекты при получении VLP антигенов HPV 16 и 18 типов, были NaCl, KCl и Na2CO3, а оптимальным диапазоном концентраций этих солей для удаления нерастворимых белков был диапазон от 0,35 М до 0,60 М.Based on the above results, it was confirmed that the salts having beneficial effects in the preparation of
Пример 4Example 4
Оценка стабильности в зависимости от вида и концентрации соли на стадии фракционированияAssessment of stability depending on the type and concentration of salt at the fractionation stage
4-1. Способы4-1. Ways
Стабильность антигена оценивали посредством варьирования температуры реакции и времени хранения антигенов, полученных с использованием различных солей и различных концентраций солей на стадии фракционирования. С этой целью провели процедуру фракционирования в соответствии с видом и концентрацией соли и получили антиген L1 VLP HPV 16 типа (0,15 М NaCl, 0,5 М NaCl, 0,4 М KCl, 0,4 М Na2CO3). Стабильность антигена оценили, задав температуру реакции получения антигена равной 40°C и 60°C, а время реакции равным 12, 24 и 36 часам. По 140 мкл антигена дозировали в новые пробирки в соответствии с условиями, указанными в Таблице 3. Пробы антигена получали через каждый час и подтверждали состояние антигена посредством вестерн-блоттинга. Вестерн-блоттинг выполнили посредством количественной оценки каждой пробы анализом с ВСА и электрофореза 0,6 мкг пробы в 12%-ном акриламидном геле при 150 В и 150 мА в течение 1,5 часов с последующим переносом полученной пробы на нитроцеллюлозную мембрану. С перенесенной пробой выполнили реакцию с использованием моноклонального антитела, доступного на рынке, которое специфически реагирует с антигенами HPV 16 и 18 типов, после чего выполнили проявление.Antigen stability was evaluated by varying the reaction temperature and storage time of antigens obtained using different salts and different salt concentrations in the fractionation step. For this purpose, the fractionation procedure was carried out in accordance with the type and concentration of salt and the
4-2. Результаты4-2. results
Как показано на Фиг. 19, согласно результатам вестерн-блоттинга проб антигена, полученных при различных температурах, пробы сохраняли стабильность в качестве антигена при 40°C и 60°C. С учетом того, что 40°C и 60°C являются жесткими температурными условиями, приведенные выше результаты подтверждают, что антигены HPV, полученные способом получения по настоящему изобретению, могут сохранять стабильность в качестве антигена при хранении в стандартном холодильнике и при температурах замораживания.As shown in FIG. 19, according to the results of Western blotting of antigen samples obtained at various temperatures, the samples remained stable as antigen at 40 ° C and 60 ° C. Given that 40 ° C and 60 ° C are harsh temperature conditions, the above results confirm that the HPV antigens obtained by the preparation method of the present invention can maintain stability as antigen when stored in a standard refrigerator and at freezing temperatures.
Также, как показано на Фиг. 19, при исследовании зависимости от вида и концентрации соли стабильность в качестве антигена была высокой при использовании 0,4 М KCl, 0,4 М Na2CO3 и 0,5 М NaCl, а не при низких концентрациях соли, таких как 0,15 М NaCl. Эти результаты показывают, что антигены HPV, полученные способом получения по настоящему изобретению, превосходили антигены HPV, полученные с использованием 0,15 М NaCl, в отношении выхода белка после очистки и стабильности, и поэтому они пригодны для применения в качестве сырьевого материала для получения диагностического средства для выявления антител к HPV.Also, as shown in FIG. 19, when studying the dependence on the type and concentration of salt, stability as an antigen was high when using 0.4 M KCl, 0.4 M Na 2 CO 3 and 0.5 M NaCl, and not at low salt concentrations, such as 0, 15 M NaCl. These results show that the HPV antigens obtained by the preparation method of the present invention were superior to the HPV antigens obtained using 0.15 M NaCl in terms of protein yield after purification and stability, and therefore they are suitable for use as a raw material for diagnostic agents for detecting antibodies to HPV.
Хотя настоящее изобретение было описано подробно со ссылкой на специфические признаки, специалистам в данной области техники будет очевидно, что это описание относится лишь к предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Поэтому объем настоящего изобретения по существу определен формулой изобретения и его эквивалентами.Although the present invention has been described in detail with reference to specific features, it will be apparent to those skilled in the art that this description only refers to a preferred embodiment of the present invention and does not limit the scope of the present invention. Therefore, the scope of the present invention is essentially defined by the claims and their equivalents.
Claims (12)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2014-0190902 | 2014-12-26 | ||
| KR20140190902 | 2014-12-26 | ||
| PCT/KR2015/010740 WO2016104923A1 (en) | 2014-12-26 | 2015-10-12 | Method for preparing virus-like particles of human papillomavirus |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015149330A3 RU2015149330A3 (en) | 2018-11-30 |
| RU2015149330A RU2015149330A (en) | 2018-11-30 |
| RU2677336C2 true RU2677336C2 (en) | 2019-01-16 |
Family
ID=56150907
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015149330A RU2677336C2 (en) | 2014-12-26 | 2015-10-12 | Method for obtaining virus-like particles of human papillomavirus |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101825996B1 (en) |
| EA (1) | EA201790944A1 (en) |
| RU (1) | RU2677336C2 (en) |
| WO (1) | WO2016104923A1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2206608C2 (en) * | 1994-05-16 | 2003-06-20 | Мерк Энд Ко., Инк. | Papilloma viral vaccines |
| RU2356943C2 (en) * | 2003-03-24 | 2009-05-27 | Мерк Энд Ко., Инк. | Nucleic acid molecule encoding hpv 31 l1, expression vector, host cell, virus-like particle and method of its obtainment, vaccine, pharmaceutical composition and methods involving them |
| EP2444103A1 (en) * | 2009-06-19 | 2012-04-25 | Eyegene Inc. | Vaccine for cervical cancer |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5821087A (en) * | 1995-03-30 | 1998-10-13 | Merck & Co., Inc. | Production of recombinant human papillomavirus type II protein utilizing papillomavirus 6/11 hybrid DNA |
| ATE333501T1 (en) * | 1997-09-05 | 2006-08-15 | Medimmune Inc | METHOD FOR IN VITRO DISASSEMBLY AND REASSEMBLY OF PAPILLOMAVIRUS VIRUS-LIKE PARTICLES (VLPS) |
| DK2154147T3 (en) * | 2007-04-29 | 2015-12-07 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Entpr Co Ltd | Truncated L1 protein of human papillomavirus 16 |
| KR100959145B1 (en) | 2008-03-21 | 2010-05-25 | 중앙대학교 산학협력단 | Process for Producing and Purifying Human Papillomavirus Virus-Like Particles |
| KR101182663B1 (en) * | 2010-06-29 | 2012-09-18 | 주식회사 유라코퍼레이션 | Process box in one body nametag |
| KR101559622B1 (en) * | 2012-07-30 | 2015-10-13 | 중앙대학교 산학협력단 | An Efficient Method for Purifying Virus-Like Particles of Human Papillomavirus |
-
2015
- 2015-10-12 WO PCT/KR2015/010740 patent/WO2016104923A1/en active Application Filing
- 2015-10-12 RU RU2015149330A patent/RU2677336C2/en active
- 2015-10-12 EA EA201790944A patent/EA201790944A1/en unknown
- 2015-10-12 KR KR1020150142107A patent/KR101825996B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2206608C2 (en) * | 1994-05-16 | 2003-06-20 | Мерк Энд Ко., Инк. | Papilloma viral vaccines |
| RU2356943C2 (en) * | 2003-03-24 | 2009-05-27 | Мерк Энд Ко., Инк. | Nucleic acid molecule encoding hpv 31 l1, expression vector, host cell, virus-like particle and method of its obtainment, vaccine, pharmaceutical composition and methods involving them |
| EP2444103A1 (en) * | 2009-06-19 | 2012-04-25 | Eyegene Inc. | Vaccine for cervical cancer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101825996B1 (en) | 2018-02-09 |
| RU2015149330A3 (en) | 2018-11-30 |
| RU2015149330A (en) | 2018-11-30 |
| EA201790944A1 (en) | 2017-11-30 |
| WO2016104923A1 (en) | 2016-06-30 |
| KR20160080060A (en) | 2016-07-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK2134360T3 (en) | Purification of virus-like particle | |
| Kim et al. | One-step chromatographic purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae | |
| AU2016239877B2 (en) | Aseptic purification process for viruses | |
| Zhao et al. | Enterovirus71 virus‐like particles produced from insect cells and purified by multistep chromatography elicit strong humoral immune responses in mice | |
| Effio et al. | High-throughput process development of an alternative platform for the production of virus-like particles in Escherichia coli | |
| CN111474367A (en) | Kit for screening and detecting African swine fever virus P30 protein monoclonal antibody and preparation method thereof | |
| Eckhardt et al. | Purification of oncolytic measles virus by cation-exchange chromatography using resin-based stationary phases | |
| CN109187774B (en) | Quantitative detection method of porcine circovirus type 2 virus-like particles | |
| CN104673760B (en) | A kind of purification process of procaryotic cell expression viruslike particle | |
| RU2677336C2 (en) | Method for obtaining virus-like particles of human papillomavirus | |
| Gomes et al. | Applications of gellan natural polymer microspheres in recombinant catechol-O-methyltransferase direct capture from a Komagataella pastoris lysate | |
| Imai et al. | Adsorption characteristics of an enteric virus-binding protein to norovirus, rotavirus and poliovirus | |
| RU2445357C1 (en) | Pichia angusta recombinant yeast strain - producer of capsid protein l1 of human papillomavirus type 16 | |
| Li et al. | Optimization of the expression of hepatitis B virus e gene in Pichia pastoris and immunological characterization of the product | |
| Zahid et al. | Guidelines for small-scale production and purification of hepatitis B surface antigen virus-like particles from recombinant Pichia pastoris | |
| JP2022512377A (en) | Vaccine virus purification method using affinity chromatography | |
| JP2016529908A5 (en) | ||
| KR101942626B1 (en) | Method for enhancing purification yield of nodavirus capsid protein | |
| Pan et al. | Rapid process for purification of an extracellular β-xylosidase by aqueous two-phase extraction | |
| JP2007228937A (en) | Method for purifying killer protein | |
| KR102546626B1 (en) | Rapid influenza virus antigen purification condition test | |
| CN114032216B (en) | New use of double-cortex epinephrine-like kinase 1 | |
| CN113502290B (en) | Aptamer HPV3901 of HPV39 virus particle and application thereof | |
| CN113621615B (en) | Aptamer HPV3101 of HPV31 virus particle and application thereof | |
| CN113528544B (en) | Gene for coding soluble HPV23L1 protein and construction and application of recombinant plasmid thereof |