RU2677293C1 - Method for determining genetic determinants of resistance of the pathogen of tuberculosis to bedaquiline and linezolid - Google Patents

Method for determining genetic determinants of resistance of the pathogen of tuberculosis to bedaquiline and linezolid Download PDF

Info

Publication number
RU2677293C1
RU2677293C1 RU2017140462A RU2017140462A RU2677293C1 RU 2677293 C1 RU2677293 C1 RU 2677293C1 RU 2017140462 A RU2017140462 A RU 2017140462A RU 2017140462 A RU2017140462 A RU 2017140462A RU 2677293 C1 RU2677293 C1 RU 2677293C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
gene
bedaquiline
resistance
linezolid
hybridization
Prior art date
Application number
RU2017140462A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Дмитрий Александрович Грядунов
Данила Вадимович Зименков
Original Assignee
Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) filed Critical Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран)
Priority to RU2017140462A priority Critical patent/RU2677293C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2677293C1 publication Critical patent/RU2677293C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: invention relates to the field of medicine, molecular biology and microbiology. Propose the method for determining genetic determinants of resistance of the pathogen of tuberculosis to Bedaquiline and Linezolid, including multiplex amplification of the Rv0678, atpE, 23S rRNA, rplC genes, providing an oligonucleotide microchip to determine the presence/absence of point mutations, insertions, deletions in the indicated genes, hybridization of the amplified fluorescently-labeled products on the oligonucleotide microchip and registration of the results of hybridization.
EFFECT: invention allows to establish the presence/absence of determinants of an unknown pre-localization in the Rv0678 gene sequence, as well as to identify mutations in the atpE, 23S rRNA, rplC genes associated with Bedaquiline and Linezolid resistance.
6 cl, 9 dwg, 3 tbl, 8 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине и обеспечивает способ определения генетических детерминант резистентности возбудителя туберкулеза - микобактерий туберкулезного комплекса (Mycobacterium tuberculosis, М. bovis, М. bovis BCG, М. africanum, М. microti, М. canettii, М. caprae, М. pinnipedii, М. mungi) к новейшим противотуберкулезным препаратам, включая бедаквилин и линезолид, в клиническом образце на дифференцирующем олигонуклеотидном микрочипе.The invention relates to molecular biology, microbiology and medicine, and provides a method for determining the genetic determinants of the resistance of the causative agent of tuberculosis - Mycobacterium tuberculosis complex (Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, M. canettii, M. caprae , M. pinnipedii, M. mungi) to the latest anti-TB drugs, including bedaquiline and linezolid, in a clinical sample on a differentiating oligonucleotide microchip.

Уровень техникиState of the art

В соответствии с приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации №951 от 29.12.2014 г. пациентов с лекарственно-устойчивыми формами туберкулеза необходимо переводить на IV и V режимы химиотерапии, включающие бедаквилин (BDQ) и линезолид (LZN). Эффективность применения данных препаратов зависит как от общего состояния пациента, так и от фенотипических и генетических характеристик изолята М. tuberculosis, являющегося причиной болезни. Недавние исследования изолятов от больных, получающих терапию бедаквилином и линезолидом, позволил определить следующие состояния возбудителя туберкулеза (ТБ) - предсуществующая резистентность к бедаквилину у пациентов с лекарственно-устойчивыми формами ТБ и резистентность к бедаквилину и/или линезолиду, приобретаемая больными в ходе лечения (Zimenkov D, Nosova Е, Kulagina Е, Antonova О, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline- and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906), что подтверждает необходимость разработки молекулярно-генетического теста для оценки эффективности действия данных препаратов.In accordance with the order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 951 dated December 29, 2014, patients with drug-resistant forms of tuberculosis must be transferred to IV and V chemotherapy regimens, including bedaquiline (BDQ) and linezolid (LZN). The effectiveness of the use of these drugs depends both on the general condition of the patient, and on the phenotypic and genetic characteristics of the M. tuberculosis isolate, which is the cause of the disease. Recent studies of isolates from patients receiving bedaquiline and linezolid therapy have identified the following conditions of the causative agent of tuberculosis (TB) - preexisting resistance to bedaquiline in patients with drug-resistant forms of TB and resistance to bedaquiline and / or linezolid acquired by patients during treatment (Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline- and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region . 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906), which confirms Parts Required development of molecular genetic test to assess the effectiveness of these drugs.

Бедаквилин (торговое название «Сиртуро», кодовые названия ТМС207 и R207910), диарилхинолон, полученный группой Koen Andries из Janssen Pharmaceutica, является первым за последние 40 лет противотуберкулезным препаратом с новым механизмом действия (Palomino, J.C. & Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. 2013. Future Microbiology. 8: 1071-80). В декабре 2012 года Food and Drug Administration (FDA, США) одобрено применение бедаквилина для комбинированной терапии туберкулеза с множественной лекарственной резистентностью (МЛУ) у взрослых.Bedaquiline (trade name Sirturo, codenamed TMC 207 and R207910), diarylquinolone obtained by the Koen Andries group of Janssen Pharmaceutica, is the first new anti-TB drug in the last 40 years (Palomino, JC & Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. 2013. Future Microbiology. 8: 1071-80). In December 2012, the Food and Drug Administration (FDA, USA) approved the use of bedaquiline for the combination therapy of multidrug-resistant tuberculosis (MDR) in adults.

Бедаквилин ингибирует микобактериальную АТФ-синтазу, препятствуя образованию АТФ в клетке и нарушению внутриклеточного метаболизма. Бедаквилин не влияет на активность АТФ-синтазы млекопитающих. Описано два вероятных механизма формирования резистентности М. tuberculosis к бедаквилину. Первый механизм связан с мутациями в гене atpE, кодирующем трансмембранную С-субъединицу АТФ-синтазы. Такой механизм был выявлен в штаммах с резистентностью к бедаквилину, полученной in vitro (Andries, K., Verhasselt, P., Guillemont, J., Gohlmann, H.W., Neefs, J.M., Winkler, H., Van Gestel, J., Timmerman, P., Zhu, M., Lee, E., Williams, P., de Chaffoy, D., Huitric, E., Hoffner, S., Cambau, E., Truffot-Pernot, C., Lounis, N. & Jarlier, V. A diarylquinoline drug active on the ATP synthase of Mycobacterium tuberculosis. 2005. Science. 307: 223-7; Segala, E., Sougakoff, W., Nevejans-Chauffour, A., Jarlier, V. & Petrella, S. New mutations in the mycobacterial ATP synthase: new insights into the binding of the diarylquinoline TMC207 to the ATP synthase C-ring structure. 2012. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56: 2326-34). Секвенирование МЛУ-изолятов с селектированной in vitro резистентностью к бедаквилину позволило выявить следующие замены в гене atpE: N28V, D32V, E61D, А63Р, I66M, N28Q, L59V, E61N, А63Р и I66M, находящиеся в области взаимодействия бедаквилина и С-субъединицы. Однако только треть устойчивых штаммов обладала мутациями в гене atpE, остальные изоляты, по видимому, обладали детерминантами резистентности в иных локусах.Bedaquiline inhibits mycobacterial ATP synthase, preventing the formation of ATP in the cell and impaired intracellular metabolism. Bedaquiline does not affect the activity of mammalian ATP synthase. Two possible mechanisms of the formation of M. tuberculosis resistance to bedaquiline are described. The first mechanism is associated with mutations in the atpE gene encoding the transmembrane C-subunit of ATP synthase. Such a mechanism has been identified in strains with resistance to bedaquiline obtained in vitro (Andries, K., Verhasselt, P., Guillemont, J., Gohlmann, HW, Neefs, JM, Winkler, H., Van Gestel, J., Timmerman , P., Zhu, M., Lee, E., Williams, P., de Chaffoy, D., Huitric, E., Hoffner, S., Cambau, E., Truffot-Pernot, C., Lounis, N . & Jarlier, V. A diarylquinoline drug active on the ATP synthase of Mycobacterium tuberculosis. 2005. Science. 307: 223-7; Segala, E., Sougakoff, W., Nevejans-Chauffour, A., Jarlier, V. & Petrella, S. New mutations in the mycobacterial ATP synthase: new insights into the binding of the diarylquinoline TMC207 to the ATP synthase C-ring structure. 2012. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56: 2326-34). Sequencing of MDR isolates with selected in vitro resistance to bedaquiline revealed the following substitutions in the atpE gene: N28V, D32V, E61D, A63P, I66M, N28Q, L59V, E61N, A63P, and I66M located in the interaction region of bedaquiline and C-subunit. However, only a third of resistant strains possessed mutations in the atpE gene; the remaining isolates, apparently, possessed determinants of resistance at other loci.

Секвенирование изолятов с искусственно полученной резистентностью (Hartkoorn, R.C., Uplekar, S. & Cole, S.T. Cross-resistance between clofazimine and bedaquiline through upregulation of MmpL5 in Mycobacterium tuberculosis. 2014. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 2979-81.) и изолята от пациента с приобретенной резистентностью (Andries, K., Villellas, С., Coeck, N., Thys, K., Gevers, Т., Vranckx, L., Lounis, N., de Jong, B.C. & Koul, A. Acquired Resistance of Mycobacterium tuberculosis to Bedaquiline. 2014. PLoS One. 9: e102135) выявило мутации в локусе Rv0678, кодирующем транскрипционный репрессор ряда генов, включающих в себя mmpL5 и mmpS5, чьи продукты формируют эффлюксный насос, обеспечивающий транспорт наружу таких препаратов как клофазимин и эконазол. Так как любая инактивация репрессора приводит к повышению экспрессии эффлюксного комплекса, то спектр возможных мутаций в рамке считывания Rv0678 необычайно широк и включает в себя как мутации, приводящие к аминокислотным заменам в ключевых регионах белка, так и всевозможные нонсенс-мутации, ответственные за сбой рамки считывания и отсутствие полноценного белка-репрессора в клетке.Sequencing of isolates with artificially generated resistance (Hartkoorn, RC, Uplekar, S. & Cole, ST Cross-resistance between clofazimine and bedaquiline through upregulation of MmpL5 in Mycobacterium tuberculosis. 2014. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 2979-81.) And isolate from a patient with acquired resistance (Andries, K., Villellas, C., Coeck, N., Thys, K., Gevers, T., Vranckx, L., Lounis, N., de Jong, BC & Koul, A. Acquired Resistance of Mycobacterium tuberculosis to Bedaquiline. 2014. PLoS One. 9: e102135) revealed mutations at the Rv0678 locus, which encodes a transcriptional repressor of a number of genes, including mmpL5 and mmpS5, whose products form an efflux pump that allows for external transport drugs like clofazimine and econazole. Since any inactivation of the repressor leads to an increase in the expression of the efflux complex, the range of possible mutations in the Rv0678 reading frame is unusually wide and includes both mutations leading to amino acid substitutions in key regions of the protein, and all kinds of nonsense mutations responsible for the reading frame failure and the lack of a complete repressor protein in the cell.

Результаты недавних исследований показали возможную ассоциацию мутаций в локусе pepQ с резистентностью к бедаквилину и клофазимину (Almeida D, Ioerger Т, Tyagi S et al. Mutations in pepQ confer low-level resistance to bedaquiline and clofazimine in Mycobacterium tuberculosis. 2016. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60: 4590-9), однако в исследовании российской популяции бедаквилин-резистентных изолятов последовательность данного локуса была отнесена к дикому типу (Zimenkov D, Nosova Е, Kulagina Е, Antonova О, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline- and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906).Recent studies have shown the possible association of mutations in the pepQ locus with resistance to bedaquiline and clofazimine (Almeida D, Ioerger T, Tyagi S et al. Mutations in pepQ confer low-level resistance to bedaquiline and clofazimine in Mycobacterium tuberculosis. 2016. Antimicrobial and 60: 4590-9), however, in the study of the Russian population of Bedaquiline-resistant isolates, the sequence of this locus was assigned to the wild type (Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline- and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial c hemotherapy. 72 (7): 1901-1906).

Линезолид (Zyvox, Pfizer), представитель класса оксазолидинонов, был одобрен FDA в 2000 г. для лечения инфекций, вызванных грамположительными бактериями, а также показал бактериостатическую активность против М. tuberculosis с множественной и широкой (ШЛУ) лекарственной резистентностью как in vitro, так и на животных моделях (Zhang, Z., Pang, Y., Wang, Y., Liu, C. & Zhao, Y. Beijing genotype of Mycobacterium tuberculosis is significantly associated with linezolid resistance in multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis in China. 2014. International Journal of Antimicrobial Agents 43: 231-5). Исследования эффективности применения линезолида для лечения МЛУ-ТБ показали хорошую переносимость препарата и обосновали введение линезолида для терапии резистентных форм ТБ (Lee, М., Lee, J., Carroll, M.W., Choi, H., Min, S., Song, Т., Via, L.E., Goldfeder, L.C., Kang, E., Jin, В., Park, H., Kwak, H., Kim, H., Jeon, H.S., Jeong, I., Joh, J.S., Chen, R.Y., Olivier, K.N., Shaw, P.A., Follmann, D., Song, S.D., Lee, J.K., Lee, D., Kim, C.T., Dartois, V., Park, S.K., Cho, S.N. & Barry, C.E., 3rd. Linezolid for treatment of chronic extensively drug-resistant tuberculosis. 2012. New England Journal of Medicine. 367: 1508-18).Linezolid (Zyvox, Pfizer), a member of the oxazolidinone class, was approved by the FDA in 2000 for the treatment of infections caused by gram-positive bacteria, and also showed bacteriostatic activity against M. tuberculosis with multidrug and extensive (XDR) drug resistance both in vitro and on animal models (Zhang, Z., Pang, Y., Wang, Y., Liu, C. & Zhao, Y. Beijing genotype of Mycobacterium tuberculosis is significantly associated with linezolid resistance in multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis in China. 2014. International Journal of Antimicrobial Agents 43: 231-5). Studies of the efficacy of linezolid for the treatment of MDR-TB showed good tolerability and substantiated the administration of linezolid for the treatment of resistant forms of TB (Lee, M., Lee, J., Carroll, MW, Choi, H., Min, S., Song, T ., Via, LE, Goldfeder, LC, Kang, E., Jin, B., Park, H., Kwak, H., Kim, H., Jeon, HS, Jeong, I., Joh, JS, Chen, RY, Olivier, KN, Shaw, PA, Follmann, D., Song, SD, Lee, JK, Lee, D., Kim, CT, Dartois, V., Park, SK, Cho, SN & Barry, CE, 3rd Linezolid for treatment of chronic extensively drug-resistant tuberculosis. 2012. New England Journal of Medicine. 367: 1508-18).

Считается, что линезолид, как и остальные оксазолидиноны, препятствует сборке рибосомы на этапе присоединения формилметиониновой тРНК, и таким образом блокирует инициацию трансляции (Shinabarger, D. Mechanism of action of the oxazolidinone antibacterial agents. 1999. Expert Opinion on Investigational Drugs. 8: 1195-202). В настоящее время установлено, что механизм действия линезолида похож на механизм действия других антибиотиков, связывающихся с пептидил-трансферазным центром рибосомы. Сравнение кристаллических структур комплекса 50S субъединицы с разными антибиотиками показало, что линезолид частично делит сайт связывания с другими антибиотиками, которые ингибируют синтез белка. Хлорамфеникол, анизомицин, клиндамицин, тиамулин и стрептомицин А имеют сайты связывания в А-сайте пептидил-трансферазного центра, перекрывающиеся с сайтом связывания линезолида.Linezolid, like the rest of the oxazolidinones, is thought to interfere with ribosome assembly during the addition of formylmethionine tRNA and thus block translation initiation (Shinabarger, D. Mechanism of action of the oxazolidinone antibacterial agents. 1999. Expert Opinion on Investigational Drugs. 8: 1195 -202). It has now been established that the mechanism of action of linezolid is similar to the mechanism of action of other antibiotics that bind to the peptidyl transferase center of the ribosome. Comparison of the crystal structures of the 50S subunit complex with different antibiotics showed that linezolid partially shares the binding site with other antibiotics that inhibit protein synthesis. Chloramphenicol, anisomycin, clindamycin, tiamulin and streptomycin A have binding sites at the A site of the peptidyl transferase center that overlap with the binding site of linezolid.

Генетические детерминанты резистентности, выявленные в линезолид-устойчивых изолятах возбудителя туберкулеза, были обнаружены генах 23S рРНК и rplC фибосомный белок L3) (Richter, Е., Rusch-Gerdes, S. & Hillemann, D. First linezolid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. 2007. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51: 1534-6; Beckert, P., Hillemann, D., Kohl, T.A., Kalinowski, J., Richter, E., Niemann, S. & Feuerriegel, S. rplC T460C identified as a dominant mutation in linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. 2012. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56: 2743-5). В российской популяции линезолид-устойчивых изолятов идентифицированы замены C154R в различных вариантах в гене rplC, впервые описаны мутации g2294a и g2814t в гене 23S рРНК (Zimenkov D, Nosova Е, Kulagina Е, Antonova О, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline- and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906).Genetic resistance determinants found in linezolid-resistant isolates of the tuberculosis pathogen were detected with 23S rRNA and rplC genes L3 fibosomal protein) (Richter, E., Rusch-Gerdes, S. & Hillemann, D. First linezolid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis . 2007. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51: 1534-6; Beckert, P., Hillemann, D., Kohl, TA, Kalinowski, J., Richter, E., Niemann, S. & Feuerriegel, S. rplC T460C identified as a dominant mutation in linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. 2012. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56: 2743-5). In the Russian population of linezolid-resistant isolates, C154R substitutions in various variants in the rplC gene were identified, mutations g2294a and g2814t in the 23S rRNA gene were described for the first time (Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline- and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906).

Таким образом, для первичного скрининга изолятов от больных туберкулезом, планируемых к терапии бедаквилином и линезолидом, актуальным представляется анализ генетических детерминант резистентности в локусах Rv0678, atpE, 23S рРНК, rplC. Принимая во внимание тот факт, что мутации в гене Rv0678 могут возникать спонтанно в любом положении открытой рамки считывания, и, кроме того, в резистентных к BDQ клинических изолятах выявлены гетеропопуляции микобактерий - смеси штаммов с разными мутациями в данном локусе, наиболее подходящим способом идентификации таких детерминант резистентности могли бы стать технологии секвенирования нового поколения (NGS). Однако успех внедрения технологий NGS во многом зависит от миниатюризации платформ, примером которых может быть система MinION (Votintseva А.А., Bradley P., Pankhurst L., Del Ojo Elias C., Loose M., Nilgiriwala K., Chatterjee A., Smith E.G., Sanderson N., Walker Т.M., Morgan M.R., Wyllie D.H., Walker A.S., Peto Т., Crook D.W. and Iqbal Z. Same-Day Diagnostic and Surveillance Data for Tuberculosis via Whole-Genome Sequencing of Direct Respiratory Samples. 2017. Journal of clinical microbiology. 55(5): 1285-1298), усовершенствования этапа пробоподготовки образца и выделения НК, упрощения и ускорения процедуры анализа в условиях потоковых тестов клинико-диагностической лаборатории (Khodakov D., Wang С. and Zhang D.Y. Diagnostics based on nucleic acid sequence variant profiling: PCR, hybridization, and NGS approaches. 2016. Advanced drug delivery reviews. 105(Pt A): 3-19.). Вместе с тем, полное отсутствие отечественных разработок, как в области приборной базы, так и в наборах реагентов, обеспечивающих цикл полногеномного/таргетного анализа клинического материала, не позволяет пока снизить цену до приемлемого уровня. Таким образом, в данной области существует острая потребность в разработке способа выявления генетических детерминант резистентности возбудителя туберкулеза к бедаквилину и линезолиду, который бы выгодно отличался от известных из уровня техники решений простотой проведения анализа, высокими специфичностью и информативностью в отношении количества определяемых детерминант резистентности, а также невысокой стоимостью.Thus, for the initial screening of isolates from tuberculosis patients planned for therapy with bedaquiline and linezolid, it seems relevant to analyze the genetic determinants of resistance at the Rv0678, atpE, 23S rRNA, rplC loci. Taking into account the fact that mutations in the Rv0678 gene can occur spontaneously in any position of the open reading frame, and in addition, heteropopulations of mycobacteria, mixtures of strains with different mutations at a given locus, are the most suitable way to identify such mutations in BDQ-resistant clinical isolates. determinants of resistance could be next-generation sequencing technology (NGS). However, the success of the implementation of NGS technologies largely depends on the miniaturization of platforms, for example, the MinION system (Votintseva A.A., Bradley P., Pankhurst L., Del Ojo Elias C., Loose M., Nilgiriwala K., Chatterjee A. , Smith EG, Sanderson N., Walker T.M., Morgan MR, Wyllie DH, Walker AS, Peto T., Crook DW and Iqbal Z. Same-Day Diagnostic and Surveillance Data for Tuberculosis via Whole-Genome Sequencing of Direct Respiratory Samples. 2017. Journal of clinical microbiology. 55 (5): 1285-1298), improvement of the stage of sample preparation of the sample and extraction of NK, simplification and acceleration of the analysis procedure in the conditions of stream tests of the clinical diagnostic laboratory (Khodakov D., Wang C. and Zhang DY Diagnostics based on n nucleic acid sequence variant profiling: PCR, hybridization, and NGS approaches. 2016. Advanced drug delivery reviews. 105 (Pt A): 3-19.). At the same time, the complete lack of domestic developments, both in the field of instrument base and in reagent kits providing a cycle of genome-wide / targeted analysis of clinical material, does not yet allow reducing the price to an acceptable level. Thus, in this area there is an urgent need to develop a method for identifying the genetic determinants of the resistance of the causative agent of tuberculosis to bedaquiline and linezolid, which would advantageously differ from the known solutions from the prior art by the simplicity of the analysis, high specificity and information content in relation to the number of determined determinants of resistance, as well as low cost.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

В результате проведенных обширных научных исследований, анализа баз данных нуклеотидных последовательностей NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/166?subset=, Welcome Trust Sanger institute http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/mycobacterium.html, TBDReaMDB (www.tbdreamdb.com), результатов собственных геномных исследований (Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline- and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906) авторы настоящего изобретения обнаружили, что задача разработки способа определения генетических детерминант резистентности возбудителя туберкулеза к бедаквилину и линезолиду может быть успешно решена путем использования олигонуклеотидных микрочипов (биочипов), содержащих олигонуклеотидные зонды, последовательности которых специфичны к последовательности гена Rv0678, а также к мутантным вариантам генов atpE, 23SpPHK, rplC.As a result of extensive scientific research, analysis of the NCBI nucleotide sequence database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/166?subset=, Welcome Trust Sanger institute http://www.sanger.ac. uk / resources / downloads / bacteria / mycobacterium.html, TBDReaMDB (www.tbdreamdb.com), results of our own genomic studies (Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline- and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906) the authors of the present invention found that task of developing a method for determining genetic children rminant resistance to Mycobacterium tuberculosis and bedakvilinu linezolid can be successfully solved by using oligonucleotide microarrays (biochips) containing oligonucleotide probes whose sequences are specific to the gene sequence Rv0678, as well as the mutant variants gene atpE, 23SpPHK, rplC.

Технология олигонуклеотидных микрочипов низкой плотности успешно зарекомендовала себя для идентификации лекарственно-устойчивых изолятов возбудителя туберкулеза (Gryadunov D., Mikhailovich V., Lapa S., Roudinskii N., Donnikov M.,

Figure 00000001
S., Markova O.,
Figure 00000002
A., Chernousova L., Skotnikova O., Moroz A., Zasedatelev A. and Mirzabekov A. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. 2005. Clinical microbiology and infection. 11(7): 531-539; Gryadunov D., Dementieva E., Mikhailovich V., Nasedkina Т., Rubina A., Savvateeva E., Fesenko E., Chudinov A., Zimenkov D., Kolchinsky A. and Zasedatelev A. Gel-based microarrays in clinical diagnostics in Russia. 2011. Expert review of molecular diagnostics. 11(8): 839-853; Zimenkov D.V., Antonova O.V.,
Figure 00000002
A.V., Isaeva Y.D., Krylova L.Y., Popov S.A., Zasedatelev A.S., Mikhailovich V.M. and Gryadunov D.A. Detection of second-line drug resistance in Mycobacterium tuberculosis using oligonucleotide microarrays. 2013. BMC infectious diseases. 13: 240; Zimenkov D.V., Kulagina E.V., Antonova O.V., Zhuravlev V.Y. and Gryadunov D.A. Simultaneous drug resistance detection and genotyping of Mycobacterium tuberculosis using a low-density hydrogel microarray. 2016. Journal of antimicrobial chemotherapy. 71(6): 1520-1531. Патенты РФ 2562866, 2376387).The technology of low-density oligonucleotide microarrays has successfully established itself for the identification of drug-resistant isolates of the tuberculosis pathogen (Gryadunov D., Mikhailovich V., Lapa S., Roudinskii N., Donnikov M.,
Figure 00000001
S., Markova O.,
Figure 00000002
A., Chernousova L., Skotnikova O., Moroz A., Zasedatelev A. and Mirzabekov A. Evaluation of hybridization on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. 2005. Clinical microbiology and infection. 11 (7): 531-539; Gryadunov D., Dementieva E., Mikhailovich V., Nasedkina T., Rubina A., Savvateeva E., Fesenko E., Chudinov A., Zimenkov D., Kolchinsky A. and Zasedatelev A. Gel-based microarrays in clinical diagnostics in Russia. 2011. Expert review of molecular diagnostics. 11 (8): 839-853; Zimenkov DV, Antonova OV,
Figure 00000002
AV, Isaeva YD, Krylova LY, Popov SA, Zasedatelev AS, Mikhailovich VM and Gryadunov DA Detection of second-line drug resistance in Mycobacterium tuberculosis using oligonucleotide microarrays. 2013. BMC infectious diseases. 13: 240; Zimenkov DV, Kulagina EV, Antonova OV, Zhuravlev VY and Gryadunov DA Simultaneous drug resistance detection and genotyping of Mycobacterium tuberculosis using a low-density hydrogel microarray. 2016. Journal of antimicrobial chemotherapy. 71 (6): 1520-1531. RF patents 2562866, 2376387).

Заявляемый в настоящем изобретении способ выгодно отличается от известных из уровня техники методов возможностью анализа ДНК возбудителя, выделенной из клинического материала, с целью установления наличия/отсутствия точечных мутаций, инсерций, делеций заранее неизвестной локализации в последовательности гена Rv0678, а также идентификации 15 мутаций в генах atpE, 23S рРНК, rplC, ассоциированных с резистентностью к бедаквилину и линезолиду. Метод не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Данные, полученные с помощью заявленного способа, могут быть использованы для включения бедаквилина и/или линезолида в IV и V режимы терапии конкретного пациента, мониторинга эффективности лечения и отмены данных препаратов в силу приобретения резистентности.The method claimed in the present invention compares favorably with the methods known from the prior art by the ability to analyze the pathogen DNA isolated from clinical material in order to establish the presence / absence of point mutations, insertions, deletions of a previously unknown location in the Rv0678 gene sequence, as well as the identification of 15 mutations in the genes atpE, 23S rRNA, rplC associated with resistance to bedaquiline and linezolid. The method does not require expensive equipment and highly qualified personnel. Data obtained using the claimed method can be used to include bedaquiline and / or linezolid in IV and V modes of treatment for a particular patient, monitor the effectiveness of treatment and cancel these drugs due to the acquisition of resistance.

В своем первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ определения генетических детерминант резистентности возбудителя туберкулеза к бедаквилину и линезолиду. Способ основан на мультиплексной ПЦР с получением флуоресцентно-меченных фрагментов микобактериального генома с последующей гибридизацией этих фрагментов на биологическом микрочипе, содержащем набор олигонуклеотидов. Способ предусматривает следующие стадии:In its first aspect, the invention provides a method for determining the genetic determinants of the resistance of the tuberculosis pathogen to bedaquiline and linezolid. The method is based on multiplex PCR to obtain fluorescently-labeled fragments of the mycobacterial genome, followed by hybridization of these fragments on a biological microchip containing a set of oligonucleotides. The method comprises the following steps:

а) мультиплексную амплификацию генов Rv0678, atpE, 23S рРНК, rplC с одновременным флуоресцентным маркированием при использовании геномной ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в качестве матрицы и набора праймеров, последовательности которых представлены SEQ ID NO: 1-12, с получением флуоресцентно-меченных фрагментов микобактериального генома.a) multiplex amplification of the Rv0678, atpE, 23S rRNA, rplC genes with simultaneous fluorescence labeling using the genomic DNA of the mycobacterium tuberculosis complex as a template and a set of primers, the sequences of which are represented by SEQ ID NO: 1-12, to obtain fluorescently labeled fragments of the mycobacterial genome .

б) обеспечение олигонуклеотидного микрочипа для установления наличия/отсутствия точечных мутаций, инсерций, делеций заранее неизвестной локализации в последовательности гена Rv0678, а также идентификации мутаций в генах atpE, 23S рРНК, rplC, ассоциированных с резистентностью к бедаквилину и линезолиду, представляющего собой подложку, содержащую множество дискретных элементов, в каждом из которых иммобилизован уникальный олигонуклеотидный зонд, имеющий последовательность, комплементарную последовательности одноцепочечного фрагмента, полученного на стадии (а), и выбранную из группы, включающей: а) соответствующие последовательности гена Rv0678 дикого типа таким образом, что совпадение последовательности 5'-концевой части каждого следующего зонда составляет не менее 75% с последовательностью предыдущего, при этом зонды длиной 20 нуклеотидов каждый полностью перекрывают последовательность кодирующей области гена Rv0678; б) соответствующие последовательности фрагмента гена atpE дикого типа; в) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена atpE, приводящего к резистентности микроорганизма к бедаквилину; г) соответствующие последовательности фрагмента гена rplC дикого типа; д) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена rplC, приводящего к резистентности микроорганизма к линезолиду; е) соответствующие последовательности фрагмента гена 23S рРНК дикого типа; ж) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена 23S рРНК, приводящего к резистентности микроорганизмов к линезолиду; при этом последовательности иммобилизованных олигонуклеотидных зондов представлены SEQ ID NO: 13-140;b) providing an oligonucleotide microchip for determining the presence / absence of point mutations, insertions, deletions of a previously unknown location in the Rv0678 gene sequence, as well as identifying mutations in the atpE, 23S rRNA, rplC genes associated with resistance to bedaquiline and linezolid, which is a substrate containing many discrete elements, in each of which a unique oligonucleotide probe is immobilized, having a sequence complementary to the sequence of a single-stranded fragment, we obtain at the stage (a), and selected from the group including: a) the corresponding sequences of the wild-type Rv0678 gene so that the sequence of the 5'-terminal part of each next probe matches at least 75% with the sequence of the previous one, while the probes are 20 nucleotides each completely overlap the coding region of the Rv0678 gene; b) the corresponding sequences of the wild-type atpE gene fragment; c) the corresponding sequence of the fragment of the mutant variant of the atpE gene, leading to the resistance of the microorganism to bedaquiline; g) the corresponding sequence of the fragment of the wild-type rplC gene; d) the corresponding sequence of the fragment of the mutant variant of the rplC gene, leading to the resistance of the microorganism to linezolid; e) the corresponding sequences of the 23S rRNA gene fragment of the wild type; g) the corresponding sequence of the fragment of the mutant variant of the 23S rRNA gene, leading to the resistance of microorganisms to linezolid; wherein the sequences of immobilized oligonucleotide probes are represented by SEQ ID NO: 13-140;

(в) - гибридизацию амплифицированных флуоресцентно-меченных продуктов, полученных на стадии (а), на олигонуклеотидном микрочипе с образованием дуплексов с иммобилизованными зондами в условиях, обеспечивающих разрешение в один нуклеотид между образующимися в результате гибридизации совершенными и несовершенными дуплексами;(c) - hybridization of amplified fluorescently-labeled products obtained in stage (a) on an oligonucleotide microchip with the formation of duplexes with immobilized probes under conditions that provide a resolution of one nucleotide between perfect and imperfect duplexes formed as a result of hybridization;

(г) регистрацию результатов гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе, проведенной на стадии (в) с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения, что позволяет использовать программную обработку интенсивностей сигналов с последующей интерпретацией результатов, которую проводят в два этапа: на первом этапе анализируют сигналы в группах элементов, содержащих зонды, соответствующие последовательностям генов atpE, 23S рРНК, rplC; на втором этапе анализируют гибридизационный профиль, включающий интенсивности сигналов элементов, содержащих зонды, соответствующие последовательности гена Rv0678.(d) recording the results of hybridization on an oligonucleotide microchip carried out in stage (c) using a fluorescence analyzer and software, which allows the use of software processing of signal intensities with subsequent interpretation of the results, which is carried out in two stages: at the first stage, the signals are analyzed in groups of elements containing probes corresponding to the gene sequences of atpE, 23S rRNA, rplC; at the second stage, the hybridization profile is analyzed, including the signal intensities of elements containing probes corresponding to the sequence of the Rv0678 gene.

В одном из своих воплощений способ характеризуется тем, что амплификацию фрагментов микобактериального генома проводят, используя образец ДНК, выделенный из мокроты, экссудата, бронхо-альвеолярного лаважа или промывных вод бронхов, или образец ДНК, выделенный из клинического изолята микобактерий.In one of its embodiments, the method is characterized in that the amplification of fragments of the mycobacterial genome is carried out using a DNA sample isolated from sputum, exudate, broncho-alveolar lavage or bronchial washings, or a DNA sample isolated from the clinical isolate of mycobacteria.

В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (а) для флуоресцентного маркирования получаемых ПЦР-фрагментов используют флуоресцентно меченый дезоксиуридинтрифосфат.In a further embodiment, the method is characterized in that, in step (a), fluorescently labeled deoxyuridine triphosphate is used to fluorescently label the resulting PCR fragments.

В следующем воплощении способ характеризуется тем, что в каждой серии экспериментов на стадии (а) в отдельной пробирке проводят амплификацию и флуоресцентного маркирование образца микобактериальной ДНК штамма дикого типа H37Rv с последующей гибридизацией полученных флуоресцентно-меченных ПЦР-фрагментов на отдельном микрочипе на стадии (в) и регистрацией результатов гибридизации на стадии (г) с получением эталонного гибридизационного профиля, включающего интенсивности сигналов элементов, содержащих зонды, соответствующие последовательности гена Rv0678 дикого типа.In a further embodiment, the method is characterized in that in each series of experiments in step (a), amplification and fluorescence labeling of a sample of mycobacterial DNA of the wild-type strain H37Rv is carried out in a separate tube, followed by hybridization of the obtained fluorescence-labeled PCR fragments on a separate microchip in step (c) and recording the results of the hybridization in step (d) to obtain a reference hybridization profile including signal intensities of elements containing probes corresponding to the sequence NOSTA wildtype gene Rv0678.

В еще одном из воплощений способ характеризуется тем, что на стадии (г) на первом этапе интерпретации анализируют сигналы групп элементов, содержащих зонды, специфичные к одному из генов atpE, 23S рРНК, rplC, таким образом, что если максимальный сигнал в группе зарегистрирован в элементе, содержащем зонд дикого типа, то считают, что по данной аминокислотной/нуклеотидной позиции данного гена изучаемый образец ДНК возбудителя туберкулеза мутаций не имеет, в противном случае, если максимальный сигнал в группе зарегистрирован в элементе, содержащем зонд, последовательность которого соответствует мутантному варианту одного из генов, то считают, что по данной аминокислотной/нуклеотидной позиции данного гена изучаемый образец ДНК возбудителя туберкулеза имеет мутацию, приводящую к резистентности к бедаквилину или линезолиду.In yet another embodiment, the method is characterized in that in step (d), in the first interpretation step, the signals of groups of elements containing probes specific to one of the atpE, 23S rRNA, rplC genes are analyzed, so that if the maximum signal in the group is detected in an element containing a wild-type probe, it is believed that, for a given amino acid / nucleotide position of this gene, the studied DNA sample of the tuberculosis pathogen does not have mutations, otherwise, if the maximum signal in the group is registered in the element containing probe, the sequence of which corresponds to the mutant variant of one of the genes, it is believed that for a given amino acid / nucleotide position of this gene, the studied sample of tuberculosis pathogen DNA has a mutation leading to resistance to bedaquiline or linezolid.

В еще одном из своих воплощений способ характеризуется тем, что на стадии (г) на втором этапе интерпретации результатов эталонный гибридизационный профиль нормируют на гибридизационные профили анализируемых образцов ДНК с неизвестной последовательностью гена Rv0678 с получением нормированных профилей, различающихся для последовательностей ДНК дикого типа и мутантных вариантов гена Rv0678, тем самым относя последовательность гена Rv0678 к дикому типу, либо к содержащей точечную мутацию, делецию, инсерцию, приводящую к резистентности к бедаквилину.In yet another embodiment, the method is characterized in that in step (d) in the second step of interpreting the results, the reference hybridization profile is normalized to the hybridization profiles of the analyzed DNA samples with an unknown Rv0678 gene sequence to obtain normalized profiles that differ for wild-type DNA sequences and mutant variants Rv0678 gene, thereby attributing the sequence of the Rv0678 gene to the wild type, or to containing a point mutation, deletion, insertion, leading to resistance to bedakvi Inu.

Другие аспекты настоящего изобретения будут ясны из прилагаемых фигур, подробного описания и формулы изобретения.Other aspects of the present invention will be apparent from the accompanying figures, detailed description, and claims.

Краткий перечень фигурShort list of figures

Для более ясного понимания сущности заявленного изобретения, а также для демонстрации его характерных черт и преимуществ далее приводятся ссылки на фигуры чертежей, на которых:For a clearer understanding of the essence of the claimed invention, as well as to demonstrate its characteristic features and advantages, the following are references to the figures of the drawings, on which:

Фиг. 1. Представляет выравнивание последовательностей олигонуклеотидов длиной 20 оснований, перекрывающих последовательность дикого типа гена Rv0678. Выделены старт- и стоп-кодоны кодирующей области гена. Олигонуклеотид Rv0678_c предназначен для контроля полноразмерной амплификации гена Rv0678.FIG. 1. Represents the alignment of sequences of oligonucleotides with a length of 20 bases, overlapping the sequence of the wild-type Rv0678 gene. Start and stop codons of the coding region of the gene are highlighted. Rv0678_c oligonucleotide is designed to control the full-size amplification of the Rv0678 gene.

Фиг. 2. Представляет схему размещения дискриминирующих олигонуклеотидов на биочипе.FIG. 2. Represents the layout of discriminating oligonucleotides on a biochip.

Фиг. 3. Нормированные гибридизационные профили, полученные при анализе последовательности гена Rv0678 в образцах ДНК с различными мутациями в данном гене. Нормированный гибридизационный профиль образца ДНК с последовательностью дикого типа по гену Rv0678 показан серыми столбцами.FIG. 3. Normalized hybridization profiles obtained by analyzing the sequence of the Rv0678 gene in DNA samples with various mutations in this gene. The normalized hybridization profile of a DNA sample with a wild-type sequence according to the Rv0678 gene is shown in gray columns.

Фиг. 4. Флуоресцентная картина гибридизации биочипа и результаты интерпретации при анализе ДНК, выделенной из клинического образца, содержащего штамм М. tuberculosis, чувствительный к бедаквилину и линезолиду.FIG. 4. Fluorescence picture of hybridization of the biochip and interpretation results in the analysis of DNA isolated from a clinical sample containing a strain of M. tuberculosis sensitive to bedaquiline and linezolid.

Фиг. 5. Флуоресцентная картина гибридизации биочипа и результаты интерпретации при анализе ДНК, выделенной из клинического образца, содержащего резистентный к бедаквилину штамм М. tuberculosis, обладающий мутацией Del32g в гене Rv0678.FIG. 5. Fluorescence picture of hybridization of the biochip and interpretation results in the analysis of DNA isolated from a clinical sample containing Bedaquiline-resistant M. tuberculosis strain with a Del32g mutation in the Rv0678 gene.

Фиг. 6. Флуоресцентная картина гибридизации биочипа и результаты интерпретации при анализе ДНК, выделенной из клинического образца, содержащего резистентный к бедаквилину штамм М. tuberculosis, обладающий, мутациями S53P, Del198g, Del336c в гене Rv0678.FIG. 6. Fluorescence pattern of hybridization of the biochip and interpretation results in the analysis of DNA isolated from a clinical sample containing Bedaquiline-resistant M. tuberculosis strain with S53P, Del198g, Del336c mutations in the Rv0678 gene.

Фиг. 7. Флуоресцентная картина гибридизации биочипа и результаты интерпретации при анализе ДНК, выделенной из клинического образца, содержащего резистентный к бедаквилину штамм М. tuberculosis, обладающий мутациями M23L и ins419g в гене Rv0678 и A63V в гене atpE.FIG. 7. Fluorescence picture of hybridization of the biochip and interpretation results when analyzing DNA isolated from a clinical sample containing Bedaquiline-resistant M. tuberculosis strain with mutations M23L and ins419g in the Rv0678 and A63V gene in the atpE gene.

Фиг. 8. Флуоресцентная картина гибридизации биочипа и результаты интерпретации при анализе ДНК, выделенной из клинического образца, содержащего резистентный к бедаквилину и линезолиду штамм М. tuberculosis, обладающий мутацией ins139g в гене Rv0678 и мутацией t460c в гене rplC.FIG. 8. Fluorescence pattern of biochip hybridization and interpretation results in the analysis of DNA isolated from a clinical sample containing the M. tuberculosis strain resistant to bedaquiline and linezolid, having the ins139g mutation in the Rv0678 gene and the t460c mutation in the rplC gene.

Фиг. 9. Флуоресцентная картина гибридизации биочипа и результаты интерпретации при анализе ДНК, выделенной из клинического изолята, содержащего резистентный к линезолиду штамм М. tuberculosis, обладающий мутациями g2294a в гене 23S рРНК и t460c в гене rplC.FIG. 9. Fluorescence picture of hybridization of the biochip and interpretation results in the analysis of DNA isolated from a clinical isolate containing linezolid-resistant M. tuberculosis strain with mutations g2294a in the 23S rRNA gene and t460c in the rplC gene.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

В заявленном способе предложено использование мультиплексной амплификации и флуоресцентного маркирования фрагментов микобактериального генома с получением флуоресцентно-меченных ПЦР-продуктов, при этом в качестве матрицы может быть использована геномная ДНК, выделенная из клинического респираторного материала, такого как мокрота, промывные воды или аспират бронхов, бронхоальвеолярный лаваж, экссудат, а также геномная ДНК, выделенная из клинических изолятов - культур клеток микобактерий, выращенных в жидкой или на твердой средах. Заявленный способ также предусматривает использование оригинального олигонуклеотидного микрочипа с иммобилизованными специфическими олигонуклеотидными зондами, процедуры гибридизации, регистрации и интерпретации результатов.In the claimed method, the use of multiplex amplification and fluorescence labeling of fragments of the mycobacterial genome to produce fluorescently-labeled PCR products is proposed, while genomic DNA isolated from clinical respiratory material such as sputum, washings or bronchial aspirate, bronchoalveolar can be used as a matrix lavage, exudate, as well as genomic DNA isolated from clinical isolates - cultures of mycobacterial cells grown in liquid or solid media. The claimed method also involves the use of an original oligonucleotide microchip with immobilized specific oligonucleotide probes, hybridization procedures, registration and interpretation of the results.

Принципиальная схема анализа микобактериальной ДНК с целью определения генетических детерминант резистентности возбудителя туберкулеза к бедаквилину и линезолиду с помощью олигонуклеотидного микрочипа.Schematic diagram of the analysis of mycobacterial DNA in order to determine the genetic determinants of the resistance of the tuberculosis pathogen to bedaquiline and linezolid using an oligonucleotide microchip.

Клинический образец подвергали деконтаминации и лизису клеток с целью обеспечения доступа к геномной ДНК. Одним из пригодных способов является разжижение в щелочных условиях в присутствии N-ацетил-L-цистеина и кипячение с детергентом для обеспечения доступа к ДНК и деконтаминации образца (Kent, Р.Т., and G.P. Kubica. Public health mycobacteriology. A guide for level III laboratory. 1985 Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA). Для этих целей также могут быть использованы иные способы, известные специалистам в данной области, такие как разрушение клеток с помощью ультразвука (Padilla Е, Gonzalez V, Manterola JM, et al. Evaluation of two different cell lysis methods for releasing mycobacterial nucleic acids in the INNO-LiPA mycobacteria test. 2003. Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases. 46(1): 19-23), лизис при помощи гуанидина тиоцианата - саркозина (Chakravorty S, Tyagi JS. Novel use of guanidinium isothiocyanate in the isolation of Mycobacterium tuberculosis DNA from clinical material. 2001. FEMS Microbiology Letters. 205(1): 113-7.) и т.д. Очистку геномной ДНК после проведения лизиса проводили с использованием автоматических роботизированных станций, например Freedom EVO® Clinical (Tecan Group Ltd., Германия), или коммерческих наборов, таких, например, как «ПРОБА-НК» (ООО «НПО «ДНК-Технология», Регистрационное удостоверение Росздравнадзора № ФСР 2008/02938), «Реагент в пробирках для выделения ДНК из биопроб с целью последующего анализа методом полимеразной цепной реакции (ДНК-ЭКСПРЕСС)» (ООО «НПФ «Литех», Регистрационное удостоверение Росздравнадзора ФСР 2007/00362), Комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» по ТУ 9398-071-01897593-2008 (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Регистрационное удостоверение Росздравнадзора ФСР 2008/03147).The clinical sample was decontaminated and lysed to ensure access to genomic DNA. One suitable method is liquefying under alkaline conditions in the presence of N-acetyl-L-cysteine and boiling with detergent to provide access to DNA and decontamination of the sample (Kent, PT, and GP Kubica. Public health mycobacteriology. A guide for level III laboratory. 1985 Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA). Other methods known to those skilled in the art can also be used for these purposes, such as cell disruption by ultrasound (Padilla E, Gonzalez V, Manterola JM, et al. Evaluation of two different cell lysis methods for releasing mycobacterial nucleic acids in the INNO-LiPA mycobacteria test. 2003. Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases. 46 (1): 19-23), lysis with guanidine thiocyanate - sarcosine (Chakravorty S, Tyagi JS. Novel use of guanidinium isothiocyanate in the isolation of Mycobacterium tu from clinical material. 2001. FEMS Microbiology Letters. 205 (1): 113-7.), etc. Genomic DNA purification after lysis was performed using automated robotic stations, for example, Freedom EVO® Clinical (Tecan Group Ltd., Germany), or commercial kits, such as, for example, PROBA-NK (NPO DNA-Technology LLC , Registration certificate of Roszdravnadzor No. FSR 2008/02938), “Reagent in test tubes for DNA extraction from biological samples for subsequent analysis by the polymerase chain reaction method (DNA-EXPRESS)” (LLC NPF Litekh, Registration certificate of Roszdravnadzor FSR 2007/00362) Reagent kit for highlighted RNA / DNA from the clinical material “RIBO-prep” according to TU 9398-071-01897593-2008 (Federal State Institution Central Research Institute of Epidemiology of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Registration Certificate of Federal Service for Health Supervision of the Federal Republic of Health 2008/03147).

Полученный препарат микобактериальной геномной ДНК использовали в качестве матрицы в мультиплексной ПЦР. В ходе амплификации происходила наработка фрагментов генов Rv0678, atpE, 23SрРНК, rplC.The resulting preparation of mycobacterial genomic DNA was used as a template in multiplex PCR. During amplification, gene fragments of Rv0678, atpE, 23SrRNA, rplC genes were generated.

Праймеры для проведения мультиплексной ПЦР выбирали таким образом, чтобы они фланкировали кодирующую область гена Rv0678, а также сегменты генов atpE, 23S рРНК, rplC, где находятся наиболее часто встречающиеся мутации, ассоциированные с резистентностью микроорганизма к бедаквилину или линезолиду. Используя специализированное программное обеспечение, например Oligo v. 6.3 (Molecular Biology Insights Inc., США) или Fast PCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm) или другие коммерчески доступные программы, или программы, свободно доступные в сети Internet, рассчитывали температуры плавления праймеров и, варьируя их длину, добивались того, чтобы разброс температур отжига праймеров внутри набора не превышал 3-4°C. При подборе праймеров избегали таких последовательностей, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления, а также последовательностей, образующих между собой дуплексы, состоящие более чем из трех-пяти нуклеотидов. Каждый выбранный праймер должен обладать уникальной специфичностью в отношении анализируемого участка последовательности генома микобактерий туберкулезного комплекса. Специфичность праймеров проверяли с помощью программного обеспечения, использующего поиск в базах нуклеотидных последовательностей по алгоритму BLAST (например, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).Primers for conducting multiplex PCR were chosen so that they flank the coding region of the Rv0678 gene, as well as segments of the atpE, 23S rRNA, rplC genes, where the most common mutations associated with the microorganism resistance to bedaquiline or linezolid are located. Using specialized software such as Oligo v. 6.3 (Molecular Biology Insights Inc., USA) or Fast PCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm) or other commercially available programs, or programs freely available on the Internet, were calculated the melting temperatures of the primers and, varying their length, ensured that the scatter in the annealing temperatures of the primers inside the set did not exceed 3-4 ° C. When selecting primers, sequences that were able to form secondary structures such as hairpins with high melting points, as well as sequences that form duplexes between themselves, consisting of more than three to five nucleotides, were avoided. Each selected primer must have unique specificity for the analyzed region of the sequence of the genome of mycobacterium tuberculosis complex. The specificity of the primers was checked using software that uses the search in the nucleotide sequence databases using the BLAST algorithm (for example, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Для обеспечения эффективной амплификации с одновременным введением флуоресцентной метки во все вышеперечисленные сегменты микобактериального генома в едином реакционном объеме использовали праймеры следующей конструкции. Последовательность каждого добавляемого в реакционную смесь праймера состояла из двух частей - 3'-специфичной, т.е. комплементарной последовательности фрагмента генома М. tuberculosis, и 5'-универсальной (адаптерной), различавшейся для прямых и обратных праймеров. Помимо таких праймеров, содержащих и специфические, и адаптерные последовательности, в реакционную смесь добавляли два праймера, последовательности которых комплементарны последовательностям адаптерной части составных праймеров (SEQ ID NO: 1, 2). Данные адаптерные праймеры присутствовали в реакционной смеси в различных концентрациях, с целью наработки преимущественно одноцепочечных фрагментов, последовательности которых комплементарны последовательностям олигонуклеотидов, иммобилизованных на биочипе.To ensure effective amplification with the simultaneous introduction of a fluorescent label in all of the above segments of the mycobacterial genome in a single reaction volume, primers of the following design were used. The sequence of each primer added to the reaction mixture consisted of two parts, 3'-specific, i.e. the complementary sequence of a fragment of the M. tuberculosis genome, and the 5'-universal (adapter), different for direct and reverse primers. In addition to such primers containing both specific and adapter sequences, two primers were added to the reaction mixture, the sequences of which are complementary to the sequences of the adapter portion of the composite primers (SEQ ID NO: 1, 2). These adapter primers were present in the reaction mixture in various concentrations in order to produce predominantly single-stranded fragments whose sequences are complementary to the sequences of oligonucleotides immobilized on a biochip.

Расчетные температуры плавления специфичных и адаптерных последовательностей выбирали равными 70°C и 55°C, соответственно, а профиль амплификации включал две стадии по 30 циклов каждая, с температурами отжига 64°C на первой, и 50°C на второй стадии.The calculated melting temperatures of specific and adapter sequences were chosen equal to 70 ° C and 55 ° C, respectively, and the amplification profile included two stages of 30 cycles each, with annealing temperatures of 64 ° C in the first and 50 ° C in the second stage.

Таким образом, в ходе ПЦР в едином реакционном объеме на первой стадии за счет гибридизации и элонгации составных праймеров при использовании геномной ДНК в качестве матрицы происходила наработка двуцепочечньгх ПЦР-продуктов, содержащих на концах последовательности, специфичные к адаптерным праймерам, а затем, в ходе второй стадии, полученные ПЦР-продукты служили матрицей для наработки одноцепочечных фрагментов при использовании адаптерных праймеров с меньшей температурой отжига (Zimenkov D.V., Kulagina E.V., Antonova O.V., Zhuravlev V.Y. and Gryadunov D.A. Simultaneous drug resistance detection and genotyping of Mycobacterium tuberculosis using a low-density hydrogel microarray. 2016. Journal of antimicrobial chemotherapy. 71(6): 1520-1531).Thus, in the course of PCR in a single reaction volume in the first stage due to hybridization and elongation of composite primers using genomic DNA as a template, double-stranded PCR products containing sequences specific to adapter primers at the ends were produced, and then, during the second stages obtained PCR products served as a matrix for producing single-stranded fragments using adapter primers with a lower annealing temperature (Zimenkov DV, Kulagina EV, Antonova OV, Zhuravlev VY and Gryadunov DA Simultaneous drug re sistance detection and genotyping of Mycobacterium tuberculosis using a low-density hydrogel microarray. 2016. Journal of antimicrobial chemotherapy. 71 (6): 1520-1531).

Флуоресцентное маркирование исследуемых фрагментов микобактериального генома проводили, добавляя в ПЦР-смесь флуоресцентный субстрат - конъюгат дезоксиуридинтрифосфата и красителя индодикарбоцианинового ряда, с длиной волны возбуждения, равной (640±5) нм и длиной волны флуоресценции, равной (665±5) нм. В ходе ПЦР данный субстрат встраивался Taq-ДНК-полимеразой в растущую цепь ДНК, обеспечивая на выходе флуоресцентно-меченные ПЦР-продукты, анализируемые далее посредством гибридизации на биочипе (Kuznetsova V.E., Spitsyn М.А., Shershov V.E., Guseinov Т.О., Fesenko E.E., Lapa S.A., Ikonnikova A.Y., Avdonina M.A., Nasedkina T.V., Zasedatelev A.S. and Chudinov A.V. Novel fluorescently labelled nucleotides: synthesis, spectral properties and application in polymerase chain reaction. 2016. Mendeleev Communications. 26(2): 95-98).The fluorescent labeling of the studied fragments of the mycobacterial genome was carried out by adding a fluorescent substrate, a conjugate of deoxyuridine triphosphate and dye of the indodicarbocyanine series, with an excitation wavelength of (640 ± 5) nm and a fluorescence wavelength of (665 ± 5) nm in the PCR mixture. During PCR, this substrate was inserted by Taq-DNA polymerase into the growing DNA strand, providing fluorescently-labeled PCR products that were further analyzed by biochip hybridization (Kuznetsova VE, Spitsyn MA, Shershov VE, Guseinov T.O. , Fesenko EE, Lapa SA, Ikonnikova AY, Avdonina MA, Nasedkina TV, Zasedatelev AS and Chudinov AV Novel fluorescently labelled nucleotides: synthesis, spectral properties and application in polymerase chain reaction. 2016. Mendeleev Communications. 26 (2): 95-98 )

Выбор дискриминирующих олигонуклеотидов осуществляли согласно двум различным алгоритмам в зависимости от анализируемой мишени. Для гена Rv0678, в котором в любом положении кодирующей области спонтанно возникают точечные мутации, делеций, инсерций, приводящие к резистентности к бедаквилину, конструировали олигонуклеотиды длиной 20 оснований каждый, соответствующие последовательности дикого типа, последовательно перекрывающие весь ген Rv0678 таким образом, что совпадение последовательности 5'-концевой части каждого следующего зонда составляет не менее 75% с последовательностью предыдущего (Фиг. 1). Такой набор олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 13-115) позволил определить наличие/отсутствие детерминант неустановленной локализации по всей длине гена с большей точностью, чем описанные ранее модели «рамочных» микрочипов (Volokhov DV, Chizhikov VE, Denkin S, Zhang Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. 2009. Methods in Molecular Biology. 465:395-41; Akama T, Suzuki K, Tanigawa K, Kawashima A, Wu H, Nakata N, Osana Y, Sakakibara Y, Ishii N. Whole-genome tiling array analysis of Mycobacterium leprae RNA reveals high expression of pseudogenes and noncoding regions. 2009. Journal of Bacteriology. 191(10):3321-7.), включая возможность идентификации сочетанных мутаций и смесей ДНК дикого типа и/или мутантных вариантов.The selection of discriminating oligonucleotides was carried out according to two different algorithms depending on the target being analyzed. For the Rv0678 gene, in which point mutations, deletions, insertions leading to resistance to bedaquiline spontaneously occur at any position of the coding region, oligonucleotides of 20 bases each were constructed, corresponding wild-type sequences sequentially overlapping the entire Rv0678 gene in such a way that sequence 5 matches The 'end part of each subsequent probe is at least 75% with the sequence of the previous one (Fig. 1). This set of oligonucleotides (SEQ ID NO: 13-115) made it possible to determine the presence / absence of determinants of undetermined localization along the entire length of the gene with greater accuracy than the previously described models of "frame" microarrays (Volokhov DV, Chizhikov VE, Denkin S, Zhang Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. 2009. Methods in Molecular Biology. 465: 395-41; Akama T, Suzuki K, Tanigawa K, Kawashima A, Wu H, Nakata N, Osana Y, Sakakibara Y, Ishii N. Whole-genome tiling array analysis of Mycobacterium leprae RNA reveals high expression of pseudogenes and noncoding regions. 2009. Journal of Bacteriology. 191 (10): 3321-7.), Including the possibility of identifying combined mutations and mixtures of wild DNA o type and / or mutant variants.

С целью идентификации генетических детерминант установленной локализации в генах atpE, 23S рРНК, rplC для каждой позиции, для которой известны мутации, конструировали набор специфичных дискриминирующих олигонуклеотидов, способный выявлять известные варианты замен. Последовательности зондов для иммобилизации на биочипе подбирали с учетом размера и сложности анализируемой последовательности и, в частности, наличия повторов и протяженных гомополимерных последовательностей. Определяли длину дискриминирующих олигонуклеотидов, обеспечивающую их специфичность в отношении анализируемой последовательности. Используя программное обеспечение, например Oligo v. 6.3 (Molecular Biology Insights Inc., США), рассчитывали температуры плавления олигонуклеотидов и, варьируя их длину, добивались того, чтобы разброс температур плавления олигонуклеотидов составлял не более 2-3°C. Избегали таких олигонуклеотидов, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления. Положение определяемых вариабельных нуклеотидов и других нуклеотидных перестроек выбирали по возможности не далее 1-4 нуклеотида от середины соответствующего дискриминирующего олигонуклеотида.In order to identify the genetic determinants of the established localization in the atpE, 23S rRNA, rplC genes, for each position for which mutations are known, a set of specific discriminating oligonucleotides was constructed that could detect known substitution variants. The sequences of probes for immobilization on a biochip were selected taking into account the size and complexity of the analyzed sequence and, in particular, the presence of repeats and extended homopolymer sequences. The length of discriminating oligonucleotides was determined to ensure their specificity with respect to the analyzed sequence. Using software such as Oligo v. 6.3 (Molecular Biology Insights Inc., USA), the melting points of the oligonucleotides were calculated and, varying their lengths, they ensured that the spread in the melting points of the oligonucleotides was no more than 2-3 ° C. Avoiding such oligonucleotides that are capable of forming secondary structures such as hairpins with high melting points. The position of the determined variable nucleotides and other nucleotide rearrangements was chosen, if possible, no further than 1-4 nucleotides from the middle of the corresponding discriminating oligonucleotide.

Дискриминирующие олигонуклеотиды иммобилизовали в гелевых элементах, которые наносились на подложку формата предметного стекла в виде капель диаметром от 50 до 100 мкм с периодом 50-100 мкм, без использования специальных приспособлений, например, кварцевых масок. В качестве материала подложки использовали полимеры (полипропилен, полиэтилен, полибутилентерефталат, полиметакрилат, поликарбонат, полистирол), либо стекло. Совместная полимеризация олигонуклеотидов с основными компонентами геля обеспечивалась за счет действия ультрафиолетового излучения. В результате этой реакции иммобилизуемые молекулы ковалентно присоединялись к мономерам растущей полимерной цепи и равномерно распределялись во всем объеме каждой гелевой ячейки (Rubina AY,

Figure 00000003
SV, Dementieva EI et al. Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production. 2004. Analytical Biochemistry. 325: 92-106).Discriminating oligonucleotides were immobilized in gel elements, which were applied to a glass slide format substrate in the form of droplets with a diameter of 50 to 100 μm with a period of 50-100 μm, without the use of special devices, for example, quartz masks. Polymers (polypropylene, polyethylene, polybutylene terephthalate, polymethacrylate, polycarbonate, polystyrene) or glass were used as the substrate material. Joint polymerization of oligonucleotides with the main components of the gel was ensured by the action of ultraviolet radiation. As a result of this reaction, immobilized molecules covalently attached to the monomers of the growing polymer chain and were uniformly distributed throughout the entire volume of each gel cell (Rubina AY,
Figure 00000003
SV, Dementieva EI et al. Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production. 2004. Analytical Biochemistry. 325: 92-106).

ПЦР-продукты, полученные на стадии ПЦР, гибридизовали на дифференцирующем биочипе с иммобилизованными олигонуклеотидами, комплементарными последовательностям изучаемых на предмет наличия мутаций генов. Гибридизацию проводили в растворе, содержащем буферный компонент для поддержания рН, соль для создания ионной силы и хаотропный (дестабилизирующий водородные связи) агент, в герметичной гибридизационной камере при температуре, зависящей от температуры плавления иммобилизованных на микрочипе дискриминирующих олигонуклеотидов. В качестве дестабилизирующего водородные связи агента использовали, например, гуанидин тиоцианат, мочевину или формамид. Выбор оптимальной температуры гибридизации проводили с учетом удобства практического применения системы. Дискриминирующие олигонуклеотиды, заявленные в настоящем изобретении, обладали температурой плавления в интервале от 42 до 44°C, что позволило проводить гибридизацию при 37°C с использованием хаотропного агента. Температура 37°C удобна тем, что большинство клинических лабораторий оснащены термостатами, поддерживающими эту температуру.PCR products obtained at the PCR stage were hybridized on a differentiating biochip with immobilized oligonucleotides complementary to the sequences studied for the presence of gene mutations. Hybridization was carried out in a solution containing a buffer component to maintain pH, a salt for creating ionic strength, and a chaotropic (destabilizing hydrogen bonds) agent in a sealed hybridization chamber at a temperature depending on the melting temperature of discriminating oligonucleotides immobilized on a microchip. As a hydrogen destabilizing agent, for example, guanidine thiocyanate, urea or formamide were used. The choice of the optimum hybridization temperature was carried out taking into account the convenience of practical application of the system. The discriminating oligonucleotides of the present invention had a melting point in the range of 42 to 44 ° C, which allowed hybridization at 37 ° C using a chaotropic agent. The temperature of 37 ° C is convenient because most clinical laboratories are equipped with thermostats that maintain this temperature.

Анализируемые фрагменты генов atpE, 23S рРНК, rplC образовывали совершенные гибридизационные дуплексы только с соответствующими (полностью комплементарными) олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами изучаемые фрагменты ДНК формировали несовершенный дуплекс. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов выполняли путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, в которых образовались дуплексы. Интенсивность сигнала в ячейке, в которой образовался совершенный гибридизационный дуплекс (Iсов) выше, чем в таковой, где образовался несовершенный дуплекс (Iнесов). Проведение гибридизации при оптимальных условиях (температура, подобранная концентрация хаотропного агента и ионная сила гибридизационного буфера) позволили добиться соотношения Iсов/Iнесов≥2 между двумя ячейками, содержащими зонды, принадлежащие одной группе, и различающиеся на один нуклеотид.The analyzed fragments of the atpE, 23S rRNA, rplC genes formed perfect hybridization duplexes only with the corresponding (fully complementary) oligonucleotides. With all other oligonucleotides, the studied DNA fragments formed an imperfect duplex. Discrimination of perfect and imperfect duplexes was performed by comparing the fluorescence intensities of the cells in which the duplexes formed. The signal intensity in the cell in which the perfect hybridization duplex (I owls ) was formed is higher than in that where the imperfect duplex (I non-waves ) was formed. Carrying out under optimal hybridization conditions (temperature, concentration of the chaotropic agent chosen and the ionic strength of the hybridization buffer) led to the relation cos I / I Nessov ≥2 between two cells containing probes, belonging to the same group and differ in one nucleotide.

В каждой из групп ячеек, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к одному из генов atpE, 23S рРНК, rplC, присутствовала ячейка, содержащая зонд дикого типа (обведена толстой линией на схеме размещения олигонуклеотидов, Фиг. 2) и ячейки, содержащие зонды на возможные мутации. Для каждой группы ячеек регистрировали максимальный сигнал, превосходящий остальные более чем в 2 раза (проверяли соотношение Iсов/Iнесов≥2). Если максимальный сигнал фиксировали в ячейке, соответствующей ДНК дикого типа (без мутаций, т.е., принадлежащей микроорганизму, чувствительному к лекарственному препарату), то считали, что по данной аминокислотной/нуклеотидной позиции (группе ячеек) изучаемый образец мутаций не имел. Если максимальный сигнал регистрировали в ячейке, соответствующей ДНК с мутацией (мутациями) (т.е., принадлежащей микроорганизму, устойчивому к лекарственному препарату), то считали, что по данной аминокислотной/нуклеотидной позиции (группе ячеек) изучаемый образец имел аминокислотную/нуклеотидную замену, приводящую к возникновению резистентности. Изучаемый образец ДНК признавали принадлежащим к чувствительному штамму микобактерий, если по каждой вариабельной аминокислотной/нуклеотидной позиции (группе ячеек) он был охарактеризован как относящийся к дикому типу. Изучаемый образец ДНК признавали принадлежащим к устойчивому штамму микобактерий, если, как минимум, по одной вариабельной аминокислотной/нуклеотидной позиции (группе ячеек) образец был охарактеризован как имеющий мутацию, приводящую к возникновению резистентности. Для таких образцов дополнительно выясняли тип препарата (бедаквилин/линезолид), к которому обнаружена устойчивость, установив группу, по которой образец отнесен к резистентному типу.In each of the groups of cells containing oligonucleotides specific to one of the atpE, 23S rRNA, rplC genes, there was a cell containing a wild-type probe (circled by a thick line in the oligonucleotide placement scheme, Fig. 2) and cells containing probes for possible mutations. For each group of cells was recorded maximum signal exceeding the remaining more than 2-fold (ratio checked cos I / I Nessov ≥2). If the maximum signal was fixed in a cell corresponding to wild-type DNA (without mutations, i.e., belonging to a drug-sensitive microorganism), then it was believed that the studied sample of mutations did not have a mutation at this amino acid / nucleotide position (group of cells). If the maximum signal was recorded in a cell corresponding to DNA with a mutation (mutations) (i.e., belonging to a drug-resistant microorganism), then it was considered that for a given amino acid / nucleotide position (group of cells) the studied sample had an amino acid / nucleotide change leading to resistance. The studied DNA sample was recognized as belonging to a sensitive strain of mycobacteria, if for each variable amino acid / nucleotide position (group of cells) it was characterized as belonging to the wild type. The studied DNA sample was recognized as belonging to a resistant strain of mycobacteria, if at least one variable amino acid / nucleotide position (group of cells), the sample was characterized as having a mutation leading to resistance. For such samples, the type of drug (bedaquiline / linezolid) to which resistance was detected was additionally clarified, establishing the group by which the sample was assigned to the resistant type.

Интенсивность сигналов ячеек с дуплексами, образованными в результате гибридизации ПЦР-продукта, содержащего полноразмерный фрагмент кодирующей области гена Rv0678, и иммобилизованными олигонуклеотидами 'O-15'-'O99' (Фиг. 2), перекрывающими последовательность данного локуса, зависела от степени гомологии прогибридизовавшихся последовательностей, вторичных структур гибридизуемого ПЦР-продукта и иммобилизованного зонда, концентрации исходной ДНК-матрицы. В общем случае, регистрировали гибридизационный профиль в виде набора интенсивностей сигналов ячеек с дуплексами, образовавшимися при гибридизации последовательности гена Rv0678 анализируемого образца. Для оценки наличия/отсутствия точечных мутаций, делеций, или инсерций в данном профиле, в каждой серии исследуемых образцов проводили анализ образца микобактериальной ДНК штамма дикого типа H37Rv посредством постановки мультиплексной ПЦР в отдельной пробирке и гибридизации на биочипе с получением эталонного гибридизационного профиля, соответствующего ДНК дикого типа. Выполняя нормировку сигналов каждого элемента эталонного профиля на соответствующий сигнал элемента в профиле анализируемого образца устанавливали наличие/отсутствие мутаций определенной локализации с точностью, в среднем, до 20 нуклеотидов. В то время как нормированный гибридизационный профиль образца ДНК с последовательностью дикого типа по гену Rv0678 представлял собой набор сигналов со значениями 1,5±0,25 (серые столбцы на Фиг. 3), наличие мутаций(и) в последовательности данного гена приводило к падению сигнала в 2,5 и более раза в соответствующих элементах нормированного профиля, формируя пики - выбросы (Фиг. 3), тем самым свидетельствуя о присутствии детерминант(ы) резистентности к бедаквилину в последовательности гена Rv0678 анализируемого образца ДНК.The signal intensity of cells with duplexes resulting from the hybridization of a PCR product containing a full-size fragment of the coding region of the Rv0678 gene and immobilized oligonucleotides O-15 '-' O99 '(Fig. 2), overlapping the sequence of this locus, depended on the degree of homology of the hybridized sequences, secondary structures of hybridizable PCR product and immobilized probe, the concentration of the original DNA matrix. In the general case, a hybridization profile was recorded in the form of a set of signal intensities of cells with duplexes formed during hybridization of the Rv0678 gene sequence of the analyzed sample. To assess the presence / absence of point mutations, deletions, or insertions in this profile, in each series of test samples, a mycobacterial DNA sample of the wild-type strain H37Rv was analyzed by multiplex PCR in a separate tube and hybridization on a biochip to obtain a reference hybridization profile corresponding to wild DNA type. By normalizing the signals of each element of the reference profile to the corresponding signal of the element in the profile of the analyzed sample, the presence / absence of mutations of a certain localization was determined with an accuracy of, on average, up to 20 nucleotides. While the normalized hybridization profile of a DNA sample with a wild-type sequence according to the Rv0678 gene was a set of signals with values of 1.5 ± 0.25 (gray bars in Fig. 3), the presence of mutations (s) in the sequence of this gene led to a drop signal 2.5 times or more in the corresponding elements of the normalized profile, forming peaks - outliers (Fig. 3), thereby indicating the presence of the determinants (s) of resistance to bedaquiline in the Rv0678 gene sequence of the analyzed DNA sample.

Данный алгоритм реализовывали в программном обеспечении анализатора флуоресценции биочипов, позволяющем проводить автоматическую регистрацию и интерпретацию результатов посредством захвата флуоресцентной картины гибридизации, вычисления сигнала в каждой ячейке, сравнения сигналов внутри групп и выдачи отчета об отсутствии/наличии детерминант резистентности к бедаквилину и/или линезолиду.This algorithm was implemented in the biochip fluorescence analyzer software, which allows automatic recording and interpretation of the results by capturing the fluorescence picture of hybridization, calculating the signal in each cell, comparing signals within the groups and reporting the absence / presence of determinants of resistance to bedaquiline and / or linezolid.

Полученные результаты могут быть использованы для включения бедаквилина и/или линезолида в режимы терапии туберкулеза конкретного пациента, мониторинга эффективности лечения и отмены данных препаратов в силу приобретения резистентности.The results can be used to include bedaquiline and / or linezolid in the treatment regimen of a particular patient’s tuberculosis, monitor the effectiveness of treatment and cancel these drugs due to the acquisition of resistance.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.The invention will now be illustrated by examples, which are intended to provide a better understanding of the essence of the claimed invention, but should not be construed as limiting the invention.

ПримерыExamples

Пример 1. Обработка клинического образца/изолята и выделение ДНК. Проведение мультиплексной ПЦР и гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации.Example 1. Treatment of a clinical sample / isolate and DNA isolation. Conducting multiplex PCR and hybridization on an oligonucleotide microchip. Registration and interpretation of hybridization results.

Обработка клинического образца и выделение ДНК.Clinical sample processing and DNA isolation.

1. Клинический респираторный образец (мокроту) смешивали в соотношении 1:1 по объему со свежеприготовленным 0,5% раствором N-ацетил-L-цистеина (NALC) в 2% NaOH. Образец тщательно перемешивали на вортексе и выдерживали при комнатной температуре в течение 20 мин. К образцу добавляли фосфатный буфер рН 6,8 в соотношении 1:5 по объему и центрифугировали в течение 30 мин при 3000 об/мин. При использовании спинномозговой жидкости проводили предварительное центрифугирование в течение 10 мин при 10000 об/мин.1. A clinical respiratory sample (sputum) was mixed in a 1: 1 ratio by volume with a freshly prepared 0.5% solution of N-acetyl-L-cysteine (NALC) in 2% NaOH. The sample was thoroughly mixed on a vortex and kept at room temperature for 20 minutes. A pH of 6.8 phosphate buffer was added to the sample in a ratio of 1: 5 by volume and centrifuged for 30 min at 3000 rpm. When using cerebrospinal fluid, preliminary centrifugation was performed for 10 min at 10,000 rpm.

2. Осадок клеток суспендировали в 1,5 мл ТЕ буфера (10 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА), рН 8,0, и осаждали при 3000 об/мин в течение 30 мин. Отмывку повторяли еще раз.2. Cell pellet was suspended in 1.5 ml of TE buffer (10 mM Tris-HC1, 1 mM EDTA), pH 8.0, and precipitated at 3000 rpm for 30 minutes. The washing was repeated once more.

3. К полученному осадку добавляли 30 мкл ТЕ буфера, рН 8,0, содержавшего 1% (об/об) Тритон Х-100, и выдерживали в сухом термостате при 95°C в течение 30 мин.3. To the resulting precipitate was added 30 μl of TE buffer, pH 8.0, containing 1% (v / v) Triton X-100, and kept in a dry thermostat at 95 ° C for 30 minutes.

4. Образец центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин4. The sample was centrifuged at 10,000 rpm for 10 min

5. Дальнейшую очистку ДНК проводили с использованием набора «ПРОБА-НК» (ООО «НПО «ДНК-Технология») согласно инструкции производителя. Полученный раствор ДНК в объем 50 мкл пригоден для проведения мультиплексной ПЦР.5. Further DNA purification was performed using the PROBA-NK kit (NPO DNA-Technology LLC) according to the manufacturer's instructions. The resulting DNA solution in a volume of 50 μl is suitable for multiplex PCR.

Обработка клинического изолята и выделение ДНК.Treatment of clinical isolate and DNA isolation.

Суспензию клеток клинического изолята, представляющего собой культуру, снятую с плотной или жидкой среды, промывали ТЕ-буфером (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8.0), осаждали центрифугированием при 10,000 g в течение 10 мин при 4°C и прогревали в ТЕ-буфере, содержавшем 1% Triton Х-100 при 95°C в течение 30 мин. Очистку микобактериальной ДНК из лизатов проводили с использованием набора «Проба-НК» («ДНК-Технология», Россия), либо на автоматизированной станции Freedom EVO® Clinical (Tecan Group Ltd., Германия).The cell suspension of the clinical isolate, which is a culture taken from a solid or liquid medium, was washed with TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0), precipitated by centrifugation at 10,000 g for 10 min at 4 ° C and warmed up in TE buffer containing 1% Triton X-100 at 95 ° C for 30 minutes Mycobacterial DNA was purified from lysates using the Proba-NK kit (DNA-Technology, Russia), or at the Freedom EVO® Clinical automated station (Tecan Group Ltd., Germany).

Проведение мультиплексной ПЦР.Carrying out multiplex PCR.

Для каждого анализируемого образца готовили стерильную пробирку вместимостью 0,2 мл для проведения ПЦР, маркируя их «N», где N - номер анализируемого образца. Добавляли одну пробирку 'K' для положительного контрольного образца.For each analyzed sample, a sterile tube with a capacity of 0.2 ml was prepared for PCR, labeling them with "N", where N is the number of the analyzed sample. One 'K' tube was added for a positive control.

Состав ПЦР-смеси в пробирках 'N' и 'К'The composition of the PCR mixture in test tubes 'N' and 'K'

- 1X ПЦР-буфер для HS Taq ДНК полимеразы (ЗАО «Евроген», Россия»);- 1X PCR buffer for HS Taq DNA polymerase (ZAO Evrogen, Russia ");

- 200 мкМ каждого dATP, dCTP, dGTP, dUTP (Евроген)- 200 μM each dATP, dCTP, dGTP, dUTP (Eurogen)

- 1 мкм флуоресцентного субстрата IMD515-dUTP (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Россия)- 1 μm of a fluorescent substrate IMD515-dUTP (LLC BIOCHIP-IMB, Russia)

- Смесь праймеров ПР. Последовательности праймеров и их концентрации в смеси представлены в Таблице 1.- A mixture of primers PR. The sequence of the primers and their concentration in the mixture are presented in Table 1.

- 5 ед. HS Taq ДНК полимеразы (ЗАО «Евроген», Россия»);- 5 units HS Taq DNA polymerase (ZAO Eurogen, Russia ");

В 30 мкл ПЦР-смесей вносили 3 мкл раствора ДНК, полученного в п. 5 процедуры обработки клинического образца и выделения ДНК. К 30 мкл ПЦР-смеси в пробирке 'K' добавляли 3 мкл раствора ДНК лабораторного штамма М. tuberculosis H37R.V.In 30 μl of PCR mixtures, 3 μl of the DNA solution obtained in step 5 of the clinical sample processing and DNA isolation procedure was added. To 30 μl of the PCR mixture in the 'K' tube, 3 μl of the DNA solution of the laboratory strain M. tuberculosis H37R.V. was added.

Figure 00000004
Figure 00000004

Figure 00000005
Figure 00000005

Мультиплексную ПЦР проводили на программируемом термостате S1000 (Bio-Rad, США) согласно температурному режиму, приведенному в Таблице 2.Multiplex PCR was performed on a S1000 programmable thermostat (Bio-Rad, USA) according to the temperature regime shown in Table 2.

Figure 00000006
Figure 00000006

Проведение гибридизации и отмывки на биочипе.Hybridization and washing on a biochip.

В пробирку объемом 0,5 мл вносили 10 мкл гибридизационного буфера (3М гуанидинтиоцианата, 150 мМ буфера HEPES рН 7,5, 15 мМ ЭДТА). Вносили 20 мкл реакционной смеси из пробирки 'N' после стадии ПЦР. Полученную смесь перемешивали на вортексе, капли собирали центрифугированием в течение 10 с при 1000 g.10 μl of hybridization buffer (3M guanidine thiocyanate, 150 mM HEPES pH 7.5, 15 mM EDTA) was added to a 0.5 ml tube. 20 μl of the reaction mixture was added from the 'N' tube after the PCR step. The resulting mixture was vortexed, drops were collected by centrifugation for 10 s at 1000 g.

30 мкл полученной гибридизационной смеси вносили в одно из отверстий реакционной камеры биочипа. Аналогичным образом проводили готовили гибридизационную смесь пробирки 'K' и вносили ее в камеру отдельного биочипа.30 μl of the obtained hybridization mixture was introduced into one of the openings of the biochip reaction chamber. In a similar manner, the hybridization mixture of the 'K' tube was prepared and introduced into the chamber of a separate biochip.

Гибридизацию проводили при 37°C в течение 6-12 часов. По окончании гибридизации биочип трижды промывали дистиллированной водой при 37°C, снимали гибридизационную камеру и высушивали биочип в потоке воздуха.Hybridization was carried out at 37 ° C for 6-12 hours. After hybridization, the biochip was washed three times with distilled water at 37 ° C, the hybridization chamber was removed and the biochip was dried in an air stream.

Регистрация и интерпретация результатов гибридизации.Registration and interpretation of hybridization results.

Регистрацию флуоресцентного изображения микрочипа выполняли на универсальном аппаратно-программном комплексе (УАПК) (ООО «БИОЧИП-ИМБ». Россия) для анализа биологических микрочипов с использованием специализированного программного обеспечения 'ImageWare®' (ООО «БИОЧИП-ИМБ»). Интерпретацию результатов проводили согласно приведенному выше алгоритму, реализованному в модуле программного обеспечения для анализа флуоресцентных изображений микрочипов 'Imageware®'.The fluorescence image of the microchip was recorded on a universal hardware-software complex (UAPK) (BIOCHIP-IMB LLC. Russia) for the analysis of biological microchips using the specialized ImageWare® software (BIOCHIP-IMB LLC). The interpretation of the results was carried out according to the above algorithm, implemented in the software module for the analysis of fluorescence images of microchips 'Imageware®'.

Пример 2. Олигонуклеотидный микрочип для идентификации генетических детерминант резистентности (точечных мутаций, инсерций, делеций) возбудителя туберкулеза к бедаквилину и линезолиду.Example 2. Oligonucleotide microchip for identification of genetic determinants of resistance (point mutations, insertions, deletions) of the tuberculosis pathogen to bedaquiline and linezolid.

Синтез олигонуклеотидов проводили на автоматическом синтезаторе ABI-394 DNA/RNA synthesizer («Applied Biosystems», США) с использованием стандартного фосфорамидитного метода и очищали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (комплекс «Gilson», Франция). Олигонуклеотиды для иммобилизации в элементах микрочипа содержали спейсер со свободной аминогруппой, введенной в процессе синтеза с использованием 5'-Amino-Modifier С6 («Glen Research», США).Oligonucleotides were synthesized using an ABI-394 DNA / RNA synthesizer (Applied Biosystems, USA) using the standard phosphoramidite method and purified by reverse phase HPLC (Gilson complex, France). The oligonucleotides for immobilization in the elements of the microchip contained a spacer with a free amino group introduced in the synthesis using 5'-Amino-Modifier C6 (Glen Research, USA).

Иммобилизацию олигонуклеотидов на подложке биочипа в формате предметного стекла проводили, как было описано ранее (

Figure 00000003
SV, Chechetkin VR, Somova OG, Antonova OV, Moiseeva OV, Prokopenko DV, Yurasov RA, Gryadunov DA, Chudinov AV. Kinetic effects on signal normalization in oligonucleotide microchips with labeled immobilized probes. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. 2009 27(2):235-44).The immobilization of oligonucleotides on a biochip substrate in the format of a slide was carried out as described previously (
Figure 00000003
SV, Chechetkin VR, Somova OG, Antonova OV, Moiseeva OV, Prokopenko DV, Yurasov RA, Gryadunov DA, Chudinov AV. Kinetic effects on signal normalization in oligonucleotide microchips with labeled immobilized probes. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. 2009 27 (2): 235-44).

Схема биочипа представлена на Фиг. 2. Биочип содержал 134 гелевых элемента, включая 128 ячейки с иммобилизованными олигонуклеотидами, 4 ячейки пустого геля с индексом '0', выполняющих роль отрицательного контроля и необходимых для вычисления фонового флуоресцентного сигнала и 2 ячейки с индексом «М», содержащие ковалентно связанный флуоресцентный краситель и использующиеся для автоматического вычисления интенсивности флуоресценции ячеек биочипа после гибридизации.A biochip diagram is shown in FIG. 2. The biochip contained 134 gel elements, including 128 cells with immobilized oligonucleotides, 4 cells of an empty gel with an index of '0', which act as a negative control and are necessary for calculating the background fluorescent signal and 2 cells with an index of 'M' containing a covalently bound fluorescent dye and used to automatically calculate the fluorescence intensity of the biochip cells after hybridization.

Биочип включал элементы с иммобилизованными зондами, в том числе:The biochip included elements with immobilized probes, including:

а) олигонуклеотиды 'Rv0678_c', 'O-15'-'O99' для выявления наличия/отсутствия точечных мутаций, инсерций, делеций неустановленной локализации в кодирующей области гена Rv0678, ассоциированных с резистентностью к бедаквилину, последовательно перекрывающие весь ген Rv0678 таким образом, что совпадение последовательности 5'-концевой части каждого следующего зонда составляло не менее 75% с последовательностью предыдущего (перекрытие на 75%);a) oligonucleotides 'Rv0678_c', 'O-15' - 'O99' to detect the presence / absence of point mutations, insertions, deletions of undetermined localization in the coding region of the Rv0678 gene associated with bedaquiline resistance, sequentially overlapping the entire Rv0678 gene in such a way that the coincidence of the sequence of the 5'-terminal part of each subsequent probe was at least 75% with the sequence of the previous one (overlap of 75%);

б) олигонуклеотиды для идентификации точечных мутаций определенной локализации в гене atpE (замены D28N/A/G, D32V, L59V, E61D/N, A63V/P, I66M), приводящих к резистентности к бедаквилину;b) oligonucleotides for the identification of point mutations of a specific localization in the atpE gene (substitutions D28N / A / G, D32V, L59V, E61D / N, A63V / P, I66M), leading to resistance to bedaquiline;

в) олигонуклеотиды для идентификации мутации в гене rplC (замена C154R в вариантах t460c/t460a+t462g), ассоциированной с резистентностью к линезолиду;c) oligonucleotides for identification of mutations in the rplC gene (C154R substitution in variants t460c / t460a + t462g) associated with resistance to linezolid;

г) олигонуклеотиды для идентификации мутаций в гене 23 S рРНК (замены g2294a, g2814t), приводящие к резистентности к линезолиду.d) oligonucleotides for the identification of mutations in the 23 S rRNA gene (substitutions g2294a, g2814t), leading to resistance to linezolid.

Ячейки, содержащие олигонуклеотиды для выявления мутаций в генах atpE, rplC, 23S рРНК объединены в группы, соответствующие вариабельным аминокислотным остаткам или нуклеотидам в регуляторных областях генов. В каждой из групп присутствует элемент, содержащий олигонуклеотид, способный формировать совершенный гибридизационный дуплекс с ДНК, не имеющей мутаций (т.е. с ДНК дикого типа (WT)), в позициях, соответствующих следующим аминокислотным остаткам или нуклеотидам в регуляторных областях генов (такие ячейки обведены толстой линией на Фиг. 2). Остальные ячейки в группе содержат зонды, специфичные к различным мутациям, приводящим к замене аминокислоты или нуклеотида. Такие зонды формируют несовершенные гибридизационные дуплексы с ДНК дикого типа.Cells containing oligonucleotides for detecting mutations in the atpE, rplC, 23S rRNA genes are combined into groups corresponding to variable amino acid residues or nucleotides in the regulatory regions of genes. In each of the groups, there is an element containing an oligonucleotide capable of forming a perfect hybridization duplex with DNA without mutations (i.e., wild-type (WT) DNA) at positions corresponding to the following amino acid residues or nucleotides in the regulatory regions of genes (such the cells are surrounded by a thick line in Fig. 2). The remaining cells in the group contain probes specific for various mutations leading to the replacement of an amino acid or nucleotide. Such probes form imperfect hybridization duplexes with wild-type DNA.

Перечень последовательностей олигонуклеотидов, иммобилизованных на биочипе, приведен в Таблице 3.The list of oligonucleotide sequences immobilized on a biochip is shown in Table 3.

Figure 00000007
Figure 00000007

Figure 00000008
Figure 00000008

Figure 00000009
Figure 00000009

Figure 00000010
Figure 00000010

Пример 3. Анализ клинического образца, содержащего штамм М. tuberculosis, чувствительный к бедаквилину и линезолиду.Example 3. Analysis of a clinical sample containing a strain of M. tuberculosis sensitive to bedaquiline and linezolid.

Клинический образец (мокрота), полученный от пациента, с подтвержденным микроскопией наличием кислотоустойчивых бактерий (БК+), был разделен на 2 части, одна из которых после деконтаминации (N-ацетил-L-цистеин и NaOH) и нейтрализации была передана для микробиологических исследований. Идентификацию микобактерий туберкулезного комплекса проводили по результатам биохимических тестов (Kent РТ, Kubica GP. Public health mycobacteriology. A guide for level III laboratory. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1985). Фенотипическую характеризацию изолята посредством определения минимальных ингибирующих концентраций, характеризующих устойчивость к бедаквилину и линезолиду, проводили в соответствии с опубликованными ранее протоколами (Torrea G, Coeck N, Desmaretz С, Van De Parre Т, Van Poucke T, Lounis N, de Jong ВС, Rigouts L. Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system. 2015. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70(8):2300-5; Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline-and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906). Значения критических концентраций по бедаквилину и линезолиду составили 0,06 мг/л и 1 мг/л, соответственно. Превышение данных значений свидетельствовало об резистентности изолята М. tuberculosis к данным противотуберкулезным препаратам. Вторую часть образца мокроты анализировали согласно изобретению, как описано в Примерах 1 и 2.A clinical specimen (sputum) obtained from a patient with microscopic evidence of acid-resistant bacteria (BK +) was divided into 2 parts, one of which, after decontamination (N-acetyl-L-cysteine and NaOH) and neutralization, was transferred for microbiological studies . Mycobacterium tuberculosis complex was identified by biochemical tests (Kent RT, Kubica GP. Public health mycobacteriology. A guide for level III laboratory. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1985). Phenotypic characterization of the isolate by determining the minimum inhibitory concentrations characterizing bedaquiline and linezolid resistance was carried out in accordance with previously published protocols (Torrea G, Coeck N, Desmaretz C, Van De Parre T, Van Poucke T, Lounis N, de Jong BC, Rigouts L. Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system. 2015. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (8): 2300-5; Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline-and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906). The critical concentrations for bedaquiline and linezolid were 0.06 mg / l and 1 mg / l, respectively. Exceeding these values testified to the resistance of M. tuberculosis isolate to these anti-TB drugs. The second part of the sputum sample was analyzed according to the invention, as described in Examples 1 and 2.

На Фиг. 4 представлен результат анализа ДНК, выделенной из данного клинического образца, и исследованной согласно изобретению.In FIG. 4 shows the result of analysis of DNA isolated from a given clinical sample and investigated according to the invention.

Согласно алгоритму обработки результатов гибридизации анализ групп ячеек с зондами, специфичными к детерминантам резистентности в генах atpE, rplC, 23S рРНК, показал, что в каждой группе совершенный гибридизационный дуплекс зарегистрирован в ячейке, соответствующей дикому типу. Значения сигналов элементов биочипа в нормированном гибридизационном профиле (Фиг. 3, серые столбцы) по гену Rv0678 составляли в среднем 1,5±0,25, что соответствует дикому типу. Методом секвенирования гена Rv0678 у данного штамма подтверждена последовательность дикого типа.According to the algorithm for processing hybridization results, the analysis of groups of cells with probes specific for resistance determinants in the atpE, rplC, 23S rRNA genes showed that in each group a perfect hybridization duplex was registered in the cell corresponding to the wild type. The signal values of the biochip elements in the normalized hybridization profile (Fig. 3, gray columns) for the Rv0678 gene averaged 1.5 ± 0.25, which corresponds to the wild type. The sequence of the wild-type was confirmed by sequencing of the Rv0678 gene in this strain.

Таким образом, ни в одном из исследуемых фрагментов генома М. tuberculosis мутации обнаружены не были. Значения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) по бедаквилину и линезолиду составили 0,03 мг/л и 0,25 мг/л, соответственно, что характеризовало данный изолят как фенотипически чувствительный. Таким образом, полученный результат на биочипе об отсутствии детерминант резистентности к бедаквилину и линезолиду совпал с микробиологическими данными.Thus, no mutations were detected in any of the studied fragments of the M. tuberculosis genome. The minimum inhibitory concentrations (MICs) for bedaquiline and linezolid were 0.03 mg / L and 0.25 mg / L, respectively, which characterized this isolate as phenotypically sensitive. Thus, the result obtained on a biochip about the absence of determinants of resistance to bedaquiline and linezolid coincided with microbiological data.

Пример 4. Анализ клинического образца, содержащего штамм М. tuberculosis, обладающий резистентностью к бедаквилину.Example 4. Analysis of a clinical sample containing a strain of M. tuberculosis, which is resistant to bedaquiline.

Клинический образец (экссудат), полученный от пациента, с подтвержденным микроскопией наличием кислотоустойчивых бактерий (БК+), был разделен на 2 части, одна из которых после деконтаминации (N-ацетил-L-цистеин и NaOH) и нейтрализации была передана для микробиологических исследований. Идентификацию микобактерий туберкулезного комплекса проводили по результатам биохимических тестов (Kent РТ, Kubica GP. Public health mycobacteriology. A guide for level III laboratory. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1985). Фенотипическую характеризацию изолята посредством определения минимальных ингибирующих концентраций, характеризующих устойчивость к бедаквилину и линезолиду, проводили в соответствии с опубликованными ранее протоколами (Torrea G, Coeck N, Desmaretz С, Van De Parre Т, Van Poucke T, Lounis N, de Jong ВС, Rigouts L. Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system. 2015. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70(8):2300-5; Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline-and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906). Значения критических концентраций по бедаквилину и линезолиду составили 0,06 мг/л и 1 мг/л, соответственно. Превышение данных значений свидетельствовало об резистентности изолята М. tuberculosis к данным противотуберкулезным препаратам. Вторую часть образца мокроты анализировали согласно изобретению, как описано в Примерах 1 и 2.A clinical sample (exudate) obtained from a patient with microscopic evidence of acid-resistant bacteria (BK +) was divided into 2 parts, one of which, after decontamination (N-acetyl-L-cysteine and NaOH) and neutralization, was transferred for microbiological studies . Mycobacterium tuberculosis complex was identified by biochemical tests (Kent RT, Kubica GP. Public health mycobacteriology. A guide for level III laboratory. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1985). Phenotypic characterization of the isolate by determining the minimum inhibitory concentrations characterizing bedaquiline and linezolid resistance was carried out in accordance with previously published protocols (Torrea G, Coeck N, Desmaretz C, Van De Parre T, Van Poucke T, Lounis N, de Jong BC, Rigouts L. Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system. 2015. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (8): 2300-5; Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline-and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906). The critical concentrations for bedaquiline and linezolid were 0.06 mg / l and 1 mg / l, respectively. Exceeding these values testified to the resistance of M. tuberculosis isolate to these anti-TB drugs. The second part of the sputum sample was analyzed according to the invention, as described in Examples 1 and 2.

На Фиг. 5 представлен результат анализа ДНК, выделенной из данного клинического образца, и исследованной согласно изобретению.In FIG. 5 shows the result of a DNA analysis isolated from a given clinical sample and investigated according to the invention.

Согласно алгоритму обработки результатов гибридизации анализ групп ячеек с зондами, специфичными к детерминантам резистентности в генах atpE, rplC, 23S рРНК, показал, что в каждой группе совершенный гибридизационный дуплекс зарегистрирован в ячейке, соответствующей дикому типу. В нормированном гибридизационном профиле (Фиг. 3, профиль

Figure 00000011
) по гену Rv0678 максимальное значение сигнала в элементе 'O9' составило 7,55, тем самым был выявлен пик в области 25-45 нуклеотида относительно старт-кодона, свидетельствующий о наличии мутации в данной области гена Rv0678. Методом секвенирования гена Rv0678 в данном штамме была выявлена делеция гуанина (g) в позиции 32 относительно старт-кодона.According to the algorithm for processing the results of hybridization, analysis of groups of cells with probes specific for resistance determinants in the atpE, rplC, 23S rRNA genes showed that in each group a perfect hybridization duplex was registered in a cell corresponding to the wild type. In the normalized hybridization profile (Fig. 3, profile
Figure 00000011
) for the Rv0678 gene, the maximum signal value in the 'O9' element was 7.55, thereby revealing a peak in the region of 25-45 nucleotides relative to the start codon, indicating the presence of a mutation in this region of the Rv0678 gene. A deletion of guanine (g) at position 32 relative to the start codon was detected by Rv0678 gene sequencing in this strain.

Микробиологический анализ показал, что минимальная ингибирующая концентрация данного изолята по бедаквилину составила 0,12 мг/л, превышая значение критической концентрации 0,06 мг/л, характеризующее устойчивое состояние штамма. Значение МИК изолята по линезолиду, равное 0,5 мг/л, соответствовало чувствительной форме. Таким образом, полученный на биочипе результат о наличии детерминанты резистентности к бедаквилину и дикому типу по линезолиду совпал с микробиологическими данными.Microbiological analysis showed that the minimum inhibitory concentration of this isolate for bedaquiline was 0.12 mg / L, exceeding the critical concentration of 0.06 mg / L, which characterizes the steady state of the strain. The value of the MIC of the isolate for linezolid, equal to 0.5 mg / l, corresponded to the sensitive form. Thus, the result obtained on the biochip about the presence of the determinants of resistance to bedaquiline and wild type according to linezolid coincided with microbiological data.

Пример 5. Анализ клинического образца, содержащего штамм М. tuberculosis, обладающий резистентностью к бедаквилину.Example 5. Analysis of a clinical sample containing a strain of M. tuberculosis, which is resistant to bedaquiline.

Клинический образец (смыв бронхов), полученный от пациента, с подтвержденным микроскопией наличием кислотоустойчивых бактерий (БК+), был разделен на 2 части, одна из которых после деконтаминации (N-ацетил-L-цистеин и NaOH) и нейтрализации была передана для микробиологических исследований. Идентификацию микобактерий туберкулезного комплекса проводили по результатам биохимических тестов (Kent РТ, Kubica GP. Public health mycobacteriology. A guide for level III laboratory. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1985). Фенотипическую характеризацию изолята посредством определения минимальных ингибирующих концентраций, характеризующих устойчивость к бедаквилину и линезолиду, проводили в соответствии с опубликованными ранее протоколами (Torrea G, Coeck N, Desmaretz С, Van De Parre Т, Van Poucke T, Lounis N, de Jong ВС, Rigouts L. Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system. 2015. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70(8):2300-5; Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline-and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906). Значения критических концентраций по бедаквилину и линезолиду составили 0,06 мг/л и 1 мг/л, соответственно. Превышение данных значений свидетельствовало об резистентности изолята М. tuberculosis к данным противотуберкулезным препаратам. Вторую часть образца мокроты анализировали согласно изобретению, как описано в Примерах 1 и 2.A clinical sample (bronchial flush) obtained from a patient with microscopic evidence of acid-resistant bacteria (BK +) was divided into 2 parts, one of which, after decontamination (N-acetyl-L-cysteine and NaOH) and neutralization, was transferred for microbiological research. Mycobacterium tuberculosis complex was identified by biochemical tests (Kent RT, Kubica GP. Public health mycobacteriology. A guide for level III laboratory. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1985). Phenotypic characterization of the isolate by determining the minimum inhibitory concentrations characterizing bedaquiline and linezolid resistance was carried out in accordance with previously published protocols (Torrea G, Coeck N, Desmaretz C, Van De Parre T, Van Poucke T, Lounis N, de Jong BC, Rigouts L. Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system. 2015. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (8): 2300-5; Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline-and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906). The critical concentrations for bedaquiline and linezolid were 0.06 mg / l and 1 mg / l, respectively. Exceeding these values testified to the resistance of M. tuberculosis isolate to these anti-TB drugs. The second part of the sputum sample was analyzed according to the invention, as described in Examples 1 and 2.

На Фиг. 6 представлен результат анализа ДНК, выделенной из данного клинического образца, и исследованной согласно изобретению.In FIG. 6 shows the result of analysis of DNA isolated from a given clinical sample and investigated according to the invention.

Согласно алгоритму обработки результатов гибридизации анализ групп ячеек с зондами, специфичными к детерминантам резистентности в генах atpE, rplC, 23S рРНК, показал, что в каждой группе совершенный гибридизационный дуплекс зарегистрирован в ячейке, соответствующей дикому типу. В нормированном гибридизационном профиле (Фиг. 3, профиль

Figure 00000012
) по гену Rv0678 максимальное значение сигнала в элементе 'O13' составило 3,1, тем самым был выявлен пик в области 40-60 нуклеотида относительно старт-кодона, свидетельствующий о наличии мутации в данной области гена Rv0678. Аналогичным образом были выявлены пики в областях 185-205 и 325-345 относительно старт-кодона, также свидетельствующие о наличии мутаций. Методом секвенирования гена Rv0678 в данном штамме были выявлены замены S53P, делеция гуанина (g) в позиции 198 и делеция цитозина (с) в позиции 336.According to the algorithm for processing the results of hybridization, analysis of groups of cells with probes specific for resistance determinants in the atpE, rplC, 23S rRNA genes showed that in each group a perfect hybridization duplex was registered in a cell corresponding to the wild type. In the normalized hybridization profile (Fig. 3, profile
Figure 00000012
) for the Rv0678 gene, the maximum signal value in the 'O13' element was 3.1, thereby a peak was detected in the region of 40-60 nucleotides relative to the start codon, indicating the presence of a mutation in this region of the Rv0678 gene. Similarly, peaks were detected in regions 185-205 and 325-345 relative to the start codon, also indicating the presence of mutations. By sequencing the Rv0678 gene in this strain, S53P substitutions, a guanine deletion (g) at position 198 and a cytosine deletion (c) at position 336 were detected.

Микробиологический анализ показал, что МИК данного изолята по бедаквилину составила 0,25 мг/л, превышая значение критической концентрации 0,06 мг/л, характеризующее устойчивое состояние штамма. Значение МИК изолята по линезолиду, равное 0,25 мг/л, соответствовало чувствительной форме. Таким образом, полученный на биочипе результат о наличии детерминант резистентности к бедаквилину и дикому типу по линезолиду совпал с микробиологическими данными.Microbiological analysis showed that the MIC of this isolate for bedaquiline was 0.25 mg / L, exceeding the critical concentration of 0.06 mg / L, which characterizes the steady state of the strain. The MIC value of the isolate for linezolid, equal to 0.25 mg / l, corresponded to the sensitive form. Thus, the result obtained on the biochip about the presence of the determinants of resistance to bedaquiline and wild type according to linezolid coincided with microbiological data.

Пример 6. Анализ клинического образца, содержащего штамм М. tuberculosis, обладающий резистентностью к бедаквилину.Example 6. Analysis of a clinical sample containing a strain of M. tuberculosis, which is resistant to bedaquiline.

Образец мокроты, полученный от пациента, с подтвержденным микроскопией наличием кислотоустойчивых бактерий (БК+), был разделен на 2 части, одна из которых после деконтаминации (N-ацетил-L-цистеин и NaOH) и нейтрализации была передана для микробиологических исследований. Идентификацию микобактерий туберкулезного комплекса проводили по результатам биохимических тестов (Kent РТ, Kubica GP. Public health mycobacteriology. A guide for level III laboratory. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1985). Фенотипическую характеризацию изолята посредством определения минимальных ингибирующих концентраций, характеризующих устойчивость к бедаквилину и линезолиду, проводили в соответствии с опубликованными ранее протоколами (Torrea G, Coeck N, Desmaretz С, Van De Parre Т, Van Poucke T, Lounis N, de Jong ВС, Rigouts L. Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system. 2015. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70(8):2300-5; Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline-and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906). Значения критических концентраций по бедаквилину и линезолиду составили 0,06 мг/л и 1 мг/л, соответственно. Превышение данных значений свидетельствовало об резистентности изолята М. tuberculosis к данным противотуберкулезным препаратам. Вторую часть образца мокроты анализировали согласно изобретению, как описано в Примерах 1 и 2.A sputum sample obtained from a patient with microscopic evidence of acid-resistant bacteria (BK +) was divided into 2 parts, one of which, after decontamination (N-acetyl-L-cysteine and NaOH) and neutralization, was transferred for microbiological studies. Mycobacterium tuberculosis complex was identified by biochemical tests (Kent RT, Kubica GP. Public health mycobacteriology. A guide for level III laboratory. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1985). Phenotypic characterization of the isolate by determining the minimum inhibitory concentrations characterizing bedaquiline and linezolid resistance was carried out in accordance with previously published protocols (Torrea G, Coeck N, Desmaretz C, Van De Parre T, Van Poucke T, Lounis N, de Jong BC, Rigouts L. Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system. 2015. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (8): 2300-5; Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline-and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906). The critical concentrations for bedaquiline and linezolid were 0.06 mg / l and 1 mg / l, respectively. Exceeding these values testified to the resistance of M. tuberculosis isolate to these anti-TB drugs. The second part of the sputum sample was analyzed according to the invention, as described in Examples 1 and 2.

На Фиг. 7 представлен результат анализа ДНК, выделенной из данного клинического образца, и исследованной согласно изобретению.In FIG. 7 shows the result of a DNA analysis isolated from a given clinical sample and investigated according to the invention.

Анализ групп ячеек с зондами, специфичными к детерминантам резистентности в генах atpE, rplC, 23S рРНК, показал, что в группе ячеек, соответствующих вариабельной аминокислоте 63 в гене atpE, совершенный гибридизационный дуплекс зарегистрирован в ячейке, соответствующей мутации A63V. Следовательно, ДНК штамма содержит мутацию, ассоциированную с резистентностью к бедаквилину. В группах ячеек с зондами, специфичными к детерминантам резистентности к линезолиду, совершенные гибридизационные дуплексы были зарегистрированы только в ячейках, соответствующих дикому типу.An analysis of cell groups with probes specific for resistance determinants in the atpE, rplC, 23S rRNA genes showed that in the group of cells corresponding to variable amino acid 63 in the atpE gene, perfect hybridization duplex was detected in the cell corresponding to the A63V mutation. Therefore, the DNA of the strain contains a mutation associated with resistance to bedaquiline. In groups of cells with probes specific for the determinants of linezolid resistance, perfect hybridization duplexes were recorded only in cells corresponding to the wild type.

В нормированном гибридизационном профиле (Фиг. 3, профиль по гену Rv0678 максимальное значение сигнала в элементе 'O7' составило 3,67, тем самым был выявлен пик в области 15-25 нуклеотида относительно старт-кодона, свидетельствующий о наличии мутации в данной области гена Rv0678. Аналогичным образом был выявлен пик в области 410-430 относительно старт-кодона, также свидетельствующий о наличии мутации. Методом секвенирования гена Rv0678 в данном штамме были выявлены замены M23L, инсерция гуанина (g) в позиции 419.In the normalized hybridization profile (Fig. 3, the profile according to the Rv0678 gene, the maximum signal value in the 'O7' element was 3.67, thereby a peak was detected in the region of 15-25 nucleotides relative to the start codon, indicating the presence of a mutation in this gene region Rv0678. Similarly, a peak was detected in the region 410-430 relative to the start codon, also indicating the presence of a mutation. M23L substitutions, insertion of guanine (g) at position 419 were detected by Rv0678 gene sequencing in this strain.

Микробиологический анализ показал, что МИК данного изолята по бедаквилину составила 1,0 мг/л, превышая значение критической концентрации 0,06 мг/л, характеризующее устойчивое состояние штамма. Значение МИК изолята по линезолиду, равное 0,25 мг/л, соответствовало чувствительной форме. Таким образом, полученный результат о наличии детерминант резистентности к бедаквилину и дикому типу по линезолиду совпал с микробиологическими данными.Microbiological analysis showed that the MIC of this isolate for bedaquiline was 1.0 mg / L, exceeding the critical concentration of 0.06 mg / L, which characterizes the steady state of the strain. The MIC value of the isolate for linezolid, equal to 0.25 mg / l, corresponded to the sensitive form. Thus, the result on the presence of the determinants of resistance to bedaquiline and wild type according to linezolid coincided with microbiological data.

Пример 7. Анализ клинического образца, содержащего штамм М. tuberculosis, обладающий резистентностью к бедаквилину и линезолиду.Example 7. Analysis of a clinical sample containing a strain of M. tuberculosis, which is resistant to bedaquiline and linezolid.

Образец промывных вод бронхов, полученный от пациента, с подтвержденным микроскопией наличием кислотоустойчивых бактерий (БК+), был разделен на 2 части, одна из которых после деконтаминации (N-ацетил-L-цистеин и NaOH) и нейтрализации была передана для микробиологических исследований. Идентификацию микобактерий туберкулезного комплекса проводили по результатам биохимических тестов (Kent РТ, Kubica GP. Public health mycobacteriology. A guide for level III laboratory. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1985). Фенотипическую характеризацию изолята посредством определения минимальных ингибирующих концентраций, характеризующих устойчивость к бедаквилину и линезолиду, проводили в соответствии с опубликованными ранее протоколами (Torrea G, Coeck N, Desmaretz С, Van De Parre Т, Van Poucke T, Lounis N, de Jong ВС, Rigouts L. Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system. 2015. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70(8):2300-5; Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline-and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906). Значения критических концентраций по бедаквилину и линезолиду составили 0,06 мг/л и 1 мг/л, соответственно. Превышение данных значений свидетельствовало об резистентности изолята М. tuberculosis к данным противотуберкулезным препаратам. Вторую часть образца мокроты анализировали согласно изобретению, как описано в Примерах 1 и 2.A sample of bronchial washings obtained from a patient with microscopic evidence of the presence of acid-resistant bacteria (BK +) was divided into 2 parts, one of which, after decontamination (N-acetyl-L-cysteine and NaOH) and neutralization, was transferred for microbiological studies. Mycobacterium tuberculosis complex was identified by biochemical tests (Kent RT, Kubica GP. Public health mycobacteriology. A guide for level III laboratory. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, 1985). Phenotypic characterization of the isolate by determining the minimum inhibitory concentrations characterizing bedaquiline and linezolid resistance was carried out in accordance with previously published protocols (Torrea G, Coeck N, Desmaretz C, Van De Parre T, Van Poucke T, Lounis N, de Jong BC, Rigouts L. Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system. 2015. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (8): 2300-5; Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline-and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906). The critical concentrations for bedaquiline and linezolid were 0.06 mg / l and 1 mg / l, respectively. Exceeding these values testified to the resistance of M. tuberculosis isolate to these anti-TB drugs. The second part of the sputum sample was analyzed according to the invention, as described in Examples 1 and 2.

На Фиг. 8 представлен результат анализа ДНК, выделенной из данного клинического образца, и исследованной согласно изобретению.In FIG. 8 shows the result of analysis of DNA isolated from a given clinical sample and investigated according to the invention.

Анализ групп ячеек с зондами, специфичными к детерминантам резистентности в генах atpE, rplC, 23S рРНК, показал, что в группе ячеек, соответствующих вариабельной позиции 460 в гене rplC, совершенный гибридизационный дуплекс зарегистрирован в ячейке, соответствующей мутации t460c (замена тимина на цитозин). Следовательно, ДНК штамма содержит мутацию, ассоциированную с резистентностью к линезолиду. В других группах ячеек с зондами, специфичными к детерминантам резистентности к бедаквилину или линезолиду, совершенные гибридизационные дуплексы были зарегистрированы только в ячейках, соответствующих дикому типу.Analysis of groups of cells with probes specific for resistance determinants in the atpE, rplC, 23S rRNA genes showed that in the group of cells corresponding to variable position 460 in the rplC gene, perfect hybridization duplex was detected in the cell corresponding to the t460c mutation (replacing thymine with cytosine) . Therefore, the DNA of the strain contains a mutation associated with resistance to linezolid. In other groups of cells with probes specific for the determinants of resistance to bedaquiline or linezolid, perfect hybridization duplexes were registered only in cells corresponding to the wild type.

В нормированном гибридизационном профиле (Фиг. 3, профиль

Figure 00000013
) по гену Rv0678 максимальное значение сигнала в элементе 'О30' составило 10,72, тем самым был выявлен пик в области 130-150 нуклеотида относительно старт-кодона, свидетельствующий о наличии мутации в данной области гена Rv0678. Методом секвенирования гена Rv0678 в данном штамме была выявлена инсерция гуанина (g) в позиции 139.In the normalized hybridization profile (Fig. 3, profile
Figure 00000013
) for the Rv0678 gene, the maximum signal value in the 'O30' element was 10.72, thereby revealing a peak in the region of 130-150 nucleotides relative to the start codon, indicating the presence of a mutation in this region of the Rv0678 gene. By sequencing the Rv0678 gene in this strain, the insertion of guanine (g) at position 139 was detected.

Микробиологический анализ показал, что МИК данного изолята по бедаквилину составила 0,12 мг/л, превышая значение критической концентрации 0,06 мг/л, характеризующее устойчивое состояние штамма. Значение МИК изолята по линезолиду составило 2 мг/л, превышая значение критической концентрации 1,0 мг/л, характеризующее устойчивое состояние штамма. Таким образом, полученный результат о наличии детерминант резистентности к бедаквилину и линезолиду совпал с микробиологическими данными.Microbiological analysis showed that the MIC of this isolate for bedaquiline was 0.12 mg / l, exceeding the critical concentration of 0.06 mg / l, which characterizes the steady state of the strain. The MIC value of the isolate for linezolid was 2 mg / L, exceeding the critical concentration of 1.0 mg / L, which characterizes the steady state of the strain. Thus, the result on the presence of the determinants of resistance to bedaquiline and linezolid coincided with microbiological data.

Пример 8. Анализ клинического изолята, содержащего штамм М. tuberculosis, обладающий резистентностью к линезолиду.Example 8. Analysis of a clinical isolate containing M. tuberculosis strain having resistance to linezolid.

Клинический изолят (культура клеток) был разделен на 2 части, одна из которых была использована для фенотипической характеризации штамма посредством определения минимальных ингибирующих концентраций, характеризующих устойчивость к бедаквилину и линезолиду (Torrea G, Coeck N, Desmaretz С, Van De Parre Т, Van Poucke T, Lounis N, de Jong ВС, Rigouts L. Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system. 2015. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70(8):2300-5; Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline- and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 2017. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906). Значения критических концентраций по бедаквилину и линезолиду составили 0,06 мг/л и 1 мг/л, соответственно. Превышение данных значений свидетельствовало об резистентности изолята М. tuberculosis к данным противотуберкулезным препаратам. Вторую часть клинического изолята анализировали согласно изобретению, как описано в Примерах 1 и 2.The clinical isolate (cell culture) was divided into 2 parts, one of which was used to phenotypically characterize the strain by determining the minimum inhibitory concentrations characterizing resistance to bedaquiline and linezolid (Torrea G, Coeck N, Desmaretz C, Van De Parre T, Van Poucke T, Lounis N, de Jong BC, Rigouts L. Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system. 2015. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (8): 2300-5; Zimenkov D, Nosova E, Kulagina E, Antonova O, Arslanbaeva L, Isakova A, Krylova L, Peretokina I, Makarova M, Safonova S, Borisov S, Gryadunov D. Examination of bedaquiline- and linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region. 20 17. Journal of antimicrobial chemotherapy. 72 (7): 1901-1906). The critical concentrations for bedaquiline and linezolid were 0.06 mg / l and 1 mg / l, respectively. Exceeding these values testified to the resistance of M. tuberculosis isolate to these anti-TB drugs. The second part of the clinical isolate was analyzed according to the invention, as described in Examples 1 and 2.

На Фиг. 9 представлен результат анализа ДНК, выделенной из данного клинического образца, и исследованной согласно изобретению.In FIG. 9 shows the result of analysis of DNA isolated from a given clinical sample and investigated according to the invention.

Анализ групп ячеек с зондами, специфичными к детерминантам резистентности в генах atpE, rplC, 23S рРНК, показал, что в группе ячеек, соответствующих вариабельной позиции 460 в гене rplC, совершенный гибридизационный дуплекс зарегистрирован в ячейке, соответствующей мутации t460c (замена тимина на цитозин). В группе элементов, соответствующих вариабельной позиции 2294 в гене 23S рРНК, совершенный гибридизационный дуплекс зарегистрирован в ячейке, соответствующей мутации g2294a (замена гуанина на аденин). Следовательно, ДНК штамма содержит мутации, ассоциированные с резистентностью к линезолиду. В других группе ячеек с зондами, специфичными к гену atpE, совершенные гибридизационные дуплексы были зарегистрированы только в ячейках, соответствующих дикому типу.Analysis of groups of cells with probes specific for resistance determinants in the atpE, rplC, 23S rRNA genes showed that in the group of cells corresponding to variable position 460 in the rplC gene, perfect hybridization duplex was detected in the cell corresponding to the t460c mutation (replacing thymine with cytosine) . In the group of elements corresponding to the variable position 2294 in the 23S rRNA gene, a perfect hybridization duplex is registered in the cell corresponding to the g2294a mutation (replacement of guanine by adenine). Therefore, the strain DNA contains mutations associated with linezolid resistance. In other groups of cells with probes specific for the atpE gene, perfect hybridization duplexes were registered only in cells corresponding to the wild type.

Значения сигналов элементов биочипа в нормированном гибридизационном профиле по гену Rv0678 составляли в среднем 1,3±0,4, что соответствует дикому типу. Методом секвенирования гена Rv0678 у данного штамма подтверждена последовательность дикого типа.The values of the signals of the biochip elements in the normalized hybridization profile for the Rv0678 gene averaged 1.3 ± 0.4, which corresponds to the wild type. The sequence of the wild-type was confirmed by sequencing of the Rv0678 gene in this strain.

Микробиологический анализ показал, что МИК данного изолята по бедаквилину составила 0,3 мг/л, характеризуя штамм как чувствительный. Значение МИК изолята по линезолиду составило 32 мг/л, превышая значение критической концентрации 1,0 мг/л, характеризующее устойчивое состояние штамма. Таким образом, полученный результат об отсутствии детерминант резистентности к бедаквилину и наличии мутаций, приводящих к резистентности к линезолиду, совпал с микробиологическими данными.Microbiological analysis showed that the MIC of this isolate for bedaquiline was 0.3 mg / L, characterizing the strain as sensitive. The MIC value of the isolate for linezolid was 32 mg / L, exceeding the critical concentration of 1.0 mg / L, which characterizes the steady state of the strain. Thus, the result of the absence of determinants of resistance to bedaquiline and the presence of mutations leading to resistance to linezolid coincided with microbiological data.

Таким образом, представленное изобретение позволяет в короткие сроки выявлять наличие/отсутствие детерминант резистентности М. tuberculosis к бедаквилину и линезолиду в клиническом материале, получаемом от больных туберкулезом. В силу высокой стоимости этих противотуберкулезных препаратов, выявления предсуществующей резистентности и формирования резистентности в процессе терапии полученные данные могут быть использованы для включения бедаквилина и/или линезолида в ГУ и V режимы терапии конкретного пациента, мониторинга эффективности лечения и отмены данных препаратов в случае формирования резистентности.Thus, the presented invention allows to quickly identify the presence / absence of determinants of M. tuberculosis resistance to bedaquiline and linezolid in the clinical material obtained from patients with tuberculosis. Due to the high cost of these anti-tuberculosis drugs, the identification of preexisting resistance and the formation of resistance during therapy, the data obtained can be used to include bedaquiline and / or linezolid in the GU and V modes of treatment for a particular patient, monitor the effectiveness of treatment and discontinue these drugs in case of resistance formation.

Хотя предпочтительные воплощения настоящего изобретения и их преимущества были подробно описаны выше, специалист в данной области сможет внести различные изменения, дополнения или, наоборот, что-то опустить, не выходя при этом за рамки данного изобретения, которые определяются прилагаемой ниже формулой изобретения.Although the preferred embodiments of the present invention and their advantages have been described in detail above, a person skilled in the art will be able to make various changes, additions, or, conversely, omit something, without going beyond the scope of this invention, which are defined by the appended claims.

Claims (10)

1. Способ определения генетических детерминант резистентности возбудителя туберкулеза к бедаквилину и линезолиду, включающий:1. A method for determining the genetic determinants of the resistance of the causative agent of tuberculosis to bedaquiline and linezolid, including: (а) мультиплексную амплификацию генов Rv0678, atpE, 23S рРНК, rplC с одновременным флуоресцентным маркированием при использовании геномной ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в качестве матрицы и набора праймеров, последовательности которых представлены SEQ ID NO: 1-12, с получением флуоресцентно-меченных фрагментов микобактериального генома;(a) multiplex amplification of the Rv0678, atpE, 23S rRNA, rplC genes with simultaneous fluorescence labeling using the genomic DNA of the mycobacterium tuberculosis complex as a template and a set of primers whose sequences are represented by SEQ ID NO: 1-12, to obtain fluorescently labeled fragments of mycobacterial genome; (б) обеспечение олигонуклеотидного микрочипа для установления наличия/отсутствия точечных мутаций, инсерций, делеций заранее неизвестной локализации в последовательности гена Rv0678, а также идентификации мутаций в генах atpE, 23S рРНК, rplC, ассоциированных с резистентностью к бедаквилину и линезолиду, представляющего собой подложку, содержащую множество дискретных элементов, в каждом из которых иммобилизован уникальный олигонуклеотидный зонд, имеющий последовательность, комплементарную последовательности одноцепочечного фрагмента, полученного на стадии (а), и выбранную из группы, включающей: а) соответствующие последовательности гена Rv0678 дикого типа таким образом, что совпадение последовательности 5'-концевой части каждого следующего зонда составляет не менее 75% с последовательностью предыдущего, при этом зонды длиной 20 нуклеотидов каждый полностью перекрывают последовательность кодирующей области гена Rv0678; б) соответствующие последовательности фрагмента гена atpE дикого типа; в) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена atpE, приводящего к резистентности микроорганизма к бедаквилину; г) соответствующие последовательности фрагмента гена rplC дикого типа; д) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена rplC, приводящего к резистентности микроорганизма к линезолиду; е) соответствующие последовательности фрагмента гена 23S рРНК дикого типа; ж) соответствующие последовательности фрагмента мутантного варианта гена 23S рРНК, приводящего к резистентности микроорганизмов к линезолиду; при этом последовательности иммобилизованных олигонуклеотидных зондов представлены SEQ ID NO: 13-140;(b) providing an oligonucleotide microchip for determining the presence / absence of point mutations, insertions, deletions of a previously unknown location in the Rv0678 gene sequence, as well as identifying mutations in the atpE, 23S rRNA, rplC genes associated with resistance to bedaquiline and linezolid, which is a substrate, containing many discrete elements, in each of which a unique oligonucleotide probe is immobilized, having a sequence complementary to the sequence of a single-stranded fragment, we obtain stage (a), and selected from the group including: a) the corresponding sequences of the wild-type Rv0678 gene in such a way that the sequence of the 5'-terminal part of each next probe matches at least 75% with the sequence of the previous one, while the probes are 20 the nucleotides each completely overlap the sequence of the coding region of the Rv0678 gene; b) the corresponding sequences of the wild-type atpE gene fragment; c) the corresponding sequence of the fragment of the mutant variant of the atpE gene, leading to the resistance of the microorganism to bedaquiline; g) the corresponding sequence of the fragment of the wild-type rplC gene; d) the corresponding sequence of the fragment of the mutant variant of the rplC gene, leading to the resistance of the microorganism to linezolid; e) the corresponding sequences of the 23S rRNA gene fragment of the wild type; g) the corresponding sequence of the fragment of the mutant variant of the 23S rRNA gene, leading to the resistance of microorganisms to linezolid; wherein the sequences of immobilized oligonucleotide probes are represented by SEQ ID NO: 13-140; (в) гибридизацию амплифицированных флуоресцентно-меченных продуктов, полученных на стадии (а), на олигонуклеотидном микрочипе с образованием дуплексов с иммобилизованными зондами в условиях, обеспечивающих разрешение в один нуклеотид между образующимися в результате гибридизации совершенными и несовершенными дуплексами;(c) hybridization of the amplified fluorescently-labeled products obtained in stage (a) on an oligonucleotide microchip with the formation of duplexes with immobilized probes under conditions providing a resolution of one nucleotide between perfect and imperfect duplexes formed as a result of hybridization; (г) регистрацию результатов гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе, проведенной на стадии (в), с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения, что позволяет использовать программную обработку интенсивностей сигналов с последующей интерпретацией результатов, которую проводят в два этапа: на первом этапе анализируют сигналы в группах элементов, содержащих зонды, соответствующие последовательностям генов atpE, 23S рРНК, rplC; на втором этапе анализируют гибридизационный профиль, включающий интенсивности сигналов элементов, содержащих зонды, соответствующие последовательности гена Rv0678.(d) recording the results of hybridization on an oligonucleotide microchip carried out in stage (c) using a fluorescence analyzer and software, which allows using software processing of signal intensities with subsequent interpretation of the results, which is carried out in two stages: at the first stage, the signals are analyzed in groups elements containing probes corresponding to the gene sequences of atpE, 23S rRNA, rplC; at the second stage, the hybridization profile is analyzed, including the signal intensities of elements containing probes corresponding to the sequence of the Rv0678 gene. 2. Способ по п. 1, в котором амплификацию фрагментов микобактериального генома проводят, используя образец ДНК, выделенный из мокроты, экссудата, бронхоальвеолярного лаважа или промывных вод бронхов, или образец ДНК, выделенный из клинического изолята микобактерий.2. The method according to claim 1, in which the amplification of fragments of the mycobacterial genome is carried out using a DNA sample isolated from sputum, exudate, bronchoalveolar lavage or bronchial lavage, or a DNA sample isolated from a clinical isolate of mycobacteria. 3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что на стадии (а) для флуоресцентного маркирования получаемых ПЦР-фрагментов используют флуоресцентно-меченный дезоксиуридинтрифосфат.3. The method according to p. 1, characterized in that at the stage (a) for fluorescent labeling of the obtained PCR fragments using fluorescently-labeled deoxyuridine triphosphate. 4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в каждой серии экспериментов на стадии (а) в отдельной пробирке проводят амплификацию и флуоресцентное маркирование образца микобактериальной ДНК штамма дикого типа H37Rv с последующей гибридизацией полученных флуоресцентно-меченных ПЦР-фрагментов на отдельном микрочипе на стадии (в) и регистрацией результатов гибридизации на стадии (г) с получением эталонного гибридизационного профиля, включающего интенсивности сигналов элементов, содержащих зонды, соответствующие последовательности гена Rv0678 дикого типа.4. The method according to p. 1, characterized in that in each series of experiments in stage (a) in a separate tube, amplification and fluorescence labeling of a sample of mycobacterial DNA of wild-type strain H37Rv is carried out, followed by hybridization of the obtained fluorescently-labeled PCR fragments on a separate microchip on stage (c) and recording the results of hybridization in stage (d) to obtain a reference hybridization profile, including signal intensities of elements containing probes corresponding to the sequence of the Rv067 gene 8 wild type. 5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что на стадии (г) на первом этапе интерпретации анализируют сигналы групп элементов, содержащих зонды, специфичные к одному из генов atpE, 23S рРНК, rplC, таким образом, что если максимальный сигнал в группе зарегистрирован в элементе, содержащем зонд дикого типа, то считают, что по данной аминокислотной/нуклеотидной позиции данного гена изучаемый образец ДНК возбудителя туберкулеза мутаций не имеет, в противном случае, если максимальный сигнал в группе зарегистрирован в элементе, содержащем зонд, последовательность которого соответствует мутантному варианту одного из генов, то считают, что по данной аминокислотной/нуклеотидной позиции данного гена изучаемый образец ДНК возбудителя туберкулеза имеет мутацию, приводящую к резистентности к бедаквилину или линезолиду.5. The method according to p. 1, characterized in that at stage (d) at the first stage of interpretation, the signals of groups of elements containing probes specific to one of the atpE, 23S rRNA, rplC genes are analyzed, so that if the maximum signal in the group If it is registered in an element containing a wild-type probe, then it is believed that, for a given amino acid / nucleotide position of this gene, the studied DNA sample of the tuberculosis pathogen does not have mutations, otherwise, if the maximum signal in the group is detected in the element containing the probe, the activity of which corresponds to the mutant variant of one of the genes, it is believed that, for a given amino acid / nucleotide position of this gene, the studied DNA sample of the tuberculosis pathogen has a mutation leading to resistance to bedaquiline or linezolid. 6. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что на стадии (г) на втором этапе интерпретации результатов эталонный гибридизационный профиль нормируют на гибридизационные профили анализируемых образцов ДНК с неизвестной последовательностью гена Rv0678 с получением нормированных профилей, различающихся для последовательностей ДНК дикого типа и мутантных вариантов гена Rv0678, тем самым относя последовательность гена Rv0678 к дикому типу, либо к содержащей точечную мутацию, делецию, инсерцию, приводящую к резистентности к бедаквилину.6. The method according to claim 4, characterized in that in step (d) in the second step of interpreting the results, the reference hybridization profile is normalized to the hybridization profiles of the analyzed DNA samples with an unknown Rv0678 gene sequence to obtain normalized profiles that differ for wild-type and mutant DNA sequences variants of the Rv0678 gene, thereby attributing the sequence of the Rv0678 gene to the wild type, or to containing a point mutation, deletion, insertion, leading to resistance to bedaquiline.
RU2017140462A 2017-11-21 2017-11-21 Method for determining genetic determinants of resistance of the pathogen of tuberculosis to bedaquiline and linezolid RU2677293C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017140462A RU2677293C1 (en) 2017-11-21 2017-11-21 Method for determining genetic determinants of resistance of the pathogen of tuberculosis to bedaquiline and linezolid

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017140462A RU2677293C1 (en) 2017-11-21 2017-11-21 Method for determining genetic determinants of resistance of the pathogen of tuberculosis to bedaquiline and linezolid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2677293C1 true RU2677293C1 (en) 2019-01-16

Family

ID=65025414

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017140462A RU2677293C1 (en) 2017-11-21 2017-11-21 Method for determining genetic determinants of resistance of the pathogen of tuberculosis to bedaquiline and linezolid

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2677293C1 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2562866C1 (en) * 2014-11-11 2015-09-10 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) Detection method of dna of tuberculosis causative agent with simultaneous identification of its genotype and determination of genetic determinants of multiple and wide drug resistance, oligonucleotide microchip, set of primers and set of oligonucleotide probes, which are used in method

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2562866C1 (en) * 2014-11-11 2015-09-10 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) Detection method of dna of tuberculosis causative agent with simultaneous identification of its genotype and determination of genetic determinants of multiple and wide drug resistance, oligonucleotide microchip, set of primers and set of oligonucleotide probes, which are used in method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDRIES K. et al. Acquired resistance of Mycobacterium tuberculosis to bedaquiline. PLoS One. 2014 Jul 10; 9(7): e102135. BECKERT P. et al. rplC T460C identified as a dominant mutation in linezolid-resistant Mycobacterium tuberculosisstrains. Antimicrob Agents Chemother. 2012 May; 56(5): 2743-5. Диагностика и лечение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя. Методические материалы к проведению цикла тематического усовершенствования врачей. - М.: Р.Валент, 2012, с.165. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Condos et al. Peripheral-blood-based PCR assay to identify patients with active pulmonary tuberculosis
Lewis et al. High-throughput whole-genome sequencing to dissect the epidemiology of Acinetobacter baumannii isolates from a hospital outbreak
Dean et al. Predicting phenotype and emerging strains among Chlamydia trachomatis infections
Zhang et al. Mycobacterium tuberculosis complex CRISPR genotyping: improving efficiency, throughput and discriminative power of ‘spoligotyping’with new spacers and a microbead-based hybridization assay
Seitz et al. Molecular epidemiology
Saravanan et al. Review on emergence of drug-resistant tuberculosis (MDR & XDR-TB) and its molecular diagnosis in Ethiopia
Tang et al. Comparison of protein A gene sequencing with pulsed-field gel electrophoresis and epidemiologic data for molecular typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
JP4590573B2 (en) Rapid identification of infection-causing bacteria
Hebb et al. Detection of novel organisms associated with salpingitis, by use of 16S rDNA polymerase chain reaction
RU2012140430A (en) METHODS FOR DIAGNOSTIC OF PATHOGENS CAUSING INFECTIOUS DISEASES AND THEIR MEDICINAL SENSITIVITY
Viscidi et al. Genetic diversity of Neisseria gonorrhoeae housekeeping genes
Lee et al. Clonal expansion of macrolide-resistant sequence type 3 Mycoplasma pneumoniae, South Korea
US20190002960A1 (en) Genetic testing for alignment-free predicting resistance of microorganisms against antimicrobial agents
Splettstoesser et al. Rapid differentiation of Francisella species and subspecies by fluorescent in situ hybridization targeting the 23S rRNA
RU2405836C2 (en) Method for mycobacterium tuberculosis beijing genotype detection
Pomares et al. Is real-time PCR targeting rep 529 suitable for diagnosis of toxoplasmosis in patients infected with non-type II strains in North America?
RU2677293C1 (en) Method for determining genetic determinants of resistance of the pathogen of tuberculosis to bedaquiline and linezolid
Gilling et al. The identification and differentiation between Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei using one gene pyrosequencing
Dilworth et al. Comparison of polymerase chain reaction for IS6110 and Amplicor in the diagnosis of tuberculosis.
Ravibalan et al. Characterization of katG and rpoB gene mutations in multi drug resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates
Goire et al. Protocol for the molecular detection of antibiotic resistance mechanisms in Neisseria gonorrhoeae
RU2636457C2 (en) Oligonucleotide biochip for identification of genetic determinant of neisseria gonorrhoeae resistance to antimicrobial preparations, set of oligonucleotides used for immobilisation on biochip
WO2019217333A1 (en) Methods and tools for determining clonal relatedness and predicting clonal traits
Samy et al. Genotyping of nosocomial methicillin resistant staphylococcus aureus with tracing the source of infection: a guideline step in infection control strategy at general surgery department of Tanta University Hospital
RU2790296C1 (en) METHOD FOR DETERMINING THE SUBLINES OF THE TUBERCULOSIS CAUSATIVE AGENT OF THE L2 beijing LINE ON BIOLOGICAL MICROCHIPS