RU2676926C1 - Фосфатмобилизующий штамм почвенных бактерий lelliottia nimipressuralis ccm 32-3 и биопрепарат на его основе для оптимизации минерального питания растений, стимуляции их роста и повышения урожайности - Google Patents

Фосфатмобилизующий штамм почвенных бактерий lelliottia nimipressuralis ccm 32-3 и биопрепарат на его основе для оптимизации минерального питания растений, стимуляции их роста и повышения урожайности Download PDF

Info

Publication number
RU2676926C1
RU2676926C1 RU2018100472A RU2018100472A RU2676926C1 RU 2676926 C1 RU2676926 C1 RU 2676926C1 RU 2018100472 A RU2018100472 A RU 2018100472A RU 2018100472 A RU2018100472 A RU 2018100472A RU 2676926 C1 RU2676926 C1 RU 2676926C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
nimipressuralis
strain
plants
ccm
lelliottia
Prior art date
Application number
RU2018100472A
Other languages
English (en)
Inventor
Людмила Александровна Чайковская
Татьяна Николаевна Мельничук
Ирина Алексеевна Каменева
Марина Ивановна Баранская
Ольга Леонидовна Овсиенко
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма" filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма"
Priority to RU2018100472A priority Critical patent/RU2676926C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2676926C1 publication Critical patent/RU2676926C1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штамм Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3 и биопрепарат на его основе. Указанный штамм депонирован в ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ В-12783. Биопрепарат на основе штамма почвенных бактерий Lelliottia nimipressuralis ВКПМ В-12783 представляет собой производственную культуру этого штамма. Группа изобретений позволяет улучшить минеральное питание растений и повысить урожайность сельскохозяйственных культур. 2 н.п. ф-лы, 4 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, биотехнологии, микробиологической промышленности и сельскому хозяйству, а именно к микробиологическим средствам оптимизации минерального питания растений путем предпосевной обработки семян эффективными ростстимулирующими и фосфатмобилизующими бактериями, способными приживаться в ризосфере растений.
Известно, что современное аграрное производство, ввиду интенсивного применения минеральных удобрений и ядохимикатов для защиты растений от вредителей и болезней, является одним из источников загрязнения окружающей среды. В связи с этим возникает проблема их частичной замены альтернативными приемами, основанными на природных процессах самовозобновления. Одним из таких экологически безопасных и ресурсосберегающих элементов функционирования и устойчивого развития агроэкосистем является введение в современные технологии выращивания сельскохозяйственных культур микробных препаратов: как удобрительных, так и для защиты растений (Завалин А.А., Кожемяков А.П. Новые технологии производства и применение биопрепаратов комплексного действия / СПб: ХИМ-ИЗДАТ, 2010, 64 с.; Тихонович И.А., Проворов Н.А. Сельскохозяйственная микробиология как основа экологически устойчивого агропроизводства: фундаментальные и прикладные аспекты / Сельскохозяйственная биология, №3, 2011, С. 3-9).
Наибольшее распространение в последнее время получили препараты, созданные на основе азотфиксирующих микроорганизмов. Однако необходимо помнить, что плодородие почв тесно связано с наличием в них фосфора. Поэтому одной из наиболее важных задач агррномической науки является разработка путей повышения доступности почвенного фосфора и улучшения минерального питания растений. Выходом из этой ситуации является создание и применение биологических препаратов на основе эффективных штаммов бактерий, обладающих способностью к ферментативному или метаболическому превращению труднорастворимых почвенных фосфатов в доступные для растений формы. В настоящее время применяют ряд препаратов, созданных на основе фосфатмобилизующих бактерий (Суховицкая Л.А. Фосфатмобилизующие микроорганизмы, их свойства и использование в практике сельского хозяйства / Актуальные проблемы плодородия почв в современных условиях: матер. 2-го съезда белорусского общества почвоведов. Минск, 2001, Книга 2, с. 288-290; Мучкин Е.В. Применение новых бактериальных препаратов в технологии выращивания столовой свеклы / Агроэкологическая эффективность применения средств химизации в современных технологиях возделывания сельскохозяйственных культур: матер. 39-ой межд. науч. конф.: М., 2005, с. 263-266; P. Jain, D.S. Khichi. Phosphate solubilizing microorganisms (PSM): an ecofriendly biofertilizer and pollution manager // J. of Dynamics in Agricultural Research. 2014, V. 1(4), p. 23-28).
Известен штамм почвенных бактерий Bacillus megaterium AP-1, улучшающий фосфорное питание растений за счет использования труднорастворимых фосфатов железа, что способствует повышению урожайности овощных культур. Штамм был выделен из кремнеземистого сапропеля в Белоруссии и депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика, коллекционный номер ВКПМ В-4440 (А.с. СССР №1645266 A1, C05F 11/08, C12N 1/20, опубл. 30.04.1991, бюл. №16).
Известен эффективный штамм почвенных фосфатрастворяющих бактерий Pseudomonas chlororaphis ssp chlororaphis Vsk-26a3, обладающий способностью подавлять фитопатогенные грибы и бактерии. Штамм Pseudomonas chlororaphis ssp chlororaphis Vsk-26a3 высвобождает фосфаты из нерастворимого минерального сырья, имеет широкий спектр действия против фитопатогенных грибов (подавляет 15 видов) и бактерий, а также стимулирует рост растений и повышает их урожайность. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-7427 (Патент РФ №2603281 C1, C12N 1/20, A01N 63/00, опубл. 27.11.2016, бюл. №33).
Известен эффективный штамм фосфатмобилизующих бактерий Bacillus subtilis 5-RK, который выделен из чернозема и депонирован в Депозитарии микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного, коллекционный номер В-7023. Штамм В. subtilis 5-RK характеризуется высокой активностью мобилизации фосфора из труднорастворимых неорганических и органических фосфатов (трикальцийфосфат, глицерофосфат, фитин), проявляет антагонистическую активность к фитопатогенным грибам и бактериям, стимулирует рост растений и повышает их урожайность (Патент Украины №54923A, C05F 11/08, C12N 1/20, опубл. 17.03.2003, бюл. «Промислова
Figure 00000001
» №3).
Недостаточная эффективность существующих микробных препаратов объясняется тем, что они созданы на основе микроорганизмов, обитающих в почвах средней климатической зоны, имеющих нейтральную или кислую реакцию почвенного раствора. Такие условия не способствуют приживаемости штаммов-биоагентов в ризосфере и, соответственно, функционированию растительно-микробных ассоциаций в почвах южных регионов России.
В основу изобретения поставлена задача получения штамма почвенных бактерий, адаптированного к почвенно-климатическим условиям юга России, способного эффективно трансформировать труднорастворимые соединения фосфора в легкоусвояемые для растений формы, стимулировать рост и развитие растений, а также создания биопрепарата на его основе, что обеспечит оптимизацию минерального питания, улучшение развития и повышение урожайности сельскохозяйственных культур.
Поставленная задача решена путем выделения из чернозема южного нового эффективного штамма Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3, полученного в отделе сельскохозяйственной микробиологи ФГБУН «НИИСХ Крыма». Выделенный из чернозема южного эффективный штамм Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3 используют для изготовления бактериального препарата, стимулирующего рост и повышающего урожайность сельскохозяйственных растений.
Новый штамм Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3 получен микробиологическим выделением фосфатмобилизующих бактерий из чернозема южного в соответствии с общепринятыми методиками (Метод, указания по выделению микроорганизмов, растворяющих труднодоступные минеральные и органические соединения фосфора. Под ред. Г.С. Муромцева, Л.: ВНИИСХМ, 1981, 20 с.).
Выделение и идентификация штамма по морфологическим и биохимическим свойствам проведена Чайковской Л.А. и Мельничук Т.Н. согласно определителей Берги (1984, 1997) и методических рекомендаций (Возняковская Ю.М., Попова Ж.П., 1985). Генетическая идентификация проведена в 2016 г. Хапчаевой С.А. в ФИЦ биотехнологии РАН: в качестве таксономических маркеров выбраны гены 16S рРНК и ген гиразы субъединицы Б gyrB, амплифицируемые с праймерами RD1 - FD1 (Weisburg et al., 1991) и UP1 - UP2r (Yamamoto et al., 1995), соответственно. На основании проведенного анализа штамм идентифицирован как Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3.
Депонирование Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3 осуществлено во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Национальный Биоресурсный Центр ВКПМ ФГБУ ГосНИИгенетика) под регистрационным номером ВКПМ: В-12783.
Биотехнологическая характеристика. Штамм Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3 трансформирует углеводы с образованием органических кислот. Отмеченные свойства штамма указывают на возможность трансформировать минеральные труднорастворимые фосфаты. Кроме того, L. nimipressuralis ССМ 32-3 обладает способностью к продуцированию фитогормонов. Ростстимулирующая активность штамма изучена Чайковской Л.А. и Баранской М.И. Активность синтеза фитогормонов (двусуточная культура на глюкозо-аспарагиновой среде) составляет: ИУК - 449 мкг/л, цитокинины (зеатин и зеатинрибозид) - 620 мкг/л, вещества гиббереллиновой природы - 18781 мкг/л.
Культурально-морфологические признаки. Клетки суточной культуры имеют палочковидную форму размером 1,6×0,9 мкм, грамнегативны, подвижны - латеральное прикрепление жгутиков, споры не образуют. При изучении ультратонкой структуры клеток установлено, что они имеют строение, характерное для грам(-) бактерий. По данным сканирующей электронной микроскопии на поверхности колоний выявлена мощная поверхностная пленка, сквозь которую просматриваются контуры клеток; их расположение в колониях хаотичное. Колонии клеток на плотных средах однотипные, мелкие, выпуклые, округлые, имеют ровный четкий контур, непрозрачные, 1,0-1,5 мм в диаметре, появляются на вторые сутки, цвет: желтовато-белый на глицериново-пептонном агаре и светло-бежевый на МПА. Штамм принадлежит к быстрорастущим бактериям. При росте на МПБ образует незначительный осадок; на картофельном ломтике - умеренный рост с образованием незначительного количества слизи, цвет штриха белесый, ломтик слегка побуревший; на среде с органическим источником азота (МПА) - рост хороший, на синтетической среде с минеральным азотом (Козера) - умеренный, менее интенсивный. Штамм L. nimipressuralis ССМ 32-3 не образует флюоресцирующих и феназиновых пигментов; способен к образованию протеолитического фермента желатиназы; амилолитические ферменты не выделяет - крахмал не гидролизирует; оксидазный тест положительный - выделяет каталазу; синтез уреазы отсутствует; органические кислоты, как единственный источник углерода, не использует; нитраты восстанавливает до нитритов -яркое проявление признака, реакция с реактивом Гриса позитивная, газообразование не выявлено. Штамм L. nimipressuralis ССМ 32-3 при использовании углеводов (глюкоза, сахароза, рамноза, лактоза) подкисляет среды с образованием пузырьков газа; имеет способность к бродильному характеру использования глюкозы - при постановке окислительно-восстановительного теста Хью-Лейфсона выявлено, что бактерии развиваются и подкисляют среду как в аэробных, так и в анаэробных (с разрывом столбика агара) условиях. Способен к хроматредукции. При росте на среде Эндо не образует индол, цвет колоний - светло-бежевый. Температурный интервал роста штамма на плотных и жидких средах составляет 15-37°С, отличия между ростом при 22°С и 37°С не выявлены. Рост бактерий наблюдается в диапазоне рН 5-8, оптимум рН - 7-7,5. Признаки штамма устойчивы. Он не является патогенным.
Культуру хранят на МПА с добавлением кукурузного экстракта или на гороховом агаре с добавлением сахарозы при температуре 4-5°С, пересев - один раз в 4 месяца.
Исследования, проведенные с целью изучения механизма действия штамма L. nimipressuralis ССМ 32-3, показали возможность продуцирования в процессе метаболизма органических кислот. При изучении физиолого-биохимических свойств штамма L. nimipressuralis ССМ 32-3 выявлено, что на средах, содержащих углеводы (глюкоза, сахароза, рамноза, лактоза), происходит подкисление среды. Таким образом, одним из аспектов механизма действия L. nimipressuralis ССМ 32-3 является способность к образованию в процессе метаболизма органических кислот, способствующих растворению труднорастворимых неорганических фосфатов и превращению их в доступные для растений формы.
Активность мобилизации штаммом 32-3 минеральных труднорастворимых фосфатов (ортофосфат кальция) в жидкой ГА среде исследована в условиях стерильных опытов. Способность штамма L. nimipressuralis ССМ 32-3 мобилизовать фосфор из труднорастворимых неорганических (Саз (POib) соединений подтверждается примером 1.
Пример 1. Готовили глюкозо-аспарагиновую (ГА) среду следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0, аспарагин - 1,0, K2SO4 - 0,2, Mg2SO4 - 0,2, кукурузный экстракт - 0,2, рН=6,5-7,0.
Источником фосфора служил Са3(PO4)2, который вносили в среду из расчета 5 г/л до стерилизации. Исследования проводили в условиях стерильных опытов в трехкратной повторности. Среду разливали по 100 мл в колбы Эрленмейера (объем 250 мл) и стерилизовали в течение 20 минут при 0,5 атм. Посевной материал приготавливали, выращивая бактерии в течение 24 часов в пробирках на агаризованной ГА среде. Готовили водную суспензию бактерий и вносили в колбы с жидкой ГА средой (смыв одного косяка на колбу). Котроль - среда ГА без инокуляции.
Бактерии L. nimipressuralis ССМ 32-3 культивировали в течение 3 суток при 28°С в периодических условиях на качалках (230 об/мин). После окончания культивирования опытные образцы центрифугировали в течение 10 минут при 6000 об/мин. Концентрацию растворимого фосфора (РО4)-3 в фугате культуральной жидкости определяли колориметрически с использованием молибденово-кислого аммония и аскорбиновой кислоты в качестве восстановителя. Содержание водорастворимого фосфора, накапливаемого штаммом 32-3, рассчитывали по разнице его концентрации в опытном (инокулированном) и контрольном (стерильном) вариантах.
Результаты исследований свидетельствуют о том, что L. nimipressuralis ССМ 32-3 активно мобилизует фосфаты из труднорастворимых неорганических (Са3(PO4)2) соединений. Выявлено, что в опытных образцах содержание растворимого фосфора колебалось в пределах 141-184 мг/л, а в контроле - 20,7-22,8 мг/л (таблица 1).
Figure 00000002
Расчет содержания растворимого фосфора, накапливаемого штаммом в течение 3 суток, показал, что его количество составляло 165,5 мг/л (среднее по трем вариантам), а при вычете показаний контроля - 143,7 мг/л. Таким образом установлено, что количество растворимого фосфора, освобожденного штаммом L. nimipressuralis ССМ 32-3 из Са3(PO4)2, составляло 143,7 мг/л.
На следующем этапе исследований проведена проверка способности L. nimipressuralis ССМ 32-Зк мобилизации труднорастворимых фосфатов в условиях вегетационных опытов (тест-культуры: соя и яровой ячмень).
Пример 2. Растения выращивали в сосудах объемом 1000 мл, субстрат - простерилизованный песок, единственный источник фосфора - Са3(PO4)2, внесенный в субстрат; подкормку растений осуществляли модифицированным раствором Прянишникова (без фосфата). Контроль - растения без инокуляции. В опытных вариантах проводили предпосевную инокуляцию семян бактериальной суспензией L. nimipressuralis ССМ 32-3. Продолжительность опыта 7 недель, повторность пятикратная.
Результаты изучения влияния штамма L. nimipressuralis ССМ 32-3 на рост, продуктивность и накопление минеральных фосфатов в фитомассе растений в условиях вегетационных опытов представлены в таблицах. Установлено, что инокуляция семян сои (расчетная доза инокулюма 1,6×104 бактерий/семя) положительно повлияла на рост и продуктивность растений. Так, их высота возросла на 17%; накопление сухой массы - на 14% (таблица 2). Свидетельством более энергичного усвоения фосфора труднорастворимых соединений является увеличение содержания Р2О5 в биомассе инокулированных растений: на 39% по сравнению с контролем.
Figure 00000003
Подобные результаты получены и при инокуляции семян ярового ячменя (расчетная доза инокулюма 2,0×103 бактерий/семя). Высота инокулированных растений увеличилась на 6%, масса побегов - на 9% против контроля (таблица 3). Предпосевная инокуляция семян положительно повлияла также и на накопление Р2О5 в побегах ячменя. Так, содержание Р2О5 возросло на 16% по сравнению с контролем.
Figure 00000004
Таким образом, предпосевная бактеризация семян способствует более энергичному усвоение фосфора из Са3(PO4)2 инокулированными растениями: содержание Р2О5 в побегах возросло (в зависимости от вида растений) на 16-39% по сравнению с контролем.
В дальнейших исследованиях, проведенных с целью раскрытия механизма действия бактерии L. nimipressuralis ССМ 32-3, показана ее способность в процессе метаболизма продуцировать фитогормоны. Количественное определение фитогормонов в культуральной жидкости штамма 32-3 проведено методом количественной спектроденситометрической тонкослойной хроматографии.
Пример 3. Для анализа использована нативная культуральная жидкость L. nimipressuralis ССМ 32-3. Культивирование образцов проводили на глюкозо-аспарагиновой среде в колбах (объем 300-350 мл) на качалках (220 об/мин) при температуре 28°С в течение 48 часов. В качестве инокулюма использована суточная маточная культура, которую выращивали на ГА среде в колбе с рабочим объемом 100 мл.
После окончания культивирования образцы центрифугировали (20 минут при 6000 об/мин). Экстракцию фитогормонов проводили в делительных воронках: трижды по 15 минут при энергичном встряхивании смеси КЖ и растворителя. Объединенные экстракты высушивали Na2SO4 (безводным), фильтровали, упаривали насухо и смывали 3 мл 70%-ного этанола. Для экстракции β-индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) из КЖ применяли диэтиловый эфир (1:1 по объему) при рН 3, подкисление проводили 2н HCl. Экстракцию гиббереллинов проводили этилацетатом (1:3 по объему) при рН 2,5, подкисление - 1н HCl; цитокининов - н-бутанолом (1:1 при рН 8), подщелачивание - 1н NaOH.
В дальнейшей работе в качестве экстрагента для освобождения физиологически активных веществ использовали 96%-й этанол. Кроме того, в этанольном экстракте при охлаждении осаждаются полисахариды. Грубый этанольный экстракт содержит большое количество сопутствующих веществ, поэтому проводили его предварительную очистку и концентрирование на пластинках с силикагелем марки Silufol UV254 ("Chemapol", Чехия).
Экспресс-очистка включала в себя следующие этапы:
1 - хроматография в хлороформе (вымывание пигментов и жиров со стартовой точки). Для нанесения образца использовали микропипетку с отогнутым носиком. Экстракт с помощью пипетки наносили на пластинку в виде полоски шириной 2-4 см и длиной 16-18 см. По верхнему краю пластинки с образцом оставляли 4-5 см свободного пространства. Во время разгонки экстракта в хлороформе в эту зону вымывались пигменты и другие вещества. После разгонки эту часть пластинки отрезали, оставляя полоску шириной 1 см над стартовой полосой, которая необходима для погружения в следующую систему растворителей;
2 - хроматография в растворе 12,5%-ного аммиака. Аммиак выводит из стартовой зоны физиологически активные вещества и концентрирует их в виде тонкой полоски над стартовой точкой. Место нанесения образца, как и на предыдущем этапе, отрезали, оставляя место для погружения пластинки в следующую систему растворителей;
3 - хроматография в системе растворителей: этилацетат - уксусная кислота (20:1) - для ауксинов и цитокининов, хлороформ - этилацетат - уксусная кислота (5:4:1) - для гиббереллинов. Зоны, совпадающие с Rf нанесенных стандартных растворов, счищали и элюировали. Элюат ИУК рехроматографировали на пластинках с окисью кремния ("Merck" №5715) в системе растворителей хлороформ - этилацетат - уксусная кислота (100:100:1), а элюатцитокининов - на пластинках с окисью алюминия ("Merck" №5713) в системе растворителей хлороформ - уксусная кислота (19:1). Количественное детектирование фитогормонов осуществляли с помощью сканирующего спектросенситометра "Camag TLC Scanner" (Швейцария).
Результаты проведенных исследований по выявлению и идентификации фитогормонов в культуральной жидкости L. nimipressuralis ССМ 32-3 приведены в табл. 4.
Figure 00000005
Установлено, что L. nimipressuralis ССМ 32-3 продуцирует ауксины, которые представлены ИУК, ее количество в культуральной жидкости составило 449 мкг/л. Кроме того, в культуральной жидкости L. nimipressuralis ССМ 32-3 выявлены и идентифицированы вещества, относящиеся к цитокининам. Показано, что они представлены как в виде свободных (зеатин), так и связанных соединений (зеатинрибозид). Количество зеатина в культуральной жидкости составило 254 мкг/л, зеатинрибозида - 366 мкг/л, а общее количество цитокининов - 620 мкг/л. Выявлена также способность L. nimipressuralis ССМ 32-3 к синтезу гиббереллинов: в культуральной жидкости обнаружены не идентифицированные вещества гиббереллиновой природы в достаточно высоких количествах - 18781 мкг/л.
На основе штамма бактерий L. nimipressuralis ССМ 32-3 создан биопрепарат, применение которого позволяет стимулировать рост сельскохозяйственных культур и повысить их урожайность, а также снизить дозы внесения минеральных удобрений при их выращивании.
Биопрепарат получают следующим образом.
Готовят агаризованную среду для выращивания штамма, а также жидкие питательные среды для маточной и производственной культуры бактерий следующих составов, (мас. %):
Figure 00000006
Проводят проверку питательных сред на наличие посторонней микрофлоры с помощью контрольного высева одной капли среды на МПА с углеводами и инкубации при 28-37°С в течение двух суток. В производственной питательной среде обеспечивают соответствие уровню рН 6,8-7,3.
Получают посевную нативную культуру путем выращивания штамма фосфатмобилизующих бактерий L. nimipressuralis ССМ 32-3 на агаризованной среде в пробирках двое суток в термостате при температуре 25-30°С.
Получают маточную культуру штамма фосфатмобилизующих бактерий L. nimipressuralis ССМ 32-3 после смыва двухсуточной культуры бактерий с агарового косяка в жидкую питательную среду для маточной культуры и выращивания трое суток в бутылях объемом три литра на качалке при оборотах 200-220 в минуту и температуре 27-30°С и достижения титра 15-24 млрд клеток в 1 мл.
Получают производственную культуру в ферментере путем инокуляции маточной культурой штамма L. nimipressuralis ССМ 32-3 в количестве 5-10% от общего объема производственной питательной среды и культивирования ее в течение двух-трех суток при температуре 27-30°С и 200-220 оборотах в минуту до титра 10-20 млрд клеток в 1 мл, обеспечивающего высокое качество и эффективность удобрительного биопрепарата.
Полученный удобрительный биопрепарат на основе штамма фосфатмобилизующих бактерий L. nimipressuralis ССМ 32-3 используется для предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур (злаковых, технических, овощных), корневой системы саженцев плодовых и рассады овощных растений для улучшения минерального питания, стимуляции их роста и повышения продуктивности. Хранят биопрепарат при температуре 10-15°С - до двух недель, а в холодильнике при 4-8°С (без замораживания) - до шести месяцев.
При обработке биопрепаратом на основе штамма Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3 получены следующие результаты.
В 2016 году в Республике Крым (Симферопольский район, село Маленькое, учебно-опытное поле Агропромышленного колледжа ФГАОУ ВО КФУ) была проведена предпосевная инокуляция семян озимой пшеницы сорта Находка биопрепаратом на основе штамма Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3. Посевы, выросшие из семян, обработанных данным удобрением, при уборке (2017 г.) показали урожайность 3,31 т/га. На участке, где были высеяны семена озимой пшеницы без инокуляции (контроль), зерновая продуктивность составила 2,63 т/га. Прибавка урожая составила 0,68 т/га (26%).
В 2017 году в Республике Крым (Симферопольский район, село Маленькое, учебно-опытное поле Агропромышленного колледжа ФГАОУ ВО КФУ) были проведены испытания биопрепарата на основе бактерии Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3 при выращивании томатов в условиях открытого и защищенного грунта. Установлено, что при использовании биопрепарата на основе почвенной бактерии Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3 (предпосевная обработка семян и корневой системы рассады) урожай томатов (сорт Шанс) по сравнению с контролем составил: открытый грунт - 16,8 т/га, контроль 15,0 т/га; защищенный грунт - 9,6 кг/м2, контроль - 8,5 кг/м2. Прибавка урожая по сравнению с контролем составила: открытый грунт - 1,8 т/га (12%), защищенный грунт - 1,1 кг/м2 (13%).
В 2014-2016 гг. в Республике Крым (Симферопольский район, село Маленькое, учебно-опытное поле Агропромышленного колледжа ФГАОУ ВО КФУ) были проведены испытания биопрепарата на основе бактерии Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3 при выращивании саженцев семечковых плодовых культур (яблоня). При использовании биопрепарата для обработки слаборослого подвоя М9 семечковых плодовых культур (яблони) увеличился выход стандартных саженцев (на 28%) по сравнению с контролем. Применение биопрепарата вызвало повышение приживаемости подвоев на 12%, улучшение роста корневой системы и развития слаборослого подвоя М9 на 18%, сохранность глазков после перезимовки увеличились на 24% по сравнению с контролем.
Приведенные примеры не отражают всего спектра возможностей положительного использования биопрепарата для повышения продуктивности и стимуляции роста сельскохозяйственных культур, однако наглядно показывают преимущества заявляемого препарата.
Таким образом, предлагаемый штамм почвенных бактерий Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3 обладает способностью продуцировать фитогормоны и трансформировать труднорастворимые минеральные фосфаты в усвояемые для растений формы, а биопрепарат на его основе позволяет оптимизировать минеральное питание растений, стимулировать их рост и повысить урожайность сельскохозяйственных культур.

Claims (2)

1. Фосфатмобилизующий штамм почвенных бактерий Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3, продуцент фитогормонов, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГБУ ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-12783, используемый для получения биопрепарата для оптимизации минерального питания растений, стимуляции их роста и повышения урожайности.
2. Биопрепарат для оптимизации минерального питания растений, стимуляции их роста и повышения урожайности на основе фосфатмобилизующего штамма почвенных бактерий Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3 ВПКМ В-12783.
RU2018100472A 2018-01-09 2018-01-09 Фосфатмобилизующий штамм почвенных бактерий lelliottia nimipressuralis ccm 32-3 и биопрепарат на его основе для оптимизации минерального питания растений, стимуляции их роста и повышения урожайности RU2676926C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018100472A RU2676926C1 (ru) 2018-01-09 2018-01-09 Фосфатмобилизующий штамм почвенных бактерий lelliottia nimipressuralis ccm 32-3 и биопрепарат на его основе для оптимизации минерального питания растений, стимуляции их роста и повышения урожайности

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018100472A RU2676926C1 (ru) 2018-01-09 2018-01-09 Фосфатмобилизующий штамм почвенных бактерий lelliottia nimipressuralis ccm 32-3 и биопрепарат на его основе для оптимизации минерального питания растений, стимуляции их роста и повышения урожайности

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2676926C1 true RU2676926C1 (ru) 2019-01-11

Family

ID=65025081

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018100472A RU2676926C1 (ru) 2018-01-09 2018-01-09 Фосфатмобилизующий штамм почвенных бактерий lelliottia nimipressuralis ccm 32-3 и биопрепарат на его основе для оптимизации минерального питания растений, стимуляции их роста и повышения урожайности

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2676926C1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2760750C1 (ru) * 2021-03-22 2021-11-30 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма" Способ выращивания озимой пшеницы в условиях южных регионов россии
RU2777194C1 (ru) * 2022-01-13 2022-08-01 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма" Комплексный биопрепарат для оптимизации минерального питания растений, защиты от фитопатогенов, повышения продуктивности и способ получения этого биопрепарата

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2121271C1 (ru) * 1997-04-02 1998-11-10 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Штамм бактерий pseudomonas lemoignei для получения препарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от грибных фитопатогенов в процессе вегетации и при хранении урожая
RU2130261C1 (ru) * 1997-09-30 1999-05-20 Дашкевич Вера Степановна Штамм бактерий pseudomonas species для получения препарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов
RU2451069C1 (ru) * 2010-10-27 2012-05-20 Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ) ФОСФАТРАСТВОРЯЮЩИЙ ШТАММ PSEUDOMONAS SPECIES 181a С ФУНГИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ
RU2603281C1 (ru) * 2015-12-09 2016-11-27 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) ФОСФАТРАСТВОРЯЮЩИЙ ШТАММ Pseudomonas chlororaphis ssp chlororaphis Vsk-26a3, ОБЛАДАЮЩИЙ ФУНГИЦИДНОЙ И БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2121271C1 (ru) * 1997-04-02 1998-11-10 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Штамм бактерий pseudomonas lemoignei для получения препарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от грибных фитопатогенов в процессе вегетации и при хранении урожая
RU2130261C1 (ru) * 1997-09-30 1999-05-20 Дашкевич Вера Степановна Штамм бактерий pseudomonas species для получения препарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов
RU2451069C1 (ru) * 2010-10-27 2012-05-20 Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ) ФОСФАТРАСТВОРЯЮЩИЙ ШТАММ PSEUDOMONAS SPECIES 181a С ФУНГИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ
RU2603281C1 (ru) * 2015-12-09 2016-11-27 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) ФОСФАТРАСТВОРЯЮЩИЙ ШТАММ Pseudomonas chlororaphis ssp chlororaphis Vsk-26a3, ОБЛАДАЮЩИЙ ФУНГИЦИДНОЙ И БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2760750C1 (ru) * 2021-03-22 2021-11-30 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма" Способ выращивания озимой пшеницы в условиях южных регионов россии
RU2777194C1 (ru) * 2022-01-13 2022-08-01 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма" Комплексный биопрепарат для оптимизации минерального питания растений, защиты от фитопатогенов, повышения продуктивности и способ получения этого биопрепарата

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Alvarez et al. Microalgae, soil and plants: A critical review of microalgae as renewable resources for agriculture
Sharma et al. Isolation of phosphate solubilizing microorganism (PSMs) from soil
Kumar et al. Isolation, screening and characterization of bacteria from Rhizospheric soils for different plant growth promotion (PGP) activities: an in vitro study
CN112410244B (zh) 一种阿氏芽孢杆菌及其应用
RU2626543C2 (ru) Штамм бактерий Paenibacillus mucilaginosus, способ стимуляции роста и защиты растений от болезней и применение штамма бактерий Paenibacillus mucilaginosus в качестве удобрения и агента биологического контроля (противопатогенного средства) в профилактике и/или лечении заболевания растений
HU230555B1 (hu) Környezetbarát mikroorganizmus-készítmény és annak előállítása
JP2017532062A (ja) 有用および機能性微生物を用いた微生物均質抽出物およびその製造方法
Chebotar’ et al. Antifungal and phytostimulating characteristics of Bacillus subtilis Ch-13 rhizospheric strain, producer of bioprepations
Kapoor et al. Gibberellins production by fluorescent Pseudomonas isolated from Rhizospheric soil of Malus and Pyrus
EP3659440B1 (en) Plant growth promoting microorganism and enzymes for soil biogenic cycles
El Kahkahi et al. Characterization of plant growth promoting rhizobacteria isolated from the rhizosphere of carob tree (Ceratonia siliqua L.) in Morocco
RU2676926C1 (ru) Фосфатмобилизующий штамм почвенных бактерий lelliottia nimipressuralis ccm 32-3 и биопрепарат на его основе для оптимизации минерального питания растений, стимуляции их роста и повышения урожайности
RU2415924C1 (ru) ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ Sinorhizobium fredii ВКМ В-2458D ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД СОЮ
Muhammad Syafiq et al. Effectiveness of Bioinoculants Bacillus cereus and Trichoderma asperellum as Oil Palm Seedlings Growth Promoters.
Ait-Kaki et al. In vitro and in vivo characterization of plant growth promoting Bacillus strains isolated from extreme environments of eastern Algeria
KR20190022967A (ko) 질소 고정능을 갖는 혼합 균주, 이를 포함하는 미생물 제제 및 이를 포함하는 생물 비료
Kolesnikov et al. Identification of the effectiveness of associative rhizobacteria in spring wheat cultivation
KR102508900B1 (ko) 식물 생장 촉진 및 식물병방제 활성 기능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 생장기 또는 결실기의 작물을 성장시키기 위한 미생물 배양배지
RU2764695C1 (ru) Штамм бактерий Bacillus subtilis subsp. subtilis - антагонист фитопатогенных микромицетов с ростостимулирующими свойствами и микробный препарат на его основе для повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и защиты их от грибных болезней
Firdous et al. Screening of cultivable endophytic bacterial isolates for their plant growth promoting activity in rice
Khastini et al. Potential contribution of dark-septate endophytic fungus isolated from pulau dua nature reserve, banten on growth promotion of chinese cabbage
Sundaram et al. Isolation and characterization of bacteria from rhizospheric soils of Curcuma longa for different plant growth promotion (PGPR) activities
Rasool et al. Isolation and characterization of Rhizobium spp. from a wild legume from BGSBU campus of District Rajouri, J & K
RU2654578C1 (ru) Штамм rhizobium leguminosarum ccm 32 (вкпм в-12661) - ризобиальный компонент микробного биопрепарата для предпосевной обработки гороха
Salunke et al. S K. Alkaline phosphatase production by Enterobacter hormaechei isolated from bird’s fecal waste and its optimization