RU2676674C1 - Method for identifying an effective cryoprotector by cytochemical index of the content of leukocyte alkaline phosphatase of autologous blood - Google Patents
Method for identifying an effective cryoprotector by cytochemical index of the content of leukocyte alkaline phosphatase of autologous blood Download PDFInfo
- Publication number
- RU2676674C1 RU2676674C1 RU2018102667A RU2018102667A RU2676674C1 RU 2676674 C1 RU2676674 C1 RU 2676674C1 RU 2018102667 A RU2018102667 A RU 2018102667A RU 2018102667 A RU2018102667 A RU 2018102667A RU 2676674 C1 RU2676674 C1 RU 2676674C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- laf
- tested
- cryoprotector
- effective
- blood
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 30
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 15
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 title claims abstract description 12
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims abstract description 15
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000006149 azo coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims abstract description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 13
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 13
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 11
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- -1 15% GMBTOEM Chemical compound 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003441 Transfusion reaction Diseases 0.000 description 1
- ZQBZAOZWBKABNC-UHFFFAOYSA-N [P].[Ca] Chemical compound [P].[Ca] ZQBZAOZWBKABNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 238000005461 lubrication Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно лабораторной диагностике, и может быть использовано для выявления эффективного криопротектора по цитохимическому показателю содержания лейкоцитарной щелочной фосфатазы (ЛЩФ*(* Лейкоцитарная щелочная фосфатаза - фермент, участвующий в транспорте фосфора через мембрану лейкоцитов и являющийся показателем фосфорно-кальциевого обмена. Уровень этого фермента в лейкоцитах служит доказательством патологического процесса в тканях организма при отсутствии симптомов или их смазанности.)) в аутокрови на доклиническом этапе трансфузионной терапии и предупреждения посттрансфузионных осложнений криопротекторного генеза. Для осуществления способа у пациента эксфузируют порцию свежей аутокрови, стабилизируют раствором цитрата натрия, делят на равные части, в контрольную пробу (КП) добавки криопротекторов не вносят, в опытные пробы (ОП) вносят по одной равной дозе тестируемых криопротекторов, перемешивают при плюс 37°C в течение 4 ч, капли приготовленных биологических жидкостей (ПБЖ) из ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла, делают мазки, готовят препараты для выявления ЛЩФ в с/я нейтрофилах по методике азосочетания Кеплоу**(** Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е.А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.; справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В.В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.), клетки микроскопируют в проходящем свете, проводят сравнительное исследование среднего цитохимического коэффициента (СЦК) ЩФ для с/я нейтрофилов в ОП и КП; тестируемый криопротектор оценивают как эффективный для конкретного пациента и пригодным к использованию (НКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, равных значениям СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как неэффективный для конкретного пациента и непригодный к использованию (НКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, отличных от таковых СЦК КП. Способ прост и доступен врачу по клинической лабораторной диагностике. Использование способа позволяет на доклиническом этапе трансфузионной терапии определить in vitro эффективность криопротектора и его пригодность в качестве добавки в рецепты криоконсервантов для живых клеток, исключающих посттрансфузионные осложнения криопротекторного генеза.The invention relates to medicine, namely laboratory diagnostics, and can be used to identify an effective cryoprotectant according to the cytochemical indicator of the content of leukocyte alkaline phosphatase (LSF * (* Leukocyte alkaline phosphatase - an enzyme involved in the transport of phosphorus through the membrane of leukocytes and which is an indicator of phosphorus-calcium metabolism The level of this enzyme in leukocytes is evidence of a pathological process in the tissues of the body in the absence of symptoms or their lubrication.)) preclinical transfusion therapy and prevention of post-transfusion complications cryoprotective genesis. To implement the method, a portion of fresh autologous blood is exfused in a patient, stabilized with sodium citrate solution, divided into equal parts, no cryoprotectants are added to the control sample (CP), one equal dose of the tested cryoprotectants is added to the experimental samples (OP), mixed at plus 37 ° C for 4 hours, drops of prepared biological fluids (PBF) from OD and KP are applied in a volume of 4 μl onto slides, smears are made, preparations are prepared for the detection of LSF in agricultural neutrophils using the Keplow azo coupling ** (** Reference for clinically laboratory laboratory research methods under the editorship of EA Kost. Moscow “Medicine”, 1975; reference book “Laboratory research methods in the clinic” under the editorship of Prof. V.V. Menshikov Moscow “Medicine” 1987), the cells are microscopic in transmitted light, conduct a comparative study of the average cytochemical coefficient (SCC) of alkaline phosphatase for s / I neutrophils in the OP and KP; the tested cryoprotectant is assessed as effective for a particular patient and suitable for use (NKI) for therapeutic purposes with SCC LSCH OP equal to SCC LSCHP KP; the tested cryoprotectant is evaluated as ineffective for a particular patient and unsuitable for use (NKI) for therapeutic purposes with SCS LSCH OP different from those of SCC KP. The method is simple and accessible to the doctor for clinical laboratory diagnostics. Using the method allows at the preclinical stage of transfusion therapy to determine in vitro the effectiveness of cryoprotectant and its suitability as an additive in cryopreservative recipes for living cells, excluding post-transfusion complications of cryoprotective genesis.
Уровень техники.The level of technology.
В современной клинической медицине посттрансфузионные реакции и осложнения рассматривают как один из универсальных механизмов патогенеза различных заболеваний, характеризующихся накоплением в тканях организма избытка токсических продуктов обмена веществ или клеточного реагирования, маркерами которых служат качественные и полуколичественные характеристики определенных цитохимических ферментативных реакций в лейкоцитах крови до и после смешивания с криопротекторами. Эти процессы могут развиваться сразу после внутривенных инъекций по типу яркой многосимптомной реакции, либо по типу скрытно и медленно развивающихся симптомов посттрансфузионных осложнений (Цитохимия замороженной клетки / Обозная Э.И., Пушкарь Н.С., Маркова О.П., Панков Е.Я. - Киев: Наук. Думка, 1981. - 176 с.). Поэтому возникает проблема раннего выявления признаков вредного влияния токсичных криопротекторов на организм и предупреждения посттрансфузионных осложнений протекторного генеза.In modern clinical medicine, post-transfusion reactions and complications are considered as one of the universal mechanisms of the pathogenesis of various diseases characterized by the accumulation in the body tissues of excess toxic metabolic products or cellular responses, the markers of which are qualitative and semi-quantitative characteristics of certain cytochemical enzymatic reactions in blood leukocytes before and after mixing with cryoprotectants. These processes can develop immediately after intravenous injection as a bright multisymptomatic reaction, or as secretively and slowly developing symptoms of post-transfusion complications (Cytochemistry of a frozen cell / Oboznaya E.I., Pushkar N.S., Markova O.P., Pankov E. I. - Kiev: Science.Dumka, 1981. - 176 p.). Therefore, the problem arises of early detection of signs of the harmful effects of toxic cryoprotectors on the body and the prevention of post-transfusion complications of the protective genesis.
Известные методы биологического и биохимического исследования сыворотки крови (определение концентрации молекул средней массы, продуктов перекисного окисления липидов, билирубина и т.д.) имеют ряд недостатков:Known methods of biological and biochemical studies of blood serum (determination of the concentration of medium-weight molecules, products of lipid peroxidation, bilirubin, etc.) have several disadvantages:
- необходимость вводить криопротектор или гемоконсервант на его основе в периферическую вену больного, то есть производить инвазивную манипуляцию, которая может быть сопряжена с техническими трудностями, осложнениями технического характера или непереносимостью субъектом лекарственного препарата;- the need to introduce a cryoprotectant or blood preservative based on it into the peripheral vein of the patient, that is, to perform invasive manipulation, which may be associated with technical difficulties, technical complications or intolerance by the subject of the drug;
необходимость использования лабораторных животных и специальной биохимической лаборатории, оснащенной сложным оборудованием и реактивами, что делает анализы не всегда доступными и дорогими как для лечебно-профилактических учреждений, так и для пациентов.the need to use laboratory animals and a special biochemical laboratory equipped with sophisticated equipment and reagents, which makes analyzes not always accessible and expensive for medical institutions and for patients.
Эти недостатки ограничивают количество и частоту необходимых исследований.These shortcomings limit the number and frequency of studies needed.
На основании предложенных в литературе лабораторных модификаций для оценки полноценности ядерных клеток крови на этапах низкотемпературного консервирования и прогнозирования предполагаемых результатов криогемотрансфузионной терапии широко используются технологии качественной и полуколичественной оценки цитохимических показателей активаторов жизненно важных клеточных ферментов в периферической крови пациентов.Based on laboratory modifications proposed in the literature, to assess the usefulness of nuclear blood cells at the stages of low-temperature preservation and to predict the expected results of cryohemotransfusion therapy, technologies for the qualitative and semi-quantitative assessment of the cytochemical parameters of activators of vital cell enzymes in the peripheral blood of patients are widely used.
Известен метод цитохимического обнаружения ЛЩФ для оценки нормальных и патологических процессов (Цитохимия костного мозга при криоконсервировании: Атлас / Обозная Э.И., Панков Е.Я.; Отв. Ред. А.М. Белоус; АН УССР. Ин-т пробл. Криобиологии и криомедицины. - Киев: Наук. Думка, 1989. - 256 с.).There is a known method for the cytochemical detection of LSF for the assessment of normal and pathological processes (Bone marrow cytochemistry during cryopreservation: Atlas / Oboznaya E.I., Pankov E.Ya .; Ed. Ed. A. Belous; Academy of Sciences of the Ukrainian SSR. Institute of Probl. Cryobiology and Cryomedicine. - Kiev: Science. Dumka, 1989. - 256 p.).
За прототип предлагаемого изобретения выбран способ, позволяющий выявить содержание ЛЩФ в высушенных мазках донорской крови (Архагов Ю.Ф. Изменение морфологии и функционально-метаболической активности лейкоцитов в процессе хранения донорской крови и под влиянием различных лучей: Автореф. дис.… канд. мед. наук. М., 2003. - 155 с.). Основным недостатком способа-прототипа является отсутствие сравнительных исследований СЦК лейкоцитов на ЛЩФ в мазках проб венозной крови, смешанных с 15% раствором гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (15% ГМБТОЭМ), 3,3% раствором Глицерола (3,3% Гл), 10% раствором диметилсульфоксида (10% ДМСО), гемоконсервантом Тромбокриодмац (ТКД) или гемоконсервантом на основе 55% раствора диметилацетамида (ДМАЦ) с 5% раствором гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) (55% ДМАЦ + 5% ГЭК), с таковыми значениями СЦК КП. Вместе с тем, определение эффективного криопротектора на этапе, предшествующем криогемотрансфузионной терапии, очень важен для больного, так как позволяет снизить риск посттрансфузионных осложнений криопротекторного генеза.For the prototype of the present invention, a method was selected that allows to detect the content of LSF in dried smears of donated blood (Arkhagov Yu.F. Changes in the morphology and functional and metabolic activity of leukocytes during storage of donated blood and under the influence of various rays: Author. Diss. ... cand. Honey. Sciences. M., 2003 .-- 155 p.). The main disadvantage of the prototype method is the lack of comparative studies of the CCS of leukocytes on LSF in smears of venous blood samples mixed with 15% solution of hexamethylenebistetraoxyethylurea (15% GMBTOEM), 3.3% Glycerol solution (3.3% Hl), 10% dimethyl sulfoxide solution ( 10% DMSO), a blood preservative Thrombocryodmac (TCD), or a blood preservative based on a 55% solution of dimethylacetamide (DMAC) with 5% hydroxyethyl starch (HES) solution (55% DMAC + 5% HES), with such values of CCK KP. At the same time, the determination of an effective cryoprotectant at the stage preceding cryohemotransfusion therapy is very important for the patient, as it reduces the risk of post-transfusion complications of cryoprotective genesis.
Целью изобретения является устранение отмеченного недостатка и создание такого способа, который бы позволял in vitro выявлять для конкретного больного эффективный криопротектор или гемоконсервант на его основе на этапе, предшествующем плановой трансфузии криоконсервированного компонента крови.The aim of the invention is to eliminate this drawback and create a method that would allow in vitro to identify for a particular patient an effective cryoprotectant or blood preservative based on it at the stage prior to the planned transfusion of the cryopreserved blood component.
Раскрытие изобретения.Disclosure of the invention.
Техническим результатом изобретения является доступность, простота выявления эффективного криопротектора на доклиническом этапе криогемотрансфузионной терапии.The technical result of the invention is the availability, ease of identifying an effective cryoprotectant at the preclinical stage of cryohemotransfusion therapy.
Технический результат в заявляемом способе выявления эффективного криопротектора по цитохимическим показателям содержания ЛЩФ аутокрови достигается тем, что, как и в способе-прототипе, анализ содержания ЛЩФ в с/я нейтрофилах осуществляют по методике азосочетания Кеплоу.The technical result in the claimed method for detecting an effective cryoprotectant by cytochemical indices of autologous LBF content is achieved by the fact that, as in the prototype method, the analysis of LBF content in agricultural neutrophils is carried out according to the Keplow azo coupling method.
Новым в способе является то, что определение эффективного криопротектора проводят путем сравнительных исследований СЦК ОП на ЛЩФ для 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Гл, 10% ДМСО, гемоконсерванта ТКД или комбинированного гемоконсервантом на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК, со значениями СЦК КП. При этом: тестируемый криопротектор оценивают как эффективный для конкретного пациента и пригодным к использованию (ПКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, равных значениям СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как неэффективный для конкретного пациента и непригодный к использованию (НКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, отличных от таковых СЦК КП.New in the method is that the determination of an effective cryoprotectant is carried out by comparative studies of the SCK OD on LSF for 15% HMBTOEM, 3.3% Hl, 10% DMSO, TKD blood preservative or combined blood preservative based on 55% DMAC and 5% HES, with values SCK KP. At the same time: the tested cryoprotectant is evaluated as effective for a particular patient and suitable for use (CRP) for therapeutic purposes with SCL BPF OP values equal to SCB LCF CP values; the tested cryoprotectant is evaluated as ineffective for a particular patient and unsuitable for use (NKI) for therapeutic purposes with SCS LSCH OP different from those of SCC KP.
Необходимое оборудование:Necessary equipment:
1. Система счетверенных контейнеров с интегрированным лейкоцитарным фильтром для получения лейкофильтрованных компонентов крови Leukotrap WB с пробоотборником для лабораторных исследований,1. Quad container system with integrated leukocyte filter for the production of Leukotrap WB leukofiltered blood components with a laboratory sampler,
2. Предметные стекла,2. Slides,
3. Пробирки для крови на 20 мл с винтовой герметичной пробкой.3. 20 ml blood tubes with screw tight stopper.
4. Световой микроскоп с проходящим светом,4. A light microscope with transmitted light,
5. Набор тест-доз различных криопротекторов или гемоконсервантов на их основе, разрешенных к клиническому применению МЗ России,5. A set of test doses of various cryoprotectants or blood preservatives based on them, approved for clinical use by the Ministry of Health of Russia,
6. Набор реагентов для цитохимического определения ЩФ в лейкоцитах. Заявляемый способ имеет основное преимущество в сравнении с прототипом -6. A set of reagents for the cytochemical determination of alkaline phosphatase in leukocytes. The inventive method has the main advantage in comparison with the prototype -
определение эффективного криопротектора реализуют путем сравнительных исследований значений СЦК ЛЩФ ОП аутологичной крови, смешанных с тест-дозами 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Гл, ТКД, 10% ДМСО или 55% ДМАЦ + 5% ГЭК, со значениями СЦК ЛЩФ КП.the determination of an effective cryoprotectant is carried out by comparative studies of autologous blood SCL BPHF OD values mixed with test doses of 15% HMBTOEM, 3.3% Hl, TKD, 10% DMSO or 55% DMAC + 5% HES, with the value of the SCH LCB KP.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом. У обследуемого натощак, до начала внутривенных трансфузий криоконсервированных компонентов крови (криогемотрансфузионной терапии) готовят в пробирках «линейку» из тест-доз с 15% ГМБТОЭМ; 3,3% Глицерола, гемоконсервантом ТКД, 10% ДМСО или комбинированным гемоконсервантом на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК по 1,5 мл в каждой; в пробоотборник эксфузируют 25 мл аутологичной венозной крови на стабилизирующем растворе цитрата натрия и фасуют с помощью дозаторной пипетки в 6 помеченных маркером пробирок по 4,0 мл в каждую; затем в пробирку №1 вносят 0,25 мл тест-дозы 15% ГМБТОЭМ, в пробирку №2 - 0,25 мл тест-дозы 3,3% Гл, в пробирку №3 - 0,25 мл тест-дозы ТКД, в пробирку №4 - 0,25 мл 10% ДМСО, в пробирку №5 - 0,25 мл гемоконсерванта на основе 55% ДМАЦ + 5% ГЭК, в пробирку №6 с КП аутокрови криопротектор не вносят; компоненты в пробирках №№1 - 6 герметизируют пробками, перемешивают на шейкере при температуре плюс 37°С в течение 4 ч; из каждой пробирки биопробы раскапывают с помощью дозаторной пипетки на чистые предметные стекла, готовят тонкие мазки, быстро высушивают, препарат на ЛЩФ готовят по методике азосочетания Кеплоу**(**Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е.А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.; справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В.В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.). Для выявления ЛЩФ используют комплект реагентов заводского приготовления, с/я нейтрофилы микроскопируют в проходящем свете, проводят сравнительное исследование СЦК ЛЩФ, выявленных в сегментоядерных нейтрофилах ОП и КП. О пригодности тестируемых криопротекторов к использованию в планируемых криогемотрансфузиях судят по соответствию значений СЦК ОП к величине СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как эффективный для конкретного пациента и пригодным к использованию (ПКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЩФ ОП, равных значениям СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как неэффективный для конкретного пациента и НКИ с лечебной целью при значениях СЦК ЩФ ОП, отличных от значений СЦК ЛЩФ КП. Способ прост и доступен врачу по клинической лабораторной диагностике современного онкогематологического центра. Использование способа позволяет выявить in vitro эффективный криопротектор на доклиническом этапе криогемотрансфузионной терапии и исключить внутривенную инфузию непригодного для конкретного больного криопротектора.The inventive method is as follows. In an examined patient on an empty stomach, before the start of intravenous transfusion of cryopreserved blood components (cryohemotransfusion therapy), a “line” of test doses with 15% HMBTOEM is prepared in test tubes; 3.3% Glycerol, a blood preservative TKD, 10% DMSO or a combined blood preservative based on 55% DMAC and 5% HES 1.5 ml each; 25 ml of autologous venous blood are exfused into the sampler in a stabilizing solution of sodium citrate and packed with a pipette into 6 4.0 ml labeled tubes in marker; then 0.25 ml of the test dose of 15% GMBTOEM is added to test tube No. 1, 0.25 ml of test dose 3.3% Hl to test tube No. 2, 0.25 ml of TCD test dose to test tube No. 3, tube No. 4 - 0.25 ml of 10% DMSO, 0.25 ml of a blood preservative based on 55% DMAC + 5% HES in the tube No. 5, do not introduce autologous blood into tube No. 6 with CP; components in tubes No. 1-6 are sealed with stoppers, mixed on a shaker at a temperature of plus 37 ° C for 4 hours; From each test tube, the biosamples are dug with a pipette onto clean slides, thin strokes are prepared, quickly dried, the preparation for LSF is prepared according to the Keplow azo coupling method ** (** Reference to clinical laboratory research methods edited by E.A. Kost. Moscow "Medicine" 1975; reference book "Laboratory research methods in the clinic" under the editorship of Prof. V.V. Menshikov Moscow "Medicine" 1987). To detect LBF, a set of factory-made reagents is used, s / I neutrophils are microscopic in transmitted light, a comparative study of the SCC of LBF detected in segmented neutrophils of OP and CP is carried out. The suitability of the tested cryoprotectants for use in the planned cryohemotransfusions is judged by the correspondence of the SCK OD values to the SCK LSHF KP value; the tested cryoprotectant is assessed as effective for a particular patient and suitable for use (CRP) for therapeutic purposes with SCC values of alkaline phosphatase OD equal to the values of SCC and alkaline phosphatase index; the tested cryoprotectant is assessed as ineffective for a particular patient and NKI for therapeutic purposes with SCC AHF OP values different from SCC AHF KP. The method is simple and accessible to the doctor for clinical laboratory diagnostics of the modern oncohematological center. Using the method allows to identify in vitro an effective cryoprotectant at the preclinical stage of cryohemotransfusion therapy and exclude intravenous infusion of a cryoprotectant unsuitable for a particular patient.
Необходимое оборудование: предметные стекла, пробирки для крови на 5 и 20 мл с винтовой герметичной пробкой, световой микроскоп с проходящим светом, набор тест-доз различных криопротекторов или гемоконсервантов на их основе, разрешенных к клиническому применению МЗ России, набор реагентов для цитохимического определения ЩФ в лейкоцитах in vitro диагностики производства РФ.Necessary equipment: glass slides, 5 and 20 ml blood tubes with a screw tight stopper, a light microscope with transmitted light, a set of test doses of various cryoprotectants or blood preservatives based on them, approved for clinical use by the Ministry of Health of Russia, a set of reagents for the cytochemical determination of alkaline phosphatase in leukocytes in vitro diagnostics of production of the Russian Federation.
В качестве иллюстрации работоспособности заявляемого способа выявления эффективного криопротектора по цитохимическому показателю содержания ЛЩФ в аутокрови приводим 3 примера (Табл. 1), которые подтверждают практическое применение данного способа.As an illustration of the health of the proposed method for identifying an effective cryoprotectant according to the cytochemical indicator of the content of LSF in autologous blood, we give 3 examples (Table 1) that confirm the practical application of this method.
Пример №1. Результаты исследования крови донора П-ва показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК (СЦК ОП с/я нейтрофилов составляет 1,28 против 1,28 в КП. Заключение: ПКИ является комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК, а НКИ являются 3,3% Глицерол, 15% ГМБТОЭМ, ТКД или 10% ДМСО, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.Example No. 1. Blood donor results from the donor Peninsula show that of the investigated test doses of cryoprotectants, the combined cryoprotector based on 55% DMAC and 5% HES is optimal (the SCK OD of neutrophils is 1.28 versus 1.28 in CP. Conclusion: PKI is a combined cryoprotectant based on 55% DMAC and 5% HES, and NKI are 3.3% Glycerol, 15% GMBTOEM, TKD or 10% DMSO, which carry risks of post-transfusion complications.
Пример №2. Результаты исследования крови донора Н-н показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является комбинированный криопротектор, содержащий 55% ДМАЦ + 5% ГЭК у которого СЦК ОП с/я нейтрофилов составляет 1,26, в ОП - также 1,26. Заключение: ПКИ является криопротектор на основе 55% ДМАЦ + 5% ГЭК, а НКИ являются 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Глицерол, ТКД и 10% ДМСО, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.Example No. 2. The results of a blood test of a donor Nn show that among the investigated test doses of cryoprotectants, the combined cryoprotector containing 55% DMAC + 5% HES in which the SCK OD of neutrophils is 1.26 is optimal, and also 1.26 in the OD . Conclusion: PKI is a cryoprotectant based on 55% DMAC + 5% HES, and NKI are 15% GMBTOEM, 3.3% Glycerol, TKD and 10% DMSO, which carry risks of post-transfusion complications.
Пример №3. Результаты исследования крови донора С-ва показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК (СЦК с/я нейтрофилов в ОП составляет 1,29 против 1,29 в КП). Заключение: ПКИ является криопротектор комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК, а НКИ являются 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Глицерол, ТКД, 10%) ДМСО, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.Example No. 3. The results of a blood donation of donor C-va show that of the studied test doses of cryoprotectors, the combined cryoprotector based on 55% DMAC and 5% HES is optimal (the SCC of s / I neutrophils in the OP is 1.29 versus 1.29 in the CP). Conclusion: PKI is a cryoprotectant combined cryoprotectant based on 55% DMAC and 5% HES, and NKI are 15% GMBTOEM, 3.3% Glycerol, TKD, 10%) DMSO, which carry risks of post-transfusion complications.
Представленные примеры иллюстрируют применимость предлагаемого способа выявления эффективного криопротектора по содержанию щелочной фосфатазы в лейкоцитах консервированной крови. Способ дешев и может быть внедрен в практику медицинских центров, использующих трансфузии криоконсервированных компонентов крови или костного мозга.The presented examples illustrate the applicability of the proposed method for identifying an effective cryoprotectant for the content of alkaline phosphatase in canned white blood cells. The method is cheap and can be implemented in the practice of medical centers using transfusions of cryopreserved blood or bone marrow components.
Таким образом, благодаря использованию более чувствительного способа выявления эффективного криопротектора по содержанию ЩФ в лейкоцитах консервированной крови удается снизить риски планируемой криогемотрансфузионной терапии криопротекторного генеза.Thus, by using a more sensitive method for identifying an effective cryoprotectant by the content of alkaline phosphatase in canned blood leukocytes, it is possible to reduce the risks of the planned cryohemotransfusion therapy of cryoprotective genesis.
Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников патентной и научно-технической литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и известных способов с существенными признаками предлагаемого технического решения. Техническим результатом использования является возможность проведения индивидуального скрининга криопротекторов на доклиническом этапе их применения.The present invention meets the criteria of "novelty" and "inventive step", as the patent information research did not identify sources of patent and scientific literature that would discredit the novelty of the proposed method, as well as known methods with significant features of the proposed technical solution. The technical result of the use is the ability to conduct individual screening of cryoprotectants at the preclinical stage of their use.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018102667A RU2676674C1 (en) | 2018-01-23 | 2018-01-23 | Method for identifying an effective cryoprotector by cytochemical index of the content of leukocyte alkaline phosphatase of autologous blood |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018102667A RU2676674C1 (en) | 2018-01-23 | 2018-01-23 | Method for identifying an effective cryoprotector by cytochemical index of the content of leukocyte alkaline phosphatase of autologous blood |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2676674C1 true RU2676674C1 (en) | 2019-01-10 |
Family
ID=64958636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018102667A RU2676674C1 (en) | 2018-01-23 | 2018-01-23 | Method for identifying an effective cryoprotector by cytochemical index of the content of leukocyte alkaline phosphatase of autologous blood |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2676674C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5843799A (en) * | 1981-09-10 | 1983-03-14 | Mamoru Sugiura | Reagent for fractionation and determination of alkaline phosphatase |
| RU2477953C1 (en) * | 2012-03-12 | 2013-03-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Combined cryoprotective solution for thrombocyte freezing |
-
2018
- 2018-01-23 RU RU2018102667A patent/RU2676674C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5843799A (en) * | 1981-09-10 | 1983-03-14 | Mamoru Sugiura | Reagent for fractionation and determination of alkaline phosphatase |
| RU2477953C1 (en) * | 2012-03-12 | 2013-03-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Combined cryoprotective solution for thrombocyte freezing |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| АРХАГОВ Ю.Ф. Изменение морфологии и функционально-метаболической активности лейкоцитов в процессе хранения донорской крови и под влиянием различных лучей. Москва, Дисс. на соиск. к. м. н., 2003, с. 155. * |
| АРХАГОВ Ю.Ф. Изменение морфологии и функционально-метаболической активности лейкоцитов в процессе хранения донорской крови и под влиянием различных лучей. Москва, Дисс. на соиск. к. м. н., 2003, с. 155. ШЕСТОПАЛОВ А.В. и др. Структурно-цитохимические критерии активации нейтрофилов в ответ на острую висцеральную боль. Кубанский научный медицинский вестник, 2009, N5 (110), с.148-152. * |
| ШЕСТОПАЛОВ А.В. и др. Структурно-цитохимические критерии активации нейтрофилов в ответ на острую висцеральную боль. Кубанский научный медицинский вестник, 2009, N5 (110), с.148-152. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hubel et al. | Storage of human biospecimens: selection of the optimal storage temperature | |
| Hess | Measures of stored red blood cell quality | |
| Grisendi et al. | Detection of microparticles from human red blood cells by multiparametric flow cytometry | |
| Olia et al. | Mechanical blood trauma in assisted circulation: sublethal RBC damage preceding hemolysis | |
| Dilken et al. | Assessment of sublingual microcirculation in critically ill patients: consensus and debate | |
| Nemeth et al. | Effects and influencing factors on hemorheological variables taken into consideration in surgical pathophysiology research | |
| Mock et al. | Red blood cell (RBC) volume can be independently determined in vivo in humans using RBCs labeled at different densities of biotin | |
| RU2676674C1 (en) | Method for identifying an effective cryoprotector by cytochemical index of the content of leukocyte alkaline phosphatase of autologous blood | |
| RU2623081C1 (en) | Method for platelets cryopreservation | |
| Ognean et al. | Transfusion Triggers and therapeutic efficacy in a group of dogs that underwent whole blood therapy | |
| Hunter et al. | Assessment of mitochondrial function and oxygen consumption measured during ex vivo normothermic machine perfusion of injured pig kidneys helps to monitor organ viability | |
| Levy et al. | Dielectric response of cytoplasmic water and its connection to the vitality of human red blood cells. II. The influence of storage | |
| RU2686107C1 (en) | Method of optimal cryoprotector selection having glycogen content in preserved blood leukocytes | |
| RU2689334C1 (en) | Method for determining a personalized cryoprotector by leukocyte acid phosphatase of preserved blood | |
| RU2689328C1 (en) | Method for determining an optimal cryoprotector according to a cytochemical indicator of content of succinate dehydrogenase in blood plasma leukocytes | |
| Divers et al. | Lizards | |
| Ackert et al. | A pilot study comparing bone marrow aspirates and venous blood for emergency point‐of‐care blood parameters in healthy dogs | |
| Dobrindt et al. | Ischemic-type biliary lesions after liver transplant: factors causing early-onset versus late-onset disease | |
| Fadeyi et al. | The viability of hematopoietic progenitor cell grafts after cryopreservation does not predict delayed engraftment in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation | |
| Gooran et al. | Prognostic value of hemoglobin concentration and graft vein blood oxygenation on renal transplant outcomes | |
| RU2624243C1 (en) | Method for determination of optimum mono-endocellular cryopreserving agent for cells storage at -80c | |
| Keskin et al. | First observation of hemoglobin San Diego, a high oxygen affinity hemoglobin variant, in Turkey | |
| RU2717313C1 (en) | Method of determining erythrocyte resistance | |
| Lau et al. | Long-term ex-vivo normothermic perfusion of human split livers: a unique model to study new therapeutics and increase the number of available organs | |
| Yehorov et al. | STERILITY MONITORING OF CANINE PACKED RED BLOOD CELLS. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200124 |