RU2676317C1 - GENETIC DESIGN OF pCXCRS-Fc FOR OBTAINING A RECOMBINANT MIXED PROTEIN WITH ANTI-IL-8 ACTIVITY - Google Patents
GENETIC DESIGN OF pCXCRS-Fc FOR OBTAINING A RECOMBINANT MIXED PROTEIN WITH ANTI-IL-8 ACTIVITY Download PDFInfo
- Publication number
- RU2676317C1 RU2676317C1 RU2017130708A RU2017130708A RU2676317C1 RU 2676317 C1 RU2676317 C1 RU 2676317C1 RU 2017130708 A RU2017130708 A RU 2017130708A RU 2017130708 A RU2017130708 A RU 2017130708A RU 2676317 C1 RU2676317 C1 RU 2676317C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- sequence
- recombinant
- receptor
- fragment
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 78
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 title claims description 7
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims abstract description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 claims abstract description 7
- 108010038415 interleukin-8 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000010681 interleukin-8 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims abstract description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims abstract description 4
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 claims abstract 2
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 claims abstract 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 abstract description 33
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 abstract description 33
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 abstract description 33
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 abstract description 33
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 abstract 1
- 101001026574 Staphylococcus aureus Kanamycin nucleotidyltransferase Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 22
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 21
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 21
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 20
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 102100036166 C-X-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 description 11
- 101000947174 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 6
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 6
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 5
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 102100028989 C-X-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108010018951 Interleukin-8B Receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101001055222 Homo sapiens Interleukin-8 Proteins 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000058084 Aegle marmelos Species 0.000 description 2
- 235000003930 Aegle marmelos Nutrition 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 2
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000012518 Poros HS 50 resin Substances 0.000 description 2
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010400 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108091008928 CXC chemokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000054900 CXCR Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100026236 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108010018976 Interleukin-8A Receptors Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009189 diving Effects 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000010102 embolization Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 102000053523 human CXCR4 Human genes 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006296 mab medium Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003606 oligomerizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940075993 receptor modulator Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- AYRVGWHSXIMRAB-UHFFFAOYSA-M sodium acetate trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].CC([O-])=O AYRVGWHSXIMRAB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009044 synergistic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной генетики, молекулярной биологии, генетической инженерии, а именно - к созданию генно-инженерной генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного слитого (химерного) белка CXCRs-Fc, представляющего собой белковую конструкцию из т.н. «рецепторной» и «адапторной» частей. «Рецепторная» часть представляет собой CXCRs-содержащий пептид, специфически связывающийся с интерлейкином-8 (IL-8). «Адапторная» часть представлена Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека, который благодаря способности собираться в димерные структуры обеспечивает полимеризацию адресующей (рецепторной) части. Предложенное изобретение может быть использовано для наработки белка, обладающего свойствами блокировать активность интерлейкина-8 (IL-8), обладающего опухоль-стимулирующей активностью. Применение данного химерного белка в качестве основы для лекарственного препарата позволит блокировать рост и пролиферацию опухолевых клеток.The invention relates to the field of biotechnology, molecular genetics, molecular biology, genetic engineering, namely to the creation of a genetic engineering genetic structure for the expression of recombinant fusion (chimeric) protein CXCRs-Fc, which is a protein construct of the so-called. "Receptor" and "adapter" parts. "Receptor" part is a CXCRs-containing peptide, specifically binding to interleukin-8 (IL-8). The “adapter” part is represented by the Fc-fragment of human immunoglobulin G, which, due to its ability to assemble into dimeric structures, ensures the polymerization of the addressing (receptor) part. The proposed invention can be used to produce a protein that has properties to block the activity of interleukin-8 (IL-8), which has tumor-stimulating activity. The use of this chimeric protein as the basis for a drug will block the growth and proliferation of tumor cells.
Уровень техникиThe level of technology
Известно изобретение WO 2004045526 (А2). Настоящее изобретение представляет средство для ингибирования роста и метастазирование раковых клеток путем введения антител к хемокинам. Необходимо определить конкретные хемокины, которые чрезмерно выражены в опухоли с помощью способов по настоящему изобретению, и вводить антитела против тех хемокинов, у которых имеет место гиперэкспресия. Недостатком данного изобретения является трудоемкость определения мишеней и необходимость последующей наработки антител.Known invention WO 2004045526 (A2). The present invention provides an agent for inhibiting the growth and metastasis of cancer cells by administering antibodies to chemokines. It is necessary to identify specific chemokines that are excessively expressed in a tumor using the methods of the present invention, and to introduce antibodies against those chemokines in which hyperexpression takes place. The disadvantage of this invention is the complexity of the determination of targets and the need for subsequent development of antibodies.
Известен способ лечения различных видов злокачественных опухолей путем введения комбинации антагониста SDF-1, который специфически связывается с человеческим CXCR4, и другого химиотерапевтического агента или лучевой терапии в ходе эмболизации терапии (Патент WO 2015123818). Такие комбинированные препараты предполагают синергетические эффекты по сравнению с использованием каждого препарата в отдельности. Способ лечения предназначен для больных онкологическими заболеваниями, которые имеют низкую толерантность к побочным эффектам, вызванным высокими дозами, которые применяются для лечения химиопрепаратами в отдельности. Недостатком данного изобретения является относительная избирательность активности.There is a method of treating various types of malignant tumors by administering a combination of an SDF-1 antagonist that specifically binds to human CXCR4 and another chemotherapeutic agent or radiation therapy during embolization therapy (Patent WO 2015123818). Such combined drugs suggest synergistic effects compared with the use of each drug separately. The method of treatment is intended for patients with oncological diseases, which have a low tolerance to side effects caused by high doses, which are used for the treatment of chemotherapy drugs separately. The disadvantage of this invention is the relative selectivity of activity.
Известно изобретение, относящееся к способу лечения рака молочной железы, характеризующееся активацией гетеродимера HER2/HER3 и включающее стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества модулятора интерлейкина-8 (IL-8) и/или его рецепторов хемокинов (СХС-мотив) рецептора 1 (CXCR1) (US2015266961). Недостатком изобретения является узкая направленность лекарственного средства.Known invention relating to the treatment of breast cancer, characterized by activation of the HER2 / HER3 heterodimer and including the stage of administering to the patient a therapeutically effective amount of chemokine receptor modulator 1 (IL-8) and / or its receptor 1 (CXCR1) (US2015266961). The disadvantage of the invention is the narrow focus of the drug.
Таким образом, на сегодняшний день отсутствует генно-инженерная конструкция, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимой части рецептора IL-8 и Fc-фрагмента иммуноглобулина G. Анализ соответствующих информационных источников не обнаружил генетической конструкции, которая могла бы быть прототипом объекта изобретения. В информационных источниках также не обнаружено сведений о том, что где-либо существует целевой продукт указанной генетической конструкции, т.е. слитый белок, состоящий из указанных частей (внеклеточная часть растворимого рецептора к IL-8, слитая с Fc-фрагментом иммуноглобулина G).Thus, there is currently no genetically engineered construct encoding a fusion protein consisting of the soluble part of the IL-8 receptor and the Fc fragment of immunoglobulin G. An analysis of relevant information sources did not reveal a genetic construct that could be the prototype object of the invention. Information sources also did not reveal information that the target product of the indicated genetic construct exists somewhere, i.e. a fusion protein consisting of the indicated portions (extracellular portion of soluble IL-8 receptor, fused to immunoglobulin G Fc fragment).
С другой стороны, имеется лишь небольшое количество изобретений, которые можно назвать лишь условными аналогами настоящей разработки. Они аналогичны предлагаемому изобретению не по самому объекту изобретения, а лишь по целевому назначению - блокирование интерлейкина-8. Это реализуется либо за счет инактивации самого лиганда, либо за счет блокирования его взаимодействия с рецептором и предотвращению, таким образом, сигнального каскада. Указанные эффекты достигаются в большинстве своем за счет применения антител либо к самому интерлейкину-8, либо к внеклеточной части его рецептора, либо их модуляторов, приводящих к ингибированию опосредованного IL-8 сигнального каскада.On the other hand, there are only a small number of inventions that can be called only conditional analogues of the present development. They are similar to the proposed invention not according to the object of the invention, but only for the intended purpose - blocking interleukin-8. This is realized either by inactivating the ligand itself, or by blocking its interaction with the receptor and thus preventing the signaling cascade. These effects are achieved mostly due to the use of antibodies either to interleukin-8 itself, or to the extracellular part of its receptor, or their modulators, leading to inhibition of the IL-8-mediated signaling cascade.
Таким образом, технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, из уровня техники не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».Thus, technical solutions that coincide with the set of essential features of the claimed invention, from the prior art is not revealed, which allows to make a conclusion about the compliance of the claimed invention to such a condition of patentability as "novelty."
Основание осуществления изобретенияThe basis for carrying out the invention
Интерлейкин-8 (IL-8) относится к группе хемокинов, основное назначение которых - обеспечивать хемотаксис в зону воспаления различных типов клеток: нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов, Т-клеток. В большинстве злокачественных опухолей, включая рак молочной железы, рак печени, желудка, толстого кишечника и рак предстательной железы, обнаруживается высокий уровень IL-8, этот факт связывают с процессом метастазирования. IL-8 - провоспалительный многофункциональный хемокин, активирующий внутриклеточные сигналы путем связывания с рецепторами на поверхности клеток, - CXCR1 и CXCR2. Указанные рецепторы сопряжены с G-белком и опосредуют множество сигнальных каскадов, в частности PI3K/АКТ, PLC/PKC, Ras/Raf/ERK1/2, FAK, Rho и Rac. Установлено также, что IL-8 способствует самоподдержанию стволовых опухолевых клеток за счет экспрессии последними высокого уровня рецептора CXCR1. В 2013 г. впервые было установлено, что передача CXCR1/2-зависимого сигнала сопровождается трансактивацией молекулы HER2 в стволовых опухолевых клетках, вызывающих рецидивирование опухоли и ее устойчивость к радио- и химиотерапии. В связи с этим в настоящее время именно IL-8 и его рецепторы рассматриваются в качестве одной из ключевых «мишеней», особенно в случае резистентности опухоли к различным видам противоопухолевой терапии.Interleukin-8 (IL-8) belongs to the group of chemokines, the main purpose of which is to provide chemotaxis to the zone of inflammation of various cell types: neutrophils, monocytes, eosinophils, T-cells. Most malignant tumors, including breast, liver, stomach, colon and prostate cancer, show high levels of IL-8, a fact associated with the process of metastasis. IL-8 is a proinflammatory multifunctional chemokine that activates intracellular signals by binding to receptors on the cell surface, CXCR1 and CXCR2. These receptors are coupled with G-protein and mediate many signaling cascades, in particular PI3K / ACT, PLC / PKC, Ras / Raf / ERK1 / 2, FAK, Rho and Rac. It has also been established that IL-8 promotes the self-maintenance of stem tumor cells by the latter expressing a high level of the CXCR1 receptor. In 2013, it was first established that the transmission of a CXCR1 / 2-dependent signal is accompanied by the transactivation of the HER2 molecule in stem tumor cells, causing tumor recurrence and its resistance to radiotherapy and chemotherapy. In this regard, at present, it is IL-8 and its receptors that are considered as one of the key “targets”, especially in the case of tumor resistance to various types of antitumor therapy.
Задача анти-IL-8 терапии - инактивировать данный ростовой фактор и вывести его из метастатического каскада. Это препятствует пролиферации и миграции эндотелиальных и опухолевых клеток, что, в свою очередь, будет подавлять неоангиогенез и развитие метастазов. Кроме того, такая терапия должна оказывать существенное влияние на устойчивость опухолевых клеток к радио- и химиотерапии, предотвращая возобновление роста опухоли после терапевтического или операционного лечения.The task of anti-IL-8 therapy is to inactivate this growth factor and remove it from the metastatic cascade. This prevents the proliferation and migration of endothelial and tumor cells, which, in turn, will inhibit neoangiogenesis and the development of metastases. In addition, such therapy should have a significant impact on the resistance of tumor cells to radiotherapy and chemotherapy, preventing the resumption of tumor growth after therapeutic or surgical treatment.
Для решения данной проблемы заявителями разработана генетическая конструкция для получения противоопухолевого рекомбинантного химерного белка, состоящего из растворимой части рецептора IL-8 и Fc-фрагмента иммуноглобулина G. Заявленное средство действует как конкурентный ингибитор IL-8. Рецепторная часть позволяет эффективно связывать IL-8 (биомишень), блокируя его опухоль-индуцирующие свойства, а вторая часть химерного белка обеспечивает удобную очистку его в процессе производства. Кроме того, она способствует усилению биологической активности препарата за счет олигомеризации химерного белка и утилизации комплекса «лиганд-рецептор».To solve this problem, the applicants have developed a genetic construct for producing an antitumor recombinant chimeric protein consisting of a soluble part of the IL-8 receptor and an immunoglobulin Fc fragment G. The claimed agent acts as a competitive inhibitor of IL-8. The receptor part allows you to effectively bind IL-8 (biotarget), blocking its tumor-inducing properties, and the second part of the chimeric protein provides easy cleaning during production. In addition, it contributes to the enhancement of the biological activity of the drug due to the oligomerization of the chimeric protein and utilization of the ligand-receptor complex.
Природные рецепторы интерлейкина-8 (CXCR1 и CXCR2) состоят из семи трансмембранных спиралей и способны связывать хемокин с аффинностью наномолярного порядка [Skelton, 1999]. CXCR1 в отличие от CXCR2 селективен в отношении IL-8. Поэтому растворимая часть рецептора - рекомбинантного CXCR1 - более предпочтительна как потенциальный ингибитор IL-8.The natural receptors for interleukin-8 (CXCR1 and CXCR2) consist of seven transmembrane helices and are able to bind the chemokine with nanomolar order affinity [Skelton, 1999]. CXCR1, unlike CXCR2, is selective for IL-8. Therefore, the soluble part of the receptor - recombinant CXCR1 - is more preferable as a potential inhibitor of IL-8.
Характер взаимодействия комплекса IL-8 с его рецепторами делает затруднительным получение рекомбинантных ингибиторов IL-8 на основе CXCR1 или CXCR2 из-за недостаточной афинности. Необходимый уровень аффинности, сопоставимый с таковым у природного аналога (Kd 1-5 nM), может быть достигнут только путем искусственной иммобилизации полноразмерного CXCR1 в липидном бислое [Park, 2011]. Однако процесс получения таких структур является достаточно трудоемким и дорогостоящим.The nature of the interaction of the IL-8 complex with its receptors makes it difficult to obtain recombinant inhibitors of IL-8 based on CXCR1 or CXCR2 due to insufficient affinity. The required level of affinity, comparable to that of the natural counterpart (Kd 1-5 nM), can only be achieved by artificially immobilizing the full-length CXCR1 in the lipid bilayer [Park, 2011]. However, the process of obtaining such structures is rather time-consuming and expensive.
Тем не менее установлено, что конструирование поливалентных структур - это эффективный способ повышения аффинности целевого белка за счет увеличения числа контактов между молекулами; многие естественные процессы, в том числе и взаимодействие антиген-антитело, основаны на этом принципе [Krishnamurthy, 2006]. Эта характеристика очень важна для противоопухолевого препарата, т.к. позволяет снизить дозировку и, следовательно, уменьшить потенциальный токсический эффект на организм. Кроме того, крупные молекулы имеют большее время циркуляции в организме [Kontermarnn, 2011].Nevertheless, it has been established that the design of polyvalent structures is an effective way of increasing the affinity of the target protein by increasing the number of contacts between molecules; Many natural processes, including the antigen-antibody interaction, are based on this principle [Krishnamurthy, 2006]. This characteristic is very important for an anticancer drug, because allows to reduce the dosage and, therefore, reduce the potential toxic effect on the body. In addition, large molecules have a longer circulation time in the body [Kontermarnn, 2011].
Для получения бивалентных молекул использовали Fc-фрагмент иммуноглобулинов G. Известны подходы к получению мультвалентных комплексов путем присоединения к Fc фрагменту дополнительного адаптора (изолейцинового сайта, шарнирной области IgG2, С-концевого фрагмента IgM) [Levin et al., 2015]. Fc фрагмент обладает рядом преимуществ по сравнению с другими олигомеризующими элементами. Присутствие Fc домена заметно увеличивает время полувыведения белка и, следовательно, продлевает терапевтическую активность [Roopenian, 2007], Fc содержащие молекулы могут взаимодействовать с Fc-рецепторами на клетках иммунной системы, что дает им преимущество при использовании в терапии онкологических и инфекционных заболеваний [Nimmerjahn, 2008]. Кроме этого Fc домен сворачивается независимо и может повысить растворимость и стабильность адресующего компонента химерной молекулы. С технологической точки зрения Fc фрагмент удобен, т.к. позволяет очистить целевой белок с помощью аффинной хроматографии на белок A/G носителе.To obtain bivalent molecules, the Fc fragment of immunoglobulins G was used. Approaches to obtaining multivalent complexes by attaching an additional adapter (isoleucine site, IgG2 hinge region, C-terminal IgM fragment) to the Fc fragment [Levin et al., 2015] are known. The Fc fragment has several advantages compared with other oligomerizing elements. The presence of the Fc domain significantly increases the half-life of the protein and, therefore, prolongs therapeutic activity [Roopenian, 2007], Fc-containing molecules can interact with Fc-receptors on the cells of the immune system, which gives them an advantage when used in the treatment of cancer and infectious diseases [Nimmerjahn, 2008]. In addition, the Fc domain folds independently and can increase the solubility and stability of the addressing component of the chimeric molecule. From a technological point of view, the Fc fragment is convenient because allows you to purify the target protein using affinity chromatography on a protein A / G carrier.
Исходя из целевого назначения будущего препарата при разработке метода получения рекомбинантного белка CXCRs-Fc следует учитывать необходимость выполнения ряда требований:Based on the purpose of the future drug in the development of a method for producing recombinant protein CXCRs-Fc, the need to fulfill a number of requirements should be taken into account:
а) рецепторная часть рекомбинантного химерного белка должна связывать биомишень IL-8, блокируя его опухоль-индуцирующие свойства;a) the receptor part of the recombinant chimeric protein should bind the biomechanical IL-8, blocking its tumor-inducing properties;
б) адапторная часть химерного белка должна индуцировать олигомеризацию химерного белка и утилизацию комплекса «лиганд-рецептор».b) the adapter part of the chimeric protein should induce oligomerization of the chimeric protein and utilization of the ligand-receptor complex.
Для дополнительного повышения авидности рецепторной части в конструкцию был включен адаптер (Fc фрагмент иммуноглобулина G человека), ответственный за олигомеризацию химерного белка. Такая модификация позволит получить димер CXCs-Fc, стабилизированный дисульфидной связью.To further enhance the avidity of the receptor part, an adapter (human immunoglobulin G Fc fragment), responsible for the oligomerization of the chimeric protein, was included in the construction. Such a modification will allow obtaining a CXCs-Fc dimer stabilized by a disulfide bond.
Как упоминалось, гибридные белки, содержащие Fc, способны выполнять эффекторные функции иммуноглобулинов in vivo. Финальный продукт, таким образом, будет способен не только связывать IL-8, но участвовать в его утилизации.As mentioned, Fc fusion proteins are capable of performing the effector functions of immunoglobulins in vivo. The final product, therefore, will be able not only to bind IL-8, but to participate in its disposal.
Для удобства очистки в структуру химерного белка была добавлена N-концевая сигнальная последовательность CD33. Она обеспечивает транспорт белка в среду культивирования, а наличие Fc-фрагмента позволяет быстро и эффективно очистить белок из среды методом аффинной хроматографии носителе с белком A/G.For ease of purification, the N-terminal signal sequence CD33 was added to the chimeric protein structure. It provides protein transport to the culture medium, and the presence of the Fc fragment allows you to quickly and efficiently purify the protein from the medium by affinity chromatography of the carrier with protein A / G.
Раскрытие изобретенияDISCLOSURE OF INVENTION
Задачей изобретения является создание рекомбинантной плазмиды, предназначенной для высокой продукции химерного белка CXCRs-Fc. Рекомбинантные плазмиды обладают биологическими характеристиками, позволяющими использовать данную конструкцию для высокоэффективной продукции химерного белка CXCRs-Fc. Для эффективной наработки белков, слитых с Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека, использовали систему экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих. Выбор системы экспрессии опосредован тем, что антиген является гликопротеином. Наработка его в бактериальной или дрожжевой системах повышает риск образования неправильно свернутых форм белка с некорректным профилем гликозилирования или агликозилированных форм. Для наработки белка была выбрана культура клеток почки НЕК. Культура HEK широко используется для наработки белков в научно-исследовательских и промышленных целях. К достоинствам культуры относят высокую скорость пролиферации и высокую степень трансфекции [Backliwal, 2008; Geisse, 2009]. Также культура легко адаптируется к росту в суспензии в широком спектре классических и бессывороточных сред [Brunner, 2010].The objective of the invention is the creation of a recombinant plasmid designed for high production of chimeric protein CXCRs-Fc. Recombinant plasmids have biological characteristics that allow this construct to be used for the highly efficient production of the chimeric CXCRs-Fc protein. For efficient production of proteins fused to the Fc-fragment of human immunoglobulin G, a system for the expression of recombinant proteins in mammalian cells was used. The choice of expression system is mediated by the fact that the antigen is a glycoprotein. Its production in the bacterial or yeast systems increases the risk of the formation of incorrectly folded forms of protein with an incorrect glycosylation profile or aglycosylated forms. For the production of protein was selected culture of kidney cells HEK. HEK culture is widely used for generating proteins for research and industrial purposes. The advantages of culture include a high proliferation rate and a high degree of transfection [Backliwal, 2008; Geisse, 2009]. The culture also easily adapts to growth in suspension in a wide range of classical and serum-free media [Brunner, 2010].
Для наработки значительных количеств рекомбинантного рецептора должна быть получена стабильная культура-продуцент. Для этого был сконструирован плазмидный вектор, где нуклеотидная последовательность целевого белка была интегрирована в одну экспрессионную кассету с последовательностью маркера селекции; такая конструкция вектора позволяет отобрать клоны продуцентов с наибольшим уровнем экспрессии белка CXCRs-Fc.To produce significant amounts of recombinant receptor, a stable producer culture should be obtained. For this, a plasmid vector was constructed, where the nucleotide sequence of the target protein was integrated into one expression cassette with the sequence of the selection marker; Such a vector design allows selection of clones of producers with the highest level of CXCRs-Fc protein expression.
Объектом техники является генетическая конструкция pCXC8R-Fc, кодирующая рекомбинантный слитый белок, состоящий из растворимого рецептора к интерлейкину-8 (IL-8) и Fc-фрагмента иммуноглобулина G. Ниже приводится обоснование для осуществления настоящего изобретения.The object of the technique is the genetic construct pCXC8R-Fc, which encodes a recombinant fusion protein consisting of a soluble interleukin-8 (IL-8) receptor and an immunoglobulin Fc fragment G. Below is the rationale for implementing the present invention.
Предлагаемая генетическая конструкция pCXC8R-Fc описывается следующими признаками: 5' - P-SP-CXCR-Fc - 3', где:The proposed genetic construct pCXC8R-Fc is described by the following features: 5 '- P-SP-CXCR-Fc - 3', where:
- Р - промоторная последовательность цитомегаловируса;- P - cytomegalovirus promoter sequence;
- SP - нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид CD33;- SP is the nucleotide sequence encoding the CD33 signal peptide;
- CXC8R - нуклеотидная последовательность экстраклеточного домена рецептора интерлейкина 8;- CXC8R - nucleotide sequence of the extracellular domain of the receptor for
- Fc -нуклеотидная последовательность константного домена иммуноглобулина G человека.- Fc-nucleotide sequence of the constant domain of human immunoglobulin G.
Технический результат заключается в том, что получена генетическая конструкция, кодирующая рекомбинантный слитый белок, обладающий анти-IL-8 активностью.The technical result is that the obtained genetic structure encoding a recombinant fusion protein with anti-IL-8 activity.
Заявляемые признаки, предопределяющие получение вышеуказанного технического результата, явно не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».The claimed signs that determine the receipt of the above technical result, clearly do not follow from the prior art, which allows to make a conclusion on the compliance of the claimed invention to the condition of patentability, as "inventive step".
Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретного применения, которыми заявляемое изобретение проиллюстрировано, но не исчерпано.The condition of patentability "industrial applicability" is confirmed by examples of specific applications, by which the claimed invention is illustrated, but not exhausted.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Фигура 1. Схематическое изображение рекомбинантного вектора pIRESneo3-Fc. CMV IE Promoter - ранний промотор цитомегаловируса (CMV) человека (230-862), CD33 signal sequence - лидерная последовательность CD33 (906-959), Factor Ха site - сайт узнавания фактора Ха (1023-1034), IgG1 Fc tail - Fc фрагмент иммуноглобулина G1 человека (1050-1748), IVS - синтетический интрон (1808-2103), IRES - участок внутренней посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита (ECMV) (2129-2719), Neo (R) - неомицин-фосфотрансфераза (2755-3555), SV40 polyA signal - сигнальная последовательность полиаденилирования вируса SV40 (3719-3724 и 3748-3753), ColE1 ori - ориджин репликации ColE1 (4345-4944), Amp (R) - β-лактамаза (5071-5933).Figure 1. Schematic representation of the recombinant vector pIRESneo3-Fc. CMV IE Promoter - human cytomegalovirus (CMV) early promoter (230-862), CD33 signal sequence - leader sequence CD33 (906-959), Factor X site - factor Xa recognition site (1023-1034), IgG1 Fc tail - Fc fragment human immunoglobulin G1 (1050-1748), IVS - synthetic intron (1808-2103), IRES - internal ribosome section of the encephalomyocarditis virus (ECMV) (2129-2719), Neo (R) - neomycin-phosphotransferase (2755-3555), SV40 polyA signal - SV40 polyadenylation signal sequence (3719-3724 and 3748-3753), ColE1 ori - the origin of replication ColE1 (4345-4944), Amp (R) - β-lactamase (5071-5933).
Фигура 2. Схематическое изображение рекомбинантного вектора pCXC8R-Fc. CMV IE Promoter - ранний промотор цитомегаловируса (CMV) человека (230-862), CD33 signal sequence - лидерная последовательность CD33 (906-959), CXC8R - экстраклеточный домен рецептора интерлейкина 8 (966-1082), Factor Ха site - сайт узнавания фактора Ха (1089-1100), IgG1 Fc tail - Fc фрагмент иммуноглобулина G1 человека (1116-1814), IVS -синтетический интрон (1874-2169), IRES - участок внутренней посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита (ECMV) (2195-2785), Neo (R) - неомицин-фосфотрансфераза (2821-3621), SV40 polyA signal - сигнальная последовательность полиаденилирования вируса SV40 (3785-3790 и 3814-3819), ColE1 ori - ориджин репликации ColE1 (4411-5010), Amp (R) - β-лактамаза (5137-5999).Figure 2. Schematic representation of the recombinant vector pCXC8R-Fc. CMV IE Promoter - human cytomegalovirus (CMV) early promoter (230-862), CD33 signal sequence - leader sequence CD33 (906-959), CXC8R - extracellular domain of
Фигура 3. Электрофорез в 2%-ном агарозном геле ПЦР- продуктов, полученных после амплификации фрагментов ДНК CXCRs-Fc. 16 - положительный контроль, где ПЦР проводили с использованием экспрессионной плазмиды в качестве ДНК-матрицы, 1 - отрицательный контроль, где ПЦР проводили с использованием хромосомной ДНК нетрансфицированной клеточной культуры в качестве ДНК-матрицы.Figure 3. Electrophoresis in 2% agarose gel of PCR products obtained after amplification of CXCRs-Fc DNA fragments. 16 - positive control, where PCR was performed using the expression plasmid as a DNA template, 1 - negative control, where PCR was performed using the chromosomal DNA of a untransfected cell culture as a DNA template.
Фигура 4. Денатурирующий ПААГ-электрофорез очищенного рекомбинантного белка CXCRs-Fc, М - смесь маркерных белков.Figure 4. Denaturing PAG electrophoresis of purified recombinant protein CXCRs-Fc, M - a mixture of marker proteins.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Осуществление изобретения проиллюстрировано, но не ограничено, следующими примерами.The implementation of the invention is illustrated, but not limited to, the following examples.
Пример 1. Получение промежуточного вектора pIRESneo3-FcExample 1. Preparation of intermediate vector pIRESneo3-Fc
На первом этапе получения запланированных генетических конструкций сконструирован новый рекомбинантный промежуточный вектор pIRESneo3-Fc (Фиг. 1). В данном векторе под регуляцией промотора CMV помещены элементы, кодирующие лидерную последовательность CD33 и Fc-фрагмент иммуноглобулина G человека. Присутствие CD33 сигнальной последовательности в составе целевого белка обеспечивает его транспорт в среду культивирования. Такой прием позволяет изолировать белок от внутриклеточных протеаз в процессе наработки, а также облегчает дальнейшую очистку.At the first stage of obtaining the planned genetic constructs, a new recombinant intermediate vector pIRESneo3-Fc was constructed (Fig. 1). In this vector, under the regulation of the CMV promoter, elements encoding the CD33 leader sequence and the Fc fragment of human immunoglobulin G are placed. The presence of the CD33 signal sequence in the composition of the target protein ensures its transport to the culture medium. This technique allows you to isolate the protein from intracellular proteases in the process of production, and also facilitates further purification.
Конструкция рекомбинантного слитого белка CXCRs-Fc обеспечивает возможность специфической одноэтапной очистки с помощью аффинной хроматографии. Очистка Fc-содержащих белков методом аффинной хроматографии на носителях с белком А или G обеспечивает довольно высокую чистоту продукта и низкий уровень потерь. Для очистки рекомбинантного белка CXCRs-Fc был выбран метод аффинной хроматографии на Prosep Ultra plus protein A.The design of the recombinant CXCRs-Fc fusion protein provides the possibility of specific one-step purification using affinity chromatography. Purification of Fc-containing proteins by affinity chromatography on media with protein A or G provides a fairly high purity of the product and a low level of losses. For purification of recombinant protein CXCRs-Fc, the method of affinity chromatography on Prosep Ultra plus protein A. was chosen.
Фрагмент ДНК, содержащий данные элементы, амплифицировали методом полимеразной цепной реакции. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием «KOD Hot Start DNA Polymerase» («Merck KGaA») согласно рекомендациям фирмы-производителя. В реакции использовали олигонуклеотиды:The DNA fragment containing these elements, amplified by the method of polymerase chain reaction. Polymerase chain reaction was performed using KOD Hot Start DNA Polymerase (Merck KGaA) according to the recommendations of the manufacturer. Oligonucleotides were used in the reaction:
spIg_f(5'-GGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTG-3')spIg_f (5'-GGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTG-3 ')
spIg_r(5'-TTAGGTGATCATATAGAATAGGGCCCTCTAGC-3').spIg_r (5'-TTAGGTGATCATATAGAATAGGGCCCTCTAGC-3 ').
В качестве ДНК-матрицы использовали плазмидную ДНК spIg. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 1х буфер для «KOD Hot Start DNA Polymerase», по 8 пМ каждого олигонуклеотида, 200 нМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,5 мМ MgSO4, 1 нг ДНК вектора spIg и 0,5 ед. «KOD Hot Start DNA Polymerase».SpIg plasmid DNA was used as a DNA template. The 25 µl reaction mixture contained 1x buffer for KOD Hot Start DNA Polymerase, 8 pM of each oligonucleotide, 200 nM of each deoxynucleoside triphosphate, 1.5 mM MgSO 4 , 1 ng of spIg vector DNA and 0.5 units. "KOD Hot Start DNA Polymerase".
Условия амплификации фрагмента ДНК приведены в таблице 1.The amplification conditions of the DNA fragment are shown in table 1.
Продукты ПЦР длиной 1344 п. н. анализировали электрофорезом в 0,8% агарозном геле. В качестве электрофорезного буфера использовали 1х ТАЕ буфер (40 мМ Трис, 20 мМ уксусная кислота, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3). После окончания электрофореза гель окрашивали раствором 5 мкг/мл бромистого этидия. Результаты визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете с помощью трансиллюминатора (Vilber Laurmat). Продукты полимеразной цепной реакции очищали с помощью набора «GeneJET PCR Purification Kit» («Thermo Scientific») в соответствии с инструкцией производителя. ПЦР фрагмент элюировали в объеме 25 мкл.PCR products with a length of 1344 bp. analyzed by electrophoresis in a 0.8% agarose gel. 1x TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH 8.3) was used as electrophoresis buffer. After electrophoresis, the gel was stained with a solution of 5 μg / ml of ethidium bromide. The results were visualized in transmitted ultraviolet light using a transilluminator (Vilber Laurmat). PCR products were purified using the GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific) according to the manufacturer's instructions. The PCR fragment was eluted in a volume of 25 μl.
Амплифицированные фрагменты ДНК гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NdeI («Thermo Scientific») и BelI («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 2х буфер «Tango», 500 нг продуктов ПЦР и по 10 ед. эндонуклеаз рестрикции NdeI и BelI. Реакционную смесь инкубировали в течение 2 часов при 37°С, ферменты инактивировали прогреванием реакционной смеси при 80°С в течение 20 мин. Векторную ДНК pIRESneo3 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NdeI («Thermo Scientific») и BamHI («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 2х буфер «Tango», 500 нг векторной ДНК и по 10 ед. эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI. Реакционную смесь инкубировали в течение 2 часов при 37°С, ферменты инактивировали прогреванием реакционной смеси при 80°С в течение 20 мин. Продукты гидролиза очищали с помощью набора «GeneJET PCR Purification Kit» («Thermo Scientific») в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты ДНК элюировали в объеме 25 мкл.Amplified DNA fragments were hydrolyzed with restriction endonucleases NdeI ("Thermo Scientific") and BelI ("Thermo Scientific") according to the recommendations of the manufacturer. The reaction mixture with a volume of 20 μl contained: 2x Tango buffer, 500 ng of PCR products and 10 units each. restriction endonucleases NdeI and BelI. The reaction mixture was incubated for 2 hours at 37 ° C, the enzymes were inactivated by heating the reaction mixture at 80 ° C for 20 minutes. Vector DNA pIRESneo3 was digested with restriction endonucleases NdeI ("Thermo Scientific") and BamHI ("Thermo Scientific") according to the recommendations of the manufacturer. The reaction mixture with a volume of 20 μl contained: 2x buffer "Tango", 500 ng of vector DNA and 10 units. restriction endonucleases NdeI and BamHI. The reaction mixture was incubated for 2 hours at 37 ° C, the enzymes were inactivated by heating the reaction mixture at 80 ° C for 20 minutes. The hydrolysis products were purified using the “GeneJET PCR Purification Kit” (“Thermo Scientific”) according to the manufacturer's instructions. The DNA fragments were eluted in a volume of 25 μl.
Продукты гидролиза (линеаризованный вектор pIRESneo3 и ПЦР-фрагменты) лигировали с использованием Т4 ДНК лигазы («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 1х буфер для Т4 ДНК лигазы, 1 мМ АТФ, 1 ед. Т4 ДНК лигазы и по 100 пмоль продуктов гидролиза. Реакционную смесь инкубировали при 22°С в течение 20 мин.Hydrolysis products (linearized vector pIRESneo3 and PCR fragments) were ligated using T4 DNA ligase (Thermo Scientific) according to the recommendations of the manufacturer. The reaction mixture with a volume of 20 μl contained: 1x buffer for T4 DNA ligase, 1 mM ATP, 1 unit. T4 DNA ligase and 100 pmol of hydrolysis products. The reaction mixture was incubated at 22 ° C for 20 minutes.
Продуктами реакции лигирования трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма ТОР10. Трансформацию клеток Е. coli проводили химическим методом: реакционную смесь добавляли к компетентным клеткам и инкубировали в течение 60 мин на ледяной бане. Клетки инкубировали на водяной бане при 42°С в течение 90 сек, охлаждали на ледяной бане в течение 15 мин. К клеткам добавляли 1 мл среды LB и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. Трансформированные клетки высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Клетки инкубировали при 37°С в течение 14-16 часов.The products of the ligation reaction transformed the competent cells of E. coli strain TOP10. Transformation of E. coli cells was performed by a chemical method: the reaction mixture was added to competent cells and incubated for 60 min in an ice bath. Cells were incubated in a water bath at 42 ° C for 90 seconds, cooled in an ice bath for 15 minutes. 1 ml of LB medium was added to the cells and incubated at 37 ° C for 60 minutes. Transformed cells were sown on Petri dishes with agar LB medium containing 100 μg / ml ampicillin. Cells were incubated at 37 ° C for 14-16 hours.
Для анализа колоний клеток Е. coli проводили полимеразную цепную реакцию с использованием Taq ДНК полимеразы («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 1х буфер для Taq ДНК полимеразы, 200 нмоль каждого дизоксинуклеозидтрифосфата, по 10 пмоль олигонуклеотидов spIg_f и IRES_r (5' - ATGCCCGCTTTTGAGAGGGAGTACT-3') и 2,5 ед. Taq ДНК полимеразы. В качестве матричной ДНК использовали суспендированные колонии клеток Е. coli в 5 мкл раствора 1% Тритона Х-100.For the analysis of E. coli cell colonies, polymerase chain reaction was performed using Taq DNA polymerase (Thermo Scientific) according to the recommendations of the manufacturer. The 25 µl reaction mixture contained 1x buffer for Taq DNA polymerase, 200 nmol of each deoxynucleoside triphosphate, 10 pmol spIg_f and IRES_r oligonucleotides (5 '- ATGCCCGCTTTTGGAGGGAGTACT-3') and 2.5 u. Taq DNA polymerase. Suspended colonies of E. coli cells in 5 μl of 1% Triton X-100 solution were used as template DNA.
Условия амплификации фрагмента ДНК приведены в таблице 2.The amplification conditions of the DNA fragment are shown in table 2.
Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 0,8% агарозном геле. Из изолированных бактериальных колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды, выделяли векторную ДНК, используя набор «GeneJFT™ Plasmid Miniprep Kit» («Thermo Scientific») согласно рекомендациям производителя. Для подтверждения получения запланированного рекомбинантного вектора проводили секвенирование клонированного фрагмента ДНК, используя олигонуклеотиды spIg_f и IRES_r.PCR products were analyzed by electrophoresis in a 0.8% agarose gel. From isolated bacterial colonies containing recombinant plasmids, vector DNA was isolated using the GeneJFT ™ Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) according to the manufacturer's recommendations. To confirm the receipt of the planned recombinant vector, sequencing of the cloned DNA fragment was carried out using oligonucleotides spIg_f and IRES_r.
Таким образом, на данном этапе был получен вектор pIRESneo3-Fc, схематическое изображение которого представлено на Фигуре 1.Thus, at this stage, the pIRESneo3-Fc vector was obtained, the schematic representation of which is shown in Figure 1.
Пример 2. Получение вектора pCXC8R-FcExample 2. Getting vector pCXC8R-Fc
Фрагмент ДНК, кодирующий экстраклеточный домен рецептора интерлейкина-8, амплифицировали в два этапа. На первом этапе проводили реакцию обратной транскрипции с использованием RevertAid обратной транскриптазы («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. В качестве матрицы для синтеза кДНК использовали препарат тотальной РНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови человека. В качестве праймера использовали олиго-дТ длиной 25 нуклеотидов. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 1х буфер для RevertAid обратной транскриптазы, 1 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 5 мкг тотальной РНК, 20 ед. RiboLock ингибитора РНКаз («Thermo Scientific»), 100 пмоль праймера олиго-дТ и 200 ед. RevertAid обратной транскриптазы. Реакционную смесь инкубировали при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали инкубацией реакционной смеси при 70°С в течение 10 мин.The DNA fragment encoding the extracellular domain of the receptor for interleukin-8, amplified in two stages. At the first stage, a reverse transcription reaction was performed using RevertAid reverse transcriptase (“Thermo Scientific”) according to the recommendations of the manufacturer. As a matrix for the synthesis of cDNA, a preparation of total RNA isolated from human peripheral blood leukocytes was used. Oligo-dT, 25 nucleotides in length, was used as a primer. The reaction mixture with a volume of 20 μl contained: 1x buffer for RevertAid reverse transcriptase, 1 mM of each deoxynucleoside triphosphate, 5 μg of total RNA, 20 units. RiboLock RNase inhibitor (Thermo Scientific), 100 pmol of oligo-dT primer and 200 units. RevertAid reverse transcriptase. The reaction mixture was incubated at 42 ° C for 60 minutes. The reaction was stopped by incubating the reaction mixture at 70 ° C for 10 minutes.
На следующем этапе проводили полимеразную цепную реакцию с использованием «KOD Hot Start DNA Polymerase» («Merck KGaA») согласно рекомендациям фирмы-производителя. В реакции использовали олигонуклеотиды CXCR81-1 (5'-CGGAAGCTTATGTCAAATATTACAGATCCACAGATGTG-3') и CXCR81-2 (5'-TCCGGATCCTTGTTGAGTGTCTCAGTTTCTAGC-3'). В качестве ДНК-матрицы использовали продукты реакции обратной транскриции. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 1х буфер для «KOD Hot Start DNA Polymerase», по 8 пмоль каждого олигонулеотида, 200 нмоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,5 мМ MgSO4, 2 мкл продуктов реакции обратной транскрипции и 0,5 ед. «KOD Hot Start DNA Polymerase». Условия амплификации фрагмента ДНК приведены в таблице 3.At the next stage, polymerase chain reaction was performed using the KOD Hot Start DNA Polymerase (Merck KGaA) according to the recommendations of the manufacturer. The reaction used oligonucleotides CXCR81-1 (5'-CGGAAGCTTATGTCAAATATTACAGATCCACAGATGTG-3 ') and CXCR81-2 (5'-TCCGGATCCTTGTTGAGTGTCTCAGTTTCTAGC-3'). Reverse transcription reaction products were used as the DNA template. The 25 µl reaction mixture contained 1x buffer for KOD Hot Start DNA Polymerase, 8 pmol of each oligonucleotide, 200 nmol of each deoxynucleoside triphosphate, 1.5 mM MgSO 4 , 2 µl of the reverse transcription reaction products and 0.5 units. "KOD Hot Start DNA Polymerase". The amplification conditions of the DNA fragment are shown in table 3.
Продукты ПЦР длиной 134 п.н. анализировали электрофорезом в 0,8% агарозном геле. Продукты полимеразной цепной реакции очищали с помощью набора «GeneJET PCR Purification Kit» («Thermo Scientific») в соответствии с инструкцией производителя. ПЦР фрагмент элюировали в объеме 25 мкл.134 bp PCR products analyzed by electrophoresis in a 0.8% agarose gel. PCR products were purified using the GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific) according to the manufacturer's instructions. The PCR fragment was eluted in a volume of 25 μl.
Амплифицированные фрагменты ДНК и векторную ДНК pIRESneo3-Fc гидролизовали эндонуклеазами рестрикции BamHI («Thermo Scientific») и HindIII («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 2х буфер «Tango», 500 нг продуктов ПЦР и по 10 ед. эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII. Реакционную смесь инкубировали в течение 2 часов при 37°С, ферменты инактивировали прогреванием реакционной смеси при 80°С в течение 20 мин. Продукты гидролиза очищали с помощью набора «GeneJET PCR Purification Kit» («Thermo Scientific») в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты ДНК элюировали в объеме 25 мкл.Amplified DNA fragments and vector DNA pIRESneo3-Fc were hydrolyzed with restriction endonucleases BamHI (“Thermo Scientific”) and HindIII (“Thermo Scientific”) according to the recommendations of the manufacturer. The reaction mixture with a volume of 20 μl contained: 2x Tango buffer, 500 ng of PCR products and 10 units each. restriction endonucleases BamHI and HindIII. The reaction mixture was incubated for 2 hours at 37 ° C, the enzymes were inactivated by heating the reaction mixture at 80 ° C for 20 minutes. The hydrolysis products were purified using the “GeneJET PCR Purification Kit” (“Thermo Scientific”) according to the manufacturer's instructions. The DNA fragments were eluted in a volume of 25 μl.
Продукты гидролиза (линеаризованный вектор pIRESneo3-Fc и ПЦР-фрагменты) лигировали с использованием Т4 ДНК лигазы («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 1х буфер для Т4 ДНК лигазы, 1 мМ АТФ, 1 ед. Т4 ДНК лигазы, 10 пмоль линеаризованного вектора pIRESneo3-Fc и 100 пмоль ПЦР-фрагментов. Реакционную смесь инкубировали при 22°С в течение 20 мин.Hydrolysis products (linearized vector pIRESneo3-Fc and PCR fragments) were ligated using T4 DNA ligase (Thermo Scientific) according to the recommendations of the manufacturer. The reaction mixture with a volume of 20 μl contained: 1x buffer for T4 DNA ligase, 1 mM ATP, 1 unit. T4 DNA ligase, 10 pmol of the linearized vector pIRESneo3-Fc and 100 pmol of PCR fragments. The reaction mixture was incubated at 22 ° C for 20 minutes.
Продуктами реакции лигирования трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма ТОР10. Трансформацию клеток Е. coli проводили химическим методом: реакционную смесь добавляли к компетентным клеткам и инкубировали в течение 60 мин на ледяной бане. Клетки инкубировали на водяной бане при 42°С в течение 90 сек, охлаждали на ледяной бане в течение 15 мин. К клеткам добавляли 1 мл среды LB и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. Трансформированные клетки высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Клетки инкубировали при 37°С в течение 14-16 часов.The products of the ligation reaction transformed the competent cells of E. coli strain TOP10. Transformation of E. coli cells was performed by a chemical method: the reaction mixture was added to competent cells and incubated for 60 min in an ice bath. Cells were incubated in a water bath at 42 ° C for 90 seconds, cooled in an ice bath for 15 minutes. 1 ml of LB medium was added to the cells and incubated at 37 ° C for 60 minutes. Transformed cells were sown on Petri dishes with agar LB medium containing 100 μg / ml ampicillin. Cells were incubated at 37 ° C for 14-16 hours.
Для анализа колоний клеток Е. coli проводили полимеразную цепную реакцию с использованием Taq ДНК полимеразы («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 1х буфер для Taq ДНК полимеразы, 200 нмоль каждого дизоксинуклеозидтрифосфата, по 10 пмоль олигонуклеотидов splg_f и Fc_r (5,-GGGGGAAGAGGAAGACTGACGGT-3') и 2,5 ед. Taq ДНК полимеразы. В качестве матричной ДНК использовали суспендированные колонии клеток Е. coli в 5 мкл раствора 1% Тритона Х-100. Условия амплификации фрагмента ДНК приведены в таблице 4.For the analysis of E. coli cell colonies, polymerase chain reaction was performed using Taq DNA polymerase (Thermo Scientific) according to the recommendations of the manufacturer. The 25 µl reaction mixture contained 1x buffer for Taq DNA polymerase, 200 nmol of each deoxynucleoside triphosphate, 10 pmol splg_f and Fc_r oligonucleotides (5, -GGGGGAAGAGAGAGAGGGGGGT-3 ') and 2.5 units. Taq DNA polymerase. Suspended colonies of E. coli cells in 5 μl of 1% Triton X-100 solution were used as template DNA. The amplification conditions of the DNA fragment are shown in table 4.
Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 0,8% агарозном геле. Из изолированных бактериальных колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды, выделяли векторную ДНК, используя набор «GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit» («Thermo Scientific») согласно рекомендациям производителя. Для подтверждения получения запланированного рекомбинантного вектора проводили секвенирование клонированного фрагмента ДНК, используя олигонуклеотид spIg_f. Таким образом, на данном этапе был получен вектор pCXC8R-Fc, схематическое изображение которого представлено на Фиг 2.PCR products were analyzed by electrophoresis in a 0.8% agarose gel. From isolated bacterial colonies containing recombinant plasmids, vector DNA was isolated using the GeneJET ™ Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) according to the manufacturer's recommendations. To confirm the receipt of the planned recombinant vector, sequencing of the cloned DNA fragment was performed using the spIg_f oligonucleotide. Thus, at this stage, the vector pCXC8R-Fc was obtained, the schematic representation of which is shown in Fig. 2.
Нуклеотидная последовательность вектора pCXC8R-Fc и аминокислотная последовательность целевого белка CXCRs-Fc приведены в Перечне последовательностей как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 соответственно.The nucleotide sequence of the vector pCXC8R-Fc and the amino acid sequence of the target protein CXCRs-Fc are listed in the sequence listing as SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
Пример 3. Получение штаммов-продуцентов рекомбинантного целевого белка CXCRs-FcExample 3. Obtaining producer strains of recombinant target protein CXCRs-Fc
Вектор pCXC8R-Fc с проверенной нуклеотидной последовательностью рекомбинантного белка CXCRs-Fc использовали для трансфекции культуры HEK293 клеток почки эмбриона человека. В связи с тем, что получение и очистку рекомбинантного белка предполагалось вести из культуральной среды, для повышения продуктивности трансфицированной культуры клеток была выбрана линия клеток НЕК293, адаптированных к росту в суспензии. Штамм характеризуется следующими свойствами:The pCXC8R-Fc vector with the verified nucleotide sequence of the recombinant CXCRs-Fc protein was used to transfect a human embryonic kidney cell culture of HEK293. Due to the fact that the preparation and purification of the recombinant protein was supposed to be carried out from the culture medium, to increase the productivity of the transfected cell culture, the HEK293 cell line was chosen, adapted to growth in suspension. The strain is characterized by the following properties:
Морфологические признаки. Под фазовоконтрастным и световым микроскопами культура представлена суспензией округлых клеток.Morphological signs. Under phase contrast and light microscopes, the culture is represented by a suspension of rounded cells.
Культуральные свойства. Штамм HEK293 поддерживается в виде суспензионной культуры на отечественных средах DMEM, DMEM/F-12, IMDM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки при температуре 37°С.Cultural properties. Strain HEK293 is maintained as a suspension culture on domestic DMEM, DMEM / F-12, IMDM media with the addition of 10% fetal calf serum at 37 ° C.
Криоконсервация. Криоконсервацию проводят на среде, содержащей 10% DMEM/F-12, добавлением 80% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида в качестве криопротектора. Концентрация клеток (2-4)×106 /мл. Штамм хранится при температуре минус (196±1)°С. Жизнеспособными после восстановления остаются не менее 60% клеток.Cryopreservation Cryopreservation is carried out on a medium containing 10% DMEM / F-12, adding 80% fetal calf serum and 10% dimethyl sulfoxide as a cryoprotectant. Cell concentration (2-4) × 10 6 / ml. The strain is stored at a temperature of minus (196 ± 1) ° C. After recovery, at least 60% of the cells remain viable.
Кариологическая характеристика. Кариотип стабилен при исследовании до 30 пассажа, модальное число хромосом - 64, уровень клеток с повышенной плоидностью - 4.2%. Обнаруженные нарушения кариотипа укладываются в требования, предъявляемые к клеточной линии-продуценту согласно РД 42-28-10-89. Кариотип соответствует виду.Cariological characteristic. The karyotype is stable in the study to 30 passage, the modal number of chromosomes - 64, the level of cells with increased ploidy - 4.2%. The detected violations of the karyotype fit the requirements for the producer cell line according to RD 42-28-10-89. Karyotype corresponds to the mind.
Контроль контаминации. Бактерии, грибы, дрожжи, микоплазмы и вирусы методами контроля согласно РД 42 -28-10-89 не обнаружены.Control contamination. Bacteria, fungi, yeast, mycoplasmas and viruses were not detected by control methods according to RD 42 -28-10-89.
Контроль на туморогенность. На 30 пассаже онкогенных потенций не обнаружено.Tumor control. No oncogenic potencies were detected at
Стабильность биологических свойств. Сохраняет стабильность кариотипа, культуральных, морфологических и продуктивных свойств до 30 пассажа (время наблюдения).Stability of biological properties. Keeps stability of the karyotype, cultural, morphological and productive properties of up to 30 passage (observation time).
Установленный уровень пассажей для использования в производстве - 30.The established level of passages for use in production is 30.
Пример 4. Исследование устойчивости наследования экспрессионной плазмиды штаммом-продуцентом и ее стабильностиExample 4. The study of the stability of the inheritance of the expression plasmid producer strain and its stability
Клетки вышеуказанного штамма HEK293 трансфицировали сконструированной экспрессионной плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность гибридого рекомбинантного белка CXCRs-Fc. Трансфицированные клетки HEK293-CXCRs-Fc культивировали в среде DMEM/F-12, содержащей 400 мкг/мл неомицина, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Через 7 дней среду культивирования меняли на свежую, содержащую 800 мкг/мл неомицина, и инкубировали еще 7 дней при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Выросшие клоны (14 штук) путем «пикирования» пересевали индивидуально на селективную среду вышеуказанного состава. Из клеток, полученных после шестого пассажа, выделяли хромосомную ДНК и подвергали ее ПЦР-анализу на присутствие целевых фрагментов ДНК (последовательности гибридного белка) с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. По данным электрофоретического разделения в агарозном геле, все клоны содержали вставку, несущую кДНК гибридного белка, о чем свидетельствует полоса ДНК-фрагмента размером 150 п. о. (Фигура 3).Cells of the above HEK293 strain were transfected with the constructed expression plasmid containing the nucleotide sequence of the recombinant CXCRs-Fc protein hybrid. Transfected HEK293-CXCRs-Fc cells were cultured in DMEM / F-12 medium containing 400 μg / ml neomycin, supplemented with 10% fetal calf serum at 37 ° C in a humid atmosphere containing 5% CO 2 . After 7 days, the culture medium was changed to fresh, containing 800 μg / ml neomycin, and incubated for another 7 days at 37 ° C in a humid atmosphere containing 5% CO 2 . Grown up clones (14 pieces) were individually subcultured on a selective medium of the above composition by “diving”. From cells obtained after the sixth passage, chromosomal DNA was isolated and subjected to PCR analysis for the presence of target DNA fragments (fusion protein sequences) using specific oligonucleotide primers. According to the electrophoretic separation in agarose gel, all clones contained an insert carrying the hybrid protein cDNA, as evidenced by the band of the
После этого амплифицированные фрагменты ДНК клонировали в вектор pUC19 и проводили анализ соответствия структуры клонированного фрагмента ДНК, кодирующего кДНК гибридного рекомбинантного белка CXCRs-Fc, с помощью ДНК-секвенирования. В результате анализа было показано наличие целевого фрагмента ДНК у всех исследованных клонов и отсутствие мутаций, делеций, инсерций, перестроек. Для клеток-продуцентов рекомбинантных белков именно этот показатель - отсутствие перестроек в структуре искусственного гена гибридного белка - является принципиально важным для дальнейшей работы. Следует отметить, что культивирование клеток-продуцентов на среде с неомицином и сохранение целевой встроенной кДНК подтверждает стабильность и наследуемость данных генотипических признаков.After that, the amplified DNA fragments were cloned into pUC19 vector and the structure of the cloned DNA fragment encoding the hybrid recombinant CXCRs-Fc cDNA was analyzed for DNA sequencing. As a result of the analysis, the presence of the target DNA fragment in all studied clones and the absence of mutations, deletions, insertions, and rearrangements were shown. For recombinant protein-producing cells, this indicator — the absence of rearrangements in the structure of the artificial hybrid protein gene — is of fundamental importance for further work. It should be noted that the cultivation of producer cells on the medium with neomycin and the preservation of the target embedded cDNA confirms the stability and heritability of these genotypic traits.
Полученные клоны-продуценты гибридного рекомбинантного белка CXCRs-Fc стабильно наследуют векторную кДНК, а анализ амплифицированных фрагментов ДНК подтвердил наличие целевого фрагмента и отсутствие в его последовательности мутаций, делеций, инсерций и перестроек. Таким образом, выполнено одно из основных условий получения клеток-продуцентов гибридных рекомбинантных белков в части их стабильности и наследуемости генотипических признаков (устойчивость к антибиотику, наличие чужеродного гена).The obtained clones-producers of the hybrid recombinant protein CXCRs-Fc stably inherit the vector cDNA, and analysis of the amplified DNA fragments confirmed the presence of the target fragment and the absence of mutations, deletions, insertions and rearrangements in its sequence. Thus, one of the main conditions for the production of hybrid recombinant protein-producing cells in terms of their stability and heritability of genotypic traits (antibiotic resistance, the presence of an alien gene) has been fulfilled.
Пример 5. Оценка биосинтетического потенциала полученных штаммов-продуцентовExample 5. Evaluation of the biosynthetic potential of the obtained producer strains
Полученные данные позволяли перейти к следующему этапу исследования сконструированных клеток-продуцентов - оценке их биосинтетического потенциала и выбору оптимального клона.The obtained data allowed us to proceed to the next stage of the study of designed producer cells — the assessment of their biosynthetic potential and the choice of the optimal clone.
Для этого выращивали по 3×106 клеток каждого из клонов в бессывороточной среде BD Cell™ в течение 4 суток. Морфологический контроль культур проводили каждые 24 часа визуально под микроскопом. По окончании культивирования культуральные жидкости собирали и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Содержание гибридного рекомбинантного белка CXCRs-Fc в отобранных после центрифугирования супернатантах оценивали с помощью иммунохимического анализа в сэндвич-ELISA постановке. Для этого в лунки 96-луночного планшета вносили рекомбинантный человеческий IL-8 (Sigma-Aldrich, США) в количестве 100 нг/лунку. После блокирования свободной поверхности лунок 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в ФСБ добавляли по 100 мкл культуральной среды каждого клона и инкубировали 1 ч при 37°С. После тщательной промывки ФСБ с 0.025% Твин-20 в лунки вносили конъюгат белок А - пероксидаза хрена (Merck Millipore) в разведении 1:5000. Инкубировали 1 ч при 37°С, промывали и проявляли пероксидазную активность в цитратном буфере, рН 4.5, содержащем 1.0 мг/мл o-phenylenediamine и 0.1% urea hydrogen peroxide при 25°C. Наличие комплексов IL-8 - CXCRs определяли спектрометрически с использованием планшетного ридера (Biorad, США). Специфичным сигналом считали значения оптической плотности, в 3 раза превышающие значения отрицательного контроля. Как следует из полученных данных, в супернатантах всех клонов обнаруживался целевой гибридный рекомбинантный белок CXCRs-Fc.For this, 3 × 10 6 cells of each clone were grown in serum-free BD Cell ™ medium for 4 days. Morphological control of cultures was carried out every 24 hours visually under a microscope. At the end of the cultivation, the culture fluids were collected and centrifuged at 13000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. The content of the hybrid recombinant protein CXCRs-Fc in the supernatants selected after centrifugation was evaluated by immunochemical analysis in a sandwich ELISA formulation. For this purpose, recombinant human IL-8 (Sigma-Aldrich, USA) was introduced into the wells of a 96-well plate in an amount of 100 ng / well. After blocking the free surface of the wells with 1% solution of bovine serum albumin in PBS, 100 μl of culture medium of each clone was added and incubated for 1 h at 37 ° C. After thorough washing of PBS with 0.025% Tween-20, protein A – horseradish peroxidase conjugate was added to the wells at a dilution of 1: 5000. Incubated for 1 h at 37 ° C, washed, and showed peroxidase activity in citrate buffer, pH 4.5, containing 1.0 mg / ml o-phenylenediamine and 0.1% urea hydrogen peroxide at 25 ° C. The presence of IL-8 – CXCRs complexes was determined spectrometrically using a tablet reader (Biorad, United States). The specific signal was considered the values of optical density, 3 times higher than the values of the negative control. As follows from the obtained data, the target hybrid recombinant CXCRs-Fc protein was detected in the supernatants of all clones.
Для более точного количественного определения уровней биосинтеза в различных клонах-продуцентах был проведен дополнительный иммунохимический анализ супернатантов. Для этого предварительно было проведено препаративное выделение рекомбинантного белка CXCRs-Fc из смеси супернатантов различных клонов на микроколонках (5×10 мм), содержащих в качестве аффинного носителя белок А-сефарозу. Смешанные супернатанты клеток-продуцентов наносили на колонку с помощью перистальтического насоса при постоянной скорости 0,5 мл/мин. Операции проводились при 4°С. Связывание белка с носителем на стадиях нанесения белка и промывки носителя контролировали по оптической плотности элюата на длине волны 280 с использованием системы проточного детектора Uvicord.For a more accurate quantitative determination of the levels of biosynthesis in various clone producers, an additional immunochemical analysis of supernatants was carried out. For this purpose, a preparative isolation of recombinant CXCRs-Fc protein from a mixture of supernatants of various clones on microcolumns (5 × 10 mm) containing protein A-Sepharose as an affinity carrier was carried out. Mixed cell producer supernatants were applied to the column using a peristaltic pump at a constant rate of 0.5 ml / min. Operations were performed at 4 ° C. The binding of the protein to the carrier during the steps of applying the protein and washing the carrier was monitored by the optical density of the eluate at a wavelength of 280 using the Uvicord flow detector system.
После связывания целевого белка с аффинным носителем носитель промывали буфером, содержащим 25 мМ трис-HCl, рН 7.1, 25 мМ NaCl г и 5 мМ ЭДТА, для отмывки белков, не связавшихся с белок А-сефарозой, с постоянным контролем по оптической плотности элюата (Uvicord).After binding the target protein to the affinity carrier, the carrier was washed with buffer containing 25 mM Tris-HCl, pH 7.1, 25 mM NaCl g and 5 mM EDTA to wash the proteins not bound to protein A-Sepharose, with constant monitoring of the optical density of the eluate ( Uvicord).
Элюцию целевого белка с колонки проводили буфером с низким значением рН (50 мМ Na-ацетат, рН 2.7) в пробирки, содержащие по 0,5 мл 100 мМ раствора трис-HCl, рН 7.9. Скорость нанесения, промывок и элюции составляла не более 0,5 мл/мин.The elution of the target protein from the column was performed with a buffer with a low pH (50 mM Na-acetate, pH 2.7) in tubes containing 0.5 ml of 100 mM Tris-HCl solution, pH 7.9. The rate of application, washing and elution was not more than 0.5 ml / min.
Качество и количество выделенного рекомбинантного белка CXCRs-Fc определяли электрофоретически (Фигура 4) с последующей денситометрией окрашенного геля. Выделенный рекомбинантный белок CXCRs-Fc с известной концентрацией использовали в качестве положительного контроля и для построения калибровочной кривой.The quality and quantity of the isolated recombinant protein CXCRs-Fc was determined by electrophoresis (Figure 4) followed by densitometry of the stained gel. The isolated recombinant protein CXCRs-Fc with a known concentration was used as a positive control and to construct a calibration curve.
Для количественной оценки продуктивности различных клонов HEK293-CXCRs-Fc был проведен иммунохимический анализ супернатантов в следующей постановке. В лунки 96-луночного планшета вносили рекомбинантный человеческий IL-8 (Sigma-Aldrich, США) в количестве 100 нг/лунку. После блокирования свободной поверхности лунок 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS добавляли по 100 мкл разведенной 1:10, 1:30 и 1:100 культуральной среды каждого клона или выделенный рекомбинантный белок CXCRs-Fc с известной концентрацией (1 мкг/лунку; 0.3 мкг/лунку; 0.1 мкг/лунку и 0.03 мкг/лунку). Инкубировали 1 ч при 37°С. После тщательной промывки PBS с 0.025% Твин-20 в лунки вносили конъюгат белок А - пероксидаза хрена (Merck Millipore) в разведении 1:5000. Инкубировали 1 ч при 37°С, промывали и проявляли пероксидазную активность в цитратном буфере, рН 4.5, содержащем 1.0 мг/мл о-phenylenediamine и 0.1% urea hydrogen peroxide при 25°C. Значения оптической плотности, определенной спектрометрически с использованием планшетного ридера (Biorad, США), сравнивали со значениями OD в лунках с выделенным рекомбинантным белком CXCRs-Fc.In order to quantify the productivity of various HEK293-CXCRs-Fc clones, an immunochemical analysis of the supernatants was carried out in the following formulation. Recombinant human IL-8 (Sigma-Aldrich, United States) was added to the wells of a 96-well plate in an amount of 100 ng / well. After blocking the free surface of the wells with a 1% solution of bovine serum albumin in PBS, 100 μl diluted 1:10, 1:30 and 1: 100 diluted culture medium of each clone or isolated recombinant CXCRs-Fc protein with a known concentration (1 μg / well; 0.3 µg / well; 0.1 µg / well and 0.03 µg / well). Incubated for 1 h at 37 ° C. After thorough washing of PBS with 0.025% Tween-20, protein A — horseradish peroxidase (Merck Millipore) conjugate was added to the wells at a dilution of 1: 5000. Incubated for 1 h at 37 ° C, washed, and showed peroxidase activity in citrate buffer, pH 4.5, containing 1.0 mg / ml o-phenylenediamine and 0.1% urea hydrogen peroxide at 25 ° C. The values of optical density, determined spectrometrically using a tablet reader (Biorad, USA), were compared with OD values in wells with isolated recombinant CXCRs-Fc protein.
Количественную оценку биосинтетической активности клонов-продуцентов рассчитывали как среднее из трех независимых экспериментов с использованием программы «StatPlus2007» [www.analystsoft.com]. Уровни продукции рекомбинантного белка CXCRs-Fc клетками-продуцентами представлены в таблице 5.The quantitative assessment of the biosynthetic activity of the producer clones was calculated as the average of three independent experiments using the StatPlus2007 software [www.analystsoft.com]. Production levels of recombinant CXCRs-Fc protein by producer cells are presented in table 5.
Анализ полученных данных показывает, что биосинтетическая активность полученных штаммов-продуцентов различается менее чем на порядок и максимальная продукция целевого белка наблюдается для клона G2K. Уровень продукции составляет по расчетным данным более 180±16 мг/л. В связи с этим он был выбран как наиболее эффективный продуцент в ряду исследованных клонов HEK293-CXCRs-Fc, и дальнейшая работа проводилась именно с ним.Analysis of the data obtained shows that the biosynthetic activity of the obtained producer strains differs by less than an order of magnitude and the maximum production of the target protein is observed for the G2K clone. The production level according to the calculated data is more than 180 ± 16 mg / l. In this regard, he was chosen as the most effective producer in the series of studied clones HEK293-CXCRs-Fc, and further work was carried out with him.
Пример 6. Выделение и очистка рекомбинантного белка CXCRs-Fc из культуральной жидкостиExample 6. Isolation and purification of recombinant protein CXCRs-Fc from the culture fluid
Для отработки условий выделения и очистки рекомбинантного CXCRs-Fc маточную культуру из матраца вносили в культуральный пакет с 1000 мл среды BD Cell™ MAb. Подготовленный пакет соединяли с модулями подачи воздуха, термостатирования и датчиками рН и DO биореактора BIOSTAT® CultiBag RM и культивировали в течение 7 суток. По окончании культивирования культуральную жидкость переносили в стеклянную емкость и использовали для оптимизации условий очистки.To work out the conditions for the isolation and purification of recombinant CXCRs-Fc, mattress culture was added to a culture bag with 1000 ml of BD Cell ™ MAb medium. The prepared bag was connected to the air supply, temperature control and pH and DO sensors of the BIOSTAT® CultiBag RM bioreactor and cultured for 7 days. At the end of the cultivation, the culture fluid was transferred into a glass container and used to optimize the purification conditions.
Основной протокол выделения и очистки целевого белка включает ряд стадий:The main protocol for isolation and purification of the target protein includes a number of stages:
1) стадия центрифугирования культуральной жидкости;1) the stage of centrifugation of the culture fluid;
2) аффинная хроматография на Prosep Ultra plus protein A;2) affinity chromatography on Prosep Ultra plus protein A;
3) катионообменная хроматография с использованием носителя Poros HS 50;3) cation exchange chromatography using
4) анионообменная хроматография с использованием носителя Q Sepharose FF.4) anion exchange chromatography using Q Sepharose FF carrier.
Стадия центрифугирования. В качестве исходного материала для выделения и очистки целевого белка использовали культуральную жидкость клеток-продуцентов рекомбинантного белка - Hek-CXCRs-Fc. По окончании инкубации клеток, культуральную жидкость объединяли (общий объем примерно 500 мл) и отделяли биомассу центрифугированием при 3000 об/мин при +4°С. Полученный супернатант использовали для выделения целевого белка.Stage centrifugation. As the starting material for the isolation and purification of the target protein, the culture fluid of the recombinant protein producing cells, Hek-CXCRs-Fc, was used. At the end of the cell incubation, the culture fluid was combined (total volume about 500 ml) and the biomass was separated by centrifugation at 3000 rpm at + 4 ° C. The resulting supernatant was used to isolate the target protein.
Очистка целевого белка методом аффинной хроматографии. Для оптимизации условий аффинной хроматографии сравнивали несколько матриц с иммобилизованными белками А или G: протеин А-агароза (Pierce), протеин G сефароза (GE), ProSepUltra Plus Protein A (Merck KGaA). Сравнительный анализ показал, что ProSepUltra Plus Protein А в отличие от других матриц характеризуется большой емкостью при скорости нагрузки до 10 мл/мин и устойчивостью к износу в процессе использования. Таким образом, для очистки рекомбинантного CXCRs-Fc использовали ProSepUltra Plus Protein А. Для этого культуральную жидкость наносили с помощью перистальтического насоса на колонку (2,5×10,2 см) с ProSepUltra Plus Protein А. После нанесения культуральной жидкости колонку промывали буферным раствором, содержащим 25 мМ Трис-HCl, 25 мМ натрия хлористого, 5 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,5 М хлорида тетраметиламмония, рН 7,0, затем аналогичным буфером без хлорида тетраметиламмония. Контроль проводили по оптической плотности элюата на длине волны 280 нм. Промывку проводили до полной отмывки несвязавшихся белков (значение оптической плотности на длине волны 280 нм меньше 0,001). Связавшийся с носителем целевой белок элюировали 100 мМ раствором уксусной кислоты. Скорость посадки, промывок и элюции поддерживали 10 мл/мин. Полученный образец белка хранили при температуре +4°С.Purification of the target protein by affinity chromatography. To optimize affinity chromatography conditions, several matrices were compared with immobilized proteins A or G: protein A-agarose (Pierce), protein G sepharose (GE), ProSepUltra Plus Protein A (Merck KGaA). A comparative analysis showed that ProSepUltra Plus Protein A, unlike other matrices, is characterized by a high capacity at a loading rate of up to 10 ml / min and resistance to wear during use. Thus, ProSepUltra Plus Protein A was used to purify recombinant CXCRs-Fc. For this purpose, the culture fluid was applied using a peristaltic pump to a column (2.5 × 10.2 cm) with ProSepUltra Plus Protein A. After applying the culture fluid, the column was washed with a buffer solution containing 25 mM Tris-HCl, 25 mM sodium chloride, 5 mM disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid, 0.5 M tetramethyl ammonium chloride, pH 7.0, then with the same buffer without tetramethylammonium chloride. The control was carried out on the optical density of the eluate at a wavelength of 280 nm. Washing was carried out until complete washing of unbound proteins (optical density at 280 nm is less than 0.001). The target protein bound to the carrier was eluted with 100 mM acetic acid. Planting, washing and elution rates were maintained at 10 ml / min. The obtained protein sample was stored at + 4 ° C.
Очистка целевого белка методом катионообменной хроматографии. Для отработки условий катионообменной хроматографии определяли оптимальные условия для нанесения и элюции целевого белка. Образец наносили в буфере с различными концентрациями соли и значениями рН (4,0, 4,5). Было установлено, что оптимальный состав буфера для нанесения образца 20 мМ натрия ацетат, 60 мМ натрий хлористый, рН 4,5. Для определения условий фракционирования образца элюцию белка вели линейным градиентом концентрации натрия хлористого (60-1000 мМ). Определили, что фракция целевого белка элюируется в буфере с 160 мМ концентрацией натрия хлористого. Ниже представлен конечный протокол очистки CXCRs-Fc на стадии катионообменной хроматографии.Purification of the target protein by cation exchange chromatography. To work out the conditions of cation-exchange chromatography, optimal conditions were determined for the deposition and elution of the target protein. The sample was applied in a buffer with different salt concentrations and pH values (4.0, 4.5). It was found that the optimal composition of the buffer for applying the sample is 20 mM sodium acetate, 60 mM sodium chloride, pH 4.5. To determine the conditions for sample fractionation, protein elution was performed using a linear gradient of sodium chloride concentration (60-1000 mM). The target protein fraction was determined to be eluted in a buffer with 160 mM sodium chloride concentration. Below is the final CXCRs-Fc purification protocol at the cation exchange chromatography stage.
Образец белка после аффинной хроматографии титровали 100 мМ раствором едкого натра до рН 4,5 и наносили с помощью перистальтического насоса на колонку (2,5×5,1 см) с носителем - Poros HS 50. После нанесения образца колонку промывали буферным раствором, содержащим 20 мМ натрия ацетат трехводный, 60 мМ натрий хлористый, рН 4,5. Контроль проводили по оптической плотности элюата на длине волны 280 нм. Промывку проводили до полной отмывки несвязавшихся белков (значение оптической плотности на длине волны 280 нм меньше 0,001). Связавшийся с носителем целевой белок элюировали буферным раствором, содержащим 20 мМ натрия ацетат трехводный, 160 мМ натрий хлористый, рН 4,5. Скорость посадки 5 мл/мин, промывок и элюции -10 мл/мин. Полученный образец белка хранили при температуре +4°С.After affinity chromatography, a protein sample was titrated with 100 mM sodium hydroxide solution to pH 4.5 and applied using a peristaltic pump to a column (2.5 × 5.1 cm) with a carrier —
Очистка целевого белка методом анионообменной хроматографии. Для отработки условий анионообменной хроматографии определяли оптимальные условия для нанесения и элюции целевого белка. Образец наносили в буфере с различными концентрациями соли и значениями рН (7,0, 8,0). Было установлено, что оптимальный состав буфера для нанесения образца 25 мМ Трис-HCl, 50 мМ натрий хлористый, рН 8,0. Для определения условий фракционирования образца элюцию белка вели линейным градиентом концентрации натрия хлористого (50-1000 мМ). Определили, что фракция целевого белка элюируется в буфере с 300 мМ концентрацией натрия хлористого. Ниже представлен конечный протокол очистки CXCRs-Fc на стадии анионообменной хроматографии.Purification of the target protein by anion exchange chromatography. To work out the conditions of anion-exchange chromatography, optimal conditions were determined for the deposition and elution of the target protein. The sample was applied in a buffer with different salt concentrations and pH values (7.0, 8.0). It was found that the optimal composition of the buffer for applying the sample is 25 mM Tris-HCl, 50 mM sodium chloride, pH 8.0. To determine the conditions for sample fractionation, protein elution was performed using a linear gradient of sodium chloride concentration (50-1000 mM). The target protein fraction was determined to be eluted in a buffer with 300 mM sodium chloride concentration. Below is the final CXCRs-Fc purification protocol for anion exchange chromatography.
Образец белка после катионообменной хроматографии титровали 1,5 М раствором трис(гидроксиметил)аминометана до рН 8,0 и наносили с помощью перистальтического насоса на колонку (1,2×8,9 см) с носителем Q Sepharose FF. После нанесения образца колонку промывали буферным раствором, содержащим 25 мМ Трис-HCl, 50 мМ натрий хлористый, рН 8,0. Контроль проводили по оптической плотности элюата на длине волны 280 нм. Промывку проводили до полной отмывки несвязавшихся белков (значение оптической плотности на длине волны 280 нм меньше 0,001). Связавшийся с носителем целевой белок элюировали буферным раствором, содержащим 25 мМ Трис-HCl, 300 мМ натрий хлористый, рН 8,0. Скорость посадки 5 мл/мин, промывок и элюции - 10 мл/мин. Полученный образец белка хранили при температуре +4°С.A sample of the protein after cation-exchange chromatography was titrated with a 1.5 M solution of Tris (hydroxymethyl) aminomethane to pH 8.0 and applied using a peristaltic pump to a column (1.2 × 8.9 cm) with Q Sepharose FF carrier. After applying the sample, the column was washed with a buffer solution containing 25 mM Tris-HCl, 50 mM sodium chloride, pH 8.0. The control was carried out on the optical density of the eluate at a wavelength of 280 nm. Washing was carried out until complete washing of unbound proteins (optical density at 280 nm is less than 0.001). The target protein bound to the carrier was eluted with a buffer solution containing 25 mM Tris-HCl, 300 mM sodium chloride, pH 8.0. Planting speed of 5 ml / min, washing and elution - 10 ml / min. The obtained protein sample was stored at + 4 ° C.
Пробы полученного рекомбинантного белка анализировали с помощью электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Сканирование высушенных гелей показало, что степень чистоты целевого рекомбинантного белка составляет не менее 96%. Результаты очистки на промежуточных стадиях представлены в таблице 6.Samples of the obtained recombinant protein were analyzed by electrophoresis on a 12% polyacrylamide gel under denaturing conditions. Scanning the dried gels showed that the purity of the target recombinant protein is at least 96%. The cleaning results at the intermediate stages are presented in table 6.
Литературные источникиLiterary sources
- Backliwal G. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions // Nucleic Acids Res. - 2008. - Vol.36. - N 15. - p. 96.- Backliwal G. Rational vector design and multi-pathway modulation of transient transfection under serum-free conditions // Nucleic Acids Res. - 2008. - Vol.36. -
- Barter E.F., Stone, M.J. Synergistic Interactions between Chemokine Receptor Elements in recognition of Interleukin-8 by soluble receptor mimics. // Biochemistry. - 2012. - Vol. 51. - N6. - P. 1322-1331.- Barter E.F., Stone, M.J. Synergistic Interactions between the receptor of the Interleukin-8 by the receptor mimics. // Biochemistry. - 2012. - Vol. 51. - N6. - P. 1322-1331.
- Brunner, D. Serum-free cell culture: the serum-free media interactive online database // ALTEX. - 2010. - Vol. 27. - №1. - p. 53-62.- Brunner, D. Serum-free media interactive online culture // ALTEX. - 2010. - Vol. 27. -
- Geisse S. Recombinant protein production by transient gene transfer into Mammalian cells // Methods Enzymol. - 2009. - Vol. 463. - p. 223-238.- Geisse S. Recombinant protein production by transient gene Mammalian cells // Methods Enzymol. - 2009. - Vol. 463. - p. 223-238.
- Helmer D. Rational design of a peptide capture agent for CXCL8 based on a model of the CXCL8:CXCR1 complex. // RSC Advances. - 2015. - V. 5. - p. 25657-25668.CXCL8: CXCR1 complex. // RSC Advances. - 2015. - V. 5. - p. 25657-25668.
- Joseph P.R., Solution N.M.R. Characterization of WTCXCL8 monomer and dimer binding to CXCR1 N-terminal domain // Protein Science. - 2015. - V. 24. - p. 81-92.- Joseph P.R., Solution N.M.R. Characterization of WTCXCL8 monomer and dimer binding to the CXCR1 N-terminal domain // Protein Science. - 2015. - V. 24. - p. 81-92.
- Kontermann R.E. Strategies of extended serum half-life of protein terapeutics. // Curr. Opin. Biotechnol. - 2011. - V.22. - p. 868-876.- Kontermann R.E. Strategies of extended serum half-life of protein terapeutics. // Curr. Opin. Biotechnol. - 2011. - V.22. - p. 868-876.
- Krishnamurthy, V.M. Multivalency in Ligand Design // Fragment-based Approaches in Drug Discovery. - Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2006. - p. 11-53.- Krishnamurthy, V.M. Multivalency in Ligand Design // Fragment-based Approaches in Drug Discovery. - Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2006. - p. 11-53.
- Levin D., Golding В., Strome S.E., Sauna Z.E. Fc fusion as a platform technology: potential for modulating immunogenicity.// Trends in Biotechnology. - 2015. - V. 33. - p. 27-34.- Levin D., Golding V., Strome S.E., Sauna Z.E. Fc fusion as a platform technology: potential for modulating immunogenicity. // Trends in Biotechnology. - 2015. - V. 33. - p. 27-34.
- Park, S.H. Interactions of Interleukin-8 with the Human Chemokine Receptor CXCR1 in Phospholipid Bilayers by NMR Spectroscopy // J Mol Biol. - 2011. - V. 414. - p. 194-203.- Park, S.H. Interactions of Interleukin-8 with the Human Chemokine Receptor CXCR1 in Phospholipid Bilayers by NMR Spectroscopy // J Mol Biol. - 2011. - V. 414. - p. 194-203.
- Roopenian D.C., Akilesh S. FcRn: The neonatal Fc receptor comes of age. // Nat. Rev. Immunol. - 2007. - V. 7. - p. 715-725.- Roopenian D.C., Akilesh S. FcRn: The neonatal Fc receptor comes of age. // Nat. Rev. Immunol. - 2007. - V. 7. - p. 715-725.
- Skelton N.J. Structure of a CXC chemokine-receptor fragment in complex with interleukin-8 // Structure. - 1999. - V. - p. 157-168.- Skelton N.J. Structure of a CXC chemokine-receptor fragment in complex with interleukin-8 // Structure. - 1999. - V. - p. 157-168.
- www.analystsoft.com- www.analystsoft.com
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017130708A RU2676317C1 (en) | 2017-08-30 | 2017-08-30 | GENETIC DESIGN OF pCXCRS-Fc FOR OBTAINING A RECOMBINANT MIXED PROTEIN WITH ANTI-IL-8 ACTIVITY |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017130708A RU2676317C1 (en) | 2017-08-30 | 2017-08-30 | GENETIC DESIGN OF pCXCRS-Fc FOR OBTAINING A RECOMBINANT MIXED PROTEIN WITH ANTI-IL-8 ACTIVITY |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2676317C1 true RU2676317C1 (en) | 2018-12-27 |
Family
ID=64753700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017130708A RU2676317C1 (en) | 2017-08-30 | 2017-08-30 | GENETIC DESIGN OF pCXCRS-Fc FOR OBTAINING A RECOMBINANT MIXED PROTEIN WITH ANTI-IL-8 ACTIVITY |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2676317C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992018641A1 (en) * | 1991-04-10 | 1992-10-29 | The Trustees Of Boston University | Interleukin-8 receptors and related molecules and methods |
| WO1995019436A1 (en) * | 1994-01-13 | 1995-07-20 | The Regents Of The University Of California | Mammalian monocyte chemoattractant protein receptors |
| US20130011436A1 (en) * | 2010-03-11 | 2013-01-10 | Health Research, Inc. | Methods and Compositions Containing Fc Fusion Proteins for Enhancing Immune Responses |
-
2017
- 2017-08-30 RU RU2017130708A patent/RU2676317C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992018641A1 (en) * | 1991-04-10 | 1992-10-29 | The Trustees Of Boston University | Interleukin-8 receptors and related molecules and methods |
| WO1995019436A1 (en) * | 1994-01-13 | 1995-07-20 | The Regents Of The University Of California | Mammalian monocyte chemoattractant protein receptors |
| US20130011436A1 (en) * | 2010-03-11 | 2013-01-10 | Health Research, Inc. | Methods and Compositions Containing Fc Fusion Proteins for Enhancing Immune Responses |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BALDI L. et al., "Transient Gene Expression in Suspension HEK-293 Cells: Application to Large-Scale Protein Production." Biotechnology progress, 2005, 21(1):148-153. * |
| BALDI L. et al., "Transient Gene Expression in Suspension HEK-293 Cells: Application to Large-Scale Protein Production." Biotechnology progress, 2005, 21(1):148-153. КОСОБОКОВА Е. Н. и др., "Слитные белки на основе антител и цитокинов: получение, функциональность и перспективы применения в онкологии." Соврем. технол. мед., 2013, 5(4):102-111. * |
| КОСОБОКОВА Е. Н. и др., "Слитные белки на основе антител и цитокинов: получение, функциональность и перспективы применения в онкологии." Соврем. технол. мед., 2013, 5(4):102-111. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102064230B1 (en) | Chimeric Antigen Receptor and Methods of Use Thereof | |
| DK2114985T3 (en) | Complexes of multivariable antigens and target antibody, a humanized | |
| US11591409B2 (en) | Anti-PD-L1/anti-PD-1 natural antibody structure-like heterodimeric bispecific antibody and preparation thereof | |
| CN106397598B (en) | Expression and preparation method of multivalent multispecific antibody and immune hybrid protein | |
| JP2022513383A (en) | Bispecific antibody and its preparation method and use | |
| US20170274072A1 (en) | Bispecific antibody targeting human epidermal growth factor receptor | |
| WO2017143839A1 (en) | Method for synthesis of pharmaceutical recombinant protein based on intein | |
| CN110028584B (en) | Bispecific antibodies against EGFR and MET proteins | |
| JP2009504136A (en) | Recombinant method for production of monoclonal antibodies against CD52 for the treatment of chronic lymphocytic leukemia | |
| CN114945384A (en) | Highly sialylated multimeric binding molecules | |
| JP2022531128A (en) | Production of antibody-derived polypeptides by polypeptide chain exchange | |
| GB2518221A (en) | Tetravalent antigen-binding protein molecule | |
| CN114106195A (en) | Multifunctional fusion protein and application thereof | |
| JP2022530045A (en) | Therapeutic multispecific polypeptide activated by exchange of polypeptide chains | |
| RU2676317C1 (en) | GENETIC DESIGN OF pCXCRS-Fc FOR OBTAINING A RECOMBINANT MIXED PROTEIN WITH ANTI-IL-8 ACTIVITY | |
| CN108300725B (en) | Soluble single-chain antibody superantigen fusion gene and protein, and preparation and application thereof | |
| RU2640259C2 (en) | Mat40 antibody binding with domain i of extracellular part of epidermal her2/cd340 growth factor receptor, and its application for cancer treatment | |
| AU2022369312A1 (en) | Heterodimeric fc cytokines and uses thereof | |
| WO2023070056A2 (en) | Heterodimeric fc cytokines and uses thereof | |
| Lee et al. | Rational design of a bifunctional AND-gate ligand to modulate cell–cell interactions | |
| KR20230172538A (en) | FC-derived polypeptides | |
| RU2822890C1 (en) | Method of producing dimeric form of immunoglobulin iga1-isotype in mammalian cells | |
| RU2822889C1 (en) | Method of producing dimeric form of mutant iga2m1-isotype immunoglobulin in mammalian cells | |
| RU2426780C2 (en) | EXPRESSION PLASMID DNA p6E-tTF CODING EXTRACELLULAR AND TRANSMEMBRANE DOMAINS OF HUMAN TISSUE FACTOR AND E.coli BL21 [DE3]/p6E-tTF STRAIN - PRODUCER OF RECOMBINANT HUMAN TISSUE FACTOR | |
| RU2513689C1 (en) | Antibody to human erythropoietin (versions) and hybridome strain producing monoclonal antibody to erythropoietin |