RU2667127C1 - Method for determining hematopoietic chimerism in the study of single nucleotide polymorphisms of genes mther: 677, mther: 1298, mtr: 2756, mtrr: 66 - Google Patents
Method for determining hematopoietic chimerism in the study of single nucleotide polymorphisms of genes mther: 677, mther: 1298, mtr: 2756, mtrr: 66 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2667127C1 RU2667127C1 RU2017122876A RU2017122876A RU2667127C1 RU 2667127 C1 RU2667127 C1 RU 2667127C1 RU 2017122876 A RU2017122876 A RU 2017122876A RU 2017122876 A RU2017122876 A RU 2017122876A RU 2667127 C1 RU2667127 C1 RU 2667127C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chimerism
- donor
- genes
- recipient
- mthfr
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к трансплантологии и может быть использовано при мониторинге гемопоэтического химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток путем исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.The invention relates to medicine, in particular to transplantology, and can be used to monitor hematopoietic chimerism after allogeneic transplantation of hematopoietic stem cells by studying single nucleotide polymorphisms of the MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 genes by polymerase chain reaction (PCR) ) in real time.
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) от родственного и неродственного донора нередко является единственным способом спасения жизни больного с тяжелым поражением костного мозга и иммунной системы. Успех аллогенной ТГСК (аллоТГСК) ограничен развитием таких осложнений, как реакция «трансплантат против хозяина», отторжение трансплантата, рецидив основного заболевания [4]. Соответственно, актуальным является выбор наиболее информативных и чувствительных методов оценки донорского химеризма (ДХ) после аллоТГСК [2]. Несмотря на различия в протоколах, в основе всех методов исследования лежит алгоритм, включающий скрининг ДНК донора и реципиента перед трансплантацией, поиск генетических различий - информативных маркеров, анализ информативных меток после трансплантации для качественного и количественного определения ДХ.Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) from a related and unrelated donor is often the only way to save the life of a patient with severe damage to the bone marrow and immune system. The success of allogeneic HSCT (allo HSCT) is limited by the development of complications such as the graft versus host reaction, graft rejection, and relapse of the underlying disease [4]. Accordingly, the choice of the most informative and sensitive methods for assessing donor chimerism (DC) after alloTGSK is relevant [2]. Despite the differences in the protocols, the basis of all the research methods is an algorithm that includes screening the DNA of the donor and recipient before transplantation, the search for genetic differences - informative markers, the analysis of informative labels after transplantation for the qualitative and quantitative determination of DC.
Известен способ цитогенетического анализа для дифференциации между клетками донора и реципиента. При лейкозах и других гематологических нарушениях происходит хромосомная перегруппировка с потерей генетической информации (моносомии или делеции), поэтому цитогенетический анализ является важным аспектом в анализе химеризма. Эти хромосомные исследования в основном проводятся на клетках периферической крови и клетках костного мозга в метафазной стадии. Стандартный цитогенетический анализ G-диапазона обычно проводится при хроническом миелолейкозе для мониторинга наличия филадельфийских (Ph+) клеток. Однако в основном цитогенетический анализ используется при аллоТГСК, несовместимых по полу [6].A known method of cytogenetic analysis for differentiation between the cells of the donor and recipient. In leukemia and other hematological disorders, a chromosome rearrangement occurs with loss of genetic information (monosomy or deletion), therefore, cytogenetic analysis is an important aspect in the analysis of chimerism. These chromosomal studies are mainly carried out on peripheral blood cells and bone marrow cells in a metaphase stage. Standard G-band cytogenetic analysis is usually performed for chronic myelogenous leukemia to monitor the presence of Philadelphia (Ph +) cells. However, mainly cytogenetic analysis is used for allTGSCs that are incompatible by sex [6].
Известен способ определения аутологичного гематопоэза, основанный на фенотипировании эритроцитов. Возрастающий процент аутологичных эритроцитов и/или уменьшение количества эритроцитов донорного происхождения всегда коррелирует с рецидивом. Преимущества иммуногематологического метода очевидны: его можно проводить на образцах крови; анализ прост, точен и чувствителен; результат может быть получен в течение 24 часов [5]. Разработанные проточные цитометрические методы увеличили скорость и эффективность данного способа [3]. Методика основана на полном фенотипировании эритроцитов пациента и донора по антигенам А, В, С, с, Е, е, D, K, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, N, S и s. Недостатком метода является его не информативность в раннем посттрансплантационном периоде и субъективность оценки соотношения клеток донора и реципиента.A known method for the determination of autologous hematopoiesis, based on phenotyping of red blood cells. An increasing percentage of autologous red blood cells and / or a decrease in the number of red blood cells of donor origin always correlates with relapse. The advantages of the immunohematological method are obvious: it can be carried out on blood samples; the analysis is simple, accurate and sensitive; the result can be obtained within 24 hours [5]. Developed flow cytometric methods have increased the speed and effectiveness of this method [3]. The technique is based on the complete phenotyping of red blood cells of a patient and a donor by antigens A, B, C, c, E, e, D, K, Fy a , Fy b , Jk a , Jk b , M, N, S and s. The disadvantage of this method is its lack of information in the early post-transplant period and the subjectivity of assessing the ratio of donor and recipient cells.
Известен способ мониторинга донорского химеризма методом амплификации высокополиморфных отрезков ДНК - тандемных повторяющихся блоков ДНК. Когда повторяющаяся последовательность составляет 15-50 нуклеотидов в длину, ее называют VNTR (variable number tandem repeats) или минисателлит, когда повторяющаяся последовательность составляет 2-6 нуклеотидов в длину - STR (short tandem repeats) или микросателлит. Генотипирование STR / VNTR не зависит от несовпадения HLA или несовпадения пола и может быть использовано сразу после трансплантации, когда для анализа доступно очень мало клеток [7]. Для генотипирования STR и VNTR были использованы три метода: типизация на основе зондов, типирование на основе ПЦР и мультиплексирование. К недостаткам метода можно отнести конкурентный характер ПЦР, особенно при проведении мультиплексной реакции. Кроме того, количество образующегося продукта ПЦР не эквивалентно начальной концентрации ДНК матрицы. Alizadeh и соавторы в 2002 году [1] предложили использовать ПЦР в реальном времени и показали, что количественный метод является лучшим для количественного донорского химеризма.A known method of monitoring donor chimerism by amplification of highly polymorphic DNA segments - tandem repeating DNA blocks. When the repeating sequence is 15-50 nucleotides in length, it is called VNTR (variable number tandem repeats) or minisatellite, when the repeating sequence is 2-6 nucleotides in length - STR (short tandem repeats) or microsatellite. Genotyping of STR / VNTR is independent of HLA mismatch or gender mismatch and can be used immediately after transplantation, when very few cells are available for analysis [7]. Three methods were used for genotyping STR and VNTR: probe-based typing, PCR-based typing, and multiplexing. The disadvantages of the method include the competitive nature of PCR, especially when conducting a multiplex reaction. In addition, the amount of the resulting PCR product is not equivalent to the initial concentration of the template DNA. Alizadeh et al. In 2002 [1] proposed the use of real-time PCR and showed that the quantitative method is the best for quantitative donor chimerism.
Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ, при котором для идентификации клеток донора и реципиента используют биаллельные InDel (инсерции-делеции) полиморфизмы, расположенные в кодирующих областях [1]. Основным фактором в выборе возможных маркеров является высокий уровень их гетерозиготности. В диагностической тест-системе используют прямые аллель-специфические праймеры. Несмотря на высокую чувствительность, у данного метода имеются ограничения в оценке количественных значений уровня донорского химеризма, что делает целесообразным его использование только при оценке остаточных популяций клеток реципиента.Closest to the proposed invention is a method in which for the identification of donor and recipient cells using biallelic InDel (insertion-deletion) polymorphisms located in the coding regions [1]. The main factor in the selection of possible markers is the high level of their heterozygosity. The diagnostic test system uses direct allele-specific primers. Despite the high sensitivity, this method has limitations in assessing the quantitative values of the level of donor chimerism, which makes it advisable to use it only when assessing residual populations of recipient cells.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание способа анализа донорского химеризма при исследовании однонуклеотидных полиморфизмов генов фолатного цикла (MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66) в качестве информативных маркеров. Технология анализа точечных мутаций замены оснований позволяет выявить однонуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphisms - SNPs) - транзиции или трансверсии в исследуемых генах. Транзиция подразумевает замену одного пуринового основания на другое (аденин и гуанин) или аналогичную замену пиримидиновых оснований (тимин и цитозин). При трансверсии пуриновое основание замещается на пиримидиновое основание или наоборот. Предлагаемый способ позволяет определить информативные маркеры, оценка которых лежит в основе мониторинга посттрансплантационного химеризма.The technical result of the claimed invention is the creation of a method for analysis of donor chimerism in the study of single nucleotide polymorphisms of folate cycle genes (MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66) as informative markers. The technology for the analysis of point mutations of base substitution makes it possible to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) - transitions or transversions in the studied genes. Transition involves the replacement of one purine base with another (adenine and guanine) or a similar replacement of pyrimidine bases (thymine and cytosine). In a transversion, the purine base is replaced by the pyrimidine base or vice versa. The proposed method allows to determine informative markers, the assessment of which is the basis for monitoring post-transplant chimerism.
Для достижения указанного результата в соответствии с аналогом [1] осуществляют генетический скрининг пары донор/реципиент и определяют информативные аллели, дифференцирующие ДНК донора и реципиента. В отличие от прототипа, в основе которого находится исследование коротких тандемных повторов генетических систем S01-S11 (STR-PCR), в предлагаемом способе выполняется определение точечных мутаций замены оснований генов MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 методом ПЦР в режиме реального времени.To achieve this result, in accordance with the analogue [1], a donor / recipient pair is genetically screened and informative alleles that differentiate the donor and recipient DNA are determined. Unlike the prototype, which is based on the study of short tandem repeats of genetic systems S01-S11 (STR-PCR), the proposed method performs the determination of point mutations of the replacement of the base of the genes MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 method Real-time PCR.
В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.In the process of conducting a patent information search, no sources were found discrediting the novelty of the alleged invention.
Заявляемое изобретение разработано в лаборатории иммуногематологии ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.The claimed invention was developed in the laboratory of immunohematology FGBUN KNIIIGiPK FMBA of Russia in accordance with the plan of research work.
Способ осуществляется следующим образом:The method is as follows:
1. Проводят типирование генов MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 у донора и реципиента. Представленные гены соответствуют следующим характеристикам:1. Genes are typed for MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 in the donor and recipient. Presented genes correspond to the following characteristics:
Ген - MTHFR: 677; хромосомная локализация - 1р36.22; идентификатор - rs1801133; выявляемая мутация- замена основания цитозина на тимин в положении 677; исследуемые генотипы - С/С, С/Т, Т/Т.Gene - MTHFR: 677; chromosome localization - 1p36.22; identifier is rs1801133; detectable mutation - replacement of the cytosine base with thymine at position 677; studied genotypes - C / C, C / T, T / T.
Ген - MTHFR: 1298; хромосомная локализация - 1р36.22; идентификатор - rs1801131; выявляемая мутация- замена основания аденина на цитозин в позиции 1298; исследуемые генотипы - А/А, А/С, С/С.Gene - MTHFR: 1298; chromosome localization - 1p36.22; identifier is rs1801131; detectable mutation - replacement of adenine base with cytosine at position 1298; studied genotypes - A / A, A / C, C / C.
Гена - MTR: 2756; хромосомная локализация - lq43; идентификатор - rs180508; выявляемая мутация- замена аденина на гуанин в позиции 2756; исследуемые генотипы А/А, A/G, G/G.Gene - MTR: 2756; chromosome localization - lq43; identifier - rs180508; detectable mutation - replacement of adenine with guanine at position 2756; studied genotypes A / A, A / G, G / G.
Ген - MTRR: 66; хромосомная локализация - 5р15.31; идентификатор - rs1801394; выявляемая мутация- замена аденина на гуанин в позиции 66; исследуемые генотипы - А/А, A/G, G/G.Gene - MTRR: 66; chromosome localization - 5p15.31; identifier is rs1801394; detectable mutation - replacement of adenine with guanine at position 66; investigated genotypes - A / A, A / G, G / G.
Выделенные ДНК донора и реципиента вносят по 100 нг в пробирки, содержащие смеси для амплификации с флуоресцентными метками Fam и Hex для соответствующего варианта полиморфизма, ПЦР-буфер, Taq-полимеразу. Реакцию амплификации выполняют на детектирующем термоциклере по программе: 80°С - 2 мин, 94°С - 5 мин, 5 циклов - 94°С - 30 сек, 67°С - 10 сек; 45 циклов - 94°С - 5 сек, 67°С - 5 сек; 1 цикл - 25°С - 30 сек; 50 циклов - 25°С - 15 сек. Анализ кривых плавления позволяет идентифицировать аллели ДНК. Оба варианта искомой последовательности определяются в одной пробирке при одновременной гибридизации с двумя альтернативными типирующими зондами с различными флуорофорами.The isolated donor and recipient DNAs were added 100 ng each into tubes containing mixtures for amplification with Fam and Hex fluorescent labels for the corresponding polymorphism variant, PCR buffer, Taq polymerase. The amplification reaction is performed on a detecting thermal cycler according to the program: 80 ° С - 2 min, 94 ° С - 5 min, 5 cycles - 94 ° С - 30 sec, 67 ° С - 10 sec; 45 cycles - 94 ° С - 5 sec; 67 ° С - 5 sec; 1 cycle - 25 ° С - 30 sec; 50 cycles - 25 ° C - 15 sec. Analysis of melting curves allows the identification of DNA alleles. Both variants of the desired sequence are determined in one tube while hybridizing with two alternative typing probes with different fluorophores.
2. Поиск информативных маркеров заключается d обнаружении различий генотипов донора и реципиента. Если аллель является позитивным для реципиента и негативным для донора или позитивным для донора и негативным для реципиента, он считается информативным. Построение калибровочной кривой в серии разведений ДНК донора в ДНК реципиента для информативных маркеров необходим для последующей оценки ДХ.2. The search for informative markers consists in detecting differences in the genotypes of the donor and the recipient. If the allele is positive for the recipient and negative for the donor or positive for the donor and negative for the recipient, it is considered informative. The construction of a calibration curve in a series of dilutions of donor DNA in the recipient's DNA for informative markers is necessary for subsequent assessment of DC.
3. Мониторинг ДХ осуществляют на 28, 42, 56, 70, 100, 120 дни после аллоТГСК. Для определения процента донорского химеризма строят калибровочную кривую для выбранных информативных аллелей в серии разведений ДНК реципиента в ДНК донора (100, 10-1, 10-2, 10-4, 10-5), содержащих следующее отношения ДНК:3. Monitoring of HF is carried out on 28, 42, 56, 70, 100, 120 days after alloTGSK. To determine the percentage of donor chimerism, a calibration curve is constructed for the selected informative alleles in a series of dilutions of the recipient’s DNA in the donor’s DNA (10 0 , 10 -1 , 10 -2 , 10 -4 , 10 -5 ) containing the following DNA ratios:
- 100% ДНК донора;- 100% donor DNA;
- 10% ДНК реципиента и 90% ДНК донора;- 10% of the recipient’s DNA and 90% of the donor’s DNA;
- 1% ДНК реципиента и 99% ДНК донора;- 1% recipient DNA and 99% donor DNA;
- 0,1% ДНК реципиента и 99,9% ДНК донора;- 0.1% of the recipient’s DNA and 99.9% of the donor’s DNA;
- 0,01% ДНК реципиента и 99,99% ДНК донора.- 0.01% of the recipient’s DNA and 99.99% of the donor’s DNA.
Количественную оценку химеризма выполняют по формуле: Химеризм, %=2-DDCt × 100%, где DDCt - разница между уровнями пороговой флуоресценции исследуемого маркера и референсного гена.Chimerism is quantified by the formula: Chimerism,% = 2 -DDCt × 100%, where DDCt is the difference between the threshold fluorescence levels of the studied marker and the reference gene.
Ниже приводятся клинические примеры, подтверждающие возможность использования заявляемого способа при мониторинге донорского химеризма.The following are clinical examples confirming the possibility of using the proposed method for monitoring donor chimerism.
Пример 1.Example 1
Пациентка Т., 21 год с диагнозом: Острый миелобластный лейкоз, высокий риск, ремиссия 3. АллоТГСК от неродственного HLA-идентичного донора, подобранного в регистре потенциальных доноров ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России, выполнена 22.03.2016. Выбран миелоаблативный режим кондиционирования. В таблице 1 представлены результаты типирования генов MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 у донора и реципиента. Информативными были признаны гены MTHFR: 677 и MTRR: 66, в которых у донора имелись аллельные специфичности, отсутствующие у реципиента. Калибровочная кривая в серии разведений ДНК донора в ДНК реципиента выстроена в соотношении 100, 10-1, 10-2, 10-4, 10-5. Исследование донорского химеризма выполнено через 30, 40, 60, 80, 180, 200, 360 дней после аллоТГСК. Донорский химеризм >95% установлен на 30 день. Донорский химеризм >99% определен с 40 дня и далее. Больная ведет полноценную жизнь хорошего качества. При обследовании через 1 год после трансплантации подтверждена полная ремиссия заболевания, донорский линейный и общий химеризм >99%, функция трансплантата удовлетворительная, отсутствуют признаки реакции «трансплантат против хозяина».Patient T., 21 years old, with a diagnosis of Acute myeloid leukemia, high risk, remission 3. AlloTGSK from an unrelated HLA-identical donor, selected in the register of potential donors of the Federal State Budgetary Institution of Medical and Medical Research "Rosplazma" FMBA of Russia, completed on March 22, 2016. A myelo-ablative conditioning regimen has been selected. Table 1 presents the typing results of the MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 genes in the donor and recipient. The MTHFR: 677 and MTRR: 66 genes were recognized as informative, in which the donor had allelic specificities absent in the recipient. The calibration curve in a series of dilutions of donor DNA into recipient DNA is aligned in the ratio 10 0 , 10 -1 , 10 -2 , 10 -4 , 10 -5 . A study of donor chimerism was performed 30, 40, 60, 80, 180, 200, 360 days after alloTGSC. Donor chimerism> 95% is set on day 30. Donor chimerism> 99% determined from day 40 onwards. The patient leads a full life of good quality. Examination 1 year after transplantation confirmed complete remission of the disease, donor linear and general chimerism> 99%, the transplant function is satisfactory, and there are no signs of a graft versus host reaction.
Пример 2.Example 2
Пациентка М., 38 лет. АллоТГСК с миелоаблативным режимом кондиционирования выполнена 20.03.2015 г. для консолидации ремиссии 3 острого миелобластного лейкоза. Донором явилась HLA-идентичная сестра больной (44 года). В таблице 2 представлены результаты типирования генов MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 у донора и реципиента. Информативным маркером явился ген MTHFR: 677, в котором у реципиента был определен аллель С, отсутствующий у донора. Построена калибровочная кривая в серии разведений ДНК донора и реципиента. Исследование гемопоэтического химеризма выполнено на 28, 65, 120 и 360 дни после аллоТГСК. Донорский химеризм >95% регистрировался в 30, 65 и 120 дни. При исследовании на 360 день генотип полностью соответствовал генотипу больной до трансплантации - донорский химеризм отсутствовал, произошло отторжение донорского кроветворения при сохранении полной клинико-гематологической ремиссии острого миелобластного лейкоза. Результат исследования подтвержден в референс лаборатории.Patient M., 38 years old. AlloTGSK with a myelo-ablative conditioning regimen was performed on March 20, 2015 to consolidate the remission of 3 acute myeloid leukemia. The donor was the HLA-identical sister of the patient (44 years old). Table 2 presents the typing results of the MTHFR: 677, MTHFR: 1298, MTR: 2756, MTRR: 66 genes in the donor and recipient. An informative marker was the MTHFR: 677 gene, in which the C allele was found in the recipient, which was absent in the donor. A calibration curve was constructed in a series of dilutions of the donor and recipient DNA. The study of hematopoietic chimerism was performed on 28, 65, 120 and 360 days after alloTGSK. Donor chimerism> 95% was recorded at 30, 65 and 120 days. In the 360-day study, the genotype was fully consistent with the patient’s genotype before transplantation - donor chimerism was absent, donor hematopoiesis was rejected while maintaining complete clinical and hematological remission of acute myeloid leukemia. The result of the study is confirmed in the reference laboratory.
Список литературыBibliography
1. Alizadeh М., Bernard М., Danic В. et al. Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction // Blood, 2002, 99: 4618-4625.1. Alizadeh M., Bernard M., Danic B. et al. Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction // Blood, 2002, 99: 4618-4625.
2. Antin J.H., Childs R., Filipovich A.H. et al. Establishment of complete and mixed donor chimerism after allogeneic lymphohematopoietic transplantation: Recommendations from a workshop at the 2001 tandem meetings of the international bone marrow transplant registry and the American society of blood and marrow transplantation // Biol Bone Marrow Transplant., 2001, 7(9): 473-485.2. Antin J.H., Childs R., Filipovich A.H. et al. Establishment of complete and mixed donor chimerism after allogeneic lymphohematopoietic transplantation: Recommendations from a workshop at the 2001 tandem meetings of the international bone marrow transplant registry and the American society of blood and marrow transplantation // Biol Bone Marrow Transplant., 2001, 7 (9 ): 473-485.
3. Hendriks E.C., de Man A.J., van Berkel Y.C. et al. Flow cytometric method for the routine follow-up of red cell populations after bone marrow transplantation // Br. J. Haematol., 1997, 97: 141-145.3. Hendriks E.C., de Man A.J., van Berkel Y.C. et al. Flow cytometric method for the routine follow-up of red cell populations after bone marrow transplantation // Br. J. Haematol., 1997, 97: 141-145.
4. Lion F., Watzinger S., Preuner H. et al. The EuroChimerism concept for a standardized approach to chimerism analysis after allogeneic stem cell transplantation // Leukemia, 2012, 26(8): 1821-1828.4. Lion F., Watzinger S., Preuner H. et al. The EuroChimerism concept for a standardized approach to chimerism analysis after allogeneic stem cell transplantation // Leukemia, 2012, 26 (8): 1821-1828.
5. Schaap N., Schattenberg A., Bar B. et al. Red blood cell phenotyping is a sensitive technique for monitoring chronic myeloid leukaemia patients after T-cell-depleted bone marrow transplantation and after donor leucocyte infusion // Br. J. Haematol., 2000, 108: 116-125.5. Schaap N., Schattenberg A., Bar B. et al. Red blood cell phenotyping is a sensitive technique for monitoring chronic myeloid leukaemia patients after T-cell-depleted bone marrow transplantation and after donor leucocyte infusion // Br. J. Haematol., 2000, 108: 116-125.
6. Seong С.М., Giralt S., Kantarjian H. et al. Early detection of relapse by hypermetaphase fluorescence in situ hybridization after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia // J. Clin. Oncol., 2000, 18: 1831-1836.6. Seong S. M., Giralt S., Kantarjian H. et al. Early detection of relapse by hypermetaphase fluorescence in situ hybridization after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia // J. Clin. Oncol., 2000, 18: 1831-1836.
7. Suttorp M., Schmitz N, Dreger P et al. Monitoring of chimerism after allogeneic bone marrow transplantation with unmanipulated marrow by use of DNA polymorphisms // Leukemia, 1993, 7: 679-687.7. Suttorp M., Schmitz N, Dreger P et al. Monitoring of chimerism after allogeneic bone marrow transplantation with unmanipulated marrow by use of DNA polymorphisms // Leukemia, 1993, 7: 679-687.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017122876A RU2667127C1 (en) | 2017-06-28 | 2017-06-28 | Method for determining hematopoietic chimerism in the study of single nucleotide polymorphisms of genes mther: 677, mther: 1298, mtr: 2756, mtrr: 66 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017122876A RU2667127C1 (en) | 2017-06-28 | 2017-06-28 | Method for determining hematopoietic chimerism in the study of single nucleotide polymorphisms of genes mther: 677, mther: 1298, mtr: 2756, mtrr: 66 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2667127C1 true RU2667127C1 (en) | 2018-09-14 |
Family
ID=63580313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017122876A RU2667127C1 (en) | 2017-06-28 | 2017-06-28 | Method for determining hematopoietic chimerism in the study of single nucleotide polymorphisms of genes mther: 677, mther: 1298, mtr: 2756, mtrr: 66 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2667127C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2758064C1 (en) * | 2020-10-28 | 2021-10-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for determining posttransplantation chimerism in course of study of abo system erythrocyte antigens |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101575643A (en) * | 2009-05-31 | 2009-11-11 | 中国人民解放军第二军医大学 | Method for detecting the chimerism rate of recipients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation |
-
2017
- 2017-06-28 RU RU2017122876A patent/RU2667127C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101575643A (en) * | 2009-05-31 | 2009-11-11 | 中国人民解放军第二军医大学 | Method for detecting the chimerism rate of recipients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ALIZADEH М. et al. Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction. Blood. 2002 Jun 15; 99(12): 4618-25. * |
| AMIGOU A. et al. Folic acid supplementation, MTHFR and MTRR polymorphisms, and the risk of childhood leukemia: the ESCALE study (SFCE). Cancer Causes Control. 2012 Aug; 23(8): 1265-77. * |
| BYUN J.M. et al. The Impact of Methylenetetrahydrofolate Reductase C677T Polymorphism on Patients Undergoing Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation with Methotrexate Prophylaxis. PLoS One. 2016 Oct 26; 11(10): e0163998. eCollection 2016 [Найдено 05.04.2018] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27783703 . * |
| ЛАВРИНЕНКО В.А. и др. Количественный анализ химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток молекулярно-генетическими методами. Онкогематология. 2014; 2: 29-36. * |
| ЛАВРИНЕНКО В.А. и др. Количественный анализ химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток молекулярно-генетическими методами. Онкогематология. 2014; 2: 29-36. BYUN J.M. et al. The Impact of Methylenetetrahydrofolate Reductase C677T Polymorphism on Patients Undergoing Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation with Methotrexate Prophylaxis. PLoS One. 2016 Oct 26; 11(10): e0163998. eCollection 2016 [Найдено 05.04.2018] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27783703 . AMIGOU A. et al. Folic acid supplementation, MTHFR and MTRR polymorphisms, and the risk of childhood leukemia: the ESCALE study (SFCE). Cancer Causes Control. 2012 Aug; 23(8): 1265-77. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2758064C1 (en) * | 2020-10-28 | 2021-10-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for determining posttransplantation chimerism in course of study of abo system erythrocyte antigens |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lo et al. | Quantitative analysis of the bidirectional fetomaternal transfer of nucleated cells and plasma DNA | |
| Gajecka | Unrevealed mosaicism in the next-generation sequencing era | |
| US8394582B2 (en) | Identification of fetal DNA and fetal cell markers in maternal plasma or serum | |
| JP4404553B2 (en) | Methods for prenatal diagnosis of isolated maternal blood fetal cells | |
| EP1325963B1 (en) | Method for non-invasive diagnosis of transplantations and transfusions | |
| US20230159991A1 (en) | Probe set for analyzing a dna sample and method for using the same | |
| US9752189B2 (en) | Non-invasive early detection of solid organ transplant rejection by quantitative analysis of mixtures by deep sequencing of HLA gene amplicons using next generation systems | |
| JP2011500041A (en) | High resolution and high efficiency HLA genotyping by clonal sequencing | |
| US10781492B2 (en) | Epigenetic method for the identification of subpopulations of CD8+ T lymphocytes, in particular CD8 alpha and beta T lymphocytes | |
| Tyler et al. | Personalized chimerism test that uses selection of short tandem repeat or quantitative PCR depending on patient's chimerism status | |
| Cankovic et al. | Clinical performance of JAK2 V617F mutation detection assays in a molecular diagnostics laboratory: evaluation of screening and quantitation methods | |
| Debeljak et al. | Haplotype counting by next-generation sequencing for ultrasensitive human DNA detection | |
| RU2667127C1 (en) | Method for determining hematopoietic chimerism in the study of single nucleotide polymorphisms of genes mther: 677, mther: 1298, mtr: 2756, mtrr: 66 | |
| WO2020218499A1 (en) | Fetal rhd blood type detection kit and use thereof | |
| KR101761801B1 (en) | Composition for determining nose phenotype | |
| RU2667006C1 (en) | Method for determining posttransplantation chimerism in analysis of point mutations of base substitution in genes f2, f5, f7, f13, fgb, itga2, itgb3, pai-1 | |
| US20210164048A1 (en) | A non-invasive prenatal test with accurate fetal fraction measurement | |
| JP6233022B2 (en) | HLA-A * 24 group judgment method | |
| US20170218447A1 (en) | Platform independent haplotype identification and use in ultrasensitive dna detection | |
| JP2018517421A5 (en) | ||
| Van Deerlin et al. | Chimerism testing in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation | |
| KR20200064891A (en) | Method of providing the information for predicting of hematologic malignancy prognosis after peripheral blood stem cell transplantation | |
| Sullivan et al. | Bone marrow engraftment analysis | |
| US20160017421A1 (en) | Non-invasive early detection of solid organ transplant rejection by quantitative analysis of hla gene amplicons | |
| WO2005059174A1 (en) | Method and kit for the genotypification of hla-drb based on real time pcr |