RU2668879C1 - Method for preparing the surface of bone tissue samples to study their microstructure using a scanning electron microscope - Google Patents
Method for preparing the surface of bone tissue samples to study their microstructure using a scanning electron microscope Download PDFInfo
- Publication number
- RU2668879C1 RU2668879C1 RU2017138725A RU2017138725A RU2668879C1 RU 2668879 C1 RU2668879 C1 RU 2668879C1 RU 2017138725 A RU2017138725 A RU 2017138725A RU 2017138725 A RU2017138725 A RU 2017138725A RU 2668879 C1 RU2668879 C1 RU 2668879C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bone tissue
- scanning electron
- preparing
- electron microscope
- minutes
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биологии и экспериментальной медицины и может применяться при проведении исследовательских работ, связанных с изучением пространственной микроструктуры образцов костной ткани. Предназначен для подготовки образцов костной ткани для исследования их микроструктуры при помощи сканирующего электронного микроскопа.The invention relates to the field of biology and experimental medicine and can be used in research work related to the study of the spatial microstructure of bone tissue samples. Designed for the preparation of bone tissue samples for the study of their microstructure using a scanning electron microscope.
Известен способ подготовки образцов недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью для многоцелевых исследований, включая сканирующую электронную микроскопию. Способ отличается тем, что там берут образцы тканей 3-4 мм и дегидратируют в режиме плавного перехода от спирта к ацетону с увеличением времени на этапах от 70% до 96% спирта до 1 ч, обезвоживают в 2 сменах 70% спирта по 1 ч, в двух сменах 80% спирта по 1 ч, в двух сменах 90% спирта по 1 ч, в двух сменах 96% спирта по 1 ч, в двух сменах 100% спирта по 30 мин, в двух сменах 100% ацетона по 30 мин, затем осуществляют пропитку в режиме плавного перехода от ацетона до смолы: смесь смола-ацетон 100% 3:1 - 2 ч, смесь смола-ацетон 100% 1:1 - 2 ч, смесь смола-ацетон 100% 1:3 - 2 ч и перед полимеризацией пропитывают в смоле при комнатной температуре до 10 суток. (Патент 2466375 RU, опубл. 10.11.2012, Способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе).A known method of preparing samples of undecalcified articular cartilage with the underlying subchondral bone for multi-purpose studies, including scanning electron microscopy. The method is characterized in that they take 3-4 mm tissue samples and dehydrate in a smooth transition from alcohol to acetone with an increase in time from 70% to 96% alcohol to 1 hour, dehydrate in 2 shifts of 70% alcohol for 1 hour, in two shifts of 80% alcohol for 1 hour, in two shifts of 90% alcohol for 1 h, in two shifts of 96% alcohol for 1 h, in two shifts of 100% alcohol for 30 minutes, in two shifts of 100% acetone for 30 minutes, then they are impregnated in a smooth transition from acetone to resin: resin-acetone mixture 100% 3: 1 - 2 hours, resin-acetone mixture 100% 1: 1 - 2 hours, resin-acetone mixture 100% 1: 3 - 2 hours and before polymerization they are impregnated in resin at room temperature for up to 10 days. (Patent 2466375 RU, publ. 10.11.2012, Method for preparing samples of biological tissues for research in a scanning electron microscope).
Данная методика является сложной в исполнении и трудоемкой, требует значительных затрат времени и реагентов.This technique is complicated and time-consuming, requires a significant investment of time and reagents.
Известен способ подготовки образцов биологических тканей для многоцелевых исследований, в том числе для сканирующей электронной микроскопии. Способ включает фиксацию, промывку и обезвоживание тканей, при этом образцы после обезвоживания, не высушивая, переносят в смесь дегидранта и камфена, затем последовательно пропитывают в двух порциях расплавленного камфена при температуре 51-60°С. При этом, время каждого этапа подготовки образцов к микроскопическому исследованию подбирают индивидуально, в зависимости от размера образца (Патент 2397472 RU, опубл. 20.08.2010, Способ подготовки недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью для многоцелевых исследований).A known method of preparing samples of biological tissues for multi-purpose studies, including for scanning electron microscopy. The method includes fixing, washing and dehydration of tissues, while the samples after dehydration, without drying, are transferred to a mixture of dehydrant and camphene, then they are subsequently impregnated in two portions of molten camphene at a temperature of 51-60 ° C. Moreover, the time of each stage of preparation of samples for microscopic examination is selected individually, depending on the size of the sample (Patent 2397472 RU, publ. 08/20/2010, Method for preparing undecalcified articular cartilage with underlying subchondral bone for multi-purpose studies).
Однако данный способ также длителен по времени и требует применения труднодоступных реактивов (камфен).However, this method is also time-consuming and requires the use of hard-to-reach reagents (camphene).
Был предложен способ подготовки к исследованию методом сканирующей электронной микроскопии регенерата костной ткани (Ирьянов Ю.М. Особенности подготовки образца регенерата кости для исследования при помощи сканирующей электронной микроскопии / Ю.М. Ирьянов, Т.Ю. Ирьянова // Морфологические ведомости - 2010. - №1. - С.135-137). Регенераты фиксировали в 2% растворе параформальдегида, глутарового альдегида и 0,1% пикриновой кислоты на фосфатном буфере (рН 7,4) при температуре +4°С в течение 48 часов, промывали, обезвоживали и заливали в аралдит по следующей схеме: 100% ацетон + смесь аралдитов в соотношениях 3:1, 1:1 и 1:3 по 12 часов в каждой смеси; смесь аралдитов без ацетона - 24 часа. Ацетон использовали для уменьшения вязкости заливочной среды. Смесь аралдитов состояла из 50 мл аралдита М (Araldite М - Araldite CY212), 45 мл аралдита Н (Araldite Hardener HY964), 5 мл MNA (Methyl-endo methylene phathalic anhydride) и 1 мл катализатора полимеризации DMP-30 (Trimethylaminomethyl phenol). Аралдитовый блок обрезали, обнажали исследуемую поверхность регенерата, которую затем полировали мелкоабразивными материалами (водостойкой абразивной бумагой Р 200, Р 400, Р 1000).A method was proposed for preparing a bone tissue regenerate for study using scanning electron microscopy (Iryanov Yu.M. Features of preparing a sample of bone regenerate for research using scanning electron microscopy / Yu.M. Iryanov, T.Yu. Iryanova // Morphological Sheets - 2010. - No. 1. - S.135-137). The regenerates were fixed in a 2% solution of paraformaldehyde, glutaraldehyde and 0.1% picric acid in phosphate buffer (pH 7.4) at + 4 ° C for 48 hours, washed, dehydrated and poured into araldite according to the following scheme: 100% acetone + araldite mixture in the ratios of 3: 1, 1: 1 and 1: 3 for 12 hours in each mixture; Araldite mixture without acetone - 24 hours. Acetone was used to reduce the viscosity of the pouring medium. The mixture of araldites consisted of 50 ml of araldite M (Araldite M - Araldite CY212), 45 ml of araldite H (Araldite Hardener HY964), 5 ml of MNA (Methyl-endo methylene phathalic anhydride) and 1 ml of DMP-30 polymerization catalyst (Trimethylaminomethyl phenol). The araldite block was cut off, the investigated surface of the regenerate was exposed, which was then polished with finely abrasive materials (waterproof abrasive paper P 200, P 400, P 1000).
Недостатком данного метода является необходимость применения дорогостоящих материалов, техническая сложность методики и длительность по времени.The disadvantage of this method is the need to use expensive materials, the technical complexity of the method and the length of time.
Для подготовки образцов биологических тканей к СЭМ было предложено промывать образец изотоническим раствором хлорида натрия, после чего использовать водный раствор хлоридов одного из редкоземельных элементов или их смеси с экспозицией от 6 часов до 20 минут с целью суправитального контрастирования (Патент 2578977 RU, опубл. 27.03.2016, Способ подготовки биологического образца к исследованию при помощи сканирующей электронной микроскопии).To prepare samples of biological tissues for SEM, it was proposed to wash the sample with an isotonic sodium chloride solution, and then use an aqueous solution of the chlorides of one of the rare-earth elements or a mixture of them with an exposure of 6 hours to 20 minutes for the purpose of supravital contrast (Patent 2578977 RU, publ. 27.03. 2016, Method for preparing a biological sample for research using scanning electron microscopy).
Данный метод не подходит для подготовки к исследованию костной ткани, так как не предполагает удаления остатков костного мозга, что затрудняет визуализацию трабекулярной микроструктуры образца ткани.This method is not suitable for preparation for the study of bone tissue, since it does not involve the removal of bone marrow residues, which complicates the visualization of the trabecular microstructure of the tissue sample.
Задачей настоящего изобретения является упрощение методики, а также уменьшение времени и материальных затрат на подготовку образцов костной ткани для исследования при помощи сканирующего электронного микроскопа.The objective of the present invention is to simplify the methodology, as well as to reduce the time and material cost of preparing bone tissue samples for examination using a scanning electron microscope.
Технический результат заключается в упрощении методики и уменьшении времени и материальных затрат на ее осуществление. Способ не требует специального оборудования, применения токсичных и дорогостоящих реактивов, является простым, эффективным, быстрым и безопасным.The technical result consists in simplifying the technique and reducing time and material costs for its implementation. The method does not require special equipment, the use of toxic and expensive reagents, is simple, effective, fast and safe.
Заявляется способ подготовки образцов костной ткани для исследования в сканирующем электронном микроскопе, включающий фиксацию и удаление липофильных компонентов в виде остатков костного мозга, отличающийся тем, что образец нативной кости помещают в 100% ортофосфорную кислоту, экспозиция составляет 6 минут, далее его промывают под проточной водой в течение 5 минут и сушат при комнатной температуре в течение часа.The method of preparing bone tissue samples for examination in a scanning electron microscope, including fixing and removing lipophilic components in the form of bone marrow residues, characterized in that the native bone sample is placed in 100% phosphoric acid, the exposure is 6 minutes, then it is washed under running water for 5 minutes and dried at room temperature for one hour.
Изобретение поясняется следующими иллюстрациями.The invention is illustrated by the following illustrations.
На фиг. 1 показан фрагмент субхондральной костной ткани латерального мыщелка большеберцовой кости.In FIG. 1 shows a fragment of the subchondral bone tissue of the lateral condyle of the tibia.
На фиг. 2 показаны образцы для исследования после обработки в ортофосфорной кислоте.In FIG. 2 shows samples for research after treatment in phosphoric acid.
На фиг. 3 показан образец до обработки. Трабекулярную структуру кости оценить невозможно, так как костные поры заполнены липофильными компонентами в виде костного мозга, экранирующими поле зрения.In FIG. 3 shows a sample before processing. It is impossible to evaluate the trabecular structure of the bone, since the bone pores are filled with lipophilic components in the form of bone marrow, which shield the field of view.
На фиг. 4 показан образец после обработки в 100% ортофосфорной кислоте в течение 6 минут. Липофильные компоненты полностью удалены, что дает возможность оценивать микроархитектонику костной ткани образца. Хорошо видна пористая структура кости и костные трабекулы.In FIG. Figure 4 shows a sample after treatment in 100% phosphoric acid for 6 minutes. The lipophilic components are completely removed, which makes it possible to evaluate the microarchitectonics of the bone tissue of the sample. The porous structure of the bone and bone trabeculae are clearly visible.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Способ включает фиксацию и удаление липофильных компонентов костного мозга. Образец нативной кости помещают в 100% ортофосфорную кислоту, экспозиция составляет 6 минут, после чего его промывают под проточной водой в течение 5 минут и сушат при комнатной температуре в течение одного часа.The method includes fixing and removing lipophilic components of the bone marrow. A native bone sample is placed in 100% phosphoric acid, the exposure is 6 minutes, after which it is washed under running water for 5 minutes and dried at room temperature for one hour.
При помощи остеотома готовится образец трабекулярной кости в форме прямоугольного параллелепипеда. Для фиксации ткани и удаления липофильного компонента в виде костного мозга образец помещают в 100% ортофосфорную кислоту, экспозиция составляет 6 минут, далее его промывают под проточной водой в течение 5 минут и сушат при комнатной температуре в течение часа, после чего осуществляется монтаж объекта на промежуточную подложку. После нанесения токопроводящего слоя препарат можно исследовать при помощи сканирующего электронного микроскопа.Using the osteotome, a sample of the trabecular bone in the form of a rectangular parallelepiped is prepared. To fix tissue and remove the lipophilic component in the form of bone marrow, the sample is placed in 100% phosphoric acid, the exposure is 6 minutes, then it is washed under running water for 5 minutes and dried at room temperature for an hour, after which the object is mounted on an intermediate the substrate. After applying the conductive layer, the drug can be examined using a scanning electron microscope.
Пример выполнения способа. Для исследования был взят фрагмент субхондральной костной ткани латерального мыщелка большеберцовой кости (фиг. 1). Из указанного фрагмента изготовили 6 образцов (фиг. 2). Три образца составляли группу контроля, они были исследованы без предварительной обработки (фиг. 3). Оставшиеся образцы готовились с использованием ортофосфорной кислоты по указанной выше методике, после чего также исследовались в сканирующем электронном микроскопе (фиг. 4). В ходе обработки была достигнута фиксация костной ткани и получена возможность оценить ее микроархитектонику.An example of the method. For the study, a fragment of the subchondral bone tissue of the lateral condyle of the tibia was taken (Fig. 1). 6 samples were prepared from the indicated fragment (Fig. 2). Three samples made up the control group; they were examined without preliminary treatment (Fig. 3). The remaining samples were prepared using phosphoric acid according to the above procedure, after which they were also examined in a scanning electron microscope (Fig. 4). During the treatment, fixation of bone tissue was achieved and it was possible to evaluate its microarchitectonics.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017138725A RU2668879C1 (en) | 2017-11-07 | 2017-11-07 | Method for preparing the surface of bone tissue samples to study their microstructure using a scanning electron microscope |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017138725A RU2668879C1 (en) | 2017-11-07 | 2017-11-07 | Method for preparing the surface of bone tissue samples to study their microstructure using a scanning electron microscope |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2668879C1 true RU2668879C1 (en) | 2018-10-04 |
Family
ID=63798433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017138725A RU2668879C1 (en) | 2017-11-07 | 2017-11-07 | Method for preparing the surface of bone tissue samples to study their microstructure using a scanning electron microscope |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2668879C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2747640C1 (en) * | 2020-04-23 | 2021-05-11 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Method for preparing large samples of regenerating bone for scanning electron microscopy |
| CN114942169A (en) * | 2022-06-02 | 2022-08-26 | 四川大学华西医院 | Method for manufacturing animal complete osteoarthropathy slices |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2397472C1 (en) * | 2008-12-22 | 2010-08-20 | Федеральное государственное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Method of preparing biological tissue samples for analysis in scanning electron microscope |
| RU2466375C1 (en) * | 2011-04-07 | 2012-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method for preparing samples of non-decalcified articular cartilage with subjacent subchondral bone for multipurpose study |
| RU2578977C1 (en) * | 2015-05-12 | 2016-03-27 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт глазных болезней" | Method of preparing biological sample for analysis by scanning electron microscopy |
-
2017
- 2017-11-07 RU RU2017138725A patent/RU2668879C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2397472C1 (en) * | 2008-12-22 | 2010-08-20 | Федеральное государственное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Method of preparing biological tissue samples for analysis in scanning electron microscope |
| RU2466375C1 (en) * | 2011-04-07 | 2012-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method for preparing samples of non-decalcified articular cartilage with subjacent subchondral bone for multipurpose study |
| RU2578977C1 (en) * | 2015-05-12 | 2016-03-27 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт глазных болезней" | Method of preparing biological sample for analysis by scanning electron microscopy |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ИРЬЯНОВ Ю.М. Пространственная организация костной ткани дистракционных регенератов по данным сканирующей электронной микроскопии. Гений ортопедии, 1998, 1, стр. 22-28, найдено 02.07.2018 в Интернете [on-line] http://ilizarov-journal.com/index.php/go/article/view/2041. * |
| СИЛАНТЬЕВА Т.А. и др. Подготовка образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе с использованием камфена. Фундаментальные исследования, 2015, 2, 22, стр. 4919-4923, найдено 02.07.2018 в Интернете [on-line] https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=38132. * |
| СИЛАНТЬЕВА Т.А. и др. Подготовка образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе с использованием камфена. Фундаментальные исследования, 2015, 2, 22, стр. 4919-4923, найдено 02.07.2018 в Интернете [on-line] https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=38132. ИРЬЯНОВ Ю.М. Пространственная организация костной ткани дистракционных регенератов по данным сканирующей электронной микроскопии. Гений ортопедии, 1998, 1, стр. 22-28, найдено 02.07.2018 в Интернете [on-line] http://ilizarov-journal.com/index.php/go/article/view/2041. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2747640C1 (en) * | 2020-04-23 | 2021-05-11 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Method for preparing large samples of regenerating bone for scanning electron microscopy |
| CN114942169A (en) * | 2022-06-02 | 2022-08-26 | 四川大学华西医院 | Method for manufacturing animal complete osteoarthropathy slices |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11035763B2 (en) | Kit for producing cleared biological specimens and method for producing cleared biological specimens | |
| RU2668879C1 (en) | Method for preparing the surface of bone tissue samples to study their microstructure using a scanning electron microscope | |
| Clough et al. | Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins | |
| PT2588027T (en) | Biomatrix scaffolds for industrial scale dispersal | |
| González-Chávez et al. | Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence | |
| CN110763661B (en) | Treatment fluid composition, kit and method for performing immunological labeling while transparentizing biological organ | |
| JP2011002453A (en) | Method of automatically treating tissue sample in tissue treatment device | |
| Parthiban et al. | BoneMA—synthesis and characterization of a methacrylated bone-derived hydrogel for bioprinting of in-vitro vascularized tissue constructs | |
| Ye et al. | Knockdown of FOXA2 enhances the osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells partly via activation of the ERK signalling pathway | |
| RU2397472C1 (en) | Method of preparing biological tissue samples for analysis in scanning electron microscope | |
| KR20180060494A (en) | Composition for clrearing of biotissue and clarity method for biotissue using thereof | |
| Tenreiro et al. | Interindividual heterogeneity affects the outcome of human cardiac tissue decellularization | |
| CN113577391A (en) | Preparation method of epiphyseal cartilage combined bone acellular material from natural tissue source | |
| Zhao et al. | Dexamethasone-Activated MSCs release MVs for stimulating osteogenic response | |
| ITCA20120004A1 (en) | SINGLE DEHYDRATING AND DIAPHANIZING REAGENT FOR HISTOLOGY AND NON-HARMFUL AND NON-TOXIC, BIODEGRADABLE CITOLOGY 88%, LOW VOLATILITY | |
| Laudier et al. | Novel procedure for high‐fidelity tendon histology | |
| JP7053860B2 (en) | A composition for clearing a spheroid, a method for clearing a spheroid using the composition, and a kit comprising the same. | |
| Schajowicz | Aspiration biopsy in bone lesions: Cytological and histological techniques | |
| Sistani et al. | Characteristics of a decellularized human ovarian tissue created by combined protocols and its interaction with human endometrial mesenchymal cells | |
| RU2499242C2 (en) | Method for preparing biological tissue samples for histopathological examinations | |
| KR20210063324A (en) | Biomaterial containing adipose-derived stem cells and gelatin, and method for preparing the same | |
| Nielsen et al. | Efficacy of marine bioactive compound fucoidan for bone regeneration and implant fixation in sheep | |
| Cao et al. | Effect of amniotic membrane/collagen-based scaffolds on the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells and cartilage repair | |
| Goldman et al. | Correlative light and backscattered electron microscopy of bone—Part I: Specimen preparation methods | |
| Pogorelov et al. | Evaluation of collagen gel microstructure by scanning electron microscopy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191108 |