RU2672581C2 - Микрофлюидное устройство для исследования влияния химических веществ на клетки млекопитающих - Google Patents
Микрофлюидное устройство для исследования влияния химических веществ на клетки млекопитающих Download PDFInfo
- Publication number
- RU2672581C2 RU2672581C2 RU2016152533A RU2016152533A RU2672581C2 RU 2672581 C2 RU2672581 C2 RU 2672581C2 RU 2016152533 A RU2016152533 A RU 2016152533A RU 2016152533 A RU2016152533 A RU 2016152533A RU 2672581 C2 RU2672581 C2 RU 2672581C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microfluidic
- microfluidic device
- cell
- nutrient medium
- damping element
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 78
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 29
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 35
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 35
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 18
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 17
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 17
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 claims description 17
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 7
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 26
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 8
- 230000004087 circulation Effects 0.000 abstract description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 26
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 25
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 18
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 6
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 5
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 4
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 4
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 4
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 4
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- DZKGMGPLDJOVCX-UHFFFAOYSA-N Dechloroethylcyclophosphamide Chemical compound ClCCNP1(=O)NCCCO1 DZKGMGPLDJOVCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 3
- 201000003471 ovarian fetiform teratoma Diseases 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 3
- WMCQWXZMVIETAO-UHFFFAOYSA-N 2-(2-carboxyethyl)-4-methyl-5-propylfuran-3-carboxylic acid Chemical compound CCCC=1OC(CCC(O)=O)=C(C(O)=O)C=1C WMCQWXZMVIETAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 101150053185 P450 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 2
- XMAYWYJOQHXEEK-OZXSUGGESA-N (2R,4S)-ketoconazole Chemical compound C1CN(C(=O)C)CCN1C(C=C1)=CC=C1OC[C@@H]1O[C@@](CN2C=NC=C2)(C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)OC1 XMAYWYJOQHXEEK-OZXSUGGESA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical group [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004425 Makrolon Substances 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960004125 ketoconazole Drugs 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012907 medicinal substance Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000021368 organ growth Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002174 soft lithography Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000603 stem cell niche Anatomy 0.000 description 1
- 210000004895 subcellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000007514 turning Methods 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002034 xenobiotic effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micromachines (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается микрофлюидного устройства для исследования влияния химических веществ на клетки млекопитающих, представляющего собой чип с размещенной в нем микрофлюидной системой. При этом микрофлюидная система выполнена в виде четырех однотипных независимых замкнутых контуров для циркуляции питательной среды, каждый из которых включает объединенные микрожидкостными каналами микронасос, клеточную ячейку, демпфирующий элемент и технологическое отверстие. Демпфирующий элемент выполнен в виде демпфирующей камеры с эластичной мембраной, сообщающейся сверху с атмосферой, а снизу - с питательной средой, а микрожидкостные каналы в месте соединения с демпфирующим элементом имеют округлое расширение. Изобретение обеспечивает сокращение временных затрат на проведение исследований при реализации in vitro условий культивирования, максимально приближенных к физиологическим. 13 з.п. ф-лы, 1 пр., 8 ил., 1 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для исследования влияния различных химических веществ на клетки млекопитающих в условиях in vitro, в частности, может применяться для проведения стандартизованных однотипных одномоментных независимых доклинических исследований гепатотоксичности и/или биотрансформации лекарственных средств. Микрофлюидное устройство может применяться в лабораториях, проводящих тестирование и разработку фармацевтических препаратов и косметической продукции.
Уровень техники
Согласно национальным нормативным документам, доклинические исследования токсичности лекарственных средств проводятся с использованием лабораторных животных. В то же время известно, что ответ различных организмов на воздействие ксенобитиков характеризуется видовой специфичностью, определяющей, в том числе, и степень токсичности вещества для организма. В связи с этим ряд разрабатываемых лекарственных субстанций и средств являются не токсичными для лабораторных животных, но оказываются токсичны для человека. На сегодняшний день все активнее развиваются методики оценки видоспецифичной для человека токсичности лекарственных средств и их комбинаций в исследованиях in vitro с использованием в качестве объекта клеточных моделей органов и тканей человека.
Для облегчения вывода из организма лекарственные вещества, как правило, превращаются в более гидрофильные вещества. Эта биотрансформация лекарственных веществ может влиять на биологическую активность ксенобиотика: в результате превращения может произойти как инактивация, так и повышение токсичности исходного соединения.
Биотрансформация включает в себя множество путей, условно их делят на метаболизм 1-й и 2-й фазы. В 1-й фазе происходит образование функциональных групп, которые позволяют образовывать конъюгаты на 2-й фазе. Практически всегда биотрансформация катализируется ферментами и чаще всего это происходит в печени.
Многие реакции биотрансформации лекарственных средств могут быть индуцированы или ингибированы другими препаратами при их совместном приеме. Это может приводить к уменьшению или увеличению концентрации препарата и его метаболитов (включая активные или токсические метаболиты) в плазме крови. Знание особенностей биотрансформации препарата позволяет избежать клинические последствия в виде неэффективности лекарственных средств и их избыточной токсичности.
Биотрансформация большинства лекарственных соединений протекает в печени под действием цитохромов Р450. Цитохромы Р450 - это ферменты, связанные с мембраной, которые в основном локализуются в эндоплазматическом ретикулуме, но могут быть также расположены в других органеллах, например, в митохондриях. Цитохромы Р450 содержат атом железа в порфириновом комплексе и катализируют реакции окисления и, при определенных условиях, могут катализировать также восстановление субстрата. Изучение вклада различных изоформ цитохрома Р450 в общий метаболизм лекарственного средства позволяет, в частности, определить форму выведения препарата из организма: в неизмененном виде или по одному из метаболических путей. Помимо этого, знание путей биотрансформации позволяет оценить влияние особенностей метаболизма пациента.
Результаты исследований, проведенных на лабораторных животных, также, как и в случае оценки токсичности, не могут быть в полной мере экстраполированы на человека в связи со значительными межвидовыми отличиями функционирования изоферментов цитохрома Р-450 [Seri В. et al. Cell types, lineage, and architecture of the germinal zone in the adult dentate gyrus. // J. Comp. Neurol. 2004. Vol. 478, No 4. P. 359-378]. С другой стороны, исследования не могут проводиться исключительно на добровольцах, так как сопряжены с риском для здоровья человека и являются высокозатратными. В этой связи все большее применение находят экспериментальные исследования процессов биотрансформации ксенобиотиков в печени человека in vitro с использованием в качестве объекта наблюдения срезов или клеток печени, а также отдельных субклеточных структур. Клеточные линии гепатоцитов, а также клеточные модели печени человека считаются перспективными объектами при изучении острой токсичности лекарственных средств в лабораторных тестах in vitro на доклиническом этапе.
Из уровня техники известен прибор ONIX производства CellASIC [Lee P. et al. Automated live cell imaging of cell migration across a microfluidic-controlled chemoattractant gradient. // Nat Meth. 2015. Vol. 12. No 11], предназначенный для проведения доклинических исследований фармакологических препаратов на клеточных моделях. В данном приборе клетки культивируются в двух 96-луночных планшетах. Недостатками прибора является отсутствие возможности длительного культивирования клеток и отсутствие замкнутого режима.
Из патента US 9273276 известно фармакокинетическое устройство для культивирования клеток, которое может быть использовано для тестирования лекарственных препаратов. Устройство содержит, в одном из вариантов осуществления изобретения, первое микромасштабное устройство культивирования и инструмент управления. Первое микромасштабное устройство культивирования включает несколько микромасштабных резервуаров с геометрией, симулирующей множество взаимодействий in vivo с культуральной средой, при этом каждый резервуар снабжен входным и выходным отверстиями для протекания через него культуральной среды, сами резервуары соединены микроканалом.
Недостатком данного решения является наличие единственного контура для культивирования клеток на одном устройстве, что затрудняет проведение масштабных исследований и приводит к увеличению стоимости каждого исследования в отдельности.
Из патента РФ №2517046 известно устройство «орган-на-чипе», которое может быть использовано для культивирования, исследования и тестирования тестовых соединений на тканях, органоидах и нишах стволовых клеток в формате миниатюризированной интегральной схемы. Устройство содержит резервуары для подачи среды; секции роста органов с полостями для органов; резервуары для сброса среды. Полость для органов посредством микрожидкостных каналов соединена с резервуаром для подачи среды и резервуаром для сброса среды. Посредством заявленного автономного устройства осуществляют культивирование клеток и органоидов, путем загрузки суспензии клеток или среза ткани в полости для органов, герметизации данных полостей, а также тестирование тестовых соединений на клетках и органоидах с последующей их микроскопической оценкой и определением параметров среды датчиками. Такое соединение «полости для органов» с резервуаром для сброса среды, объединенного с контролируемым датчиками устройством, обеспечивает долговременное культивирование клеток и возможность перемещения данного устройства без отсоединения жидкостных каналов от внешнего резервуара для сброса, что обеспечивает автономность функционирования устройства и расширение круга его использования в клеточных технологиях.
Однако конструкция данного устройства не обладает замкнутым контуром среды для культивирования органов, что не позволяет проводить изучение биотрансформации лекарственных средств, а также проводить сопоставление результатов изучения токсичности, полученных с использованием других методов.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является микрофлюидный чип, известный из патента RU 2584598 и предназначенный для испытаний лекарственных препаратов, создания клеточных моделей тканей и органов млекопитающих и моделирования межорганных взаимодействий. Чип содержит пластину из поликарбоната, на которой отлит слой полидиметилсилоксана с размещенной в нем микрофлюидной системой. Микрофлюидная система включает микрожидкостный контур, состоящий из объединенных микрожидкостными каналами шести ячеек для одновременного культивирования клеточных моделей тканей и органов млекопитающих. Изобретение обеспечивает более аутентичное поведение клеточных моделей органов при культивировании, а, следовательно, и получение более достоверных результатов при тестировании воздействия различных препаратов на жизнеспособность моделей.
Необходимо отметить, что применение известного микрофлюидного чипа при проведении рутинных исследований, таких как изучение гепатотоксичности или биотрансформации лекарственных препаратов, представляется затруднительным: наличие одного контура для культивирования клеток приводит к большим затратам времени на тестирование лекарственных препаратов. При этом известный микрофлюидный чип не обладает возможностью масштабирования, что обусловлено целым рядом факторов, связанных как с технологией изготовления самого чипа, так и с методологией проведения исследований с его помощью.
Раскрытие изобретения
Технология изготовления известных микрофлюидных чипов предполагает, как правило, приклеивание предметного стекла к слою ПДМС, поэтому необходимым является наличие достаточно толстых стенок у микроканалов и других элементов микрофлюидной системы в целях обеспечения герметичности в местах примыкания слоя ПДМС к предметному стеклу. Кроме того, для реализации условий микроциркуляции необходимо соблюдение требований к общей длине микрофлюидного контура, а также к характерным размерам его элементов. С другой стороны, поскольку исследования, как правило, проводятся с использованием стандартного оптического микроскопа, то размеры микрофлюидного чипа не должны превышать размеров стандартного предметного стекла. Следовательно, простое уменьшение габаритов известных микрофлюидных устройств и размещение нескольких его экземпляров в ограниченном пространстве чипа (то есть стандартное масштабирование известного решения) приведет к нарушению требований к реализации условий микроциркуляции, нарушению технологии изготовления, а также ко взаимному влиянию микрофлюидных контуров, размещенных на одном чипе. Поэтому разработка устройства, обладающего несколькими замкнутыми контурами для культивирования и при этом, обеспечивающего исследование ответного воздействия на клетки или клеточные модели различных химических веществ в условиях, приближенных к in vivo, является нетривиальной задачей. Следует также отметить, что в рамках решения задачи исследования влияния химических веществ на клеточную модель органа или ткани для обеспечения статистической достоверности минимально необходимо проведение четырех испытаний. Таким образом, размещение четырех контуров на чипе позволило бы выполнять статистически достоверное исследование с использованием одного чипа.
Задача настоящего изобретения заключалась в разработке микрофлюидного устройства для исследования влияния различных веществ на клетки или клеточные модели, включая исследование безопасности лекарственных препаратов, в частности, их гепатотоксичности и/или биотрансформации, характеризующегося топологией размещения микрофлюидных элементов, обеспечивающей, с одной стороны, размещение максимального количества контуров (не менее четырех) на ограниченной площади, а с другой стороны - максимальное соответствие условий in vitro условиям in vivo в процессе проведения исследований с обеспечением надежности устройства в процессе его работы и технологичности при его изготовлении.
Техническим результатом является сокращение временных затрат на проведение исследований при реализации in vitro условий культивирования, максимально приближенных к физиологическим.
Указанный технический результат может быть получен при выполнении микрофлюидного устройства в виде биочипа, в котором реализуются независимое культивирование не менее четырех клеточных моделей с имитацией микроциркуляции. При этом размеры чипа соответствуют размерам стандартного предметного стекла, что позволяет проводить исследования клеточных моделей тканей и органов оптическими методами без необходимости их изъятия.
Поставленная задача решается тем, что микрофлюидное устройство для исследования влияния химических веществ на клетки млекопитающих представляет собой чип с размещенной в нем микрофлюидной системой, при этом микрофлюидная система выполнена в виде четырех однотипных независимых замкнутых контуров для циркуляции питательной среды, каждый из которых включает объединенные микрожидкостными каналами микронасос для обеспечения движения питательной среды в контуре, клеточную ячейку для культивирования клеточных моделей тканей и органов млекопитающих, демпфирующий элемент для гашения скачков давления и скорости движения питательной среды в контуре и технологическое отверстие для доступа к питательной среде в контуре.
В предпочтительном варианте реализации изобретения чип имеет трехслойную структуру, выполненную из оптически прозрачного материала. Верхний слой чипа может быть образован пластиной из поликарбоната, на нижней стороне которой размещен слой полидиметилсилоксана, а нижний слой может быть образован стандартным предметным стеклом, при этом микрофлюидная система расположена в слое полидиметилсилоксана с обеспечением герметизации каналов посредством предметного стекла. Пластина из поликарбоната может быть выполнена толщиной от 5 до 10 мм, слой полидиметилсилоксана - толщиной от 1 до 2 мм, а предметное стекло - толщиной от 0,16 до 1 мм.
Демпфирующий элемент может представлять собой демпфирующую камеру с эластичной мембраной, сообщающейся сверху со сквозным отверстием, выполненным в пластине из поликарбоната, а снизу - с демпфирующей камерой. Предпочтительно мембрана демпфирующего элемента выполнена из полидиметилсилоксана толщиной от 0,1 до 0,6 мм и диаметром от 1 до 10 мм.
В одном из вариантов выполнения изобретения пары соседних микрофлюидных контуров обладают взаимной центральной симметрией с расположением всех центров симметрии на одной прямой.
Микронасос может представлять собой рабочую камеру, ограниченную с двух сторон нормально закрытыми клапанами, при этом рабочая камера и нормально закрытые клапаны выполнены в виде уширений микрожидкостного канала в форме цилиндра, закрытого сверху эластичной мембраной, а каждый клапан снабжен размещенной на мембране перемычкой, выполненной с возможностью перекрытия канала. Предпочтительно мембраны рабочей камеры и клапанов выполнены из полидиметилсилоксана толщиной от 0,1 до 0,6 мм и диаметром от 1 до 10 мм.
Клеточная ячейка может быть выполнена в форме цилиндра высотой от 1 до 2 мм и диаметром от 2 до 10 мм.
Микрофлюидное устройство выполнено с габаритными размерами, не превышающими 70-80 мм × 20-30 мм. Замкнутый контур выполнен длиной, выбранной из диапазона от 36 до 76 мм.
В предпочтительном варианте выполнения микрожидкостные каналы выполнены прямоугольного сечения с высотой от 0,1 мм до 1 мм и шириной от 0,1 до 1 мм, в месте соединения с демпфером имеют округлое расширение с радиусом кривизны от 0,5 до 1 мм, а в месте соединения с клеточной ячейкой имеют округлое расширение с радиусом кривизны от 0,1 до 2,1 мм.
Технологическое отверстие может быть выполнено диаметром от 1 до 10 мм.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами и графиками.
На фиг. 1 представлен общий вид микрофлюидного устройства.
На фиг. 2. представлено схематичное изображение заявляемого устройства, вид снизу.
На фиг. 3 представлено схематичное изображение заявляемого устройства вид сбоку.
На фиг. 4 - схематичное изображение насоса, вид сбоку.
На фиг. 5 - общий вид клеточной ячейки.
На фиг. 6 - макет разработанного устройства, общий вид.
На фиг. 7 представлена диаграмма, иллюстрирующая влияние специфических ингибиторов цитохромов на биотрансформацию циклофосфамида (по вертикальной оси отложены значения концентраций метаболита циклофосфамида, N-дехлорэтил-циклофосфамида, при добавлении ингибиторов, нормализованные относительно значения концентрации N-дехлорэтил-циклофосфамида, измеренного в отсутствии ингибиторов).
Позициями на чертежах обозначены: 1 - пластина из поликарбоната (основа), 2 - слой полидиметилсилоксана (ПДМС), 3.1 - первый замкнутый контур для циркуляции питательной среды, 3.2 - второй замкнутый контур для циркуляции питательной среды, 3.3 - третий замкнутый контур для циркуляции питательной среды, 3.4 - четвертый замкнутый контур для циркуляции питательной среды, 4 - предметное стекло, 5 - микрофлюидный канал (микроканал), 6 - клеточная ячейка для культивирования клеточных моделей тканей и органов млекопитающих, 7 - микронасос, 8 - демпфирующий элемент, 9 - технологическое отверстие, 10 - пробка клеточной ячейки, 11 - уплотнительное кольцо пробки, 12 - фитинг для подключения пневматических трубок, 13 - заглушка технологического отверстия, 14 - уплотнительное кольцо заглушки, 15 - рабочая камера микронасоса, 16 - нормально закрытый клапан микронасоса, 17 - отверстие в пластине из поликарбоната, сообщающееся с демпфирующим элементом.
Осуществление изобретения
Конструкция микрофлюидного устройства (чипа) представляет собой по меньшей мере, трехслойную структуру, выполненную из оптически прозрачного материала (см. фиг. 1, 3). Ниже представлено описание заявляемого устройства с указанием конкретных параметров его элементов, которые не ограничивают настоящее изобретение, а предназначены лишь для лучшего понимания его сущности. В частности, верхний слой устройства может быть образован пластиной 1, выполненной, например, из поликарбоната толщиной 10 мм, на нижней стороне которой размещен слой из газопроницаемого эластичного органического материала, например, полимерного оптически прозрачного полидиметилсилоксана (ПДМС) 2 толщиной 2 мм, содержащего, по меньшей мере, четыре независимых однотипных замкнутых контура 3 для циркуляции питательной среды, а также нижний слой, образованный стандартным предметным стеклом 4 толщиной 1 мм, формирующим нижнюю стенку контуров. Каждый из замкнутых контуров содержит (см. фиг. 2) расположенные по направлению циркуляции питательной среды и объединенные системой микрофлюидных (микрожидкостных) каналов 5 клеточную ячейку 6 для культивирования клеток или клеточных моделей тканей и органов млекопитающих, микронасос 7, обеспечивающий непрерывную перфузию питательной среды, демпфирующий элемент 8 в виде гибкой эластичной мембраны, которая обеспечивает плавное изменение давления в клеточной ячейке и технологическое отверстие 9 для заполнения контура и вывода из него воздуха и излишков культуральной среды. Микрофлюидные каналы, соединяющие элементы каждого контура, выполнены прямоугольного сечения (например, с высотой 0.1 мм и шириной 0.4 мм). Применение каналов постоянного сечения позволило обеспечить приемлемую технологичность формы для литья слоя ПДМС при сохранении условий культивирования клеток, приближенных к физиологическим, при наличии микроциркуляции. Минимальная длина замкнутого контура составляет 36 мм, максимальная длина - 76 мм.
Клеточная ячейка 6 каждого контура сверху герметизирована пробкой 10 с уплотнительным кольцом 11, расположенной в сквозном отверстии, выполненном в слое поликарбоната пластины 1 над клеточной ячейкой и закрепленной в ней с помощью резьбового соединения. В одном из вариантов исполнения, диаметр сквозного отверстия в слое поликарбоната соответствует диаметру клеточной ячейки. В пластине 1 из поликарбоната также выполнены резьбовые отверстия для фитингов 12 (например, с метрической резьбой М3), которые могут представлять собой пружинную цангу с уплотнительным кольцом. Фитинги 12 обеспечивают герметичное соединение насосов 7 микрофлюидного чипа с микробиореактором (например, «Гомункулус») с помощью воздушных трубок (для приведения в действие микронасосов). Технологическое отверстие 9 выполнено в виде расширения микроканала 5 в форме круга диаметром, например, 2 мм, сообщающимся со сквозным отверстием в пластине 1 из поликарбоната, выполненным такого же диаметра и снабженного резьбой для установки заглушки 13 с уплотнительным кольцом 14.
Каждая клеточная ячейка 6 выполнена цилиндрической формы (см. фиг. 5), при этом боковые стенки ячейки образованы слоем ПДМС, а дно ячейки образовано предметным стеклом, герметизирующим микроканалы 5. Микрофлюидные каналы в местах соединения с клеточной ячейкой образуют уширения, при этом проекции границ каналов в месте уширения на плоскость предметного стекла имеют форму расходящихся кривых с радиусом кривизны, например, 2,1 мм (с целью устранения неоднородностей и обеспечения более равномерного распределения поля скоростей по площади ячейки), а проекция клеточной ячейки представляет собой окружность, например, с диаметром 4,2 мм, при этом продольная ось каналов проходит через центр окружности. Высота ячейки выбрана из условия обеспечения величин касательных напряжений на клеточной модели ткани или органа в пределах физиологических значений, и может составлять 2 мм. Допустимая величина отклонения от указанных параметров в данной конкретной реализации может составлять не более чем 10%.
Микронасос 7, интегрированный в замкнутый контур, является перистальтическим и представляет собой, например, для описываемого варианта исполнения, рабочую камеру 15, ограниченную с двух сторон нормально закрытыми клапанами 16 (см. фиг. 4). При этом рабочая камера и нормально закрытые клапаны выполнены в виде уширений микроканала в форме цилиндра высотой 1 мм, образующего в проекции на плоскость предметного стекла круг диаметром 3 мм, и закрытых сверху эластичной мембраной из ПДМС толщиной 0,53 мм и диаметром 3 мм. При этом каждый клапан снабжен перемычкой шириной 0,4 мм и высотой 0,1 мм, размещенной на мембране, обеспечивающей возможность перекрытия микроканала. При подаче на клапан воздуха под давлением ниже атмосферного - клапан открывается, при подаче воздуха под давлением выше атмосферного - клапан герметично закрывается. Преимуществами данных клапанов является высокая технологичность изготовления, обусловленная использованием только одного слоя ПДМС. Положение трех мембран каждого микронасоса контролируется устройством управления пневматически, посредством воздушных трубок, подключенных к соответствующим фитингам 12. Переключение повышенного и пониженного давления на клапанах и мембране рабочей камеры микронасоса в определенной последовательности обеспечивает циркуляцию жидкости (питательной среды) по микроканалам 5 через ячейки 6 в определенном направлении и с определенной скоростью.
Перистальтический насос 7 создает резкие пульсации тока жидкости с частотой, равной частоте работы клапанов, которые оказывают пагубное воздействие на культивируемые клетки человека. Для того, чтобы минимизировать ударное воздействие микронасоса на клеточные модели, в каждом замкнутом независимом контуре 3 МФУ расположен демпфирующий элемент 8 в виде интегрированной в контур мембраны (например, диаметром 4 мм), расположенной на расстоянии не менее 5 мм от перистальтического насоса и представляющей собой истонченный слой ПДМС, который снизу сообщается с питательной средой, протекающей в микроканале, а сверху - с атмосферой посредством отверстия 17, выполненного в пластине 1 из поликарбоната, что позволяет гасить резкие скачки давления и скорости жидкости в микроканалах и не создавать стрессовую ситуацию для клеток в клеточной ячейке. При этом микроканал непосредственно под мембраной выполнен с расширением, повторяющим форму мембраны. Толщина мембраны демпфера может варьироваться от 0,2 мм до 0,4 мм. Данный диапазон удовлетворяет требованиям к работе демпфера и возможности его изготовления. Если мембрана будет тоньше, она будет рваться при изготовлении, если мембрана будет толще, она перестанет сглаживать поток. При этом отверстие 17 выполнено диаметром не менее 5 мм, что обеспечивает необходимую для подвижности демпфера воздушную полость. Такая конструкция проста в реализации, надежна и не будет приводить к контаминации. Микроканалы в месте соединения с демпфером имеют округлое расширение с радиусом кривизны от 0,5 до 1 мм, обеспечивающее ламинарное движение среды через демпфирующий элемент.
Расположение замкнутых контуров в слое ПДМС выбрано из условия максимального удаления контуров друг от друга и от края предметного стекла, что предотвращает образование тонких частей из ПДМС при работе устройства (в противном случае слой ПДМС при всех четырех работающих контурах будет подвергаться большим механическим растяжениям на небольшой площади) и отклеивание ПДМС от стекла по периметру. Исключается взаимное влияние контуров друг на друга, что обеспечивает одновременную независимую работу всех контуров. При этом общий размер микрофлюидного устройства, как правило, не превышает 70-80 мм × 20-30 мм. В одном из вариантов выполнения устройства замкнутые контуры для циркуляции питательной среды расположены в один ряд вдоль протяженной стороны устройства, при этом пары соседних контуров обладают взаимной центральной симметрией с расположением всех центров симметрии на одной прямой (вторая пара контуров взаимно ориентирована аналогично первой паре). При этом технологическое отверстие и клеточная ячейка первого контура 3.1 расположены ближе к краю чипа с его короткой стороны (на расстоянии 2 мм от края), а микронасос расположен на максимальном удалении от края. Демпфирующий элемент расположен между микронасосом и технологическим отверстием и приближен к краю чипа с его длинной стороны на расстояние 2 мм. Второй контур 3.2 повернут относительно первого на 180° по направлению циркуляции питательной среды таким образом, что интегрированный в него микронасос расположен напротив микронасоса первого контура. Последовательное расположение микрофлюидных элементов в третьем контуре 3.3 аналогично их расположению в первом контуре, а расположение элементов в четвертом контуре 3.4 - аналогично второму.
Радиусы кривизны микроканалов, соединяющих элементы одного контура, выбраны исходя из решения задачи оптимизации с условием обеспечения минимального гидравлического сопротивления микрофлюидных элементов при сохранении возможности размещения не менее четырех замкнутых контуров в ограниченном пространстве чипа. В одном из вариантов выполнения устройства микроканал, соединяющий микронасос 7 и клеточную ячейку 6, выполнен с двумя изгибами - на 90° и на 120°; микроканал, соединяющий клеточную ячейку 6 и технологическое отверстие 9 выполнен с изгибом 120°; микроканал, соединяющий технологическое отверстие 9 и демпфер 8 выполнен с изгибом 120°, а канал, соединяющий демпфер 8 с микронасосом 7, выполнен с двумя изгибами - на 135° и на 45°.
Клеточные модели, загружаемые в клеточные ячейки 6 для тестирования лекарственных средств, могут быть представлены сфероидами, состоящими из клеток одного или множества типов, являющихся первичной культурой или клеточной линией, либо монослоем клеток различного происхождения.
Заявляемое МФУ может быть изготовлено методом «мягкой литографии» (А flexible method for rapid-prototyping of PDMS microfluidic chips using direct-writing for generation of polymer-master-structures L. Gutzweiler, F. Stumpf, L. Riegger, P. Koltay, R. Zengerle and L. Tanguy) посредством литья полидиметилсилоксана в формы. Шаблон для литья может быть изготовлен фотолитографически или механической обработкой. Для формирования закрытых структур поверхность ПДМС активируют с помощью низкотемпературной плазмы и прижимают к чистой стеклянной поверхности.
Заполнение контуров питательной средой осуществляют с помощью специальной пробки и шприца, которые с помощью резьбового соединения устанавливают в ячейку. Забор питательной среды может быть осуществлен посредством микродозатора со сменными пластиковыми наконечниками.
Таким образом, процессы, воспроизводимые в заявляемом устройстве, с помощью реализации топологии контуров с клеточными ячейками и микронасосами, приближены к естественным процессам, протекающим в организме человека. При этом микрофлюидное устройство позволяет культивировать клеточные модели в течение не менее 72 часов, а также проводить исследования клеточных моделей оптическими методами без необходимости их изъятия, с возможностью забора образцов культуральной среды и внесения веществ через отдельный порт (технологическое отверстие). Предлагаемое решение позволяет проводить тестирование максимального количества препаратов при различных условиях, что дает возможность сократить временные затраты на проведение тестирования, а также уменьшить стоимость проводимых исследований при сохранении высокого уровня достоверности и информативности результатов исследований.
Пример конкретного выполнения
Был изготовлен макет микрофлюидного устройства (см. фиг. 6), представляющего собой слой полидиметилсилоксана толщиной 2 мм и размерами 25×75 мм, отлитый на слое поликарбоната марки Makrolon 2099 фирмы Bayer толщиной 10 мм с образованием четырех замкнутых контуров с микрофлюидными элементами (клеточная ячейка, микронасос, демпфер и технологическое отверстие), соединенными микрожидкостными каналами, и герметизированных предметным стеклом толщиной 1 мм. Микрофлюидные каналы имели высоту 0,1 мм и ширину 0,4 мм. Клеточные ячейки были выбраны высотой 2 мм и диаметром 4,4 мм. Рабочая камера микронасоса была выполнена высотой 0,1 мм и закрыта сверху мембраной из ПДМС толщиной 0,44 мм и диаметром 3 мм. Клапаны микронасоса, выполненные в виде уширения микроканала, также были закрыты сверху эластичной мембраной из ПДМС толщиной 0,53 мм и диаметром 3 мм с перемычкой шириной 0,4 мм и высотой 0,1 мм, перекрывающей микроканал. В качестве демпфирующего элемента использовалась мембрана толщиной 0,35 мм и диаметром 4 мм. Технологическое отверстие выполнено сквозным с диаметром 2 мм, содержащим резьбу М3 глубиной 4 мм.
Пластины из поликарбоната для макетов МФУ были изготовлены на фрезерном станке с ЧПУ, заглушки и пробки изготавливались точением на токарном станке с последующей фрезеровкой шлицов. В качестве мастер-шаблона использовали алюминиевую пластину, в которой фрезерованием получали выступающие относительно плоскости пластины каналы будущего МФУ. Сборка МФУ осуществлялась заполнением заливочной формы полидиметилсилоксаном с центрифугированием. Предварительно собранные формы для заливки заготовки МФУ, помещались на ротор центрифуги. Далее экспериментальным способом были подобранны параметры центрифугирования, а именно температура центрифугирования и количество оборотов вращения ротора центрифуги в минуту. Подбором количества оборотов вращения ротора - 200 об/мин, удалось добиться наиболее качественного и полного заполнения заливочной формы, избежать возникновения пузырей в толще полидиметилсилоксана. Для усиления адгезии слоя ПДМС на поверхности поликарбоната использовали праймер-грунт Primer PR-1200 фирмы Dow Corning.
В качестве исследуемой клеточной модели была выбрана клеточная модель печени человека (КМПЧ) в виде сфероидов, состоящих из 5000 дифференцированных клеток гепатокарциномы человека линии HepaRG.
Для получения сфероидов на подготовительной стадии исследований осуществляли культивирование клеток линии HepaRG в полной питательной среде (ППС), содержащей Williams' Medium Е (Gibco, США), 2 мМ L-глутамина (Gibco, США), 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, Thermo Scientific, США), 5 мкг/мл рекомбинантного инсулина человека (Gibco, США), 5×10-5 М гидрокортизона гемисукцината (Sigma, США), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США). При достижении культуры клеток линии HepaRG конфлюэнтного монослоя, осуществляли дифференцировку клеток в ППС с добавлением 2% диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 14 дней. После завершения дифференцировки в культуре клеток HepaRG с помощью фазово-контрастной микроскопии наблюдали образование трабекул, окруженных холангиоцитами. Затем клеточную суспензию переносили в планшет Perfecta3DTM Hanging Drop Plates, который позволяет методом висячей капли формировать сфероид, и культивировали в CO2 - инкубаторе в течение 3 дней. Образовавшиеся сфероиды, состоящие из дифференцированных клеток HepaRG, переносили в 96-луночный планшет и культивировали в бессывороточной питательной среде (БПС) в течение 2 дней в CO2-инкубаторе для завершения формирования трехмерных образований.
Далее осуществляли исследование гепатотоксичности и биотрансформации лекарственного средства при воздействии на полученные клеточные модели. В качестве тестируемого лекарственного средства использовали раствор циклофосфамида в бессывороточной питательной среде в концентрациях 1,2; 2,5; 5; 10; 20; 40; 60; 80; 100 мМ (экспериментальные образцы). Для контроля наличия возможных систематических ошибок при формировании образцов КМПЧ использовали ячейки с контрольным образцом - КМПЧ, не обработанные тестируемым лекарственным веществом.
Для получения статистически достоверных результатов проводили по четыре идентичных эксперимента - по одному в каждом контуре микрофлюидного чипа, при этом для каждой концентрации циклофосфамида, а также для проведения контрольного теста и получения фоновых значений использовали по одному микрофлюидному устройству.
В качестве бессывороточной питательной среды использовали среду, содержащую William's Е (Gibco, США), 2 мМ L-глутамина (Gibco, США), 1 мг/мл альбумина сыворотки крови человека (Sigma, США), питательной добавки, состоящей из инсулина, трансферрина и селена (5.5 мкг/мл инсулина, Gibco, США), несущественных аминокислот (Gibco, США), 50 мкМ гидрокортизона гемисукцината (Sigma, США), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США).
Для исследования гепатотоксичности в каждую из четырех ячеек для культивирования клеток микрофлюидного устройства вносили по 10 образцов КМПЧ (что соответствовало 50 тыс. клеток HepaRG), затем из ячеек отбирали питательную среду и вносили по 125 мкл экспериментального образца раствора циклофосфамида в одной из указанных выше концентраций. Затем микрофлюидное устройство подключали к микробиореактору «Гомункулус», включали режим циркуляции среды и помещали МФУ в CO2-инкубатор, где осуществляли инкубирование КМПЧ с лекарственным средством в течение 48 ч при режиме работы МБР 5 Гц ±10 кПа. Аналогичные действия осуществляли с контрольным образцом КМПЧ, при этом вместо экспериментального образца раствора циклофосфамида использовали БПС. Затем выполняли цитотоксический тест с нейтральным красным (НК-тест) и с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромидом (МТТ-тест).
Для проведения теста с НК из ячеек МФУ микродозатором со сменными пластиковыми наконечниками отбирали питательную среду, образцы КМПЧ, а также ячейки без клеток (фон) промывали дважды фосфатно-солевым буфером (ФСБ) в объеме 250 мкл, затем инкубировали с 33 мкг/мл НК, растворенного в полной питательной среде, не содержащей эмбриональную сыворотку, в течение 3 ч в СО2-инкубаторе. После чего, образцы КМПЧ промывали раствором ФСБ в объеме 250 мкл. Образовавшиеся кристаллы растворяли в 130 мкл десорбирующего раствора (1% раствор ледяной уксусной кислоты, 50% EtOH, 49% Н2О) в течение 20 мин в темноте с использованием шейкера. Затем переносили по 100 мкл образовавшегося раствора в 96-ти луночный планшет. Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 540 нм на микропланшетном спектрофотометре BioRad X-mark (BioRad, США). Оценку жизнеспособности КМПЧ производили по формуле: жизнеспособность, % = 100% * (оптическая плотность экспериментального образца - оптическая плотность десорбирующего раствора) / (оптическая плотность контрольного образца - оптическая плотность десорбирующего раствора). Основным критерием при оценке жизнеспособности клеток являлось изменение сигнала оптической плотности раствора в зависимости от накопившегося в живых клетках красителя за время инкубации. Все полученные значения оптической плотности раствора после инкубации с контрольными образцами КМПЧ находились в диапазоне от 0.205 до 1.645 опт. ед, а растворителя от 0.043 до 0.059 опт. ед.
Для проведения МТТ-теста из ячеек МФУ отбирали питательную среду, образцы КМПЧ, а также ячейки без клеток (фон) промывали дважды ФСБ в объеме 250 мкл, затем инкубировали с 0.5 мг/мл МТТ, растворенного в БПС, в течение 3 ч в СО2-инкубаторе. После чего, образцы КМПЧ промывали раствором ФСБ в объеме 250 мкл. Образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 130 мкл ДМСО (десорбирующий раствор) в течение 20 мин в темноте с использованием шейкера. Переносили по 100 мкл раствора в 96-ти луночный планшет. Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 570 нм на микропланшетном спектрофотометре BioRad X-mark (BioRad, США). Оценку жизнеспособности производили по формуле: жизнеспособность, % = 100% * (оптическая плотность экспериментального образца - оптическая плотность десорбирующего раствора) / (оптическая плотность контрольного образца - оптическая плотность десорбирующего раствора).
С помощью программного обеспечения Prism® вычислили значение log ЕС50 и HillSlope по значениям кривой зависимости жизнеспособности КМПЧ от концентрации циклофосфамида. Значение IC50 циклофосфамида для образцов КМПЧ составило 11,2 мкМ при оценке тестом с НК и 10 мкМ для МТТ-теста.
Для проведения исследования биотрансформации циклофосфамида в каждую из четырех ячеек для культивирования клеток микрофлюидного устройства вносили по 100 образцов КМПЧ, затем из ячеек отбирали питательную среду и вносили по 125 мкл среды, содержащей специфичные ингибиторы изоформ цитохрома Р450 в одной из концентраций, указанных в таблице 1, и 1 мкМ тестируемого вещества (циклофосфамида). В качестве контрольного образца использовали 1 мкМ тестируемого вещества в отсутствие ингибиторов. Микрофлюидное устройство подключали к микробиореактору «Гомункулус» и проводили культивирование в течение 24 ч при частоте работы клапанов 5 Гц и давлении ±10 кПа, затем из каждой ячейки отбирали 100 мкл среды, и добавляли 35 мкл охлажденного до -20°С ацетонитрила и проводили хроматомасс-спектрометрический анализ для определения концентрации исходных веществ и их метаболитов.
Хромато-масс-спектрометрический анализ. Разделение полученных образцов среды проводили на ВЭЖХ колонке ZORBAX Eclipse Plus C18 4,6 мм × 150 мм, 5 мкм (Agilent, США) при скорости потока 1 мл/мин и Т=40°С и градиентном режиме: 0-3 мин - 100% фазы А (0,425 об. % муравьиной кислоты в 5% растворе ацетонитрила в воде), 3-11 мин - линейный градиент от 100 до 60% фазы А, 11-13 мин - линейный градиент от 60 до 0% фазы А, 13-15 мин - 0% фазы А, 15-18 мин - линейный градиент от 0 до 100% фазы Б, 18-21 мин - 100% фазы Б (0,425 об. % муравьиной кислоты в ацетонитриле). Детекцию продуктов биотрансформации проводили на хроматомасс-спектрометре LCMS 8030 (Shimadzu, Япония).
Было показано, что в биотрансформации циклофосфамида участвует цитохром 3А4, так как при использовании его специфического ингибитора кетоконазола, было снижено образование основного метаболита N-дехлорэтил-циклофосфамида (см. фиг. 8).
Таким образом, для изучения токсичности и биотрансформации циклофосфамида было использовано 22 и 5 ед. описываемого микрофлюидного устройства, соответственно. Для проведения того же объема исследований с использованием устройств, описанных в патентах US 9273276 и RU 2584598, потребовалось бы 80 и 20 ед., соответственно, что существенно увеличило бы время проведения анализа. Кроме того, реализация испытаний на базе описанной микрофлюидной системы обеспечило сохранение условий, максимально приближенных к физиологическим, за счет наличия постоянной и равномерной ламинарной микроциркуляции культуральной среды в каждом замкнутом микрофлюидном контуре.
Claims (14)
1. Микрофлюидное устройство для исследования влияния химических веществ на клетки млекопитающих, представляющее собой чип с размещенной в нем микрофлюидной системой, при этом микрофлюидная система выполнена в виде четырех однотипных независимых замкнутых контуров для циркуляции питательной среды, каждый из которых включает объединенные микрожидкостными каналами перистальтический микронасос для обеспечения движения питательной среды в контуре, клеточную ячейку для культивирования клеточных моделей тканей и органов млекопитающих, демпфирующий элемент для гашения скачков давления и скорости движения питательной среды в контуре и технологическое отверстие для доступа к питательной среде в контуре, при этом демпфирующий элемент выполнен в виде демпфирующей камеры с эластичной мембраной, сообщающейся сверху с атмосферой, а снизу - с питательной средой, а микрожидкостные каналы в месте соединения с демпфирующим элементом имеют округлое расширение с радиусом кривизны от 0,5 до 1 мм.
2. Микрофлюидное устройство по п. 1, характеризующееся тем, что чип имеет трехслойную структуру, выполненную из оптически прозрачного материала.
3. Микрофлюидное устройство по п. 2, характеризующееся тем, что верхний слой чипа образован пластиной из поликарбоната, на нижней стороне которой размещен слой полидиметилсилоксана, а нижний слой образован стандартным предметным стеклом, при этом микрофлюидная система расположена в слое полидиметилсилоксана с обеспечением герметизации каналов посредством предметного стекла.
4. Микрофлюидное устройство по п. 3, характеризующееся тем, что пластина из поликарбоната выполнена толщиной от 5 до 10 мм, слой полидиметилсилоксана выполнен толщиной от 1 до 2 мм, а предметное стекло выполнено толщиной от 0,16 до 1 мм.
5. Микрофлюидное устройство по п. 1, характеризующееся тем, что эластичная мембрана демпфирующего элемента выполнена из полидиметилсилоксана толщиной от 0,1 до 0,6 мм и диаметром от 1 до 10 мм.
6. Микрофлюидное устройство по п. 1, характеризующееся тем, что пары соседних контуров обладают взаимной центральной симметрией с расположением всех центров симметрии на одной прямой.
7. Микрофлюидное устройство по п. 1, характеризующееся тем, что микронасос представляет собой рабочую камеру, ограниченную с двух сторон нормально закрытыми клапанами, при этом рабочая камера и нормально закрытые клапаны выполнены в виде уширений микрожидкостного канала в форме цилиндра, закрытого сверху эластичной мембраной, а каждый клапан снабжен размещенной на мембране перемычкой, выполненной с возможностью перекрытия канала.
8. Микрофлюидное устройство по п. 7, характеризующееся тем, что мембраны рабочей камеры и клапанов выполнены из полидиметилсилоксана толщиной от 0,1 до 0,6 мм и диаметром от 1 до 10 мм.
9. Микрофлюидное устройство по п. 1, характеризующееся тем, что клеточная ячейка выполнена в форме цилиндра высотой от 1 до 2 мм и диаметром от 2 до 10 мм.
10. Микрофлюидное устройство по п. 1, характеризующееся тем, что выполнено с габаритными размерами, не превышающими 70-80 мм × 20-30 мм.
11. Микрофлюидное устройство по п. 1, характеризующееся тем, замкнутый контур выполнен длиной, выбранной из диапазона от 36 до 76 мм.
12. Микрофлюидное устройство по п. 1, характеризующееся тем, что микрожидкостные каналы выполнены прямоугольного сечения с высотой от 0,1 мм до 1 мм и шириной от 0,1 до 1 мм.
13. Микрофлюидное устройство по п. 1, характеризующееся тем, что микрожидкостные каналы в месте соединения с клеточной ячейкой имеют округлое расширение с радиусом кривизны от 0,1 до 2,1 мм.
14. Микрофлюидное устройство по п. 1, характеризующееся тем, что технологическое отверстие выполнено диаметром от 1 до 10 мм.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016152533A RU2672581C2 (ru) | 2016-12-30 | 2016-12-30 | Микрофлюидное устройство для исследования влияния химических веществ на клетки млекопитающих |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016152533A RU2672581C2 (ru) | 2016-12-30 | 2016-12-30 | Микрофлюидное устройство для исследования влияния химических веществ на клетки млекопитающих |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016152533A RU2016152533A (ru) | 2018-07-03 |
RU2016152533A3 RU2016152533A3 (ru) | 2018-07-03 |
RU2672581C2 true RU2672581C2 (ru) | 2018-11-16 |
Family
ID=62813887
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016152533A RU2672581C2 (ru) | 2016-12-30 | 2016-12-30 | Микрофлюидное устройство для исследования влияния химических веществ на клетки млекопитающих |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2672581C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU191716U1 (ru) * | 2019-05-22 | 2019-08-19 | Общество с ограниченной ответственностью научно-технический центр "БиоКлиникум" (ООО НТЦ "БиоКлиникум") | Микрофлюидный чип для культивирования и исследования клеточных моделей |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CZ2020134A3 (cs) * | 2020-03-12 | 2021-05-19 | Univerzita Jana Evangelisty Purkyně V Ústí Nad Labem | Mikrofluidní čip pro průtokové kultivace biologických objektů |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2522613C2 (ru) * | 2012-08-21 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова Российской академии наук, (ИК РАН) | Микрофлюидное устройство для кристаллизации белков в условиях невесомости |
GB2531615A (en) * | 2015-02-02 | 2016-04-27 | Atlas Genetics Ltd | Instrument for performing a diagnostic test on a fluidic cartridge |
RU2584598C1 (ru) * | 2015-03-27 | 2016-05-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" | Микрофлюидный чип для создания клеточных моделей органов млекопитающих |
-
2016
- 2016-12-30 RU RU2016152533A patent/RU2672581C2/ru not_active Application Discontinuation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2522613C2 (ru) * | 2012-08-21 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова Российской академии наук, (ИК РАН) | Микрофлюидное устройство для кристаллизации белков в условиях невесомости |
GB2531615A (en) * | 2015-02-02 | 2016-04-27 | Atlas Genetics Ltd | Instrument for performing a diagnostic test on a fluidic cartridge |
RU2584598C1 (ru) * | 2015-03-27 | 2016-05-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" | Микрофлюидный чип для создания клеточных моделей органов млекопитающих |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
UPADHAYA S., et al., Miniaturized microfluidic formats for cell-based high-throughput screening.Crit Rev Biomed Eng. 2009;37(3):193-257. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU191716U1 (ru) * | 2019-05-22 | 2019-08-19 | Общество с ограниченной ответственностью научно-технический центр "БиоКлиникум" (ООО НТЦ "БиоКлиникум") | Микрофлюидный чип для культивирования и исследования клеточных моделей |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2016152533A (ru) | 2018-07-03 |
RU2016152533A3 (ru) | 2018-07-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10843189B2 (en) | Methods and apparatus for cell culture array | |
Park et al. | Organoids-on-a-chip | |
Young et al. | Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments | |
McLean et al. | Powering ex vivo tissue models in microfluidic systems | |
Domansky et al. | Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering | |
US8501462B2 (en) | Insert device for multiwell plate | |
US10023832B2 (en) | Interconnections of multiple perfused engineered tissue constructs and microbioreactors, multi-microformulators and applications of the same | |
US20130059322A1 (en) | Cell culture and invasion assay method and system | |
Hattersley et al. | Study of ethanol induced toxicity in liver explants using microfluidic devices | |
JP2018515146A (ja) | インビトロ3d細胞培養実験のためのマイクロ流体デバイス | |
US11149242B2 (en) | Methods and apparatus for perfusion and environment control of microplate lab ware | |
Baudoin et al. | Parallelized microfluidic biochips in multi well plate applied to liver tissue engineering | |
RU2672581C2 (ru) | Микрофлюидное устройство для исследования влияния химических веществ на клетки млекопитающих | |
Berthier et al. | Kit-On-A-Lid-Assays for accessible self-contained cell assays | |
Marasso et al. | Optimized design and fabrication of a microfluidic platform to study single cells and multicellular aggregates in 3D | |
Wei et al. | Microfluidics-enabled 96-well perfusion system for high-throughput tissue engineering and long-term all-optical electrophysiology | |
Lin et al. | Orthogonal screening of anticancer drugs using an open-access microfluidic tissue array system | |
US9657260B2 (en) | Method and system for continous monitoring of toxicity | |
RU189789U1 (ru) | Микрофлюидное устройство для исследования влияния химических веществ на клетки млекопитающих | |
Borenstein | Organs-on-chips: how microsystems technology can transform the drug development process | |
Renggli et al. | Design and engineering of multiorgan systems | |
Li et al. | The method to generate pulsatile circulatory fluid flow using microfluidics | |
Dufva | Background and Organ on a Chip | |
MacNearney et al. | Microfluidic Probe for Neural Organotypic Brain Tissue and Cell Perfusion | |
Erb | Design and Principal Evaluation of In-Line Monitoring Systems for Dynamic Microscale Fluid Networks |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FA92 | Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted) |
Effective date: 20180822 |
|
FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20181009 |