RU2665781C1 - Method for obtaining a pure viable culture of protoscolexes echinococcus multilocularis - Google Patents
Method for obtaining a pure viable culture of protoscolexes echinococcus multilocularis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2665781C1 RU2665781C1 RU2017116745A RU2017116745A RU2665781C1 RU 2665781 C1 RU2665781 C1 RU 2665781C1 RU 2017116745 A RU2017116745 A RU 2017116745A RU 2017116745 A RU2017116745 A RU 2017116745A RU 2665781 C1 RU2665781 C1 RU 2665781C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protoscolexes
- obtaining
- pure
- culture
- multiocularis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 241000244163 Echinococcus multilocularis Species 0.000 title abstract description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 claims abstract description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 claims description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 4
- 241000244160 Echinococcus Species 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 abstract 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 208000009366 Echinococcosis Diseases 0.000 description 8
- 206010014096 Echinococciasis Diseases 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 208000006968 Helminthiasis Diseases 0.000 description 3
- 206010019659 Hepatic echinococciasis Diseases 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 201000003894 alveolar echinococcosis Diseases 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- 208000014837 parasitic helminthiasis infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000001759 immunoprophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 101001094887 Ambrosia artemisiifolia Pectate lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001123576 Ambrosia artemisiifolia Pectate lyase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001123572 Ambrosia artemisiifolia Pectate lyase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000573177 Ambrosia artemisiifolia Pectate lyase 5 Proteins 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 201000003808 Cystic echinococcosis Diseases 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 241000244030 Toxocara canis Species 0.000 description 1
- 241000243777 Trichinella spiralis Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000010796 biological waste Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229940096911 trichinella spiralis Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной и медицинской гельминтологии. Предложенный способ предусматривает одномоментное выделение чистой культуры жизнеспособных протосколексов Echinococcus multiocularis, которые могут быть использованы для дальнейших биотехнологических, иммунологических исследований и лабораторного моделирования альвеолярного эхинококкоза.The invention relates to veterinary and medical helminthology. The proposed method involves the simultaneous isolation of a pure culture of viable protocholeks Echinococcus multiocularis, which can be used for further biotechnological, immunological studies and laboratory modeling of alveolar echinococcosis.
Эхинококкоз (лат. Echinococcosis) - гельминтоз из группы цестодозов, характеризующийся образованием в печени, легких или других органах и тканях паразитарных кист, распространяющихся по организму путем метастазирования. Возбудитель альвеолярной формы эхинококкоза - E.multilocularis относится к числу наиболее патогенных социально опасных гельминтов, представляющих серьезную угрозу для здоровья человека и являющихся актуальными для ветеринарной медицины. Вызываемое им заболевание - альвеолярный эхинококкоз, характеризуется чрезвычайно тяжелым хроническим течением с первичным поражением печени, нередко сопровождающееся метастазами подобно раковой опухоли в головной мозг, легкие и другие органы. Циста паразита (метацестода, ларвоциста) - это плотный бугристый паразитарный узел, на разрезе имеющий мелкоячеистое строение, часто с полостью распада в центре. Гистологически среди разрастаний грубой соединительной ткани выявляется множество пузырьков альвеококка с протосколексами внутри. Возможно метастазирование, чаще в легкие и головной мозг. Распространение цистного и альвеолярного гидатидоза за последние годы увеличивается по причине усиления урбанизации, возросшей миграции населения, развала устоявшихся экономических отношений, а также в связи с ухудшением социальной жизни и снижения санитарно-эпидемиологического контроля [2, 3, 5].Echinococcosis (lat. Echinococcosis) - helminthiasis from the group of cestodoses, characterized by the formation in the liver, lungs or other organs and tissues of parasitic cysts that spread through the body by metastasis. The causative agent of the alveolar form of echinococcosis, E.multilocularis, is one of the most pathogenic socially dangerous helminths, which pose a serious threat to human health and are relevant for veterinary medicine. The disease he causes is alveolar echinococcosis, characterized by an extremely severe chronic course with primary liver damage, often accompanied by metastases like a cancerous tumor in the brain, lungs, and other organs. A parasitic cyst (metacestode, larvocyst) is a dense tuberous parasitic node, with a small-meshed structure in the section, often with a decay cavity in the center. Histologically, among the overgrowths of the coarse connective tissue, many vesicles of the alveococcus with protoscolexes inside are revealed. Perhaps metastasis, often to the lungs and brain. The prevalence of cystic and alveolar hydatidosis in recent years has been increasing due to increased urbanization, increased population migration, the collapse of established economic relations, as well as due to the deterioration of social life and lower sanitary and epidemiological control [2, 3, 5].
Эпидемиологическая ситуация по эхинококкозам в РФ по данным Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека остается сложной. Ежегодно в РФ регистрируется свыше 500 случаев эхинококкоза, причем в структуре заболевания 14,5% составляют дети. За трехлетний период (2013-2015 годы) зарегистрировано 174 случая альвеококкоза в 31 субъекте Российской Федерации (Алтайский, Красноярский, Пермский края и др.). Максимальное число случаев альвеококкоза зарегистрировано в Алтайском крае (34 случая); Республике Башкортостан (16 сл); Новосибирской (22 сл.), Кемеровской (13 сл) областях, городе Москва (17 сл.) [4].The epidemiological situation of echinococcosis in the Russian Federation, according to the Federal Service for Supervision of Consumer Rights and Human Well-being, remains difficult. Over 500 cases of echinococcosis are registered annually in the Russian Federation, and in the structure of the disease, 14.5% are children. Over a three-year period (2013-2015), 174 cases of alveococcosis were recorded in 31 subjects of the Russian Federation (Altai, Krasnoyarsk, Perm Territories, etc.). The maximum number of cases of alveococcosis was recorded in the Altai Territory (34 cases); Republic of Bashkortostan (16 cl.); Novosibirsk (22 words), Kemerovo (13 words) regions, the city of Moscow (17 words) [4].
Увеличение числа случаев заболевания людей требует немедленной организации методов борьбы и профилактики и становится важной проблемой ветеринарии и здравоохранения. Именно поэтому поиск эффективных методов диагностики, профилактики и лечения этого социально опасного гельминтозооноза был и остается одним из приоритетных направлений гельминтологической науки и практики. Чистая, жизнеспособная культура протосколексов E.multiocularis необходима для получения первичной и перевиваемых культур клеток, для получения антигенов паразита как физико-химическими методами, так и на основе клеточной технологии для проведения иммунодиагностических и иммунопрофилактических исследований при альвеолярном эхинококкозе.The increase in the number of cases of human disease requires the immediate organization of control and prevention methods and is becoming an important problem of veterinary medicine and public health. That is why the search for effective methods of diagnosis, prevention and treatment of this socially dangerous helminthiasis has been and remains one of the priority areas of helminthological science and practice. A pure, viable culture of E. multiocularis protoscolexes is necessary for obtaining primary and transplantable cell cultures, for obtaining parasite antigens both by physicochemical methods and based on cell technology for immunodiagnostic and immunoprophylactic studies in alveolar echinococcosis.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ, описанный Коваленко Ф.П. с соавторами в патенте №1839182 «Способ хранения ларвального альвеококка» от 30.12.1993 [1]. Способ-прототип состоит в следующем. Из фрагментов конгломератов ларвоцист выделяют зародышевые элементы. Для этого ларвоцисты измельчают ножницами, полученные фрагменты смешивают со стерильным раствором хлорида натрия при соотношении фрагментов ларвоцист и физиологического раствора 1:10. Полученную смесь процеживают через мельничный газ (нейлоновую сетку) с диаметром ячеек 1,0 мм. Полученный фильтрат процеживают через мельничный газ с диаметром ячеек 0,3 мм. Затем фильтрат взбалтывают и после 2 мин отстаивания удаляют всю надосадочную жидкость и заменяют ее свежим физиологическим раствором до конечного объема 50 мл. Эту операцию повторяют 5 раз до достижения полной прозрачности надосадочной жидкости.Closest to the claimed technical solution is the method described by Kovalenko F.P. with co-authors in patent No. 1839182 "Method for storing larval alveococcus" dated 12/30/1993 [1]. The prototype method is as follows. From fragments of conglomerates, larvocysts distinguish germ elements. For this, larvocysts are crushed with scissors, the obtained fragments are mixed with a sterile solution of sodium chloride at a ratio of fragments of larvocysts and saline solution 1:10. The resulting mixture is filtered through a mill gas (nylon mesh) with a mesh diameter of 1.0 mm. The resulting filtrate is filtered through a mill gas with a mesh diameter of 0.3 mm. Then the filtrate is shaken and after 2 minutes of settling all the supernatant is removed and replaced with fresh saline to a final volume of 50 ml. This operation is repeated 5 times until complete transparency of the supernatant.
К недостаткам данного метода следует отнести наличие большого количества биологических отходов-фрагментов ларвоцист, часто содержащих в себе невыделенные жизнеспособные протосколексы паразита, а также наличие поврежденных, малоактивных или нежизнеспособных протосколексов в выделенном осадке. Помимо прочего данный способ обладает большой времяемкостью и на каждом этапе работы требует использования ручного труда, как на этапе выделения инвазивных элементов, - измельчение ножницами, использование мельничного газа различного диаметра ячеек, многократное перетирание и промывание биомассы.The disadvantages of this method include the presence of a large amount of biological waste fragments of larvocysts, often containing undetected viable protoscolexes of the parasite, as well as the presence of damaged, inactive or non-viable protoscolexes in the separated sediment. Among other things, this method is time consuming and at each stage of work it requires the use of manual labor, as at the stage of separation of invasive elements, such as grinding with scissors, the use of mill gas of various cell diameters, multiple grinding and washing of biomass.
Сопоставительный анализ показывает, что заявляемое техническое решение существенно отличается от прототипа, во-первых, механическим измельчением ларвоцист паразита при помощи электрической мясорубки. Во-вторых, аппаратным способом выделения чистых жизнеспособных протосколексов, а в-третьих, использованием для этих целей искусственного желудочного сока (ИЖС), что позволяет сократить время выделения в 2-2,5 раза и увеличить количество выделенных чистых жизнеспособных протосколексов до 95-98%. Использованные для выделения чистой культуры жизнеспособных протосколексов E.multilocularis методы применены впервые в мире, поэтому данное техническое решение отвечает критерию «новизна».Comparative analysis shows that the claimed technical solution differs significantly from the prototype, firstly, by mechanical grinding of the parasite larvocyst using an electric meat grinder. Secondly, by the hardware method of isolation of pure viable protoscolexes, and thirdly, the use of artificial gastric juice (IZHS) for these purposes, which allows to reduce the isolation time by 2-2.5 times and increase the number of isolated pure viable protoscolexes to 95-98 % The methods used to isolate a pure culture of viable protoscolexes of E.multilocularis were applied for the first time in the world, therefore this technical solution meets the criterion of "novelty."
Целью изобретения является способ получения чистой, жизнеспособной культуры протосколексов E.multiocularis, необходимой для приготовления клеточной культуры, получения антигенов паразита различными способами для проведения иммунодиагностических и иммунопрофилактических исследований.The aim of the invention is a method for obtaining a clean, viable culture of protoscolexes E.multiocularis, necessary for the preparation of cell culture, the production of parasite antigens in various ways for immunodiagnostic and immunoprophylactic studies.
Предлагаемый нами способ включает следующие этапы:Our proposed method includes the following steps:
1. Получение эхинококковых ларвоцист.1. Obtaining echinococcal larvocyst.
2. Подготовка полученного биоматериала из ларвоцист E.multilocularis для выделения чистой культуры протосколексов и оценка жизнеспособности выделенных протосколексов.2. Preparation of the obtained biomaterial from the larvocyst of E.multilocularis to isolate a pure protoscolex culture and assess the viability of the isolated protoscolex.
1. Получение эхинококковых ларвоцист.1. Obtaining echinococcal larvocyst.
Эхинококковые ларвоцисты получали от белых крыс, массой 160-180 г экспериментально зараженных внутрибрюшинно в дозе 1500-2000 инвазивных протосколексов с антибиотиками (стрептомицин и пенициллин по 100 ЕД/мл) через 3-4 месяца после заражения. Для этого зараженные животные подвергались эвтаназии (в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».), вскрывались, а ларвоцисты иссекались стерильными хирургическими инструментами и помещались в стеклянные стаканы со стерильным физиологическим раствором комнатной температуры. Полученные ларвоцисты промывались для удаления следов крови, взвешивались и использовались для выделения чистых жизнеспособных протосколексов E.multitocularis.Echinococcal larvocysts were obtained from white rats weighing 160-180 g experimentally infected intraperitoneally at a dose of 1,500-2,000 invasive protoscolexes with antibiotics (streptomycin and penicillin at 100 IU / ml) 3-4 months after infection. For this, infected animals were euthanized (in accordance with the "Rules for the Use of Experimental Animals".), Opened, and larvocysts were excised with sterile surgical instruments and placed in glass glasses with sterile physiological saline solution at room temperature. The obtained larvocysts were washed to remove traces of blood, weighed, and used to isolate pure viable protoscolexes of E. multitocularis.
2. Подготовка полученного биоматериала из ларвоцист E.multilocularis для выделения чистой культуры протосколексов и оценка жизнеспособности выделенных протосколексов.2. Preparation of the obtained biomaterial from the larvocyst of E.multilocularis to isolate a pure protoscolex culture and assess the viability of the isolated protoscolex.
Ларвоцисты E.multilocularis, выделенные от экспериментально-зараженных крыс, подвергли измельчению через мясорубку с диаметром решетки 3-4 мм. Смешивали с ИЖС из расчета 1:10 (1 г фрагментов ларвоцист на 15 мл раствора) следующего состава: вода водопроводная - 1000 см3 (температура 41-42°C); кислота соляная концентрированная (удельная масса 1,2) - 10 см3; пепсин пищевой - 6,0 г; NaCl - 9,0 г. Приготовленный раствор заливали в реактор аппарата и запускали режим прогревания до 41-42°C (автоматическая предустановленная программа).Larvocysts of E.multilocularis isolated from experimentally infected rats were minced through a meat grinder with a grid diameter of 3-4 mm. Mixed with IZHS at the rate of 1:10 (1 g of larvocyst fragments per 15 ml of solution) of the following composition: tap water - 1000 cm 3 (temperature 41-42 ° C); concentrated hydrochloric acid (specific gravity 1.2) - 10 cm 3 ; food pepsin - 6.0 g; NaCl - 9.0 g. The prepared solution was poured into the reactor of the apparatus and the heating mode was started up to 41-42 ° C (automatic preset program).
Полученную измельченную пробу закладывали в металлическую колбу аппарата «Gastros-2M» и помещали в реактор и прогретый ИЖС. Время экспозиции аппарата в режиме переваривания при постоянном автоматическом перемешивании - 50 минут и постоянной температуре 41-42°C, время отстаивания - 10 минут. Характеристики прибора позволяют одномоментно производить переваривание измельченных ларвоцист E.multiocularis с массой 75-150 г с использованием от одного до двух литров ИЖС.The obtained ground sample was placed in a metal flask of the Gastros-2M apparatus and placed in a reactor and heated IZHS. The exposure time of the apparatus in the digestion mode with constant automatic stirring is 50 minutes and a constant temperature of 41-42 ° C, the settling time is 10 minutes. The characteristics of the device allow the simultaneous digestion of crushed larvocyst E.multiocularis with a mass of 75-150 g using one to two liters of IZHS.
Полученный перевар представляет собой мутный бульон без крупных оформленных частиц ткани, на дне реактора оставался тонкий белесый осадок и непереваренные фрагменты соединительно-тканной природы, не представляющие ценности. Мутный бульон в объеме 30-50 см3 сливали из реактора по истечении 10-минутного отстаивания. Объем мутного бульона не зависит от первоначальной массы измельченных ларвоцист.The resulting digest is a muddy broth without large framed particles of tissue, at the bottom of the reactor there was a thin whitish precipitate and undigested fragments of connective tissue nature that were not valuable. Turbid broth in a volume of 30-50 cm 3 was drained from the reactor after 10 minutes of sedimentation. The volume of turbid broth does not depend on the initial mass of crushed larvocysts.
Полученную смесь взбалтывали и после 5 мин отстаивания удаляли всю надосадочную жидкость и заменяли ее свежим физиологическим раствором 37°C до конечного объема 50 мл. После отстаивания в течение 5 минут надосадочную жидкость удаляли автоматическим пипетором Thermo Scientific Finnpipette С1 со сменными одноразовыми пластиковыми пипетками и заменяли свежим физиологическим раствором 37°C с пенициллином и мономицином в концентрации 4000 ед./мл каждого до конечного объема 50 мл. Данная операция повторялась до тех пор, пока надосадочная жидкость не становилась прозрачной, в среднем 2-3 раза.The resulting mixture was shaken and after 5 minutes of settling all the supernatant was removed and replaced with fresh saline 37 ° C to a final volume of 50 ml. After settling for 5 minutes, the supernatant was removed with a Thermo Scientific Finnpipette C1 automatic pipette with replaceable disposable plastic pipettes and replaced with fresh saline at 37 ° C with penicillin and monomycin at a concentration of 4000 units / ml each to a final volume of 50 ml. This operation was repeated until the supernatant became transparent, on average 2-3 times.
Жизнеспособность выделенных протосколексов оценивали путем микроскопии осадка при увеличении объектива 4×10 по их целостности, двигательной активности и наличию/отсутствию инородных примесей. Получение культуры протосколексов эхинококка считается эффективным, если в поле зрения присутствуют не менее 95% жизнеспособных активно двигающихся протосколексов E.multiocularis без включения инородных элементов. Инвазивность определяли биопробой на интактных мышах или крысах.The viability of the isolated protoscolexes was assessed by microscopy of the sediment with an increase in the lens 4 × 10 according to their integrity, motor activity and the presence / absence of foreign impurities. Obtaining a culture of echinococcus protoscolexes is considered effective if at least 95% of viable actively moving E. multiocularis protoscolexes are present in the field of view without the inclusion of foreign elements. Invasiveness was determined by bioassay on intact mice or rats.
Примеры конкретного исполненияExamples of specific performance
ПРИМЕР 1. Получение из чистой жизнеспособной культуры протосколексов E.multiocularis антигенов и оценка их диагностической эффективности.EXAMPLE 1. Obtaining from a pure viable culture of protoscolex E.multiocularis antigens and evaluation of their diagnostic effectiveness.
От пяти белых беспородных крыс, экспериментально зараженных внутрибрюшинно инвазивным материалом E.multiocularis в дозе 1500-2000 экз. с антибиотиками (стрептомицин и пенициллин по 100 ЕД/мл), получали ларвоцисты E.multiocularis через 3-4 месяца после заражения. Полученные ларвоцисты подвергали измельчению и использовали для получения жизнеспособной чистой культуры протосколексов E.multiocularis по вышеописанной методике (стр. 4-6). Из полученной чистой жизнеспособной культуры протосколексов E.multiocularis готовили клеточную культуру с последующим культивированием и получением антигенов протосколексов (патент №2219551 - 2003. Бюл №35). Диагностическую эффективность полученного антигена протосколексов E.multiocularis проверили с 30 пробами сывороток экспериментально зараженных белых крыс, в том числе зараженных E.multiocularis - 12 проб, Trichinella spiralis - 12 проб, Toxocara canis - 6 проб и 10 проб сывороток от интактных крыс. Результаты исследования представлены в таблице.From five white outbred rats experimentally infected with the intraperitoneal invasive material E.multiocularis at a dose of 1500-2000 ind. with antibiotics (streptomycin and penicillin at 100 IU / ml), E.multiocularis larvocysts were obtained 3-4 months after infection. The obtained larvocysts were subjected to grinding and used to obtain a viable pure culture of E. multiocularis protoscolexes according to the method described above (p. 4-6). A cell culture was prepared from the obtained pure viable protoscolex culture of E.multiocularis, followed by cultivation and preparation of protoscolex antigens (patent No. 2219551 - 2003. Bull No. 35). The diagnostic efficacy of the obtained E.multiocularis protoscolex antigen was checked with 30 samples of experimentally infected white rat sera, including infected E.multiocularis 12 samples, Trichinella spiralis 12 samples, Toxocara canis 6 samples and 10 serum samples from intact rats. The results of the study are presented in the table.
ПРИМЕР 2. Оценка протективной эффективности полученных антигенов из чистой жизнеспособной культуры протосколексов E.multiocularisEXAMPLE 2. Evaluation of the protective efficacy of the obtained antigens from a pure viable culture of E. multiocularis protoscolexes
От трех белых беспородных крыс, экспериментально зараженных внутрибрюшинно инвазивным материалом E.multiocularis в дозе 1500-2000 экз. с антибиотиками (стрептомицин и пенициллин по 100 ЕД/мл), получали ларвоцисты E.multiocularis через 3-4 месяца после заражения. Полученные ларвоцисты подвергали измельчению и использовали для получения жизнеспособной чистой культуры протосколексов E.multiocularis по вышеописанной методике (стр. 4-6). Из полученной чистой жизнеспособной культуры протосколексов E.multiocularis готовили клеточную культуру с последующим культивированием и получением антигенов протосколексов (патент №2219551 - 2003. Бюл №35). Протективную эффективность полученного антигена протосколексов E.multiocularis проверили на 30 беспородных белых мышах.From three white outbred rats experimentally infected with the intraperitoneal invasive material E.multiocularis at a dose of 1500-2000 ind. with antibiotics (streptomycin and penicillin at 100 IU / ml), E.multiocularis larvocysts were obtained 3-4 months after infection. The obtained larvocysts were subjected to grinding and used to obtain a viable pure culture of E. multiocularis protoscolexes according to the method described above (p. 4-6). A cell culture was prepared from the obtained pure viable protoscolex culture of E.multiocularis, followed by cultivation and preparation of protoscolex antigens (patent No. 2219551 - 2003. Bull No. 35). The protective efficacy of the obtained protoscolex antigen E.multiocularis was tested on 30 outbred white mice.
Непосредственно перед проведением экспериментов на животных-моделях определяли необходимое количество иммунизирующей дозы антигена протосколексов E.multilocularis (по белку) в объемном выражении. Разовая иммунизирующая доза для мышей составляла 0,2 мл (80 мкг белка). Протективные свойства антигена изучили на животных-моделях при 2-кратном подкожном введении с интервалом 10 дней и последующем проверочном заражении иммунизированных и контрольных животных инвазивным материалом E.multitocularis через 14 дней после последней иммунизации. Исследования провели на экспериментальных 30 белых беспородных мышах, массой 20,0 г, распределенных на 2 равноценные группы по 15 мышей в каждой. У мышей, иммунизированных антигеном протосколексов E.multitocularis защитный эффект составил 80%, у трех мышей (20%) из 15 были обнаружены в печени цисты паразита без зародышевых элементов. У всех контрольных мышей были обнаружены многочисленные ларвоцисты во всех внутренних органах и в брюшной полости размером до 1,2 см в диаметре. В большинстве ларвоцист паразита регистрировали сформировавшиеся протосколексы.Immediately before conducting experiments on animal models, the required amount of an immunizing dose of the E. multilocularis protoscolex antigen (by protein) was determined in volume terms. A single immunizing dose for mice was 0.2 ml (80 μg protein). The protective properties of the antigen were studied in animal models with 2-fold subcutaneous administration with an interval of 10 days and subsequent verification infection of the immunized and control animals with invasive material E.multitocularis 14 days after the last immunization. The studies were carried out on experimental 30 white outbred mice weighing 20.0 g, distributed into 2 equivalent groups of 15 mice each. In mice immunized with the E. multitocularis protoscolex antigen, the protective effect was 80%; in three mice (20%) of 15, parasite cysts without germ elements were found in the liver. Numerous larvocysts in all internal organs and in the abdominal cavity up to 1.2 cm in diameter were found in all control mice. In most parasite larvocysts, the formed protoscolexes were recorded.
Таким образом, антиген, полученный из выделенной чистой культуры протосколексов E.multilocularis, является эффективным стимулятором защитных иммунных механизмов.Thus, the antigen obtained from the isolated pure culture of E. multilocularis protoscolexes is an effective stimulator of protective immune mechanisms.
Положительный эффект изобретения Ключевым моментом исследований по поиску оптимальных способов выделения очищенной и жизнеспособной культуры протосколексов в больших объемах является повышение качества получаемой культуры протосколексов. В настоящий момент метод выделения через мельничный газ предусматривает применение ручного труда на всех этапах выделения культуры, особенно на этапе выделения протосколексов путем многократного перетирания и промывания биомассы ларвоцист. При данном способе в культуру могут выделяться как жизнеспособные, так и нежизнеспособные протосколексы, а также иные элементы, такие как обрывки капсул, клетки ларвоцист, гной переродившихся цист, ткани животного и прочее. Кроме того, при таком способе получения выход остатка биомассы, содержащего в себе жизнеспособные протосколексы достаточно велик, так как цистная ткань зачастую имеет хрящеподобное строение и с трудом подвергается ручной и механической деструкции. Помимо прочего описанный выше процесс является трудоемким и времязатратным.Advantageous Effect of the Invention A key aspect of research to find the best ways to isolate a purified and viable protoscolex culture in large volumes is to improve the quality of the resulting protoscolex culture. At the moment, the method of separation through mill gas involves the use of manual labor at all stages of the extraction of culture, especially at the stage of isolation of protoscolexes by repeated grinding and washing of biomass of larvocysts. With this method, both viable and non-viable protoscolexes can be secreted into the culture, as well as other elements, such as fragments of capsules, larvocyst cells, pus of degenerated cysts, animal tissue, etc. In addition, with this method of obtaining the yield of the remainder of the biomass containing viable protoscolexes is large enough, since the cystic tissue often has a cartilaginous structure and is difficult to undergo manual and mechanical destruction. Among other things, the process described above is laborious and time consuming.
Предложенный способ выделения протосколексов E.multiocularis путем переваривания в ИЖС обеспечивает отбор только жизнеспособных протосколексов и позволяет произвести предварительную очистку культуры от посторонних включений биологического происхождения по сравнению с ручным методом выделения. Также снижаются потери ценного биоматериала (протосколексы E.multiocularis) в связи с увеличением безотходности производства. Помимо прочего заметно снижаются затраты времени на получение жизнеспособной культуры протосколексов (до 1,5 часов). Способ прост в исполнении, не требует дополнительного оборудования и больших материальных затрат, позволяет увеличить выход чистых жизнеспособных протосколексов E.multitocularis до 95-98%.The proposed method for the isolation of E. multiocularis protoscolexes by digestion in IZhS provides the selection of only viable protoscolexes and allows the preliminary purification of the culture from foreign inclusions of biological origin in comparison with the manual extraction method. Also, the loss of valuable biomaterial (protoscolexes E.multiocularis) is reduced due to an increase in non-waste production. Among other things, the time required to obtain a viable protoscolex culture is significantly reduced (up to 1.5 hours). The method is simple to execute, does not require additional equipment and high material costs, allows to increase the yield of pure viable protoscolexes E.multitocularis up to 95-98%.
Предложенный нами способ не является очевидным, так как никто в мире до нас никогда не получал культуру протосколексов E.multiocularis путем переваривания ларвоцист в искусственном желудочном соке. Применение аппарата ускоряет процесс и обеспечивает выделение исключительно живых протосколексов.Our proposed method is not obvious, since no one in the world before us has ever received a culture of protoscolexes of E.multiocularis by digesting larvocysts in artificial gastric juice. The use of the apparatus accelerates the process and ensures the isolation of exclusively living protoscolexes.
Информация, принятая во внимание:Information taken into account:
1. Бережко В.К., Кленова И.Ф., Сивкова Т.Н., Коваленко Ф.П., Бессонов А.С., Написанова Л.А., Гламаздин И.Г. Патент "Способ получения диагностического антигена цестод", 20.12.2003. №2219551 - 2003. Бюл №35.1. Berezhko V.K., Klenova I.F., Sivkova T.N., Kovalenko F.P., Bessonov A.S., Pisanova L.A., Glamazdin I.G. Patent "Method for the production of diagnostic cestode antigen", 12.20.2003. No. 2219551 - 2003. Bull No. 35.
2. Коваленко Ф.П., Джаброва В.И, Баллад Н.Е., Збарский А.И., Буланова Т.Е. Способ хранения ларвального альвеококка. Номер патента 1839182, опубликовано: 30.12.1993.2. Kovalenko F.P., Dzhabrova V.I., Ballad N.E., Zbarsky A.I., Bulanova T.E. A method of storing larval alveococcus. Patent number 1839182, published: 12/30/1993.
3. Маркин А.В. Эпидемиологическая ситуация по гельминтозам в России (1986-1995) // Матер. Докл. Науч. конф. Всеросс. О-ва гельминтол. «Теория Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М., 1999 – с. 152-154.3. Markin A.V. The epidemiological situation of helminthiasis in Russia (1986-1995) // Mater. Doc. Scientific conf. All-Russian. Helminthol Islands. "Theory Theory and practice of controlling parasitic diseases." - M., 1999 - p. 152-154.
4. Мусаев Г.Х. Эпидемиологические аспекты развития эхинококкоза // Матер. Докл. Науч. конф. Всеросс. О-ва гельминтол. «Теория Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М., 1999 – с. 170-171.4. Musaev G.Kh. Epidemiological aspects of the development of echinococcosis // Mater. Doc. Scientific conf. All-Russian. Helminthol Islands. "Theory Theory and practice of controlling parasitic diseases." - M., 1999 - p. 170-171.
5. Письмо от 20.06.2016 №01/7782-16-27 "О заболеваемости эхинококкозом и альвеококкозом в Российской Федерации" [Электронный ресурс]: http: //www.rospotrebnadzor.ru/upload/iblock/cca/ekhinokokkoz.pdf5. Letter dated 20.06.2016 No. 01/7782-16-27 "On the incidence of echinococcosis and alveococcosis in the Russian Federation" [Electronic resource]: http: //www.rospotrebnadzor.ru/upload/iblock/cca/ekhinokokkoz.pdf
6. Kovalenko F., Darchenkova N., Legonkov Y., Musaev G., Gudovsky L., Parshin V., et al. Hydatid diseases (cystic and alveolar) in Russia (1983-1997). Acta Parasitol. 2000; 45: 241-2.6. Kovalenko F., Darchenkova N., Legonkov Y., Musaev G., Gudovsky L., Parshin V., et al. Hydatid diseases (cystic and alveolar) in Russia (1983-1997). Acta Parasitol. 2000; 45: 241-2.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017116745A RU2665781C1 (en) | 2017-05-15 | 2017-05-15 | Method for obtaining a pure viable culture of protoscolexes echinococcus multilocularis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017116745A RU2665781C1 (en) | 2017-05-15 | 2017-05-15 | Method for obtaining a pure viable culture of protoscolexes echinococcus multilocularis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2665781C1 true RU2665781C1 (en) | 2018-09-04 |
Family
ID=63459949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017116745A RU2665781C1 (en) | 2017-05-15 | 2017-05-15 | Method for obtaining a pure viable culture of protoscolexes echinococcus multilocularis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2665781C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1839182A1 (en) * | 1990-04-25 | 1993-12-30 | Inst Med Parazitologii I Tropi | Method of larval alveococcus storage |
| RU2219551C1 (en) * | 2002-06-17 | 2003-12-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина | Method for obtaining diagnostic antigen in cestodes |
-
2017
- 2017-05-15 RU RU2017116745A patent/RU2665781C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1839182A1 (en) * | 1990-04-25 | 1993-12-30 | Inst Med Parazitologii I Tropi | Method of larval alveococcus storage |
| RU2219551C1 (en) * | 2002-06-17 | 2003-12-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина | Method for obtaining diagnostic antigen in cestodes |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| КЕРЕЕВ Я.М. Эхинококкоз животных. Научные труды, Орал, 2010, с. 5-25. * |
| Найдено в интернет: mteh.1.ru/internet-magazin/katalog/2763/9909/, 2014 год. ТХАКАХОВА А.А., БЕРЕЖКО В.К. Сероэпизоотологический мониторинг эхинококкоза овец в Кабардино-Балкарской Республике. Российский паразитологический журнал, 2012, N. 3, с.103-109. * |
| Найдено в интернет: mteh.1.ru/internet-magazin/katalog/2763/9909/, 2014 год. ТХАКАХОВА А.А., БЕРЕЖКО В.К. Сероэпизоотологический мониторинг эхинококкоза овец в Кабардино-Балкарской Республике. Российский паразитологический журнал, 2012, N. 3, с.103-109. ТХАКАХОВА А.А., БЕРЕЖКО В.К. Белковый спектр трехдневных экскреторно- секреторных продуктов культивируемых протоскоксов Echinococcus granulosus и E. multilocularis. Российский паразитологический журнал, 2010, N. 4, с. 83-88. КЕРЕЕВ Я.М. Эхинококкоз животных. Научные труды, Орал, 2010, с. 5-25. * |
| ТХАКАХОВА А.А., БЕРЕЖКО В.К. Белковый спектр трехдневных экскреторно- секреторных продуктов культивируемых протоскоксов Echinococcus granulosus и E. multilocularis. Российский паразитологический журнал, 2010, N. 4, с. 83-88. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kot et al. | Amoebas from the genus Acanthamoeba and their pathogenic properties | |
| TWI517858B (en) | Purified plasmodium and vaccine compositions | |
| AU2006332241B2 (en) | Composition comprising parasite eggs and methods for isolation and storage of parasite eggs | |
| CN1617668A (en) | Methods for pretreating a subject with extracorporeal photopheresis and/or apoptotic cells | |
| RU2665781C1 (en) | Method for obtaining a pure viable culture of protoscolexes echinococcus multilocularis | |
| CN105907715B (en) | Exosome derived from schistosoma japonicum egg antigen-stimulated dendritic cell and application thereof | |
| NL8104979A (en) | METHOD FOR THE PREPARATION OF IMMUNOBIOLOGICAL PREPARATIONS FOR USE IN THE DIAGNOSIS, PREVENTION AND / OR TREATMENT OF CANDIDA GUILLIERMONDII INFECTIONS | |
| CN101820891B (en) | BCG polysaccharide nucleic acid extractive and preparation method thereof | |
| EP1834648B1 (en) | Process for producing an allergen extract | |
| Etewa et al. | Studies on the role of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) in hepatocytes induced apoptosis in vaccinated, Schistosoma mansoni-challenged mice | |
| Shirazi et al. | Isolation and purification of Echinococcus granulosus antigen B from hydatid cyst fluid using three different methods | |
| RU2415416C1 (en) | Method to detect sarcocyst trophozoites | |
| RU2525688C2 (en) | METHOD FOR PRODUCING PURIFIED SOMATIC ANTIGEN OF Dirofilaria immitis | |
| Ali et al. | Evaluation of IL-2, IL-1 evaluation of IL-2, IL-10 and IFN-gamma immune expression in liver and spleen after treatment of experimental cystic echinococcosis | |
| RU2727007C1 (en) | Method for production of bovine lymphocytes | |
| RU2567845C1 (en) | METHOD OF SEPARATION OF LARVAE T.canis BY METHOD OF DIGESTING LUNG AND LIVER PARENCHYMA OF CARNIVORES | |
| RU2802251C1 (en) | Vaccine composition for the prevention of enzootic abortion in sheep | |
| RU2798283C1 (en) | Chlamydia vnitibp-21 chlamydia abortus strain for the production of immunobiological medicinal products | |
| CN113016713B (en) | Method for separating echinococcus granulosus eggs from dog feces and hatching ouncercaria sexually in vitro | |
| WO2018025236A1 (en) | Method for ex vivo induction of suppressor lymphocytes using a solution of proteins from helminth parasites, lymphocytes produced by this method and uses thereof | |
| Forsyth et al. | Purification of Onchocerca gibsoni microfilariae | |
| CN108707588B (en) | Muscovy duck parvovirus strain and application thereof | |
| Ali et al. | Prevalence of Blastocystis hominis in patients with diabetes mellitus in Balad City, Salahaddin Province, Iraq | |
| CN108607095B (en) | Goose parvovirus strain and application thereof | |
| Zawawi | Towards the development of a novel vaccine for Trichuris trichiura |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190516 |