RU2665171C2 - Method for detecting phosphatidylserine on the erythrocyte membrane surface - Google Patents
Method for detecting phosphatidylserine on the erythrocyte membrane surface Download PDFInfo
- Publication number
- RU2665171C2 RU2665171C2 RU2016133652A RU2016133652A RU2665171C2 RU 2665171 C2 RU2665171 C2 RU 2665171C2 RU 2016133652 A RU2016133652 A RU 2016133652A RU 2016133652 A RU2016133652 A RU 2016133652A RU 2665171 C2 RU2665171 C2 RU 2665171C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phosphatidylserine
- minutes
- red blood
- glutaraldehyde
- membrane surface
- Prior art date
Links
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 title claims abstract description 21
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 21
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- ICAKDTKJOYSXGC-UHFFFAOYSA-K lanthanum(iii) chloride Chemical compound Cl[La](Cl)Cl ICAKDTKJOYSXGC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к биологии и медицине, а именно к лабораторным методам исследования, и может использоваться для оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.The present invention relates to biology and medicine, namely to laboratory research methods, and can be used to assess the presence of phosphatidylserine on the surface of red blood cell membranes.
Известно, что в эритроцитах фосфолипиды расположены асимметрично. Фосфатидилхолин и сфингомиелин локализованы на внешней половине липидного бислоя, фосфатидилэтаноламин на внешней и внутренней половине мембраны. Отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин локализован исключительно на внутренней стороне липидного бислоя (Zwaal R.F.A., Schroit A.J. Blood. 1997. Vol. 89. P. 1121-1132). Выход фосфатидилсерина на поверхность мембран клеток крови при многих патологических состояниях ускоряет свертывание крови, приводит к тромботическим состояниям (Zwaal R.F.A, Comfurius P., Bevers E.V. Cell. Mol. Life Sci. 2005. Vol. 62. P. 971-988.).In erythrocytes, phospholipids are known to be asymmetrically located. Phosphatidylcholine and sphingomyelin are located on the outer half of the lipid bilayer, phosphatidyl ethanolamine on the outer and inner half of the membrane. Negatively charged phospholipid phosphatidylserine is located exclusively on the inside of the lipid bilayer (Zwaal R.F.A., Schroit A.J. Blood. 1997. Vol. 89. P. 1121-1132). The release of phosphatidylserine on the surface of blood cell membranes under many pathological conditions accelerates blood coagulation and leads to thrombotic conditions (Zwaal R.F.A, Comfurius P., Bevers E.V. Cell. Mol. Life Sci. 2005. Vol. 62. P. 971-988.).
Известен способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов, который включает добавление к эритроцитам флюоресцентного белка аннексина V и последующее измерение флюоресценции с помощью проточного цитофлюориметра (Kuypers F.A., Lewis R.A., Hua М. et al. Blood. 1996. Vol. 87. P. 1179-1183).A known method for assessing the presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes, which includes adding annexin V fluorescent protein to red blood cells and then measuring fluorescence using a flow cytometer (Kuypers FA, Lewis RA, Hua M. et al. Blood. 1996. Vol. 87. P. 1179-1183).
Однако для этого требуется дорогостоящее дефицитное оборудование (проточный цитофлюориметр) и дорогие дефицитные реактивы.However, this requires expensive scarce equipment (flow cytometer) and expensive scarce reagents.
В качестве прототипа выбран способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов (Шереметьев Ю.А., Успенский А.Н., Шевченко Е.А., Еремин С.П. Способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов. Патент RU 2547573. 2015), который включает фиксацию эритроцитов глутаровым альдегидом, помещение их на предметное стекло, обработанное хлористым лантаном. После перемешивания по появлению агрегатов судят о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.As a prototype, a method for assessing the presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes was selected (Sheremetyev Yu.A., Uspensky AN, Shevchenko EA, Eremin SP. Method for assessing the presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes. Patent RU 2547573. 2015 ), which includes the fixation of red blood cells with glutaraldehyde, placing them on a glass slide treated with lanthanum chloride. After mixing, the appearance of aggregates is used to judge the presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes.
Однако этот способ требует длительного времени. Это заключается в предварительном приготовлении стекол, обработанных хлористым лантаном и трехкратном отмывании эритроцитов дистиллированной водой. Кроме того, фиксация эритроцитов происходит в растворе глутарового альдегида в течение 60 минут.However, this method requires a long time. This consists in the preliminary preparation of glasses treated with lanthanum chloride and three times washing the red blood cells with distilled water. In addition, the fixation of red blood cells occurs in a solution of glutaraldehyde within 60 minutes.
Задача предлагаемого изобретения - совершенствование способа.The objective of the invention is the improvement of the method.
Технический результат - сокращение времени оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.EFFECT: reduced time for evaluating the presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем фиксацию эритроцитов с помощью раствора глутарового альдегида в течение 30 минут, их однократное отмывание забуференным физиологическим раствором, к клеткам добавляют хлористый лантан в финальной концентрации 20 мкМ и наблюдают за появлением агрегатов. По появлению агрегатов эритроцитов судят о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.The technical result is achieved due to the fact that in a method that includes fixing red blood cells with a solution of glutaraldehyde for 30 minutes, washing them once with buffered saline, add lanthanum chloride at a final concentration of 20 μM to the cells and observe the appearance of aggregates. By the appearance of red blood cell aggregates, the presence of phosphatidylserine on the surface of red blood cell membranes is judged.
Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты фиксируют в 0.25% растворе глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере, в течение 30 минут при комнатной температуре. После фиксации эритроциты один раз отмывают забуференным физиологическим раствором (10 мМ трис-HCI, 150 мМ NaCI, рН 74) с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 минут. К 0.9 мл 0.5% суспензии фиксированных эритроцитов в забуференном физиологическом растворе добавляют 0.1 мл хлористого лантана в финальной концентрации 20 мкМ, перемешивают и наблюдают с помощью светового микроскопа за образованием агрегатов клеток. Появление агрегатов свидетельствует о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.The method is as follows. Red blood cells are fixed in a 0.25% solution of glutaraldehyde prepared in phosphate buffer for 30 minutes at room temperature. After fixation, red blood cells are washed once with buffered saline (10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 74), followed by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes. To 0.9 ml of a 0.5% suspension of fixed red blood cells in buffered saline solution, 0.1 ml of lanthanum chloride at a final concentration of 20 μM was added, mixed and observed using a light microscope to form cell aggregates. The appearance of aggregates indicates the presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes.
Известно, что инкубация отмытых эритроцитов при 37°C в течение 48 ч в присутствии кальция приводит к развитию эриптоза, на поверхности мембран появляется большое количество фосфатидилсерина (Klarl В.A. et al. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2006. Vol. 290. C. 244-253).It is known that incubation of washed red blood cells at 37 ° C for 48 h in the presence of calcium leads to the development of erythosis, a large amount of phosphatidylserine appears on the membrane surface (Klarl B.A. et al. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2006. Vol .290. C. 244-253).
Пример 1. К 0.9 мл 0.5% суспензии фиксированных нормальных эритроцитов добавляли 0.1 мл хлористого лантана до финальной концентрации 20 мкМ, перемешивали и наблюдали с помощью светового микроскопа. Наблюдается отсутствие агрегатов эритроцитов (рис. 1). На поверхности мембран эритроцитов фосфатидилсерин отсутствует (рис. 1).Example 1. To 0.9 ml of a 0.5% suspension of fixed normal red blood cells, 0.1 ml of lanthanum chloride was added to a final concentration of 20 μM, mixed and observed using a light microscope. There is a lack of red blood cell aggregates (Fig. 1). Phosphatidylserine is absent on the surface of erythrocyte membranes (Fig. 1).
Пример 2. К 0.9 мл 0.5% суспензии фиксированных эритроцитов, которые предварительно инкубировали в присутствии 1 мМ кальция при 37°C в течение 48 ч, добавляли 0.1 мл хлористого лантана до финальной концентрации 20 мкМ, перемешивают и наблюдают с помощью светового микроскопа. Наблюдаются агрегаты эритроцитов (рис. 2). На поверхности мембран эритроцитов присутствует фосфатидилсерин.Example 2. To 0.9 ml of a 0.5% suspension of fixed red blood cells, which were previously incubated in the presence of 1 mM calcium at 37 ° C for 48 h, 0.1 ml of lanthanum chloride was added to a final concentration of 20 μM, stirred and observed using a light microscope. Aggregates of red blood cells are observed (Fig. 2). Phosphatidylserine is present on the surface of erythrocyte membranes.
Проведенные эксперименты показывают возможности применения способа оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов и его преимущества перед прототипом (сокращается время определения с 120 до 40 мин).The experiments performed show the applicability of the method for assessing the presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes and its advantages over the prototype (determination time is reduced from 120 to 40 minutes).
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016133652A RU2665171C2 (en) | 2016-08-15 | 2016-08-15 | Method for detecting phosphatidylserine on the erythrocyte membrane surface |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016133652A RU2665171C2 (en) | 2016-08-15 | 2016-08-15 | Method for detecting phosphatidylserine on the erythrocyte membrane surface |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016133652A RU2016133652A (en) | 2018-02-19 |
| RU2665171C2 true RU2665171C2 (en) | 2018-08-28 |
Family
ID=61227538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016133652A RU2665171C2 (en) | 2016-08-15 | 2016-08-15 | Method for detecting phosphatidylserine on the erythrocyte membrane surface |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2665171C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2701520C1 (en) * | 2019-05-06 | 2019-09-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия" (ФГБОУ ВО НГСХА) | Method of assessing the degree of presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes |
| RU2768194C1 (en) * | 2021-08-02 | 2022-03-23 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева" (НГТУ) | Method for assessing the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2082968C1 (en) * | 1991-12-10 | 1997-06-27 | Нижегородский сельскохозяйственный институт | Method of estimation of erythrocyte membrane state alternation |
| RU2277711C1 (en) * | 2004-10-26 | 2006-06-10 | ФГОУ ВПО Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия (ФГОУ ВПО НГСХА) | Method for evaluating stable state of erythrocytic membranes |
| RU2547573C2 (en) * | 2013-04-15 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия" (ФГБОУ ВПО НГСХА) | Method for detecting phosphatidyl serine on erythrocyte membrane surface |
-
2016
- 2016-08-15 RU RU2016133652A patent/RU2665171C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2082968C1 (en) * | 1991-12-10 | 1997-06-27 | Нижегородский сельскохозяйственный институт | Method of estimation of erythrocyte membrane state alternation |
| RU2277711C1 (en) * | 2004-10-26 | 2006-06-10 | ФГОУ ВПО Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия (ФГОУ ВПО НГСХА) | Method for evaluating stable state of erythrocytic membranes |
| RU2547573C2 (en) * | 2013-04-15 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия" (ФГБОУ ВПО НГСХА) | Method for detecting phosphatidyl serine on erythrocyte membrane surface |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ПОПОВИЧЕВА А.Н. Влияние хранения крови на лантан-индуцированную агрегацию эритроцитов. // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2014. N4(1). С.188-192. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2701520C1 (en) * | 2019-05-06 | 2019-09-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия" (ФГБОУ ВО НГСХА) | Method of assessing the degree of presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes |
| RU2768194C1 (en) * | 2021-08-02 | 2022-03-23 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева" (НГТУ) | Method for assessing the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016133652A (en) | 2018-02-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Maeda et al. | The autophagic membrane tether ATG2A transfers lipids between membranes | |
| Pretorius et al. | Erythrocytes and their role as health indicator: Using structure in a patient-orientated precision medicine approach | |
| Litman | Determination of molecular asymmetry in the phosphatidylethanolamine surface distribution in mixed phospholipid vesicles | |
| Williamson et al. | Involvement of spectrin in the maintenance of phase-state asymmetry in the erythrocyte membrane | |
| JP2013500858A (en) | Bilayer | |
| CN110082531A (en) | A kind of tumour excretion body nano fluorescent detection kit and its application | |
| ES2895133T3 (en) | Method for agglutinating erythrocytes, method for separating erythrocytes and hemagglutination reagent | |
| RU2665171C2 (en) | Method for detecting phosphatidylserine on the erythrocyte membrane surface | |
| Jewell et al. | Clostridium perfringens α-toxin interaction with red cells and model membranes | |
| Choe et al. | Alteration of red cell membrane organization in sickle cell anaemia | |
| Andronico et al. | Sizing extracellular vesicles using membrane dyes and a single molecule-sensitive flow analyzer | |
| RU2547573C2 (en) | Method for detecting phosphatidyl serine on erythrocyte membrane surface | |
| RU2701520C1 (en) | Method of assessing the degree of presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes | |
| CN104833805A (en) | Circulating tumor cell detection and identification kit and application thereof | |
| Chen et al. | Microstructure and biomolecules mobility of human milk fat globules by fluorescence recovery after photobleaching with confocal scanning laser microscope | |
| Hermann et al. | Real-time live confocal fluorescence microscopy as a new tool for assessing platelet vitality | |
| Montes et al. | Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions | |
| Imai et al. | Comprehensive analysis and comparison of proteins in salivary exosomes of climacteric and adolescent females | |
| Vest et al. | Use of steady-state laurdan fluorescence to detect changes in liquid ordered phases in human erythrocyte membranes | |
| Ginevri et al. | Peroxidative damage of the erythrocyte membrane in children with nephrotic syndrome | |
| Latham et al. | Accessing the embryo interior without microinjection | |
| Snead et al. | A tethered vesicle assay for high-throughput quantification of membrane fission | |
| Puthukodan et al. | Purification analysis, intracellular tracking, and colocalization of extracellular vesicles using atomic force and 3d single-molecule localization microscopy | |
| Ghazaryan et al. | Morphological changes of proteolipid giant unilamellar vesicles affected by Macrovipera lebetina obtusa venom visualized with fluorescence microscope | |
| RU2768194C1 (en) | Method for assessing the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20180518 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190816 |