RU2624243C1 - Method for determination of optimum mono-endocellular cryopreserving agent for cells storage at -80c - Google Patents
Method for determination of optimum mono-endocellular cryopreserving agent for cells storage at -80c Download PDFInfo
- Publication number
- RU2624243C1 RU2624243C1 RU2016130834A RU2016130834A RU2624243C1 RU 2624243 C1 RU2624243 C1 RU 2624243C1 RU 2016130834 A RU2016130834 A RU 2016130834A RU 2016130834 A RU2016130834 A RU 2016130834A RU 2624243 C1 RU2624243 C1 RU 2624243C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cryopreserving
- optimal
- agent
- cryopreservative
- particular patient
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторному исследованию биологической жидкости (супернатант, плазма или сыворотка крови), и позволяет прогнозировать реакцию организма на лечебное воздействие по коррекции гемопоэза. Проводят сравнительное исследование зональных структур высушенных капель супернатантов с различными криоконсервантами, замороженных до температуры минус 80°С, а также до и спустя определенные интервалы времени после испытания на модели трансфузии in vitro и при аналогичности структуропостроения центральных, срединных и краевых зон контрольного и опытного микробиопрепаратов примененный криоконсервант оценивают как оптимальный для конкретного больного.The invention relates to medicine, in particular to a laboratory study of biological fluid (supernatant, plasma or blood serum), and allows to predict the body's response to therapeutic effect for the correction of hematopoiesis. A comparative study of the zonal structures of dried droplets of supernatants with various cryopreservatives frozen to a temperature of minus 80 ° C, as well as before and after certain time intervals after testing on an in vitro transfusion model and with similar structural design of the central, middle and regional zones of the control and experimental microbiological preparations, is carried out. cryopreservative is rated as optimal for a particular patient.
Для осуществления способа изъятую у больного порцию венозной крови при комнатной температуре делят на равные части в пробирки, одна из которых контрольная, в опытных смешивают с разными криоконсервантами в соотношении 25:1, соответственно, предварительно охлажденными до температуры минус 80°С, перемешивают при температуре 37°С в течение определенного отрезка времени (модель трансфузии in vitro), центрифугируют, супернатант раскапывают на предметном стекле, высушивают при температуре 37°С и исследуют под малый увеличением микроскопа в проходящем свете. Производят качественный и количественный анализ визуаметрических параметров структуропостроения центральных, срединных и краевых зон высушенных капель микропрепаратов биожидкости контрольного и опытных образцов* (*Мартусевич А.К., Гришина А.А. Биокристалломика: общие представления, методология и методы исследования. Учебное пособие. Кирон: Типография ВГСХА, 2009. - 26 с.) и при аналогичности структуропостроения центральных, срединных и краевых зон контрольного и опытного микробиопренаратов примененный криоконсервант для замораживания клеток крови при температуре минус 80°С оценивают как оптимальный для конкретного больного.To implement the method, a portion of venous blood taken from a patient at room temperature is divided into equal parts into test tubes, one of which is a control, in the experimental mixed with different cryopreservatives in a ratio of 25: 1, respectively, pre-cooled to a temperature of minus 80 ° C, mixed at a temperature 37 ° C for a certain period of time (in vitro transfusion model), centrifuged, the supernatant is digested on a glass slide, dried at a temperature of 37 ° C and examined under a small magnification microscope in passing I eat light. A qualitative and quantitative analysis of the visualization parameters of the structural engineering of the central, middle and marginal zones of dried drops of micropreparations of biofluid of the control and experimental samples * (* Martusevich AK, Grishina AA Biocrystallomics: general concepts, methodology and research methods. Study guide. Kiron : VGSHA Printing House, 2009. - 26 p.) And with similar structural design of the central, middle and marginal zones of the control and experimental microbiological preparations, a cryopreservative was used to freeze cells blood flow at a temperature of minus 80 ° C is assessed as optimal for a particular patient.
Клетки крови, консервированные при температуре минус 80°С, являются одними из эффективных средств в терапии депрессивных состоянии гемопоэза различного генеза (Белоус A.M., Грищенко В И. Криобиология. Киев: «Наукова думка», 1994. - 432 с.; Руководство по трансфузионной медицине (Под редакцией Е.П. Сведенцова. - Киров, 1999.)).Blood cells preserved at a temperature of minus 80 ° C are one of the effective means in the treatment of depressed hematopoiesis of various genesis (Belous AM, Grishchenko V. I. Cryobiology. Kiev: Naukova Dumka, 1994. - 432 p .; Manual for transfusion medicine (Edited by EP Swedentsov. - Kirov, 1999.)).
Ключевым вопросом в применении криомедицинских технологий является использование нетоксичных или малотоксичных криопротекторов и криоконсервантов на их основе для замораживания клеток крови с лечебной целью (Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлаждения. - М.: Издательство иностранной литературы, 1963. - 505 с.; Хлябич Г.Н. Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга. Москва: Медицина, 1997. -192 с.; Багаутдинов Ш.М. Совершенствование методов долгосрочного хранения крови и костного мозга в замороженном состоянии в службе крови вооруженных сил: Автореф: дис. докт. биол. наук. - СПб., 1998. - 29 с.; Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. Сыктывкар, 2010. - 80 с.).The key issue in the application of cryomedical technologies is the use of non-toxic or low-toxic cryoprotectants and cryopreservatives based on them for freezing blood cells for therapeutic purposes (Smith O. Biological effect of freezing and hypothermia. - M .: Publishing House of Foreign Literature, 1963. - 505 p .; Hlyabich G.N. Blood substitutes, preservatives of blood and bone marrow.Moscow: Medicine, 1997. -192 p .; Bagautdinov Sh.M. Improving the methods of long-term storage of blood and bone marrow in the frozen state in the service of JVI armed forces: Abstract:..... dissertation, Doctor of Biological Science - St. Petersburg, 1998. - 29 p .; Svedentsov EP cryoprotectant for living cells Syktyvkar, 2010. - 80 c)...
При этом особую ценность приобретают методы тестирования биологической активности криоконсервантов и возможной реакции организма в посттрансфузионном периоде по определению уровня белка, гемоглобина, холестерина, билирубина и других показателей гомеостаза (см. Руководство по клинической лабораторной диагностике. Под ред. А.С. Петровой. М.: Медицина, 1985).In this case, methods of testing the biological activity of cryopreservatives and the possible reaction of the body in the post-transfusion period to determine the level of protein, hemoglobin, cholesterol, bilirubin and other indicators of homeostasis are of particular value (see Guide to clinical laboratory diagnostics. Edited by A.S. Petrova. M .: Medicine, 1985).
Известны способы оценки эффективности криоконсервантов, основанные на исследовании морфологических, функциональных и иммунологических показателей консервируемых клеток крови на этапах их консервирования (Регламенты по изготовлению гемоконсервантов. Государственная Фармакопея РФ ХП ч. 1; Инструкция по применению компонентов крови, утвержденная Приказом Минздрава Росси 25 ноября 2002 г. №363).Known methods for assessing the effectiveness of cryopreservatives based on the study of morphological, functional and immunological parameters of preserved blood cells at the stages of their preservation (Regulations for the manufacture of hemoconservatives. State Pharmacopoeia of the Russian Federation CP Part 1; Instructions for the use of blood components, approved by Order of the Ministry of Health of Russia on November 25, 2002 No. 363).
Однако перечисленные показатели изменяются при развитой картине посттрансфузионной реакции или осложнения и не позволяют прогнозировать реакцию организма на лечебное воздействие по коррекции гемопоэза на более раннем, доклиническом этапе применения криоконсервированных клеток крови.However, the listed indicators change with the developed picture of the post-transfusion reaction or complication and do not allow predicting the body's response to the therapeutic effect of correcting hematopoiesis at an earlier, preclinical stage of the use of cryopreserved blood cells.
Наиболее близким к заявляемому способу является микроскопический способ оценки состояния гомеостаза, основанный на кристаллографическом исследовании высушенных капель плазмы (сыворотки) крови (патент РФ N 2114432). При этом пробы биологической жидкости обрабатывают лазером или электромагнитным полем, раскапывают на чистое стекло, высушивают и исследуют под микроскопом в поляризованном свете, после чего сравнивают зональные структуры фаций опытного образца с исходным, т.е. полученным до воздействия на биожидкость внешнего фактора. При этом, чем раньше происходит возвращение параметров зональных структур капель высушенной биожидкости к исходным показателям, тем более устойчивое ожидаемое у субъекта состояние гомеостаза. Если восстановление параметров морфотипов зональных структур биожидкости после воздействия на нее изучаемого физического фактора замедлено по сравнению с контрольной группой, то это указывает на неустойчивое состояние гомеостаза.Closest to the claimed method is a microscopic method for assessing the state of homeostasis, based on a crystallographic study of dried drops of plasma (serum) of blood (RF patent N 2114432). In this case, samples of the biological fluid are treated with a laser or an electromagnetic field, digged onto clean glass, dried and examined under a microscope in polarized light, after which the zonal facies structures of the experimental sample are compared with the initial one, i.e. obtained before exposure to the biofluid of an external factor. Moreover, the earlier the parameters of the zonal structures of the dried biofluid droplets return to their initial values, the more stable the homeostasis state expected from the subject. If the restoration of the morphotypes of the zonal structures of the biofluid after exposure to the studied physical factor is slowed down in comparison with the control group, this indicates an unstable state of homeostasis.
Недостатком прототипа является то, что в нем не предлагается количественный и качественный анализ визуаметрических параметров структуропостроения кристаллизации высушенных капель биологической жидкости. Кроме того, при оценке состояния гомеостаза по кристаллогенной активности плазмы (сыворотки) крови известным способом не представляется возможным оценить влияние различных криоконсервантов на гомеостаз до введения в сосудистое русло реципиента консервированного при температуре минус 80°С компонента крови. Вместе с тем, индивидуальный выбор криоконсерванта в трансфузиологии на доклиническом этапе очень важен, так как позволяет своевременно (до проявления первых клинических признаков посттрансфузионной реакции или осложнения) дать оценку пригодности или непригодности препарата для консервирования клеток крови конкретно данному больному.The disadvantage of the prototype is that it does not offer a quantitative and qualitative analysis of the visual parameters of the structural structure of crystallization of dried drops of biological fluid. In addition, when assessing the state of homeostasis by the crystallogenic activity of blood plasma (serum) in a known manner, it is not possible to assess the effect of various cryopreservatives on homeostasis before introducing into the vascular bed a recipient of a blood component preserved at a temperature of minus 80 ° С. At the same time, the individual choice of a cryopreservative in transfusiology at the preclinical stage is very important, as it allows timely (before the first clinical signs of a post-transfusion reaction or complication to appear) assessment of the suitability or unsuitability of the drug for preserving blood cells for a particular patient.
Поэтому поставленной задачей было устранение недостатка и создание такого способа, который бы позволял индивидуально подобрать in vitro для конкретного больного наиболее эффективный и безопасный криоконсервант на этапе, предшествующем его инфузии с клетками крови, криоконсервированными при температуре минус 80°С.Therefore, the task was to eliminate the drawback and create a method that would individually select in vitro for a particular patient the most effective and safe cryopreservative at the stage preceding its infusion with blood cells cryopreserved at a temperature of minus 80 ° C.
Поставленная задача решается по следующей схеме.The problem is solved according to the following scheme.
Пример выполнения. Пациентка М. (мед. карта 386/13. У пациентки (после получения добровольного информированного согласия) аспирировали 20 мл венозной крови, которые фасовали в пробирки по 5,0 мл. Пробирка №1 - контрольная, без криоконсерванта. В пробирку №2 с помощью дозаторной пипетки вносили 0,2 мл криоконсерванта на основе 5% раствора ДМАЦ и 2,5% раствора глюкозы, в пробирку №3 - 0,2 мл криоконсерванта на основе 5% раствора ДМСО, в пробирку №4 - 0,2 мл криоконсерванта на основе 5% раствора Глицерина и 4% раствора глюкозы (ГЛ). Растворы криоконсервантов предварительно охлаждали до температуры минус 80°С. Готовые биологические системы «кровь + криоконсервант» перемешивали на шейкере при температуре 37°С в течение 4 ч и 24 ч, центрифугировали при 2100 об/мин 18 мин, получали супернатант, последний раскапывали (не меньше 6 капель объемом 4 мкл каждая) на горизонтальную поверхность предметного стекла, высушивали при 37°С, после чего исследовали характеристики и параметры кристаллизации зональных морфологических структур: центральных, срединных, краевых под увеличением ×40 и ×100 микроскопа в проходящем свете.Execution example. Patient M. (medical card 386/13. The patient (after obtaining voluntary informed consent) was aspirated with 20 ml of venous blood, which was Packed in 5.0 ml tubes. Test tube No. 1 - control, without cryopreservative. In test tube No. 2 with 0.2 ml cryopreservative based on a 5% DMAC solution and 2.5% glucose solution were added using a pipette pipette, 0.2 ml cryopreservative based on a 5% DMSO solution in test tube 3, 0.2 ml cryopreservative in test tube 4 based on 5% Glycerol solution and 4% glucose (GL) solution. and up to a temperature of minus 80 ° С. Ready-made biological systems “blood + cryopreservative” were mixed on a shaker at a temperature of 37 ° C for 4 hours and 24 hours, centrifuged at 2100 rpm for 18 minutes, the supernatant was obtained, the latter was digged out (at least 6 droplets with a volume of 4 μl each) on the horizontal surface of a glass slide were dried at 37 ° C, after which the characteristics and crystallization parameters of zonal morphological structures were examined: central, middle, edge under a magnification of × 40 and × 100 microscope in transmitted light.
Необходимые математические расчеты выявленных количественных и качественных критериев морфологических структур высушенных капель супернатанта производили по известной методике* (*Мартусевич А.К., Гришина А.А. Биокристалломика: общие представления, методология и методы исследования. Учебное пособие. Кирон: Типография ВГСХА, 2009. - 26 с.). Далее сопоставляли результаты оценки фаций высушенных капель образцов биологической жидкости с данными контрольного образца. В случае аналогичности структуропостроения зональных структур контрольного и опытного образцов микробиопрепарата примененный криоконсервант оценивали как безопасный и оптимальный из числа сравниваемых для конкретного больного (табл. 1).The necessary mathematical calculations of the quantitative and qualitative criteria for the morphological structures of the dried supernatant droplets were carried out using the well-known method * (* Martusevich AK, Grishina AA Biocrystallomics: general concepts, methodology and research methods. Study guide. Kiron: Printing house of the All-Union Agricultural Agricultural Academy, 2009 . - 26 p.). Next, the results of the evaluation of the facies of dried drops of biological fluid samples were compared with the data of the control sample. In the case of similar structural design of the zonal structures of the control and experimental samples of the microbiological preparation, the cryopreservative used was evaluated as safe and optimal among those compared for a particular patient (Table 1).
Представленный пример иллюстрирует применимость предлагаемого способа индивидуализации использования гемоконсервантов. Согласно анализу результатов кристаллизации контрольной и опытных проб супернатантов, оптимальным для конкретного больного является криоконсервант на основе 5% раствора ДМАЦ и 2,5% раствора глюкозы, опытный образец с которым обладает наиболее высокой аналогичностью структуропостроения к контрольной пробе по сравнению с биопробами, содержащими 5% раствор ДМСО или 5% раствор Глицерина. Из чего следует заключение: для пациентки М. оптимален криоконсервант на основе 5% раствора ДМАЦ и 2,5% раствора глюкозы. Криоконсерванты, содержащие 5% раствор ДМСО или 5% раствор Глицерина, пациентке М. не оптимальны и не показаны для замораживания компонентов крови.The presented example illustrates the applicability of the proposed method of individualization of the use of blood preservatives. According to the analysis of the crystallization results of the control and experimental samples of supernatants, the cryopreservative based on a 5% DMAC solution and 2.5% glucose solution is optimal for a particular patient, the experimental sample with which has the highest structural similarity to the control sample compared to bioassays containing 5% DMSO solution or 5% glycerol solution. The conclusion follows: for patient M., a cryopreservative based on a 5% DMAC solution and a 2.5% glucose solution is optimal. Cryopreservatives containing 5% DMSO solution or 5% Glycerin solution are not optimal for patient M. and are not indicated for freezing blood components.
Необходимое оборудование: персональный компьютер, микроскоп с проходящим светом, цифровая приставка, пипеточный микродозатор, предметные стекла, набор гемоконсервантов из ДМАЦ, ДМСО и Глицерина, разрешенных МЗ РФ к клиническому применению.Necessary equipment: a personal computer, a microscope with transmitted light, a digital set-top box, a pipette microdoser, glass slides, a set of blood preservatives from DMAC, DMSO and Glycerin approved by the Ministry of Health of the Russian Federation for clinical use.
Способ дешев и может быть освоен на базе клинической лаборатории ЛПУ, использующего трансфузии компонентов крови, замороженных до температуры минус 80°С.The method is cheap and can be mastered on the basis of the clinical laboratory of hospitals using transfusion of blood components frozen to a temperature of minus 80 ° C.
Таким образом, благодаря использованию указанного, более чувствительного способа определения индивидуальной безопасности криоконсервантов, удается на раннем доклиническом этапе выявить in vitro безопасный и оптимальный для конкретного больного криоконсервант и рекомендовать его для замораживания компонентов крови с лечебной целью.Thus, due to the use of the indicated, more sensitive method for determining the individual safety of cryopreservatives, it is possible at an early preclinical stage to identify in vitro a safe and optimal cryopreservative for a particular patient and recommend it for freezing blood components for therapeutic purposes.
Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников патентной и научно-технической литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и известных способов с существенными признаками предлагаемого технического решения. Техническим результатом использования изобретения является возможность проведения индивидуального скрининга криоконсерванта на доклиническом этапе его применения.The present invention meets the criteria of "novelty" and "inventive step", as the patent information research did not reveal sources of patent and scientific literature that would discredit the novelty of the proposed method, as well as known methods with significant features of the proposed technical solution. The technical result of using the invention is the ability to conduct individual screening of a cryopreservative at the preclinical stage of its use.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016130834A RU2624243C1 (en) | 2016-07-26 | 2016-07-26 | Method for determination of optimum mono-endocellular cryopreserving agent for cells storage at -80c |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016130834A RU2624243C1 (en) | 2016-07-26 | 2016-07-26 | Method for determination of optimum mono-endocellular cryopreserving agent for cells storage at -80c |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2624243C1 true RU2624243C1 (en) | 2017-07-03 |
Family
ID=59312429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016130834A RU2624243C1 (en) | 2016-07-26 | 2016-07-26 | Method for determination of optimum mono-endocellular cryopreserving agent for cells storage at -80c |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2624243C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2045573C1 (en) * | 1992-11-19 | 1995-10-10 | Олег Петрович Плотников | Composition for storage of bacteria |
| RU2114432C1 (en) * | 1996-09-24 | 1998-06-27 | Шабалин Владимир Николаевич | Method for evaluating homeostasis state |
| RU2233589C2 (en) * | 2002-01-14 | 2004-08-10 | Галина Степановна Лобынцева | Method for cryopreserving human hemopoietic cells |
-
2016
- 2016-07-26 RU RU2016130834A patent/RU2624243C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2045573C1 (en) * | 1992-11-19 | 1995-10-10 | Олег Петрович Плотников | Composition for storage of bacteria |
| RU2114432C1 (en) * | 1996-09-24 | 1998-06-27 | Шабалин Владимир Николаевич | Method for evaluating homeostasis state |
| RU2233589C2 (en) * | 2002-01-14 | 2004-08-10 | Галина Степановна Лобынцева | Method for cryopreserving human hemopoietic cells |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ВЕТОШКИН К. А. Разработка комбинированного криоконсерванта для замораживания и хранения тромбоцитов при низких и ультранизких температурах. Диссер. к.м.н. Киров, 2014, 86 с. Бабийчук Л.А. и др. Оценка стадий апоптоза и распределения фосфатидилсерина в мембране ядросодержащих клеток пуповинной и периферической крови при различных технологиях криоконсервации. Клеточная трансплатология и тканевая инженерия. 2013. N 4. С.50-54. * |
| ВЕТОШКИН К. А. Разработка комбинированного криоконсерванта для замораживания и хранения тромбоцитов при низких и ультранизких температурах. Диссер. к.м.н. Киров, 2014, 86 с. Бабийчук Л.А. и др. Оценка стадий апоптоза и распределения фосфатидилсерина в мембране ядросодержащих клеток пуповинной и периферической крови при различных технологиях криоконсервации. Клеточная трансплатология и тканевая инженерия. 2013. N 4. С.50-54. Методы длительного хранения коллекционных культур микроор- ганизмов и тенденции развития / В. Д. Похиленко, А. М. Баранов, К. В. Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2009. N 4 (12). с. 99-121. * |
| Методы длительного хранения коллекционных культур микроор- ганизмов и тенденции развития / В. Д. Похиленко, А. М. Баранов, К. В. Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2009. N 4 (12). с. 99-121. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Swamydas et al. | Isolation of mouse neutrophils | |
| Hubel et al. | Storage of human biospecimens: selection of the optimal storage temperature | |
| Westerkamp et al. | End‐ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature | |
| Raval et al. | The use of the mechanical fragility test in evaluating sublethal RBC injury during storage | |
| Musiał et al. | Formalin use in anatomical and histological science in the 19th and 20th centuries | |
| Rosso et al. | Transmission of dengue virus from deceased donors to solid organ transplant recipients: case report and literature review | |
| Forzán et al. | Clinical pathology of amphibians: a review | |
| Kamijima et al. | Antifreeze protein prolongs the life-time of insulinoma cells during hypothermic preservation | |
| Datta et al. | Prolonged cold ischemia time results in local and remote organ dysfunction in a murine model of vascularized composite transplantation | |
| Tamburrino et al. | Cryopreservation of human spermatozoa: Functional, molecular and clinical aspects | |
| Amann et al. | COVID-19 effects on the kidney | |
| Flegel | Fresh blood for transfusion: how old is too old for red blood cell units? | |
| Taeger et al. | Assessing viability of extracorporeal preserved muscle transplants using external field stimulation: a novel tool to improve methods prolonging bridge-to-transplantation time | |
| Astrup et al. | The routine use of C-reactive protein in forensic investigations | |
| Núñez et al. | Complement activation in liver transplantation: role of donor macrosteatosis and implications in delayed graft function | |
| Hadjesfandiari et al. | Current understanding of the relationship between blood donor variability and blood component quality | |
| Evans et al. | Osmoregulation by the prenatal spiny dogfish, Squalus acanthias | |
| Segabinazzi et al. | Three manual noncommercial methods to prepare equine platelet-rich plasma | |
| Smith et al. | Advances in hypothermic and normothermic perfusion in kidney transplantation | |
| Innis et al. | Tortoises and freshwater turtles | |
| RU2624243C1 (en) | Method for determination of optimum mono-endocellular cryopreserving agent for cells storage at -80c | |
| Horioka et al. | Hypothermia causes platelet activation in the human spleen | |
| Haefele et al. | Hematologic and physiologic reference ranges for free-ranging adult and young common loons (Gavia immer) | |
| Backes et al. | Effects of tacrolimus and insulin in a liver regeneration model in growing animals with portal vein stenosis: immunohistochemical and molecular studies | |
| Sharp et al. | Quantitative assessment of cerebral basement membranes using electron microscopy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200727 |