RU2664478C2

RU2664478C2 - Method for producing a culture growth supplement based on human platelet lysate

Info

Publication number: RU2664478C2
Application number: RU2017129446A
Authority: RU
Inventors: Наталья Сергеевна Сергеева; Ярослав Дмитриевич Шанский; Ирина Константиновна Свиридова; Валентина Александровна Кирсанова; Сурая Абдулла кызы Ахмедова; Павел Анатольевич Каралкин; Андрей Дмитриевич Каприн
Priority date: 2017-08-18
Filing date: 2017-08-18
Publication date: 2018-08-17
Also published as: RU2017129446A3; RU2017129446A

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to cellular biology and biotechnology, in particular to the production of a culture growth supplement for the cultivation of tumor cells. Method includes rationing a platelet concentrate (PC) samples by platelet content by centrifuging the PC at 3,130 g for 40 minutes at 20 °C and resuspension of the precipitate in a supernatant of a predetermined volume to obtain a platelet concentration of 1.75×10cells/ml, 3-fold temperature lysis of platelets by freezing for a day to -80 °C and thawing at +37 °C. Cell debris is further deposited by centrifuging at 3,130 g, 40 minutes, 20 °C, collection of the supernatant, microscopic control (×200) for the presence in the field of view of not more than 3 fragments of platelets, standardization by pooling samples equal in volume obtained from PC of not less than 12 donors of both gender groups, further centrifugation of the pooled platelet lysate at 3,130 g, 40 minutes, 20 °C and filtering the sample on 0.45 mcm and 0.22 mcm filters, finally, pouring the required volume in aliquots and lyophilization.EFFECT: invention provides a higher growth of tumor cells of HT-29, MCF-7 line and MG-63 and a similar growth of tumor cells of HCT-116 and HEp-2 lines.1 cl, 7 dwg, 9 tbl, 6 ex

Description

Изобретение относится к области биомедицины и направлено на создание «ростовой добавки», пригодной для 2D и 3D культивирования клеток и микроорганных культур, в том числе на этапах получения клеточных продуктов, предназначенных для введения в организм человека, тканеинженерных конструкций и 3D биопечати, также для создания мягких лекарственных и косметических форм.The invention relates to the field of biomedicine and is aimed at creating a “growth supplement” suitable for 2D and 3D culturing of cells and microorganisms, including at the stages of obtaining cell products intended for introduction into the human body, tissue engineering structures and 3D bioprinting, also for creating soft dosage and cosmetic forms.

Культивирование и наращивание клеток человека in vitro является начальным, промежуточным этапом или самостоятельной процедурой во многих сферах и, в частности, включает:The cultivation and growth of human cells in vitro is an initial, intermediate stage or an independent procedure in many areas and, in particular, includes:

- культивирование и наращивание разных типов клеток для экспериментальных разработок;- cultivation and growth of different types of cells for experimental development;

- культивирование и наращивание клеток гибридом с целью получения моноклональных антител;- cultivation and growth of hybridoma cells in order to obtain monoclonal antibodies;

- культивирование и наращивание клеток разных типов (дифференцированных, прогениторных, стволовых) в целях клеточной терапии;- cultivation and growth of cells of different types (differentiated, progenitor, stem) for the purpose of cell therapy;

- культивирование и наращивание клеток как этап создания тканеинженерных конструкций для регенеративной медицины;- the cultivation and growth of cells as a stage in the creation of tissue-engineering structures for regenerative medicine;

- культивирование и наращивание клеток для биотехнологических целей (включая генетическую инженерию);- cultivation and growth of cells for biotechnological purposes (including genetic engineering);

- культивирование герминогенных клеток в рамках репродуктивных технологий;- cultivation of germ cells in the framework of reproductive technologies;

- формирование, культивирование и 3D биопечать клеток, клеточных сфероидов и микроорганных культур;- the formation, cultivation and 3D bioprinting of cells, cell spheroids and microorgan cultures;

- 3D культивирование клеток, микроорганов и клеточных сфероидов из нормальных и патологически измененных, в том числе, опухолевых клеток в целях тестирования новых лекарственных средств.- 3D cultivation of cells, microorganisms and cell spheroids from normal and pathologically altered, including tumor cells, in order to test new drugs.

Культивирование клеток человека in vitro осуществляют в коммерческих питательных средах разных типов, которые обогащают добавками (supplements). Добавки делятся на два основных типа:The cultivation of human cells in vitro is carried out in commercial nutrient media of various types, which are enriched with supplements (supplements). Additives are divided into two main types:

- традиционно используемые как источники факторов роста (далее - ФР), гормонов, витаминов - сыворотки крови крупного рогатого скота, в т.ч. эмбриональная телячья сыворотка (далее - ЭТС);- traditionally used as sources of growth factors (hereinafter - FR), hormones, vitamins - blood serum of cattle, including fetal calf serum (hereinafter - ETS);

- специальные добавки для решения конкретных задач.- special additives for solving specific problems.

Одной из актуальных проблем регенеративной медицины является безопасность биомедицинских клеточных продуктов и тканеинженерных конструкций, использование которых способствовало бы восстановлению структуры и функции утраченных органов и тканей у пациентов без угрозы возникновения у них различных осложнений, в том числе, иммунологических.One of the urgent problems of regenerative medicine is the safety of biomedical cell products and tissue-engineering structures, the use of which would help restore the structure and function of lost organs and tissues in patients without the threat of various complications, including immunological ones.

Для стандартизации и валидации процесса получения безопасных биомедицинских клеточных продуктов (включая тканеинженерные конструкции и 3D биопечать) требуется разработка регламента их получения. К этому разделу относится и разработка безопасных технологий культивирования клеток, в частности, с использованием подходящих культуральных сред и добавок.To standardize and validate the process of obtaining safe biomedical cellular products (including tissue-engineering constructions and 3D bioprinting), the development of a procedure for their production is required. This section also includes the development of safe cell culture technologies, in particular using suitable culture media and additives.

Для надежного скрининга новых лекарственных средств in vitro более адекватным на сегодняшний день считается не традиционно используемое 2D, а 3D культивирование клеток, их ассоциатов (в частности, клеточных сфероидов) и микрорганных культур. В 3D культурах клетки находятся в более физиологичных и приближенных к реальному организму условиях, в сравнении с таковыми в 2D культурах, и, как показано, отличаются от последних по своей морфологии, активности сигнальных путей, организации межклеточного матрикса и дифференцировочной активности (Astashkina, А. & Grainger, D. W., 2014. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models forhigh-throughput drug candidate toxicity assessments. Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 69-70, pp. 1-18; Akkerman, N. & Defize, L.H., 2017. Dawn of the organoid era. BioEssays, 39(4), pp. 1600244 (1-10).For reliable screening of new drugs in vitro, not traditionally used 2D, but 3D cultivation of cells, their associates (in particular, cell spheroids) and microorgan cultures is considered more adequate today. In 3D cultures, cells are in more physiological and close to the real organism conditions, in comparison with those in 2D cultures, and, as shown, differ from the latter in their morphology, activity of signaling pathways, organization of the intercellular matrix and differentiation activity (Astashkina, A. & Grainger, DW, 2014. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 69-70, pp. 1-18; Akkerman, N. & Defize, LH, 2017. Dawn of the organoid era. BioEssays, 39 (4), pp. 1600244 (1-10).

3D культивирование также требует нексеногенных биологически активных матриксов для культивирования. Одной из моделей 3D культур является культивирование клеток в геле, в частности, в биосовместимых гидрогелях (Kuo, Y.-C. & Wang, С.-С., 2010. Effect of bovine pituitary extract on the formation of neocartilage in chitosan/gelatin scaffolds. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers., Том 40, pp. 150-156; Napolitano, А. и др., 2007. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques, 43(494), pp. 496-500). К таковым относятся, в частности, фибриновые гели Hakkinen, К., Harunaga, J., Doyle, А. & Yamada, K., 2011. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Eng A, Volume 17, pp. 713-724.3D cultivation also requires non-xenogenic biologically active matrices for cultivation. One of the models of 3D cultures is the cultivation of cells in a gel, in particular, in biocompatible hydrogels (Kuo, Y.-C. & Wang, C.-S., 2010. Effect of bovine pituitary extract on the formation of neocartilage in chitosan / gelatin Scaffolds. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers., Volume 40, pp. 150-156; Napolitano, A. et al., 2007. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques, 43 (494) , pp. 496-500). These include, in particular, the fibrin gels Hakkinen, K., Harunaga, J., Doyle, A. & Yamada, K., 2011. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Eng A, Volume 17, pp. 713-724.

Традиционно в качестве ростовой добавки для культивирования клеток используют ЭТС, которая является комплексной смесью высоко- и низкомолекулярных биомолекул с физиологическим балансом стимулирующих и блокирующих ФР, а также с низким содержанием антител- γ-глобулинов - ингибиторов роста и пролиферации клеток (Bieback, K., 2013. Platelet Lysate as Replacement for Fetal Bovine Serum in Mesenchymal Stromal Cell Cultures. Transfus Med Hemother, 40(5), p. 326-335; Mojica-Henshaw, M. et al., 2013. Serum-converted platelet lysate can substitute for fetal bovine serum in human mesenchymal stromal cell cultures. Cytotherapy, 15(12), pp. 1458-68).Traditionally, ETS, which is a complex mixture of high and low molecular weight biomolecules with a physiological balance of stimulating and blocking RFs, and also with a low content of γ-globulin antibodies - cell growth and proliferation inhibitors (Bieback, K., 2013. Platelet Lysate as Replacement for Fetal Bovine Serum in Mesenchymal Stromal Cell Cultures. Transfus Med Hemother, 40 (5), p. 326-335; Mojica-Henshaw, M. et al., 2013. Serum-converted platelet lysate can substitute for fetal bovine serum in human mesenchymal stromal cell cultures. Cytotherapy, 15 (12), pp. 1458-68).

Однако использование ЭТС, представляющей собой источник ксеногенных протеинов, при культивировании клеток на этапах приготовления клеточных препаратов и тканеинженерных конструкций, предназначенных для введения человеку, в настоящее время не рекомендуется вследствие возможности аллергических реакций, а также переноса в организм человека вирусов, прионов и возбудителей зоонозных инфекций (Azouna, N. et al., 2012. Phenotypical and functional characteristics of mesenchymal stem cells from bone marrow: comparison of culture using different media supplemented with human platelet lysate or fetal bovine serum. Stem Cell Res Then, 3(1), p. 6; Warnke, P., Humpe, A., Strunk, D. & et al., 2013. A clinically-feasible protocol for using human platelet lysate and mesenchymal stem cells in regenerative therapies. J Craniomaxillofac Surg., Volume 41, pp. 153-161). В частности, показано, что при введении человеку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), культивированных с ЭТС, могут вырабатываться антитела, опосредующие развитие реакции Артюса (Selvaggi, Т., Walker, R. & Fleisher, Т., 1997. Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions. Blood, 89(3), pp. 776-779). Возможная экспрессия главного комплекса гистосовместимости II типа (МНС II) в ММСК в присутствии ЭТС, по мнению ряда авторов, также ограничивает использование ЭТС в технологиях регенеративной медицины (Griffiths, S. и др., 2013. Human platelet lysate stimulates high-passage and senescent human multipotent mesenchymal stromal cell growth and rejuvenation in vitro. Cytotherapy, 15(12), p. 1469). He исключено, что генетическая нестабильность ММСК ряда доноров in vitro также может быть индуцирована компонентами ЭТС (Crespo-Diaz, R. et al. Platelet lysate consisting of a natural repair proteome supports human mesenchymal stem cell proliferation and chromosomal stability. Cell Transplant., 20(6), pp. 797-811).However, the use of ETS, which is a source of xenogenic proteins, when culturing cells at the stages of preparing cell preparations and tissue-engineering structures intended for administration to humans, is currently not recommended due to the possibility of allergic reactions, as well as the transfer of viruses, prions and pathogens of zoonotic infections into the human body (Azouna, N. et al., 2012. Phenotypical and functional characteristics of mesenchymal stem cells from bone marrow: comparison of culture using different media supplemented with human platelet lysate or fetal bovine serum. Stem Cell Res Then, 3 (1), p .6; Warnke, P., Humpe , A., Strunk, D. & et al., 2013. A clinically feasible protocol for using human platelet lysate and mesenchymal stem cells in regenerative therapies. J Craniomaxillofac Surg., Volume 41, pp. 153-161). In particular, it has been shown that when a person is administered multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) cultured with ETS, antibodies can be generated that mediate the development of the Arthus reaction (Selvaggi, T., Walker, R. & Fleisher, T., 1997. Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions. Blood, 89 (3), pp. 776-779). The possible expression of the main histocompatibility complex of type II (MHC II) in MMSC in the presence of ETS, according to several authors, also limits the use of ETS in regenerative medicine technologies (Griffiths, S. et al., 2013. Human platelet lysate stimulates high-passage and senescent human multipotent mesenchymal stromal cell growth and rejuvenation in vitro. Cytotherapy, 15 (12), p. 1469). It is not excluded that the genetic instability of MMSCs of a number of donors in vitro can also be induced by ETS components (Crespo-Diaz, R. et al. Platelet lysate consisting of a natural repair proteome supports human mesenchymal stem cell proliferation and chromosomal stability. Cell Transplant., 20 (6), pp. 797-811).

Кроме того, известно, что состав ЭТС значительно варьирует по содержанию активных компонентов от лота к лоту, что не дает возможности стандартизовать ее по наиболее значимым компонентам (Naaijkens, В. и др., 2012. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res., 348(1), pp. 119-130). Это часто создает технические, экономические и научные трудности при подборе ЭТС для определенных клеточных линий, а в ряде случаев - при сопоставлении результатов, полученных при использовании разных лотов ЭТС даже в одной лаборатории, а также сходных результатов, полученных в разных лабораториях. При этом подбор ЭТС для конкретной культуры является время- и трудозатратным процессом. Кроме того, ограниченность каждой партии ЭТС определяет необходимость проведения повторных тестирований в полном объеме.In addition, it is known that the composition of ETS varies significantly in content of active components from lot to lot, which makes it impossible to standardize it for the most significant components (Naaijkens, B. et al., 2012. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res., 348 (1), pp. 119-130). This often creates technical, economic and scientific difficulties in selecting ETS for certain cell lines, and in some cases when comparing the results obtained using different lots of ETS even in one laboratory, as well as similar results obtained in different laboratories. At the same time, the selection of ETS for a particular culture is a time- and labor-intensive process. In addition, the limited nature of each batch of ETS determines the need for retesting in full.

Основными недостатками ЭТС, как ростовой добавки для культивирования клеток, предназначенных для введения человеку являются:The main disadvantages of ETS as a growth supplement for the cultivation of cells intended for administration to humans are:

- ЭТС - ксеногенный (в отношении человека) материал;- ETS - xenogenic (in relation to humans) material;

- возможность переноса с ЭТС инфекционных агентов, включая микоплазму, зоонозы, прионы и вирусы (в т.ч. вирус бычьей диареи, парвовирусы, вызывающие бычью энцефалопатию, а также неидентифицированные вирусы);- the possibility of transferring infectious agents, including mycoplasma, zoonoses, prions and viruses (including bovine diarrhea virus, parvoviruses causing bovine encephalopathy, as well as unidentified viruses) from ETS;

- возможность переноса с ЭТС свободной ксеногенной ДНК;- the possibility of transferring free xenogenous DNA from the ETS;

- возможность переноса с ЭТС нежелательных метаболитов;- the possibility of transferring unwanted metabolites from ETS;

- возможность иммунологического ответа на ЭТС, в т.ч. аллергических реакций на ксеногенные компоненты;- the possibility of an immunological response to ECF, including allergic reactions to xenogenic components;

- изменение экспрессии ряда маркеров в клетках человека, культивируемых в присутствии ЭТС;- a change in the expression of a number of markers in human cells cultured in the presence of ETS;

- нестандартизованность ЭТС по функциональной активности.- non-standardization of ETS by functional activity.

В странах западной Европы запрет на использование ЭТС при производстве клеточных продуктов регламентируется «Guidance of Minimizing the Risk of Transmitting Animal Spongiform Encephalopathy Agents via Human and Veterinary Medical Products (EMA/410/01), в России - ФЗ №180 от 23.06.2016 г. «О биомедицинских клеточных продуктах».In Western Europe, the ban on the use of ETS in the production of cellular products is regulated by the Guidance of Minimizing the Risk of Transmitting Animal Spongiform Encephalopathy Agents via Human and Veterinary Medical Products (EMA / 410/01), in Russia - Federal Law No. 180 of 06.23.2016 "On Biomedical Cellular Products."

На этапах разработки гуманизированных ростовых добавок к культуральным средам были апробированы экстракты различных тканей, биологические жидкости и бессывороточные среды с рекомбинантными ФР, однако удовлетворительные результаты получены не были (Kuo, Y.-C. & Wang, С.-С., 2010. Effect of bovine pituitary extract on the formation of neocartilage in chitosan/gelatin scaffolds. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers., Том 40, pp. 150-156). Аллогенные сыворотки в качестве замены ЭТС вызывали задержку пролиферации и гибель ММСК (Shahdadfar, A. F. K., Haug, Т., Reinholt, F. & Brinchmann, J., 2005. In vitro expansion of human mesenchymal stem cells: choice of serum is a determinant of cell proliferation, differentiation, gene expression, and transcriptome stability. Stem Cells, 23(9), pp. 1357-66). В аутологичных сыворотках ММСК пролиферировали адекватно, но делать ее дорого и непрактично. Несмотря на существующую возможность использования аутологичной сыворотки, получение ее в объемах, необходимых для наращивания терапевтически значимого количества клеток крайне затруднено, особенно в случаях забора крови от пациентов, ослабленных возрастными изменениями или сопутствующими патологическими процессами (Kobayashi, Т. и др., 2005. Motility and growth of human bone-marrow mesenchymal stem cells during ex vivo expansion in autologous serum. J Bone Joint Surg Br., 87(10), pp. 1426-33).At the stages of the development of humanized growth additives for culture media, various tissue extracts, biological fluids and serum-free media with recombinant RF were tested, but satisfactory results were not obtained (Kuo, Y.-C. & Wang, C.-S., 2010. Effect of bovine pituitary extract on the formation of neocartilage in chitosan / gelatin scaffolds. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers., Volume 40, pp. 150-156). Allogeneic sera as a substitute for ETS caused delayed proliferation and death of MMSCs (Shahdadfar, AFK, Haug, T., Reinholt, F. & Brinchmann, J., 2005. In vitro expansion of human mesenchymal stem cells: choice of serum is a determinant of cell proliferation, differentiation, gene expression, and transcriptome stability. Stem Cells, 23 (9), pp. 1357-66). In autologous sera, MMSCs proliferated adequately, but making it expensive and impractical. Despite the existing possibility of using autologous serum, obtaining it in the volumes necessary to increase the therapeutically significant number of cells is extremely difficult, especially in cases of blood sampling from patients weakened by age-related changes or concomitant pathological processes (Kobayashi, T. et al., 2005. Motility and growth of human bone-marrow mesenchymal stem cells during ex vivo expansion in autologous serum. J Bone Joint Surg Br., 87 (10), pp. 1426-33).

В последние годы внимание исследователей обращено к тромбоцитам - естественным источникам многих ФР (PDGF, изоформы АА, АВ, ВВ; TGFα1, -β; HGF; IGF-1; VEGF; EGF; FGFb), в частности, к лизату тромбоцитов (ЛТ) человека для замены ЭТС (Azouna, N. et al., 2012. Phenotypical and functional characteristics of mesenchymal stem cells from bone marrow: comparison of culture using different media supplemented with human platelet lysate or fetal bovine serum. Stem Cell Res Then, 3(1), p.6; Ruggiu, A. et al., 2013. The effect of Platelet Lysate on osteoblast proliferation associated with a transient increase of the inflammatory response in bone regeneration. Biomaterials, 34(37), pp. 9318-30). В ряде работ показаны также регенеративные свойства препаратов на основе тромбоцитов; накоплен определенный положительный клинический опыт по использованию богатой тромбоцитами плазмы при длительно незаживающих ранах, таких как трофические язвы, травматические повреждения кожного покрова, заболевания языка и некоторые другие патологии покровных и мягких тканей (Chandra, R. K. et al., 2007. Histologic effects of autologous platelet gel in skin flap healing. Arch Facial Plast Surg., 9(4), pp. 260-263;

, J. P., Martineau, I. & Gagnon, G., 2005. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing. J Dent Res, 84(5), pp. 434-439). Вместе с тем, JIT представляет собой водную смесь биологически активных веществ с относительно невысокой стабильностью, и в силу своей гидрофильности ограниченно проникающих через кожные покровы. Решением данной проблемы является создание лекарственных форм ЛТ, содержащих необходимые вспомогательные веществ, обеспечивающие стабильность ЛТ и его доставку в пораженные участки кожи.In recent years, researchers have turned their attention to platelets, the natural sources of many RFs (PDGF, isoforms AA, AB, BB; TGFα1, -β; HGF; IGF-1; VEGF; EGF; FGFb), in particular, platelet lysate (LT) human to replace ETS (Azouna, N. et al., 2012. Phenotypical and functional characteristics of mesenchymal stem cells from bone marrow: comparison of culture using different media supplemented with human platelet lysate or fetal bovine serum. Stem Cell Res Then, 3 ( 1), p. 6; Ruggiu, A. et al., 2013. The effect of Platelet Lysate on osteoblast proliferation associated with a transient increase of the inflammatory response in bone regeneration. Biomaterials, 34 (37), pp. 9318-30 ) A number of studies also show the regenerative properties of platelet-based drugs; There has been some positive clinical experience with the use of platelet-rich plasma for long-term non-healing wounds such as trophic ulcers, traumatic skin lesions, tongue diseases, and some other pathologies of the integumentary and soft tissues (Chandra, RK et al., 2007. Histologic effects of autologous platelet gel in skin flap healing. Arch Facial Plast Surg., 9 (4), pp. 260-263;

, JP, Martineau, I. & Gagnon, G., 2005. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing. J Dent Res, 84 (5), pp. 434-439). At the same time, JIT is an aqueous mixture of biologically active substances with relatively low stability, and due to its hydrophilicity it penetrates through the skin to a limited extent. The solution to this problem is the creation of dosage forms of RT containing the necessary auxiliary substances to ensure the stability of RT and its delivery to the affected areas of the skin.

Известен способ получения ЛТ из тромбомассы человека (Сергеева, Н. и др., 2016. Способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов из тромбоцитарной массы доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток. Россия, Патент №Заявка №2016115622), в котором использована технологическая схема, подобная, но не идентичная указанной в заявляемом способе.A known method of producing LT from human thrombomass (Sergeeva, N. et al., 2016. A method of obtaining a growth supplement based on platelet lysate from platelet mass of donors to a medium for increasing the cell mass of stem, progenitor, differentiated and tumor cells. Russia, Patent No. Application No. 2016115622), which used a technological scheme similar, but not identical, to that specified in the claimed method.

Отличия заявляемого нами изобретения:The differences of the claimed invention:

- полученный ЛТ в заявляемом способе лиофилизируют.- the obtained LT in the claimed method is lyophilized.

- лиофилизированный ЛТ далее подвергают описанным в формуле изобретения технологическим процедурам для получения следующих видов продукта: ЛТ, богатый фибриногеном, который можно использовать в качестве ростовой добавки; ЛТ, обедненный фибриногеном, который можно использовать в качестве ростовой добавки и в качестве активного компонента при приготовлении мягких лекарственных и косметологических форм; ЛТ, обедненный фибриногеном в среде для культивирования, который можно использовать для культивирования клеток; гель на основе ЛТ, который можно использовать для 2D и 3D культивирования клеток, сфероидов, микроорганов и 3D биопечати.- lyophilized RT is then subjected to the technological procedures described in the claims to obtain the following types of product: RT, rich in fibrinogen, which can be used as a growth additive; Fibrinogen-depleted LT, which can be used as a growth supplement and as an active component in the preparation of mild dosage and cosmetic forms; RT depleted of fibrinogen in a culture medium that can be used to cultivate cells; gel based on LT, which can be used for 2D and 3D cultivation of cells, spheroids, microorganisms and 3D bioprinting.

Известен способ получения ЛТ из богатой тромбоцитами плазмы крови взрослых животных (Persson, A. et al., 2006. Blood Platelet Lysate and Method of Producing The Same. Sweden, Patent No. WO 2006137778) в котором лизис тромбоцитов осуществляют добавлением к тромбоцитам в плазме растворимых солей кальция либо деионизированной воды. Далее смесь центрифугируют и фильтруют.A known method for producing LT from platelet-rich blood plasma of adult animals (Persson, A. et al., 2006. Blood Platelet Lysate and Method of Producing The Same. Sweden, Patent No. WO 2006137778) in which platelet lysis is carried out by adding to platelets in plasma soluble salts of calcium or deionized water. The mixture is then centrifuged and filtered.

Однако полученный по данному способу ЛТ обогащен солями кальция и может быть токсичным для ряда клеточных культур. Высокие концентрации кальция в среде культивирования могут изменять функционирование клеток, так как Са²⁺ - один из ключевых ионов-регуляторов жизнедеятельности.However, RT obtained by this method is enriched with calcium salts and can be toxic to a number of cell cultures. High concentrations of calcium in the culture medium can alter the functioning of cells, since Ca ²⁺ is one of the key ion-regulators of life.

Отличительными признаками предложенного нами способа являются:Distinctive features of our proposed method are:

- использование тромбоцитарной массы (ТМ) человека;- the use of platelet mass (TM) of a person;

- способ дегрануляции тромбоцитов (для выхода ФР в плазму) - замораживание/оттаивание ТМ.- a method of platelet degranulation (for the release of FR into the plasma) - freezing / thawing of TM.

Известен способ приготовления ЛТ и культуральной среды с ЛТ (Holmovist, О. & Westermark, В., 1994. Blood Platelet Lysate, Method Of Its Preparation And A Cell Culture Medium Containing Said Blood Platelet Lysate. Sweden, Patent No. WO 89/10398) из цельной крови животных для выращивания гибридом с целью получения антител.A known method of preparing RT and culture medium with RT (Holmovist, O. & Westermark, B., 1994. Blood Platelet Lysate, Method Of Its Preparation And A Cell Culture Medium Containing Said Blood Platelet Lysate. Sweden, Patent No. WO 89/10398 ) from whole blood of animals for growing hybridomas in order to obtain antibodies.

Отличия от нашего изобретения:Differences from our invention:

- использование периферической крови взрослых животных с бойни;- the use of peripheral blood of adult animals from slaughter;

- получаемый в результате ЛТ - ксеногенный продукт, при этом внутрисердечная пункция эмбриона коровы исключена;- the resulting RT is a xenogenic product, while intracardiac puncture of the cow embryo is excluded;

- способ разрушения и дегрануляции тромбоцитов - добавление Ca²⁺.- a method of destruction and degranulation of platelets - the addition of Ca ²⁺ .

Как и в предыдущем известном способе, полученный ЛТ оказывается обогащенным солями кальция, что связано с повышенным риском токсичности в отношении клеточных культур человека и животных.As in the previous known method, the obtained RT is enriched with calcium salts, which is associated with an increased risk of toxicity in relation to human and animal cell cultures.

Известен способ получения ростовой добавки из обогащенной тромбоцитами плазмы крови животных (Holmovist, О. & Westermark, В., 1993. Preparation of a blood platelet lysate for use in a cell culture medium for hybridoma cells. USA, Patent No. US 5198357) для культивирования гибридомных клеток. ЛТ получают из цельной крови животных с раствором цитрата натрия для предотвращения коагуляции крови. Способ лизиса - добавление солей кальция, что одновременно приводит к коагуляции фибриногена. Сепарацию производят путем центрифугирования, стерилизацию - путем последующей фильтрации. Используют как более дешевую альтернативу ЭТС.A known method of obtaining growth supplements from platelet-rich blood plasma of animals (Holmovist, O. & Westermark, B., 1993. Preparation of a blood platelet lysate for use in a cell culture medium for hybridoma cells. USA, Patent No. US 5198357) for culturing hybridoma cells. RT is obtained from whole blood of animals with sodium citrate solution to prevent blood coagulation. The method of lysis is the addition of calcium salts, which simultaneously leads to the coagulation of fibrinogen. Separation is carried out by centrifugation, sterilization by subsequent filtration. Use as a cheaper alternative to ETS.

Известен способ получения ростовой добавки из обогащенной тромбоцитами плазмы крови (Strunk, D., Schallmoser, K. & Rohde, Е., 2012. Plasma-free platelet lysate for use as a supplement in cell cultures and for the preparation of cell therapeutics. Austria, Patent No. US 20120276632), включающий температурный лизис тромбоцитов (замораживание/оттаивание).A known method of obtaining growth supplements from platelet-rich blood plasma (Strunk, D., Schallmoser, K. & Rohde, E., 2012. Plasma-free platelet lysate for use as a supplement in cell cultures and for the preparation of cell therapeutics. Austria , Patent No. US 20120276632), including temperature platelet lysis (freezing / thawing).

В отличие от предлагаемого нами метода, непосредственно перед лизисом тромбоцитов авторы освобождают ТМ от плазмы крови посредством центрифугирования и разводят тромбоциты в среде, содержащей альбумин человеческой сыворотки, декстран и гидроксиэтилкрахмал для восстановления осмолярности.In contrast to our method, immediately before platelet lysis, the authors release TM from blood plasma by centrifugation and dilute platelets in a medium containing human serum albumin, dextran and hydroxyethyl starch to restore osmolarity.

Известен способ изготовления и применения ЛТ (Shuming, Z., Shichun, W., Yahan, F. & Chunmeng, S., 2015. Method for preparing platelet lysate and application of platelet lysate. China, Patent No. CN 104673747) из тромбомассы, полученной с помощью афереза. Лизис осуществляют путем однократного замораживания (-80°C) - оттаивания (+37°C) тромбомассы с последующей обработкой ультразвуком (100-400 вт, 3-6 секунд), повторяя последнюю процедуру от 5 до 15 раз. Далее ЛТ центрифугируют для осаждения дебриса, очищают от фибрина рекальцинацией (глюконатом кальция или хлоридом кальция) и используют ЛТ как ростовую добавку для культивирования ММСК. В полученном ЛТ определяют содержание VEGF, PDGF, заявляя их как наиболее важные компоненты ЛТ, обеспечивающие для его функциональную активность.A known method for the manufacture and use of LT (Shuming, Z., Shichun, W., Yahan, F. & Chunmeng, S., 2015. Method for preparing platelet lysate and application of platelet lysate. China, Patent No. CN 104673747) from thrombomass obtained using apheresis. Lysis is carried out by a single freezing (-80 ° C) - thawing (+ 37 ° C) of thrombomass followed by ultrasound treatment (100-400 W, 3-6 seconds), repeating the last procedure from 5 to 15 times. Then, LT is centrifuged to precipitate debris, purified from fibrin by recalcification (calcium gluconate or calcium chloride), and LT is used as a growth additive for the cultivation of MMSCs. In the obtained RT, the content of VEGF, PDGF is determined, declaring them as the most important components of RT, ensuring its functional activity.

Известен способ приготовления композиции, содержащий лизат тромбоцитов (Dietz, А. В., Gustafson, М. Р. & Butler, G. W., 2010. Compositions Containing Platelet Contents. USA, Patent No. WO 2010033605). Приготовление ЛТ включает в себя не менее 2-х циклов замораживания (-80°C) - оттаивания (+37°C) и последующее центрифугирование (2000-4000g, оптимально - 3000g) в течение 30 минут. Для стерилизации ЛТ осуществляют ультрафильтрацию (размер пор - 0,45 мкм и 0,2 мкм). Полученный ЛТ в концентрации 5-10% от объема культуральной среды используют в качестве ростовой добавки для культивирования ММСК из жировой ткани (ЖТ), фибробластов человека (ФЧ) или культур опухолевых клеток (глиомы), что обеспечивает длительную (более 30 дней) пролиферацию этих культур in vitro с динамикой нарастания клеточной популяции, сходной с таковой при использовании 5-10% ЭТС. В предложенном способе оценку качества приготовленного ЛТ проводят по содержанию фактора роста эндотелия сосудов VEGF - не менее 200 пг/мл.A known method of preparing a composition containing platelet lysate (Dietz, A. B., Gustafson, M. P. & Butler, G. W., 2010. Compositions Containing Platelet Contents. USA, Patent No. WO 2010033605). RT preparation includes at least 2 cycles of freezing (-80 ° C) - thawing (+ 37 ° C) and subsequent centrifugation (2000-4000g, optimally 3000g) for 30 minutes. Ultrafiltration (pore size 0.45 μm and 0.2 μm) is carried out to sterilize RT. The obtained LT at a concentration of 5-10% of the volume of the culture medium is used as a growth additive for the cultivation of MMSCs from adipose tissue (VT), human fibroblasts (PS) or tumor cell cultures (gliomas), which ensures prolonged (more than 30 days) proliferation of these cultures in vitro with the dynamics of the growth of the cell population, similar to that when using 5-10% ETS. In the proposed method, the quality of the prepared RT is assessed by the content of the vascular endothelial growth factor VEGF - not less than 200 pg / ml.

В заявляемом нами способе стандартизацию проводят по функциональным свойствам. Полученный ЛТ в заявляемом способе лиофилизируют и далее используют для приготовления богатой фибриногеном или лишенной фибриногена ростовой добавки или гидрогеля для 3D культивирования клеток, а также активного композита для создания мягких лекарственных и косметологических средств.In our claimed method, standardization is carried out according to functional properties. The obtained LT in the inventive method is lyophilized and then used for the preparation of a fibrinogen-rich or fibrinogen-free growth supplement or hydrogel for 3D cell culture, as well as an active composite to create soft medicinal and cosmetic products.

Известны способы приготовления композита на основе ЛТ (Copland, I. В. & Galipeau, J., 2014. Compositions, uses, and preparation of platelet lysates. s.l. Patent No. US 20140127314 A1; Woods, E. J. & Taylor, C. G., 2015. Bioactive Compositions Derivable from Platelet Concentrates, and Methods for Preparing and Using Same. USA, Patent No. WO 2015031465) для использования в качестве компонента среды культивирования клеток, включающие лизис тромбоцитов, освобождение путем центрифугирования от клеточного дебриса, очищение от фибриногена путем добавления солей металлов, в частности, хлорида кальция.Known methods for preparing a composite based on LT (Copland, I. B. & Galipeau, J., 2014. Compositions, uses, and preparation of platelet lysates. Sl Pat No. No. US 20140127314 A1; Woods, EJ & Taylor, CG, 2015. Bioactive Compositions Derivable from Platelet Concentrates, and Methods for Preparing and Using Same. USA, Patent No. WO 2015031465) for use as a component of a cell culture medium, including platelet lysis, centrifugal release from cell debris, purification from fibrinogen by adding metal salts in particular calcium chloride.

Известен способ приготовления ЛТ путем отделения плазмы крови от тромбоцитов, отмывания тромбоцитов от плазмы, их лизиса, отмывания от дебриса и фильтрацию, и далее разведение ЛТ в отделенной ранее плазме крови для усиления свойства ЛТ как ростовой добавки in vitro или активного компонента средств для ухода за кожей, предотвращающих появление морщин, и для заживления кожных ран в целях профилактики рубцевания (Barlow, J., Davey, W. & Tressler, R., 2017. Compositions and Methods for Cell Culture. USA, Patent No. US 20170175080). В заявляемом нами способе не производится отмывка тромбоцитов от плазмы, а осуществляется разведение/концентрация, в зависимости от истинного содержания тромбоцитов в исходной ТМ.A known method of preparing RT by separating blood plasma from platelets, washing platelets from plasma, lysis, washing from debris and filtering, and then diluting RT in previously separated blood plasma to enhance the properties of RT as a growth supplement in vitro or an active component of skin care products anti-wrinkle skin and for healing skin wounds to prevent scarring (Barlow, J., Davey, W. & Tressler, R., 2017. Compositions and Methods for Cell Culture. USA, Patent No. US 20170175080). In our claimed method, platelets are not washed from the plasma, but dilution / concentration is carried out, depending on the true platelet content in the initial TM.

Известен способ получения ЛТ из периферической крови доноров, включающий выделение обогащенной тромбоцитами плазмы крови с ее лизисом и последующей лиофилизацией. Полученный ЛТ соединяли в различных соотношениях с выделенной параллельно обедненной тромбоцитами лиофилизированной фракцией плазмы и применяли для культивирования стволовых и прогениторных клеток (Muraglia, A. et al., 2015. Combined platelet and plasma derivatives enhance proliferation of stem/progenitor cells maintaining their differentiation potential. Cytotherapy, 17(12), pp. 1793-806.),A known method of producing LT from peripheral blood of donors, including the allocation of platelet-rich blood plasma with its lysis and subsequent lyophilization. The obtained LT was combined in various ratios with a separated lyophilized plasma fraction isolated in parallel with platelet-depleted plasma and used to cultivate stem and progenitor cells (Muraglia, A. et al., 2015. Combined platelet and plasma derivatives enhance proliferation of stem / progenitor cells maintaining their differentiation potential. Cytotherapy, 17 (12), pp. 1793-806.),

Известна композиция для заживления язв кожи, включающая лизат мезенхимальных стволовых клеток пуповины, нативный и лифилизированный в виде пудры и богатую тромбоцитами плазму крови (Chen, В. и др., 2012. The effects of human platelet lysate on dental pulp stem cells derived from impacted human third molars. Biomaterials, 33(20), pp. 5023-35).A known composition for healing skin ulcers, including an umbilical cord mesenchymal stem cell lysate, native and powder-free and platelet-rich blood plasma (Chen, B. et al., 2012. The effects of human platelet lysate on dental pulp stem cells derived from impacted human third molars. Biomaterials, 33 (20), pp. 5023-35).

Известна композиция для заживления диабетических язв, включающая ЛТ, коммерческий гидрогель и водорастворимый полимер Pluronic F-127 (Cerecedo, М. D. A. et al., 2013. Pharmaceutical Composition of a Platelet Lysate with Wound Healing Activity. Argentina, Patent No. MX2013011483).A known composition for healing diabetic ulcers, including RT, a commercial hydrogel and a water-soluble polymer Pluronic F-127 (Cerecedo, M. D. A. et al., 2013. Pharmaceutical Composition of a Platelet Lysate with Wound Healing Activity. Argentina, Patent No. MX2013011483).

Известен способ получения лиофилизированного ЛТ (Patel А., 2012. Lyophilized platelet lysates. USA, Patent No. US 9682104 B2) из периферической крови индивидуальных доноров путем лизиса концентрата тромбоцитов и последующим 3-6-кратным замораживанием при -80-190°C в течение 24 часов/оттаиванием при +37°C. Полученный ЛТ лиофилизируют и хранят при -80°C до использования. Полученный продукт используют в качестве ростовой добавки для культивирования ММСК из жировой ткани и костного мозга человека. Также полученные продукты используют для лечения ран (в виде порошка, в том числе под окклюзионной повязкой, или раствора для орошения, в концентрациях 5-50% об.), для ингаляций (при растворении порошковой формы). Лиофилизированные продукты могут быть использованы совместно с другими терапевтическими средствами (антибактериальными, противогрибковыми, противовирусными, содержащими ФР), в зависимости от назначения.A known method for producing lyophilized RT (Patel A., 2012. Lyophilized platelet lysates. USA, Patent No. US 9682104 B2) from the peripheral blood of individual donors by lysis of platelet concentrate and subsequent 3-6-fold freezing at -80-190 ° C in within 24 hours / thawing at + 37 ° C. The resulting RT is lyophilized and stored at -80 ° C until use. The resulting product is used as a growth additive for the cultivation of MMSCs from adipose tissue and human bone marrow. Also, the resulting products are used to treat wounds (in the form of a powder, including under an occlusive dressing, or a solution for irrigation, in concentrations of 5-50% vol.), For inhalation (when dissolved in a powder form). Lyophilized products can be used in conjunction with other therapeutic agents (antibacterial, antifungal, antiviral, containing FR), depending on the purpose.

В заявляемом нами способе источником тромбоцитов является не цельная кровь, а тромбоцитарная масса в цитратной плазме крови. Кроме того, ЛТ получают из крови индивидуального донора, в то время как в заявляемом способе осуществляют стандартизацию путем объединения как минимум 12 индивидуальных образцов ЛТ. Получение композиций в указанном источнике не предусматривает их очистку от фибриногена, негативно влияющего на состояние клеток в культуре, в случае соответствующего использования (в заявляемом способе возможно получение продукта как содержащего фибриноген, так и очищенного от него).In our method, the source of platelets is not whole blood, but platelet mass in citrated blood plasma. In addition, RT is obtained from the blood of an individual donor, while in the present method, standardization is carried out by combining at least 12 individual RT samples. Obtaining compositions in the specified source does not provide for their purification from fibrinogen, which negatively affects the state of cells in the culture, in case of appropriate use (in the present method, it is possible to obtain a product containing fibrinogen and purified from it).

Наиболее близким прототипом является заявка на патент на способ получения ростовой добавки на основе ЛТ (RU 2016115622 А). Исходным продуктом для получения ЛТ является ТМ, нормированная по содержанию тромбоцитов путем центрифугирования ТМ при 3130g в течение 40 минут при 20°C и ресуспендирования осадка в супернатанте заданного объема до концентрации тромбоцитов 1,75×10⁹ клеток/мл. ТМ подвергают 3-кратному температурному лизису путем замораживания на сутки до -80°C и размораживания при +37°C. Клеточный дебрис осаждают путем центрифугирования при 3130g в течение 40 минут при 20°C. ЛТ в супернатанте подвергают микроскопическому контролю (×200) на наличие в поле зрения не более 3-х фрагментов тромбоцитов и далее стандартизируют его путем пулирования равных по объему образцов, полученных из ТМ не менее 12 доноров обеих тендерных групп. Пулированный ЛТ центрифугируют при 3130g в течение 40 минут при 20°C и дважды фильтруют (0,45 мкм и 0,22 мкм) с последующим разливанием по аликвотам требуемого объема.The closest prototype is a patent application for a method of producing growth additives based on LT (RU 2016115622 A). The initial product for the production of LT is TM, normalized by platelet count by centrifugation of TM at 3130g for 40 minutes at 20 ° C and resuspension of the pellet in the supernatant of a given volume to a platelet concentration of 1.75 × 10 ⁹ cells / ml. TM is subjected to 3-fold temperature lysis by freezing for a day to -80 ° C and thawing at + 37 ° C. Cell debris is precipitated by centrifugation at 3130g for 40 minutes at 20 ° C. RT in the supernatant is subjected to microscopic control (× 200) for the presence in the field of view of no more than 3 platelet fragments and then standardize it by pooling equal in volume of samples obtained from TM at least 12 donors of both tender groups. The pulled RT is centrifuged at 3130g for 40 minutes at 20 ° C and filtered twice (0.45 μm and 0.22 μm), followed by pouring into aliquots of the required volume.

Анализ выявил следующие отличия прототипа от нашего изобретения:The analysis revealed the following differences of the prototype from our invention:

- Полученный ЛТ хранят в замороженном состоянии и ex tempore размораживают и используют в жидком виде (в заявляемом способе - ЛТ после фильтрации лиофилизируют, что позволяет исключить этап размораживания перед получением ростовой среды)- Received RT is stored in a frozen state and ex tempore thawed and used in liquid form (in the present method - RT after lyophilization is filtered, which eliminates the stage of thawing before obtaining a growth medium)

- ЛТ используется только как ростовая добавка для культивирования клеток, в то время как в заявляемом способе предполагается также использование лиофилизата ЛТ для получения для получения полной ростовой среды (как содержащей фибриноген, так и очищенной от нее), отдельно для создания гидрогеля для 3D культивирования, и отдельно для введения ЛТ в состав лекарственных средств для дермального применения.- RT is used only as a growth additive for cell culture, while the claimed method also involves the use of LT lyophilisate to obtain a complete growth medium (both containing fibrinogen and purified from it), separately to create a hydrogel for 3D cultivation, and separately for the introduction of RT in the composition of drugs for dermal use.

- Получаемый ЛТ не подвергается очистке от фибриногена, негативно влияющего на состояние некоторых клеточных линий in vitro (в заявляемом способе, в зависимости от цели использования, возможно применение ЛТ как содержащего фибриноген, так и очищенного от него).- The resulting RT is not subjected to purification from fibrinogen, which negatively affects the state of some cell lines in vitro (in the present method, depending on the purpose of use, RT can be used both containing fibrinogen and purified from it).

Технический результат направлен на разработку технологии получения спектра медицинских продуктов на основе ЛТ, пригодных для культивирования клеток разных типов, клеточных сфероидов, микроорганных культур, а также получения мягких лекарственных форм и косметических средств для наружного применения.The technical result is aimed at developing a technology for obtaining a spectrum of medical products based on RT, suitable for the cultivation of different types of cells, cell spheroids, microorganisms, as well as obtaining soft dosage forms and cosmetics for external use.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что полученный пулированный ЛТ лиофилизируют. Далее, в зависимости от конкретных задач, подвергают дополнительным стадиям технологической обработки. Для получения среды с ростовой добавкой, содержащей фибриноген, лиофилизированный ЛТ доводят стерильной водой для инъекций до исходного (до лиофилизации) объема и при дальнейшей работе in vitro добавляют к среде для культивирования с гепарином (1-2 ЕД/мл среды) в количестве 5-10% от ее общего объема. Для получения среды с ростовой добавкой, очищенной от фибриногена, добавляют лиофилизированный ЛТ к среде культивирования, содержащей ионы Са²⁺, без гепарина в количестве 5-10% от ее объема, помещают в термостат (при 37°C в течение 4 часов), сформированный фибриновый сгусток стабилизируют в холодильнике (при 4°C в течение 16 часов), затем отделяют сгусток от стенок пробирки и центрифугируют (280g в течение 10 минут при комнатной температуре), супернатант фильтруют через сито с диаметром отверстий 40 мкм и фильтрат используют для культивирования клеток. Для получения ЛТ, очищенного от фибриногена, к разведенному (до исходного объема) в воде для инъекций лиофилизированному ЛТ добавляют CaCl2 до конечной концентрации 16-20 ммоль/л для формирования сгустка, далее помещают в термостат (при 37°C на 4 часа), сформированный в ЛТ фибриновый сгусток стабилизируют в холодильнике (при 4°C в течение 16 ч), далее сгусток отделяют от плазмы и центрифугируют (280 g, 10 минут при комнатной температуре) и полученный супернатант, свободный от фибриногена, используют в качестве ростовой добавки к средам для культивирования клеток и для получения мягких лекарственных форм накожного применения в целях регенеративной медицины и для создания косметических средств. Для получения гидрогеля в целях использования при 3D культивировании лиофилизированный ЛТ разводят в воде для инъекции до исходного объема, добавляют в количестве 10-15% в ростовую среду, содержащую Са2+ в концентрации 10-30 ммоль/л и сформированный гидрогель используют для культивирования клеток, клеточных ассоциатов, микроорганов, а также в качестве «чернил» для 3D биопечати.A feature of the proposed method lies in the fact that the obtained pulled RT is lyophilized. Further, depending on the specific tasks, subjected to additional stages of technological processing. To obtain a medium with a growth supplement containing fibrinogen, lyophilized RT is brought with sterile water for injection to the initial (prior to lyophilization) volume and added to 5–5 heparin culture medium in vitro for further work 10% of its total volume. To obtain a medium with a growth supplement purified from fibrinogen, lyophilized RT is added to a culture medium containing Ca ^{2+ ions} without heparin in an amount of 5-10% of its volume, placed in a thermostat (at 37 ° C for 4 hours), the formed fibrin clot is stabilized in the refrigerator (at 4 ° C for 16 hours), then the clot is separated from the walls of the tube and centrifuged (280g for 10 minutes at room temperature), the supernatant is filtered through a sieve with a hole diameter of 40 μm and the filtrate is used for cultivation crate to. To obtain RT purified from fibrinogen, CaCl2 is added to the lyophilized RT diluted (to the initial volume) in water for injection to a final concentration of 16-20 mmol / L to form a clot, then placed in a thermostat (at 37 ° C for 4 hours), the fibrin clot formed in RT is stabilized in the refrigerator (at 4 ° C for 16 h), then the clot is separated from the plasma and centrifuged (280 g, 10 minutes at room temperature) and the obtained fibrinogen-free supernatant is used as a growth additive to cultured media I cells and for the preparation of soft medicinal forms for dermal application in regenerative medicine and for the creation of cosmetics. To obtain a hydrogel for use in 3D cultivation, lyophilized RT is diluted in water for injection to the initial volume, added in an amount of 10-15% to a growth medium containing Ca2 + at a concentration of 10-30 mmol / L and the generated hydrogel is used to cultivate cells, cell associates, microorganisms, and also as "ink" for 3D bioprinting.

Таким образом, описанными способами, получают четыре продукта:Thus, by the described methods, four products are obtained:

1. Лиофилизированный ЛТ на основе плазмы крови, богатого фибриногеном.1. Lyophilized RT based on blood plasma rich in fibrinogen.

2. ЛТ на основе плазмы крови, свободного от фибриногена, полученного растворением лиофилизата ЛТ в стерильной воде для инъекций, в составе ростовой среды.2. RT based on fibrinogen-free blood plasma obtained by dissolving RT lyophilisate in sterile water for injection, in a growth medium.

3. ЛТ на основе плазмы крови, свободного от фибриногена, полученного растворением лиофилизата ЛТ в стерильной воде для инъекций, содержащего CaCl₂.3. LT-based plasma free of fibrinogen obtained by dissolving a lyophilisate LT in sterile water for injection containing CaCl _2.

4. Гидрогеля на основе 10-15% лиофилизированного ЛТ, растворенного в воде для инъекций, в ростовой среде, содержащей Ca²⁺.4. A hydrogel based on 10-15% lyophilized RT dissolved in water for injection in a growth medium containing Ca ²⁺ .

Изобретение поясняется подробным описанием, клиническими примерами, таблицами и иллюстрациями, на которых изображено:The invention is illustrated by a detailed description, clinical examples, tables and illustrations, which depict:

Фиг. 1 - Прирост популяции ММСК в присутствии 10% ЛТ и ЭТС (относительно 1-х суток, принятых за 100%).FIG. 1 - Growth in the MMSC population in the presence of 10% RT and ETS (relative to 1 day, taken as 100%).

Фиг. 2 - Морфология НЕр-2 in vitro в присутствии ЛТ и ЭТС в различные сроки наблюдения (фазово-контрастная микроскопия): А-Д) - ЛТ 10%; Д-З) - ЭТС 10%; А,Д) - 0 ч; Б,Е) - 1 сутки; В,Ж) - 3 сут; Г,З) - 7 суток.FIG. 2 - Morphology of HEP-2 in vitro in the presence of RT and ETS at different observation times (phase contrast microscopy): AD) - RT 10%; DZ) - ETS 10%; A, D) - 0 h; B, E) - 1 day; B, G) - 3 days; D, H) - 7 days.

Фиг. 3 - Морфология MCF-7 in vitro в присутствии ЛТ и ЭТС в различные сроки наблюдения (фазово-контрастная микроскопия): А-Д) - ЛТ 10%; Е-К) - ЭТС 10%; А,Е) - 0 ч; Б,Ж) - 1 сутки; В,З) - 2 суток; Г,И) - 3 суток; Д,К) - 7 суток.FIG. 3 - Morphology of MCF-7 in vitro in the presence of RT and ETS at different observation times (phase contrast microscopy): AD) - RT 10%; E-K) - ETS 10%; A, E) - 0 h; B, G) - 1 day; B, H) - 2 days; G, I) - 3 days; D, K) - 7 days.

Фиг. 4 - Формирование фолликулов щитовидной железы через 2,5 месяца культивирования фрагментов ткани в трансвелле на границе раздела двух сред - жидкой/воздушной в геле на основе ЛТ в ПРС.FIG. 4 - The formation of thyroid follicles after 2.5 months of culturing tissue fragments in transwell at the interface between two media - liquid / air in RT-based gel in ORS.

Фиг. 5 - Динамика формирования кожного регенерата в контрольной группе животных. Окраска - гематоксилин-эозин; А, Б - до операции; В, Г, - 7 сутки, Д, Е-13 сутки.FIG. 5 - Dynamics of the formation of skin regenerate in the control group of animals. Coloring - hematoxylin-eosin; A, B - before the operation; B, D, - 7 days, D, E-13 days.

Фиг. 6 - Формирование кожного регенерата на 7-13 сутки после операции при обработке раневой поверхности 20% ЛТ. Окраска: гематоксилин-эозин; А, Б - 7 сутки; В, Г - 13 сутки.FIG. 6 - The formation of skin regenerate on the 7-13th day after surgery when treating the wound surface of 20% LT. Coloring: hematoxylin-eosin; A, B - 7 days; B, G - 13 days.

Фиг. 7 - Формирование кожного регенерата на 7-13 сутки после операции при обработке раневой поверхности 100% ЛТ. Окраска: гематоксилин-эозин; А, Б - 7 сутки; В,Г - 13 сутки.FIG. 7 - The formation of skin regenerate on the 7-13th day after surgery when treating the wound surface of 100% LT. Coloring: hematoxylin-eosin; A, B - 7 days; B, G - 13 days.

Способы получения указанных продуктов, согласно заявляемому изобретению, осуществляют следующим образом.Methods of obtaining these products, according to the claimed invention, are as follows.

1. Получение лиофилизированного ЛТ.1. Obtaining lyophilized RT.

Материал для получения лиофилизированного ЛТ - образцы ТМ доноров, полученные путем тромбоцитафереза (например, на аппаратном комплексе Amicus (Швейцария)). Процедура заготовки ТМ валидирована и предполагает контаминацию лейкоцитами в количестве не более 1×10⁶ на дозу (объем 230-300 мл) (~2×10¹¹ тромбоцитов), что контролируется техническим регламентом «О требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии» (постановление №29 ПРФ от 26 января 2010 г.), а также Стандартом №9 «Донорская кровь и ее компоненты: характеристики и контроль качества. IX. Тромбоциты, полученные методом афереза» (Общероссийская общественная организация «Российская ассоциация трансфузиологов»)» от 1.04.2005 г.The material for obtaining lyophilized RT is the samples of TM donors obtained by thrombocytapheresis (for example, on the Amicus hardware complex (Switzerland)). The TM procurement procedure is validated and involves leukocyte contamination in an amount of not more than 1 × 10 ⁶ per dose (230-300 ml volume) (~ 2 × 10 ¹¹ platelets), which is controlled by the technical regulation “On the requirements for the safety of blood, blood products, blood-replacing solutions and equipment used in transfusion and infusion therapy ”(Decree No. 29 of the PRF dated January 26, 2010), as well as Standard No. 9“ Donor blood and its components: characteristics and quality control. IX. Platelets obtained by apheresis method "(All-Russian public organization" Russian Association of Transfusiologists ")" from 1.04.2005

Полученный образец ТМ доноров (объемом около 300 мл) в пластиковом контейнере в стерильных условиях тщательно перемешивают и отбирают точечные пробы объемом 0,5 мл для определения концентрации тромбоцитов с помощью автоматического гематологического анализатора (например, Sysmex KX20, Япония). ТМ переносят в пластиковые пробирки объемом 50 мл (например, Corning, США). Перед измерением пробу разводят в 10 раз цитратным буфером ACD-A.The obtained sample of TM donors (about 300 ml in volume) in a plastic container under sterile conditions is thoroughly mixed and point samples of 0.5 ml in volume are taken to determine the platelet concentration using an automatic hematology analyzer (for example, Sysmex KX20, Japan). TM is transferred to 50 ml plastic tubes (e.g., Corning, USA). Before measurement, the sample is diluted 10 times with citrate buffer ACD-A.

Образец ТМ нормируют по концентрации тромбоцитов. Для этого ТМ центрифугируют в указанных пробирках при 3000g в течение 40 мин при 20°C (например, центрифуга Eppendorf 5810R, Германия). Осадок тромбоцитов ресуспендируют в супернатанте рассчитанного объема, обеспечивающего требуемую концентрацию тромбоцитов (1,75×10⁹ тромбоцитов/мл).Sample TM normalized by the concentration of platelets. For this, the TMs are centrifuged in the indicated tubes at 3000 g for 40 min at 20 ° C (for example, an Eppendorf 5810R centrifuge, Germany). Platelet sediment is resuspended in the supernatant of the calculated volume, providing the desired platelet concentration (1.75 × 10 ⁹ platelets / ml).

Для получения ЛТ пробирки с образцом ТМ, нормированным по концентрации тромбоцитов, подвергают процедуре температурного лизиса: быстро замораживают до -80°C (низкотемпературный холодильник, например, Sanyo MDF-U500VX) и через 18-24 ч размораживают при +37°C в течение 40-60 мин (термостат, например ТС-80М-2, или водяная баня, например, Biosan WB-4MS) до достижения указанной температуры. Процедуру повторяют трехкратно.To obtain LT, tubes with a TM sample normalized by platelet concentration are subjected to temperature lysis: they are quickly frozen to -80 ° C (a low-temperature refrigerator, for example, Sanyo MDF-U500VX) and thawed at + 37 ° C for 18-24 hours 40-60 min (thermostat, for example ТС-80М-2, or a water bath, for example, Biosan WB-4MS) until the indicated temperature is reached. The procedure is repeated three times.

Для осаждения фрагментов разрушенных тромбоцитов (клеточного дебриса) пробирки с ЛТ центрифугируют при 3000g в течение 40 мин при 20°C с минимальной скоростью торможения (например, центрифуга Eppendorf 5810R, Германия). После завершения этапа центрифугирования супернатант, представляющий собой ЛТ, собирают в стерильные пластиковые пробирки объемом 50 мл (например, Corning, США).To precipitate fragments of destroyed platelets (cell debris), RT tubes are centrifuged at 3000 g for 40 min at 20 ° C with a minimum inhibition rate (for example, an Eppendorf 5810R centrifuge, Germany). After the centrifugation step is completed, the LT supernatant is collected in 50 ml sterile plastic tubes (e.g., Corning, USA).

Пробу образца ЛТ оценивают на наличие/отсутствие видимых целых тромбоцитов и/или их фрагментов под световым микроскопом (например, Leica LEITZ DM IL, Германия) при увеличении ×200. Очистку считают адекватной при наличии в поле зрения не более 3 фрагментов тромбоцитов.A sample of an LT sample is evaluated for the presence / absence of visible whole platelets and / or fragments thereof under a light microscope (e.g., Leica LEITZ DM IL, Germany) at a magnification of × 200. Cleaning is considered adequate if there are no more than 3 platelet fragments in the field of view.

В основу принципа пулирования положены функциональные свойства ЛТ как ростовой добавки - его способность обеспечивать пролиферацию иммортализованных фибробластов кожи человека (например, ФЧ, штамм 1608h TERT, ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН), с тем условием, что по этому признаку пулы ЛТ не должны отличаться более чем на 10% (Сергеева, и др., 2016. Способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов из тромбоцитарной массы доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток. Россия, Патент №Заявка №2016115622). Для получения стандартизованного по функциональным характеристикам ЛТ объединяют (пулируют) равные объемы ЛТ, полученные из ТМ 12 доноров.The principle of pooling is based on the functional properties of RT as a growth supplement — its ability to proliferate immortalized fibroblasts of human skin (for example, PS, strain 1608h TERT, Federal State Budgetary Institution “Institute of Molecular Biology named after VA Engelhardt” RAS), with the condition that on this basis, RT pools should not differ by more than 10% (Sergeeva et al., 2016. A method for producing a growth supplement based on platelet lysate from platelet mass of donors to a medium for increasing the cellular mass of stem, progenitor, differential th e and tumor cells. Russia, No. №Zayavka №2016115622). To obtain RT standardized in terms of functional characteristics, equal volumes of RT obtained from TM of 12 donors are combined (pululated).

ЛТ фильтруют через фильтр (диаметр отверстий 0,45 мкм и 0,22 мкм, например, Millipore, США) и аликвоты по 10 мл разливают в стерильные стеклянные флаконы объемом 20 мл, после чего маркируют с указанием номера, даты изготовления и объема образца ЛТ.RT is filtered through a filter (hole diameter 0.45 μm and 0.22 μm, for example, Millipore, USA) and 10 ml aliquots are poured into sterile glass bottles with a volume of 20 ml, after which they are marked with the number, date of manufacture, and volume of the RT sample .

Аликвотированный ЛТ подвергают лиофилизации с использованием аппаратной лиофильной сушки (например, PowerDry PL3000 Freeze Dryer 3kg/24hrs, Thermofisher, США) в соответствии с рекомендованным производителем режимом, который определяется объемом образцов.An aliquot of RT is lyophilized using hardware freeze drying (for example, PowerDry PL3000 Freeze Dryer 3kg / 24hrs, Thermofisher, USA) in accordance with the manufacturer's recommended regimen, which is determined by the volume of samples.

Лиофилизированный ЛТ растворяют в стерильной воде для инъекций (ФС 2.2.0019.15), доводя объем ЛТ до такового перед лиофилизацией и далее в количестве 5-10% (по объему) вводят в состав среды для культивирования клеток, содержащей гепарин (1-2 ЕД/мл) в целях предотвращения выпадения осадка фибрина (например, в среду для культивирования ММСК, состав которой указан далее в табл. 1 настоящей заявки или в другую среду для культивирования клеток).Lyophilized RT is dissolved in sterile water for injection (FS 2.2.0019.15), bringing the RT volume to that before lyophilization and then in the amount of 5-10% (by volume) is introduced into the cell culture medium containing heparin (1-2 PIECES / ml) in order to prevent the precipitation of fibrin (for example, in the medium for cultivation MMSC, the composition of which is indicated below in table 1 of this application or in another medium for cell culture).

2. Получение ЛТ, содержащего фибриноген в составе ростовой среды.2. Obtaining LT containing fibrinogen in the composition of the growth medium.

Лиофилизированный стандартизованный по функциональной активности ЛТ получают в соответствии со Способом 1.Lyophilized functional activity standardized RT is prepared according to Method 1.

Лиофилизированный ЛТ растворяют в стерильной воде для инъекций (ФС 2.2.0019.15), доводя его объем до исходного объема ЛТ до лиофилизации.Lyophilized RT is dissolved in sterile water for injection (FS 2.2.0019.15), bringing its volume to the initial volume of RT before lyophilization.

Растворенный ЛТ в количестве 5-10% (по объему) вводят в состав ростовой среды, содержащей гепарин 1-2 ЕД/мл (например, DMEM, ПанЭко, Россия, табл. 1), в стерильном стеклянном или пластиковом флаконе. Далее флакон со средой выдерживают при 37°C (термостат, например ТС-80М-2, или водяная баня, например, Biosan WB-4MS) в течение 4 часов для перевода фибриногена в среде в нерастворимый фибрин, а затем в холодильник (например, Liebherr LKUv 1610, Германия) на 16-18 часов при 4°C для стабилизации образовавшегося фибринового сгустка.Dissolved LT in an amount of 5-10% (by volume) is introduced into the growth medium containing heparin 1-2 U / ml (for example, DMEM, PanEco, Russia, Table 1), in a sterile glass or plastic bottle. Next, the medium bottle is kept at 37 ° C (thermostat, for example ТС-80М-2, or a water bath, for example, Biosan WB-4MS) for 4 hours to transfer fibrinogen in the medium to insoluble fibrin and then to the refrigerator (for example, Liebherr LKUv 1610, Germany) for 16-18 hours at 4 ° C to stabilize the resulting fibrin clot.

Сгусток отделяют от стенок пробирки и центрифугируют (например, центрифуга Eppendorf 5810R, Германия) при 280g в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим декантированием очищенного от фибриногена супернатанта в стеклянный или пластиковый флакон.The clot is separated from the walls of the tube and centrifuged (for example, an Eppendorf 5810R centrifuge, Germany) at 280g for 10 minutes at room temperature, followed by decantation of the fibrinogen-free supernatant into a glass or plastic bottle.

Супернатант фильтруют через сито 40 мкм (например, производства компании BD, США) в стеклянный или пластиковый флакон и фильтрат далее используют как полную ростовую среду для культивирования клеток. Оценка функциональной активности образца пулированного лиофилизированного ЛТ в составе ростовой среды (табл. 1) осуществляется в тестах in vitro, например, на модели ММСК человека.The supernatant is filtered through a 40 μm sieve (for example, manufactured by BD, USA) into a glass or plastic bottle and the filtrate is then used as a complete growth medium for cell culture. Evaluation of the functional activity of a sample of a pooled lyophilized RT in the composition of the growth medium (Table 1) is carried out in in vitro tests, for example, on a model of human MMSC.

3. Получение ЛТ, очищенного от фибриногена, в составе ростовой среды.3. Obtaining LT, purified from fibrinogen, in the composition of the growth medium.

Лиофилизированный ЛТ растворяют в стерильной воде для инъекций (ФС 2.2.0019.15), доводя объем до исходного до лиофилизации ЛТ.Lyophilized RT is dissolved in sterile water for injection (FS 2.2.0019.15), bringing the volume to the initial one before lyophilization of RT.

Разведенный ЛТ добавляют к ростовой среде, содержащей кальций (например, DMEM/F-12), перемешивают путем пипетирования и выдерживают при 37°C (термостат, например ТС-80М-2, или водяная баня, например, Biosan WB-4MS) в течение 4 часов для перевода фибриногена в нерастворимый фибрин, а затем в холодильник (например, Liebherr LKUv 1610, Германия) на 16-18 часов при 4°C для стабилизации образовавшегося фибринового сгустка.Diluted LT is added to a growth medium containing calcium (for example, DMEM / F-12), stirred by pipetting and kept at 37 ° C (thermostat, for example TC-80M-2, or a water bath, for example, Biosan WB-4MS) in 4 hours to convert fibrinogen to insoluble fibrin, and then to a refrigerator (for example, Liebherr LKUv 1610, Germany) for 16-18 hours at 4 ° C to stabilize the resulting fibrin clot.

Сгусток отделяют от ЛТ и центрифугируют (например, центрифуга Eppendorf 5810R, Германия) при 280g в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим декантированием очищенного от фибриногена супернатанта в стеклянный или пластиковый флакон.The clot is separated from the RT and centrifuged (for example, an Eppendorf 5810R centrifuge, Germany) at 280g for 10 minutes at room temperature, followed by decantation of the fibrinogen-free supernatant into a glass or plastic bottle.

Супернатант пропускают через сито с диаметром отверстий 40 мкм (например, BD, США) и фильтрат далее используют для культивирования клеток. Оценка функциональной активности образца пулированного лиофилизированного ЛТ в составе ростовой среды (табл. 1) осуществляется в тестах in vitro, например, на модели перевивной клеточной линии остеосаркомы человека (MG-63) или иммортализованных фибробластов кожи человека (ФЧ).The supernatant is passed through a sieve with a hole diameter of 40 μm (for example, BD, USA) and the filtrate is then used to cultivate cells. Evaluation of the functional activity of a sample of a pooled lyophilized RT in the growth medium (Table 1) is carried out in vitro tests, for example, on a model of a transplantable cell line of human osteosarcoma (MG-63) or immortalized human skin fibroblasts (PS).

4. Получение ростовой добавки на основе ЛТ, очищенной от фибриногена.4. Obtaining growth supplements based on LT, purified from fibrinogen.

К разведенному ЛТ добавляют раствор кальция хлорида 10% до конечной концентрации 16-22 ммоль/л для формирования фибринового сгустка. Перемешивают путем пипетирования и выдерживают при 37°C (термостат, например ТС-80М-2, или водяная баня, например, Biosan WB-4MS) в течение 4 часов для перевода фибриногена в нерастворимый фибрин, а затем в холодильник (например, Liebherr LKUv 1610, Германия) на 16-18 часов при 4°C для стабилизации образовавшегося фибринового сгустка.To the diluted LT add a solution of calcium chloride 10% to a final concentration of 16-22 mmol / l to form a fibrin clot. Mix by pipetting and incubated at 37 ° C (thermostat, for example TC-80M-2, or a water bath, for example, Biosan WB-4MS) for 4 hours to convert fibrinogen into insoluble fibrin, and then in a refrigerator (for example, Liebherr LKUv 1610, Germany) for 16-18 hours at 4 ° C to stabilize the resulting fibrin clot.

Супернатант пропускают через сито с диаметром отверстий 40 мкм (например, BD, США) и фильтрат далее используют в качестве ростовой добавки для культивирования клеток.The supernatant is passed through a sieve with a hole diameter of 40 μm (for example, BD, USA) and the filtrate is then used as a growth additive for cell culture.

5. Получение ЛТ, очищенного от фибриногена, в целях регенеративной медицины.5. Obtaining RT, purified from fibrinogen, for the purpose of regenerative medicine.

ЛТ, очищенный от фибриногена, получают из лиофилизированного стандартизированного по функциональной активности ЛТ в соответствии со Способом 4.RT purified from fibrinogen is obtained from a lyophilized functional activity standardized RT in accordance with Method 4.

Оценку регенеративной активности полученного ЛТ при накожном применении оценивают in vivo на модели искусственного дефекта кожных покровов (например, раневой дефект кожных покровов у мелких лабораторных животных - крыс, мышей, морских свинок).The assessment of the regenerative activity of the obtained RT during cutaneous application is evaluated in vivo using a model of artificial skin defects (for example, wound skin defects in small laboratory animals - rats, mice, guinea pigs).

6. Получение гидрогеля на основе ЛТ.6. Obtaining a hydrogel based on LT.

Фибриновый гидрогель получают из лиофилизированного ЛТ в соответствии со Способом 3. К ростовой среде добавляют 10-15% растворенного ЛТ (полная ростовая среда, ПРС) и используют сразу после приготовления.Fibrin hydrogel is obtained from lyophilized RT in accordance with Method 3. 10-15% dissolved RT (complete growth medium, ORS) is added to the growth medium and used immediately after preparation.

Для образования гидрогеля полученную ПРС сразу после приготовления в асептических условиях помещают в камеру Бойдена с полупроницаемыми мембранами (например, Corning, Transwell, 0.4 um, США), заселяют монослойными клеточными культурами (стволовыми/прогениторными/дифференцированными/опухолевыми клетками), клеточными ассоциатами (сфероидами) или микроорганами и помещают в CO2-инкубатор (например, Sanyo MCO-20AIC, Япония) на 4 часа при 37°C для формирования гидрогеля, после чего культивируют в соответствии с дизайном экспериментов. При длительном культивировании при необходимости производят добавление свежих порций ПРС, содержащих ЛТ, в культуральную систему.To form a hydrogel, the obtained ORS immediately after preparation under aseptic conditions is placed in a Boyden chamber with semipermeable membranes (for example, Corning, Transwell, 0.4 um, USA), colonized with monolayer cell cultures (stem / progenitor / differentiated / tumor cells), cell associations (spheroids ) or microorganisms and placed in a CO2 incubator (for example, Sanyo MCO-20AIC, Japan) for 4 hours at 37 ° C to form a hydrogel, and then cultured in accordance with the design of the experiments. With prolonged cultivation, if necessary, add fresh portions of ORS containing RT to the culture system.

Все процедуры в Способах 1-6 осуществляют в стерильных условиях.All procedures in Methods 1-6 are carried out under sterile conditions.

Пример конкретного исполнения №1.An example of a specific performance No. 1.

1. Заготовка образцов тромбоцитарной массы доноров.1. The procurement of platelet mass samples of donors.

В стерильных условиях методом тромбоцитафереза (аппаратный комплекс Amicus, Швейцария) получено 12 индивидуальных образцов ТМ (6 мужчин, 6 женщин). Перед процедурой заготовки ТМ доноры проходили обследование на наличие ВИЧ I и II типа, HBs-антигена, вируса HCV, возбудителя сифилиса. Также был осуществлен клинический анализ крови.Under sterile conditions, thrombocytapheresis (Amicus hardware complex, Switzerland) obtained 12 individual TM specimens (6 men, 6 women). Before the TM harvesting process, donors were screened for the presence of HIV type I and II, HBs antigen, HCV virus, and the causative agent of syphilis. A clinical blood test was also performed.

Через 24 часа после процедуры тромбоцитафереза образцы ТМ доноров объемом 200-400 мл в специальных пластиковых мешках помещали в транспортировочный контейнер и переносили в лабораторию с прилагаемой сопроводительной информацией (ФИО донора, пол, возраст, дата заготовки ТМ, результаты лабораторных исследований), где в асептических условиях (ламинарный бокс 2-класса защиты) тщательно перемешивали, отбирали 3 точечных пробы по 0,5 мл для определения концентрации тромбоцитов и затем и переносили в пластиковые пробирки (Corning, США), по 40-50 мл. Объем полученной ТМ доноров варьировал от 228 до 330 мл (Табл. 2).24 hours after the thrombocytapheresis procedure, samples of TM donors 200-400 ml in special plastic bags were placed in a shipping container and transferred to a laboratory with the accompanying information (donor's name, gender, age, date of harvesting TM, laboratory results), where aseptic conditions (laminar box 2-class of protection) were thoroughly mixed, 3 point samples of 0.5 ml were taken to determine the concentration of platelets and then transferred to plastic tubes (Corning, USA), 40-50 ml. The volume of TM donors obtained varied from 228 to 330 ml (Table 2).

2. Определение концентрации тромбоцитов в образцах ТМ.2. Determination of platelet concentration in the samples of TM.

Производили определение концентрации тромбоцитов в образце ТМ каждого донора. Для этого отобранные точечные пробы ТМ объединяли, ресуспендировали путем тщательного перемешивания с использованием механической пипетки на 1,0 мл Eppendorf или Biohit. Далее отбирали пробу объемом 50,0 мкл для определения в ней концентрации тромбоцитов и переносили в пластиковую пробирку (Eppendorf, Германия) объемом 0,5 или 1,0 мл. В пробирку с пробой добавляли 450,0 мкл цитратного буфера ACD-A для получения рабочего разведения пробы 1:10. Разведенную пробу вносили в лабораторный анализатор Sysmex KX21 (Япония) и измеряли концентрацию тромбоцитов (табл. 2).Platelet concentration in the TM sample of each donor was determined. For this, the selected point samples of TM were pooled, resuspended by thorough mixing using a 1.0 ml Eppendorf or Biohit mechanical pipette. Then a sample of 50.0 μl was taken to determine the platelet concentration in it and transferred to a 0.5 or 1.0 ml plastic tube (Eppendorf, Germany). 450.0 μl of ACD-A citrate buffer was added to the sample tube to obtain a working dilution of the sample 1:10. The diluted sample was added to a Sysmex KX21 laboratory analyzer (Japan) and the platelet concentration was measured (Table 2).

3. Нормирование образцов ТМ по количеству тромбоцитов.3. Rationing of TM samples by platelet count.

Образцы ТМ в указанных закрытых пробирках помещали в лабораторную центрифугу (Eppendorf 5810R, Германия) и центрифугировали при 3130g в течение 40 мин при 20°C для осаждения тромбоцитов.TM samples in these closed tubes were placed in a laboratory centrifuge (Eppendorf 5810R, Germany) and centrifuged at 3130g for 40 min at 20 ° C to precipitate platelets.

Нормирование тромбоцитов производили в расчете на стандартную концентрацию: рассчитывали объем супернатанта для разведения в нем осадка тромбоцитов, необходимый для достижения концентрации 1,75×10⁹ тромбоцитов/мл. При концентрации тромбоцитов меньше заданной (образцы ТМ от доноров - мужчин №№2, 6 и №№2, 3 и 5 доноров - женщин), удаляли избыточный объем супернатанта и ресуспендировали осадок тромбоцитов в нужном для достижения указанной концентрации объеме. При концентрации тромбоцитов больше заданной (образцы №1, 3, 4, 5 от доноров - мужчин и №№1, 4, 6 от доноров - женщин) ТМ разводили плазмой, аналогичной по составу бесклеточной фракции ТМ.Platelets were normalized based on the standard concentration: the volume of the supernatant was calculated to dilute the platelet sediment in it, necessary to achieve a concentration of 1.75 × 10 ⁹ platelets / ml. When the platelet concentration is less than the specified one (TM samples from donors - men No. 2, 6 and No. 2, 3 and 5 female donors), the excess supernatant volume was removed and the platelet sediment was resuspended in the volume necessary to achieve the indicated concentration. At a platelet concentration higher than the set one (samples No. 1, 3, 4, 5 from male donors and No. 1, 4, 6 from female donors), TM was diluted with plasma, similar in composition to the cell-free fraction of TM.

4. Температурный лизис образцов ТМ.4. Temperature lysis of TM samples.

Образцы ТМ доноров, нормированные по концентрации тромбоцитов, в указанных закрытых пробирках переносили в низкотемпературный холодильник (Sanyo MDF-U500VX, Япония) и выдерживали при температуре -80°C в течение 1 суток. По истечении указанного времени содержимое пробирок размораживали при +37°C (термостат ТС-80М-2 или водяная баня Biosan WB-4MS) в течение 40-60 мин. Циклы замораживания / оттаивания повторяли 3 раза.Samples of donor TM normalized by platelet concentration in these closed tubes were transferred to a low-temperature refrigerator (Sanyo MDF-U500VX, Japan) and kept at -80 ° C for 1 day. After this time, the contents of the tubes were thawed at + 37 ° C (TC-80M-2 thermostat or Biosan WB-4MS water bath) for 40-60 minutes. Freeze / thaw cycles were repeated 3 times.

5. Центрифугирование образцов ЛТ.5. Centrifugation of RT samples.

Для освобождения образцов лизированной тромбомассы от фрагментов тромбоцитов производили их центрифугирование. Пробирки с образцами ЛТ переносили в лабораторную центрифугу (Eppendorf 5810R, Германия) и центрифугировали при 3130g в течение 40 мин при комнатной температуре для осаждения фрагментов тромбоцитов. Супернатант переносили в новые стерильные пластиковые пробирки (50 мл, Corning, США).To release samples of lysed thrombomass from platelet fragments, they were centrifuged. Tubes with RT samples were transferred to a laboratory centrifuge (Eppendorf 5810R, Germany) and centrifuged at 3130g for 40 min at room temperature to precipitate platelet fragments. The supernatant was transferred into new sterile plastic tubes (50 ml, Corning, USA).

6. Микроскопический контроль образцов ЛТ доноров.6. Microscopic control of LT donor samples.

Осуществляли с помощью светового микроскопа (Leica LEITZ DM IL, Германия) при увеличении ×200, оценивая наличие/отсутствие видимых нелизированных тромбоцитов и/или их фрагментов. Содержание частиц клеточного дебриса и цельных тромбоцитов в пробах ЛТ от каждого из 12 доноров в каждом поле зрения не превосходило 2.It was carried out using a light microscope (Leica LEITZ DM IL, Germany) at a magnification of × 200, assessing the presence / absence of visible non-lysed platelets and / or their fragments. The content of cell debris particles and whole platelets in RT samples from each of 12 donors in each field of view did not exceed 2.

7. Пулирование, фильтрация и аликвотирование образцов ЛТ доноров.7. Pooling, filtration and aliquoting of LT donor samples.

На заключительном этапе производили пулирование образцов ЛТ доноров. Для этого равные объемы 12 образцов ЛТ в стерильных условиях объединяли путем переноса в пластиковые флаконы для центрифугирования объемом 250 мл (Corning, США).At the final stage, the donor RT samples were pooled. For this, equal volumes of 12 RT samples under sterile conditions were combined by transferring them into plastic centrifugation bottles with a volume of 250 ml (Corning, USA).

Флаконы с пулированным ЛТ помещали в лабораторную центрифугу (Eppendorf 5810R, Германия) и центрифугировали при 3130g в течение 15 мин при комнатной температуре для дополнительного осаждения остаточного дебриса. Пробирки извлекали из центрифуги и в стерильных условиях осуществляли фильтрацию супернатанта, последовательно через фильтры 0,45 мкм и 0,2 мкм (Millipore, США) в пробирки аналогичного типа. Далее пулированный ЛТ разливали в стеклянные флаконы на 20,0 мл по аликвотам (по 10,0 мл) и маркировали.RT vials were placed in a laboratory centrifuge (Eppendorf 5810R, Germany) and centrifuged at 3130g for 15 min at room temperature to further precipitate residual debris. The tubes were removed from the centrifuge and, under sterile conditions, the supernatant was filtered, successively through 0.45 μm and 0.2 μm filters (Millipore, USA) into tubes of a similar type. Next, the pulled RT was poured into 20.0 ml glass vials in aliquots (10.0 ml each) and labeled.

8. Лиофильная сушка ЛТ.8. Freeze drying LT.

Аликвотированные образцы ЛТ объемом 10,0 мл подвергали лиофильной сушке с использованием аппарата Heto PowerDry PL3000 (Thermofisher, США) при остаточном давлении в камере 5-10 Па и температуре -35°C в течение 24 часов с последующим досушиванием при остаточном давлении 1-2 Па и температуре +20°C в течение 12 часов.Aliquoted 10.0 ml RT samples were freeze dried using a Heto PowerDry PL3000 apparatus (Thermofisher, USA) at a residual pressure in the chamber of 5-10 Pa and a temperature of -35 ° C for 24 hours, followed by drying at a residual pressure of 1-2 Pa and a temperature of + 20 ° C for 12 hours.

Пример конкретного исполнения №2.An example of a specific performance No. 2.

Для культивирования ММСК, выделенных из жировой ткани (ЖТ) человека (пассаж 4), использовали образец лиофилизированного пулированного ЛТ, полученного из ТМ 12 доноров по методике, описанной в «Примере конкретного исполнения №1».For the cultivation of MMSCs isolated from human adipose tissue (VT) (passage 4), we used a sample of lyophilized pulled RT obtained from TM 12 donors according to the procedure described in “Specimen specific embodiment No. 1”.

2. Приготовление рабочего раствора ЛТ.2. Preparation of working solution RT.

Лиофилизированный ЛТ растворяли в стерильной воде для инъекций (ФС 2.2.0019.15), доводя объем до исходного объема образца до лиофилизации (10,0 мл).Lyophilized RT was dissolved in sterile water for injection (FS 2.2.0019.15), bringing the volume to the original volume of the sample before lyophilization (10.0 ml).

3. Приготовление ростовой среды с ЛТ.3. Preparation of growth medium with LT.

Растворенный ЛТ в объеме 10,0 мл вводили во флакон с 90,0 мл ростовой среды на основе DMEM/F-12, содержащей гепарин (2 ЕД/мл, «ПанЭко», Россия) (табл. 3).Dissolved RT in a volume of 10.0 ml was injected into a vial with 90.0 ml of DMEM / F-12 growth medium containing heparin (2 U / ml, PanEco, Russia) (Table 3).

Супернатант после центрифугирования пропускали через сито 40 мкм (BD, США) и далее использовали как полную ростовую среду для культивирования клеток.After centrifugation, the supernatant was passed through a 40 μm sieve (BD, USA) and then used as a complete growth medium for cell culture.

4. Оценка функциональной активности полной ростовой среды с ЛТ.4. Assessment of the functional activity of the full growth medium with LT.

ММСК культивировали в ПРС, представляющей собой фильтрат из п. 5.MMSCs were cultured in ORS, which is a filtrate from p. 5.

На сроках культивирования 1, 3, 6 суток определяли жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста (МТТ, Sigma, США). Сравнительные эксперименты in vitro по оценке динамики роста культур ММСК с использованием пулированного образца ЛТ доноров и образца ЭТС (РАА, Австрия, лот № А10106-0671) в качестве ростовых добавок к среде культивирования из п. 5 осуществляли в 96-луночных планшетах (Corning, США) с плотностью посева 1,5×10⁴ кл./см² и со сменой среды дважды в неделю. На сроках культивирования 1, 3, 6 суток определяли пул жизнеспособных клеток с помощью МТТ-теста (МТТ, Sigma, США). Для проведения МТТ-теста по окончании срока культивирования из каждой лунки отбирали по 100 мкл среды и вносили по 25 мкл раствора МТТ в концентрации 5 мг/мл. Через 3 ч инкубации в термостате (Sanyo МСО-20AIC, Япония) при 5% СО₂, 37°C из каждой лунки полностью удаляли среду и производили растворение образовавшегося формазана с помощью изопропилового спирта (200 мкл/лунку). От осадка, образующегося в результате преципитации белков в изопропиловом спирте, освобождались центрифугированием планшета в течение 10 мин при 3000 об/мин (Jouan, Франция). Далее из каждой лунки переносили по 100 мкл супернатанта в 96-луночный планшет для спектрофотометрии (Costar, США) и оценивали оптическую плотность (OD) раствора формазана на спектрофотометре FC (Thermoscientific, США) при длине волны 540 нм.At the cultivation periods of 1, 3, 6 days, cell viability was determined using the MTT test (MTT, Sigma, USA). Comparative in vitro experiments to assess the growth dynamics of MMSC cultures using a pulled donor LT sample and an ETS sample (RAA, Austria, lot No. A10106-0671) as growth additives to the cultivation medium from step 5 were carried out in 96-well plates (Corning, USA) with a sowing density of 1.5 × 10 ⁴ cells / cm ² and with a change of medium twice a week. At cultivation periods of 1, 3, 6 days, a pool of viable cells was determined using the MTT test (MTT, Sigma, USA). To conduct the MTT test, at the end of the cultivation period, 100 μl of medium were taken from each well and 25 μl of MTT solution was added at a concentration of 5 mg / ml. After 3 h of incubation in a thermostat (Sanyo MCO-20AIC, Japan) at 5% CO ₂ , 37 ° C, the medium was completely removed from each well and the resulting formazan was dissolved with isopropyl alcohol (200 μl / well). The precipitate resulting from the precipitation of proteins in isopropyl alcohol was freed by centrifuging the plate for 10 min at 3000 rpm (Jouan, France). Next, 100 μl of the supernatant was transferred from each well to a 96-well spectrophotometric plate (Costar, USA) and the optical density (OD) of the formazan solution was evaluated on an FC spectrophotometer (Thermoscientific, USA) at a wavelength of 540 nm.

Полученные данные (Фиг. 1) свидетельствовали о том, что уже на 3-й сутки культивирования ММСК величина прироста (относительно 1-х суток) клеточной популяции в присутствии ЛТ была достоверно выше, чем в присутствии ЭТС. На 7-е сутки культивирования (vs 1 сутки) в присутствии ЛТ величина прироста ММСК составила 503,1%, после чего произошел переход культуры в стационарную фазу. В присутствии ЭТС прирост культуры ММСК происходил медленнее. Переход ММСК в стационарную фазу отмечен лишь на 10-е сутки культивирования; прирост клеточной популяции к этому сроку составил 374,0%.The data obtained (Fig. 1) indicated that already on the 3rd day of MMSC cultivation, the growth rate (relative to 1 day) of the cell population in the presence of RT was significantly higher than in the presence of ETS. On the 7th day of cultivation (vs 1 day) in the presence of RT, the growth rate of MMSCs was 503.1%, after which the culture transitioned to the stationary phase. In the presence of ETS, the growth of MMSC culture was slower. The transition of MMSCs to the stationary phase was noted only on the 10th day of cultivation; the growth of the cell population by this time amounted to 374.0%.

Таким образом, среда для культивирования ММСК, содержащая в качестве ростовой добавки ЛТ, полученный растворением лиофилизата ЛТ, и не содержащая фибриноген и гепарин, поддерживали пролиферацию ММСК in vitro активнее, чем ЭТС.Thus, the MMSC cultivation medium containing RT as a growth additive obtained by dissolving RT lyophilisate and not containing fibrinogen and heparin supported MMSC proliferation in vitro more actively than ETS.

Пример конкретного исполнения №3.An example of a specific performance No. 3.

Для культивирования ФЧ (штамм hTERT 1018) и MG-63, выделенных из жировой ткани (ЖТ) человека (пассаж 4), использовали образец лиофилизированного пулированного ЛТ, полученного из ТМ 12 доноров по методике, описанной в «Примере конкретного исполнения №1».For the cultivation of PS (strain hTERT 1018) and MG-63 isolated from human adipose tissue (VT) (passage 4), we used a sample of lyophilized, pulled RT obtained from TM 12 donors according to the method described in “Specific execution example No. 1”.

3. Формирование фибринового сгустка.3. The formation of a fibrin clot.

Растворенный ЛТ в объеме 10,0 мл вводили во флакон с 90,0 мл ростовой среды на основе DMEM/F-12, содержащей ионы Са²⁺(DMEM/F-12, «ПанЭко», Россия) и помещали в термостат (ТС-80М-2, Россия) на 4 часа при 37°C для перевода фибриногена в нерастворимый фибрин, а затем в холодильник (Liebherr LKUv 1610, Германия) на 16-18 часов при 4°C для стабилизации образовавшегося фибринового сгустка. Состав ростовой среды представлен в табл. 3.Dissolved LT in a volume of 10.0 ml was introduced into a vial with 90.0 ml of DMEM / F-12 growth medium containing Ca ^{2+ ions} (DMEM / F-12, PanEco, Russia) and placed in a thermostat (TC -80M-2, Russia) for 4 hours at 37 ° C to convert fibrinogen to insoluble fibrin, and then to a refrigerator (Liebherr LKUv 1610, Germany) for 16-18 hours at 4 ° C to stabilize the resulting fibrin clot. The composition of the growth medium is presented in table. 3.

4. Удаление фибринового сгустка из ростовой среды с ЛТ.4. Removal of the fibrin clot from the growth medium with LT.

Фибриновый сгусток отделяли от стенок флакона и центрифугировали (Eppendorf 581 OR, Германия) при 280g в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим декантированием супернатанта в стеклянный или пластиковый флакон.The fibrin clot was separated from the walls of the vial and centrifuged (Eppendorf 581 OR, Germany) at 280 g for 10 minutes at room temperature, followed by decantation of the supernatant into a glass or plastic vial.

5. Фильтрация ростовой среды с ЛТ без фибрина.5. Filtration of the growth medium with RT without fibrin.

6. Проверка функциональной активности образца пулированного лиофилизированного ЛТ в составе ростовой среды, содержащей гепарин, на модели культивирования перевивной клеточной линии остеосаркомы человека (MG-63) и иммортализованных фибробластов кожи человека (ФЧ).6. Verification of the functional activity of the sample of the pulled lyophilized RT in the growth medium containing heparin on a model of cultivation of a transplantable cell line of human osteosarcoma (MG-63) and immortalized human skin fibroblasts (PS).

Сравнительные эксперименты in vitro по оценке динамики роста культур MG-63 и ФЧ (штамм 1608h TERT) с использованием пулированного образца ЛТ доноров и образца ЭТС (РАА, Австрия, лот № А10106-0671) в качестве ростовых добавок к среде культивирования из п. 5 осуществляли в 96-луночных планшетах (Corning, США) с плотностью посева 1,5×10⁴ кл./см² и со сменой среды дважды в неделю. На сроках культивирования 1, 3, 6 суток определяли пул жизнеспособных клеток с помощью МТТ-теста (МТТ, Sigma, США). Для проведения МТТ-теста по окончании срока культивирования из каждой лунки отбирали по 100 мкл среды и вносили по 25 мкл раствора МТТ в концентрации 5 мг/мл. Через 3 ч инкубации в термостате (Sanyo МСО-20AIC, Япония) при 5% СО₂, 37°C из каждой лунки полностью удаляли среду и производили растворение образовавшегося формазана с помощью изопропилового спирта (200 мкл/лунку). От осадка, образующегося в результате преципитации белков в изопропиловом спирте, освобождались центрифугированием планшета в течение 10 мин при 3000 об/мин (Jouan, Франция). Далее из каждой лунки переносили по 100 мкл супернатанта в 96-луночный планшет для спектрофотометрии (Costar, США) и оценивали оптическую плотность (OD) раствора формазана на спектрофотометре FC (Thermoscientific, США) при длине волны 540 нм.Comparative in vitro experiments to assess the growth dynamics of MG-63 and PS cultures (strain 1608h TERT) using a pulled donor LT sample and an ETS sample (RAA, Austria, lot No. A10106-0671) as growth additives to the culture medium from paragraph 5 performed in 96-well plates (Corning, USA) with a seeding density of 1,5 × ¹⁰ April Cl. / cm ² and with a medium change twice weekly. At cultivation periods of 1, 3, 6 days, a pool of viable cells was determined using the MTT test (MTT, Sigma, USA). To conduct the MTT test, at the end of the cultivation period, 100 μl of medium were taken from each well and 25 μl of MTT solution was added at a concentration of 5 mg / ml. After 3 h of incubation in a thermostat (Sanyo MCO-20AIC, Japan) at 5% CO ₂ , 37 ° C, the medium was completely removed from each well and the resulting formazan was dissolved with isopropyl alcohol (200 μl / well). The precipitate resulting from the precipitation of proteins in isopropyl alcohol was freed by centrifuging the plate for 10 min at 3000 rpm (Jouan, France). Next, 100 μl of the supernatant was transferred from each well to a 96-well spectrophotometric plate (Costar, USA) and the optical density (OD) of the formazan solution was evaluated on an FC spectrophotometer (Thermoscientific, USA) at a wavelength of 540 nm.

На основании результатов МТТ-теста рассчитывали величину прироста популяции клеток Д (в процентах) в конкретный срок наблюдения по формуле:Based on the results of the MTT test, the growth rate of the D cell population (in percent) at a specific observation period was calculated using the formula

где OD_наст. - оптическая плотность раствора формазана в условных единицах в конкретный срок эксперимента, OD_пред. - оптическая плотность раствора формазана в предыдущий срок эксперимента. Результаты оценки функциональной активности клеток при культивировании приведены в Таблице 4.where OD _crust. - the optical density of the solution of formazan in arbitrary units at a specific time of the experiment, OD _before . - the optical density of the solution of formazan in the previous period of the experiment. The results of the evaluation of the functional activity of cells during cultivation are shown in Table 4.

Показано, что при данном способе пулирования образцов ЛТ, популяция ФЧ при культивировании в ПРС, обогащенной 10% ЛТ, эффективно нарастает и, начиная с 3-х суток наблюдения, статистически достоверно превышает популяцию ФЧ в ПРС с 10% ЭТС. Так, показатель OD раствора формазана на 6-е сутки культивирования ФЧ в ПРС с 10% ЛТ составил 1,090 vs 0,564 при культивировании клеток в ПРС с 10% ЭТС, а величина прироста популяции ФЧ - 429% vs 248%, соответственно (табл. 4).It was shown that with this method of pooling RT samples, the population of PS during cultivation in ORS enriched with 10% RT effectively increases and, starting from the 3rd day of observation, statistically significantly exceeds the population of PS in ORS with 10% EF. Thus, the OD index of the formazan solution on the 6th day of cultivation of PS in ORS with 10% RT was 1.090 vs 0.564 when cells were cultured in ORS with 10% ET, and the growth rate of the population of PS was 429% vs 248%, respectively (Table 4 )

Скорость пролиферации клеток линии остеосаркомы человека MG-63 при условии ее культивирования в ПРС с 10% пулированного ЛТ доноров или в ПРС с 10% ЭТС при плотности посева 5 тыс. кл. на лунку практически не отличалась: величина OD раствора формазана составляла на 5 сутки 0,974 vs 1,109 для ПРС с 10% пула ЛТ и ПРС с 10% ЭТС, соответственно, а величина прироста - 313% и 386%, соответственно (табл. 4).The proliferation rate of human osteosarcoma cell line MG-63 under the condition of its cultivation in ORS with 10% pululated RT donors or in ORS with 10% ETS with a culture density of 5 thousand cells. per well practically did not differ: on the 5th day, the OD value of formazan solution was 0.974 vs 1.109 for ORS with 10% pool of RT and ORS with 10% ETF, respectively, and the growth rate was 313% and 386%, respectively (Table 4).

Пример конкретного исполнения №4.An example of a specific implementation No. 4.

1. Получение лиофилизированного ЛТ1. Obtaining lyophilized RT

Для приготовления ЛТ, очищенного от фибриногена, использовали лиофилизированный ЛТ, полученный по методике, описанной в «Примере конкретного исполнения №1»(п.п. 1-8).For the preparation of RT purified from fibrinogen, lyophilized RT obtained according to the procedure described in the “Specific Performance Example No. 1” was used (pp. 1-8).

2. Приготовление рабочего раствора ЛТ2. Preparation of working solution RT

Лиофилизированный ЛТ растворяли в стерильной воде для инъекций (ФС 2.2.0019.15), доводя до исходного объема образца до лиофилизации (10 мл).Lyophilized RT was dissolved in sterile water for injection (FS 2.2.0019.15), bringing to the initial volume of the sample before lyophilization (10 ml).

3. Формирование фибринового сгустка3. The formation of fibrin clot

К растворенному ЛТ объемом 10 мл добавляли 0,02 мл 10% раствора CaCl₂ («ПанЭко», Россия). Флакон с ЛТ в асептических условиях помещали в термостат (ТС-80М-2, Россия) или на водяную баню (Biosan WB-4MS) на 4 часа при 37°C для перевода фибриногена в нерастворимый фибрин, а затем в холодильник (Liebherr LKUv 1610, Германия) на 16-18 часов при 4°C для стабилизации образовавшегося фибринового сгустка.0.02 ml of a 10% CaCl ₂ solution (PanEco, Russia) was added to dissolved 10 ml RT. The LT vial under aseptic conditions was placed in a thermostat (TS-80M-2, Russia) or in a water bath (Biosan WB-4MS) for 4 hours at 37 ° C to convert fibrinogen to insoluble fibrin and then to a refrigerator (Liebherr LKUv 1610 , Germany) for 16-18 hours at 4 ° C to stabilize the resulting fibrin clot.

4. Удаление фибринового сгустка из ЛТ.4. Removal of fibrin clot from RT.

Сгусток отделяли и центрифугировали (Eppendorf 5810R, Германия) при 280g в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим декантированием супернатанта в стеклянный или пластиковый флакон.The clot was separated and centrifuged (Eppendorf 5810R, Germany) at 280g for 10 minutes at room temperature, followed by decantation of the supernatant into a glass or plastic bottle.

5. Фильтрация.5. Filtering.

Супернатант ЛТ после центрифугирования (п. 4) пропускали через сито с диаметром отверстий 40 мкм (BD, США).After centrifugation (item 4), the LT supernatant was passed through a sieve with a hole diameter of 40 μm (BD, USA).

6. Приготовление полной ростовой среды, содержащей ЛТ без фибриногена.6. Preparation of a complete growth medium containing RT without fibrinogen.

Фильтрат объемом 10 мл вводили в среду, формируя ПРС, указанную в табл. 5.The filtrate with a volume of 10 ml was introduced into the medium, forming the ORS indicated in the table. 5.

7. Оценка функциональной активности полной ростовой среды с ЛТ.7. Assessment of the functional activity of the full growth medium with LT.

Для исследования были взяты линии аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и карциномы гортани НЕр-2. Состав полной ростовой среды соответствовал таковому в табл. 6; в контроле 10% ЛТ был заменен на 10% ЭТС в этой же ПРС.For the study, we took the lines of human breast adenocarcinoma MCF-7 and laryngeal carcinoma HEP-2. The composition of the complete growth medium corresponded to that in the table. 6; in the control, 10% LT was replaced by 10% EF in the same ORS.

Культивирование проводили при исходной плотности посева клеток 1,5×10⁴ клеток/см². Жизнеспособность клеток была оценена по изменению OD раствора формазана в МТТ-тесте на 1-14-е сутки в 4-х повторах. Параллельно в 96-луночных планшетах с помощью системы для прижизненного мониторинга клеток in vitro IncuCyte® ZOOM™ (Essen Bioscience, США) визуально оценивали состояние клеточного монослоя и количественно - степень конфлюентности последнего.Cultivation was carried out at an initial cell seeding density of 1.5 × 10 ⁴ cells / cm ² . Cell viability was evaluated by changing the OD of the solution of formazan in the MTT test on days 1-14 on 4 replicates. In parallel, in 96-well plates using the in vivo in vitro cell monitoring system IncuCyte® ZOOM ™ (Essen Bioscience, USA), the state of the cell monolayer and the confluence of the latter were quantified.

Как ЭТС, так и ЛТ обеспечивали пролиферацию клеток при их культивировании в течение 7 суток. В то же время, для НЕр-2 значения OD в МТТ-тесте при использовании ЛТ были значимо выше, в сравнении с таковыми для ЭТС на 3-й сутки (0,556±0,013 vs 0,432±0,005) и значимо ниже - на 7-е сутки (0,664±0,017 vs 0,726±0,009) - табл. 6.Both ETS and LT provided proliferation of cells during their cultivation for 7 days. At the same time, for HEP-2, the OD values in the MTT test when using RT were significantly higher in comparison with those for ETS on the 3rd day (0.556 ± 0.013 vs 0.432 ± 0.005) and significantly lower on the 7th day (0.664 ± 0.017 vs 0.726 ± 0.009) - tab. 6.

Представленные данные свидетельствуют о том, что в присутствии 10% ЛТ клетки НЕр-2 начинают пролиферировать активнее, чем в присутствии 10% ЭТС, быстрее достигают предконфлюентного монослоя, замедляя пролиферацию вследствие контактного торможения.The data presented indicate that in the presence of 10% LT, HEP-2 cells begin to proliferate more actively than in the presence of 10% ETF, they reach the pre-confluent monolayer faster, slowing down proliferation due to contact inhibition.

ЛТ и ЭТС поддерживали и пролиферацию клеток MCF-7. В то же время значения OD в присутствии ЛТ были значимо ниже в сравнении с ЭТС на 3-й и 7-е сутки (0,308±0,003 vs 0,360±0,009 и 0,752±0,006 vs 0,880±0,013) (Табл. 6).RT and ETS supported the proliferation of MCF-7 cells. At the same time, the OD values in the presence of RT were significantly lower in comparison with the ETS on the 3rd and 7th day (0.308 ± 0.003 vs 0.360 ± 0.009 and 0.752 ± 0.006 vs 0.880 ± 0.013) (Table 6).

Визуально определяли нарастание плотности монослоя клеток обеих линий уже через 3 суток культивирования в присутствии обеих ростовых добавок: средняя степень конфлюентности для ЛТ и ЭТС составила 99,7% и 99,5% для НЕр-2, соответственно, и ~ 100% для обеих ростовых добавок для MCF-7. Клетки в среде с ЛТ сохраняли характерную для них морфологию (Фиг. 2, Фиг. 3).Visually determined the increase in the density of the monolayer of cells of both lines after 3 days of cultivation in the presence of both growth additives: the average degree of confluence for RT and ETS was 99.7% and 99.5% for HEP-2, respectively, and ~ 100% for both growth additives for MCF-7. Cells in the medium with RT retained their characteristic morphology (Fig. 2, Fig. 3).

Таким образом, среда для культивирования линий опухолевых клеток НЕр-2 и MCF-7, содержащая в качестве ростовой добавки ЛТ, полученный растворением лиофилизата ЛТ, и не содержащий фибриногена и гепарина, поддерживает пролиферацию ММСК in vitro в сходной с ЭТС степени.Thus, the medium for culturing the Hep-2 and MCF-7 tumor cell lines containing LT as a growth additive obtained by dissolving LT lyophilisate and not containing fibrinogen and heparin supports MMSC proliferation in vitro to a degree similar to ETS.

Пример конкретного исполнения №5.An example of a specific implementation No. 5.

Лиофилизированный, стандартизованный по функциональной активности ЛТ был получен в соответствии с пп. 1-8 «Примера конкретного исполнения №1».Lyophilized, standardized according to the functional activity of RT was obtained in accordance with paragraphs. 1-8 "Examples of specific performance No. 1".

2. Оценка регенеративной активности ЛТ при накожном применении.2. Evaluation of the regenerative activity of RT during cutaneous use.

Нами был апробирован способ накожного применения 10% раствора лиофилизированного ЛТ у крыс с эксцизионной раной кожных покровов для ускорения заживления последних.We have tested the method of cutaneous application of a 10% solution of lyophilized RT in rats with an excisional wound of the skin to accelerate healing of the latter.

Перед операцией крысам под наркозом (дроперидол 2,5 мг/мл, внутрибрюшинно по 0,5 мл, кетамин 5% раствор, внутримышечно по 0,25 мл) выбривали шерсть на спине и в области лопаток формировали с помощью пинцета и ножниц плоскостной полнослойный кожный дефект площадью 0,2-0,3 см². Область раны закрывали стерильной 4-х слойной салфеткой Medicomp (Hartmann AG, Германия) и гипоаллергенным воздухопроницаемым пластырем Fixopore S (Matorat, Польша). На 4-е сутки животных освобождали от повязок и далее кожные раны вели открытыми. Содержание животных после операционного вмешательства было одиночным. Всего было сформировано три группы животных по 6 голов в каждой: 1 - контроль (ежедневная обработка раны 0,9% раствором NaCl); 2 - опыт (ежедневная обработка области раны 20% раствором ЛТ; 3 - опыт (ежедневная обработка области раны 100% раствором ЛТ). Объем средства (0,9% раствор NaCl / 20% раствор ЛТ / 100% раствор ЛТ) для однократной обработки одной раны составлял 70 мкл.Before surgery, rats under anesthesia (droperidol 2.5 mg / ml, intraperitoneally 0.5 ml, ketamine 5% solution, intramuscularly 0.25 ml) were shaved on the back and in the area of the shoulder blades a flat full skin layer was formed with tweezers and scissors defect area of 0.2-0.3 cm ² . The wound area was covered with a Medicomp sterile 4-layer napkin (Hartmann AG, Germany) and a fixopore S hypoallergenic adhesive patch (Matorat, Poland). On the 4th day, the animals were released from dressings and further skin wounds were open. The animals were kept alone after surgery. In total, three groups of animals were formed with 6 animals each: 1 - control (daily wound treatment with 0.9% NaCl solution); 2 - experience (daily treatment of the wound area with 20% LT solution; 3 - experience (daily treatment of the wound area with 100% LT solution). Amount of agent (0.9% NaCl solution / 20% LT solution / 100% LT solution) for a single treatment one wound was 70 μl.

На 7-е и 13-е сутки из каждой группы выводили по 3 животных из эксперимента путем передозировки эфирного наркоза и осуществляли забор биологического материала для гистологического исследования. Из иссеченных фрагментов изготавливали парафиновые блоки. Окрашенные гематоксилин-эозином гистологические срезы изучали с помощью световой микроскопии. Эксперимент завершили, когда в группе 3 кожный дефект закрылся полностью (13-е сутки после операции).On the 7th and 13th day from each group, 3 animals were taken out of the experiment by overdose of ether anesthesia and biological material was collected for histological examination. Paraffin blocks were made from excised fragments. Histological sections stained with hematoxylin-eosin were examined using light microscopy. The experiment was completed when, in group 3, the skin defect completely closed (13th day after surgery).

В норме эпидермис межлопаточной области представлен плоским ороговевающим эпителием. Кератиноциты базального слоя кубической формы, расположены в один ряд, в зернистом и шиповатом слоях насчитывается по 2-3 ряда клеток, роговой слой достаточно узкий. Малоклеточная дерма представлена сосочковым и сетчатым слоями, в которых определяются равномерно расположенные волосяные фолликулы и сальные железы (Фиг. 5, А, Б).Normally, the epidermis of the interscapular region is represented by squamous epithelium. Keratinocytes of the basal layer of a cubic form are arranged in one row, in the granular and prickly layers there are 2-3 rows of cells, the stratum corneum is quite narrow. The small cell dermis is represented by the papillary and reticular layers, in which uniformly located hair follicles and sebaceous glands are determined (Fig. 5, A, B).

На 7-е сутки после операции в контрольной группе животных область раны была заполнена богато васкуляризированной молодой грануляционной тканью с хаотично расположенными фиброб ластами. На поверхности неэпителизированной раны определялся слой фибрина, под которым визуализировалась тонкая «полоска» лимфоидной инфильтрации. С краев раны - гипертрофированный отечный эпителий, представленный 9-10 рядами рыхло расположенных клеток (Фиг. 5, В, Г).On the 7th day after the operation in the control group of animals, the wound area was filled with richly vascularized young granulation tissue with randomly located fibroblasts. A fibrin layer was determined on the surface of an unepithelial wound, under which a thin “strip” of lymphoid infiltration was visualized. From the edges of the wound - hypertrophied edematous epithelium, represented by 9-10 rows of loosely located cells (Fig. 5, C, D).

На 13-й день после формирования дефекта кожный регенерат был покрыт сплошным многослойным (8-10 слоев) рыхлым эпителием. Дерма представлена еще васкуляризованной грануляционной тканью, однако зрелые фибробласты ближе к поверхности раны располагались более разреженно параллельно поверхности кожи. Признаков отека и воспаления не обнаружено (Фиг. 5, Д, Е).On the 13th day after the formation of the defect, the skin regenerate was covered with a continuous multilayer (8-10 layers) friable epithelium. Derma is also represented by vascularized granulation tissue, however, mature fibroblasts closer to the wound surface were located more sparse parallel to the skin surface. Signs of edema and inflammation were not detected (Fig. 5, D, E).

Во 2-й группе (20% ЛТ) уже на 7-е сутки была выявлена полная эпителизация раневой поверхности: сглаженный эпителий из 6-8 слоев над кратерообразной раной и гипертрофированный (отечный) в области ее краев. Незрелая грануляционная ткань пронизана большим количеством сосудов, однако фибробласты и соединительнотканные волокна располагались в ближайшей к ране области уже параллельно поверхности кожи, что косвенно свидетельствует о начале фиброзной трансформации грануляционной ткани, т.е. ее созревании (Фиг. 6, А, Б). На 13 сутки процесс формирования кожного регенерата продолжался. Это выражалось, с одной стороны, в формировании сплошного широкого многорядного эпителия с вертикальной анизоморфностью, запустевании сосудов в сосочковом отделе дермы, в упорядочении ориентации соединительнотканных волокон в области дефекта и уменьшении количества фибробластов, появлении зачатков волосяных фолликулов (Фиг. 6, В, Г). Наблюдаемая в присутствии ЛТ быстрая эпителизация является протектором рубцовых образований.In the 2nd group (20% LT), already on the 7th day, complete epithelization of the wound surface was revealed: a smooth epithelium of 6-8 layers above the crater-like wound and hypertrophic (edematous) in the region of its edges. Immature granulation tissue is penetrated by a large number of vessels, however, fibroblasts and connective tissue fibers were located in the area closest to the wound parallel to the skin surface, which indirectly indicates the onset of fibrous transformation of granulation tissue, i.e. its maturation (Fig. 6, A, B). On day 13, the process of formation of skin regenerate continued. This was expressed, on the one hand, in the formation of a continuous, wide, multi-row epithelium with vertical anisomorphism, desolation of blood vessels in the papillary dermis, in ordering the orientation of connective tissue fibers in the defect and a decrease in the number of fibroblasts, the appearance of hair follicle primordia (Fig. 6, C, D) . Rapid epithelization observed in the presence of RT is a protector of scar formations.

В третьей группе животных обработка раневой поверхности 100% ЛТ в течение 7 дней привела к полной эпителизации раны: за это время в зоне кожного дефекта был сформирован многослойный (8-12 слоев) разреженный эпителий с четкой поляризацией клеток базального слоя. Под эпителием располагалась гиперплазированная дерма с сосудами, над ним - слой фибрина (Фиг. 7, А, Б)In the third group of animals, treatment of the wound surface of 100% RT for 7 days led to complete epithelialization of the wound: during this time, a multilayer (8-12 layers) diluted epithelium with a clear polarization of the basal layer cells was formed in the area of the skin defect. Under the epithelium was a hyperplastic dermis with vessels, above it was a fibrin layer (Fig. 7, A, B)

Через 13 суток толщина эпителия кожного регенерата в этой группе животных и его строение, в целом, соответствовало эпителию межлопаточной области кожи спины интактных крыс, за исключением более сглаженного рисунка. В эти сроки были выявлены, как и в предыдущей опытной группе, признаки созревания грануляционной ткани: запустевание кровеносных сосудов и снижение их количества, обеднение клеточного состава дермы за счет снижения количества фибробластов, появление кожных дериватов в области регенерата и ориентация соединительнотканного компонента параллельно поверхности кожи (Фиг. 7, В, Г).After 13 days, the thickness of the skin regenerate epithelium in this group of animals and its structure, in general, corresponded to the epithelium of the interscapular region of the skin of the back of intact rats, with the exception of a smoother pattern. Within these terms, signs of maturation of granulation tissue were revealed, as in the previous experimental group: desolation of blood vessels and a decrease in their number, depletion of the cellular composition of the dermis due to a decrease in the number of fibroblasts, the appearance of skin derivatives in the regenerate region and the orientation of the connective tissue component parallel to the skin surface ( Fig. 7, B, D).

Таким образом, ЛТ стимулирует эпителизацию кожного дефекта и ускоряет формирование грануляционной ткани, причем, этот эффект нарастает с возрастанием концентрации ЛТ с 20% до 100%.Thus, LT stimulates the epithelization of the skin defect and accelerates the formation of granulation tissue, and this effect increases with an increase in the concentration of LT from 20% to 100%.

Пример конкретного исполнения №6.An example of a specific performance No. 6.

1. Получение фибринового гидрогеля из ЛТ1. Obtaining fibrin hydrogel from RT

Гидрогель на основе фибрина был получен из лиофилизированного ЛТ, согласно п.п. 1-2 «Примера конкретного исполнения №3». К ростовой среде состава: среда F12 (ПанЭко, Россия), глютамин (ПанЭко, Россия) 0,44 мг/мл, гентамицин (ПанЭко, Россия) 1,25 мкг/мл, буферный раствор HEPES 1 мМ (ПанЭко, Россия) 1 мл/100 мл среды, добавляли 10-15% растворенного ЛТ. Полученную ПРС использовали сразу после приготовления.Fibrin-based hydrogel was obtained from lyophilized RT according to 1-2 "Examples of specific performance No. 3". To the growth medium of the composition: medium F12 (PanEco, Russia), glutamine (PanEco, Russia) 0.44 mg / ml, gentamicin (PanEco, Russia) 1.25 μg / ml, HEPES buffer solution 1 mM (PanEco, Russia) 1 ml / 100 ml of medium, 10-15% dissolved RT was added. The obtained ORS was used immediately after preparation.

2. Культивирование микроорганов (фрагментов щитовидной железы) и клеток (тиреоцитов) в фибриновом гидрогеле на основе ЛТ.2. The cultivation of microorganisms (fragments of the thyroid gland) and cells (thyroid cells) in fibrin hydrogel based on RT.

В пробирку со свежеприготовленной ПРС (~ 1,0 мл) в асептических условиях вносили взвесь (50,0-100,0 мг) фрагментов ткани измельченной механическим способом нормальной щитовидной железы (ЩЖ, операционный материал после тиреоидэктомии), осторожно перемешивали, переносили в полупроницаемые мембраны Transwell (Corning, США) и помещали в 6-луночные планшеты (Corning, США). Планшеты помещали в СО₂-инкубатор (Sanyo MCO-20AIC, Япония) на 4 ч для формирования гидрогеля при 37°C, 5% СО₂. Затем на дно лунки 6-луночного планшета вносили по 1 мл ПРС состава: среда F12 (ПанЭко, Россия), глютамин (ПанЭко, Россия) 0,44 мг/мл, гентамицин (ПанЭко, Россия) 1,25 мкг/мл, буферный раствор HEPES 1 мМ (ПанЭко, Россия) 1 мл/100 мл среды, 5% ЭТС (Gibco, США). Планшеты помещали в CO₂-инкубатор (Sanyo MCO-20AIC, Япония) и поддерживали микрокультуру при 37°C, 5% СО₂. В процессе культивирования периодически производили добавление ПРС состава, указанного в п. 1, для формирования гидрогеля на основе ЛТ, с параллельным отбором такого же количества жидкой фазы со дна лунки планшета. Оценку состояния клеток в гидрогеле осуществляли методом световой микроскопии.In a test tube with freshly prepared ORS (~ 1.0 ml), under suspension aseptic conditions, a suspension (50.0-100.0 mg) of tissue fragments mechanically ground by the normal thyroid gland (thyroid gland, surgical material after thyroidectomy) was added, carefully mixed, transferred to semipermeable Transwell membranes (Corning, USA) and placed in 6-well plates (Corning, USA). The plates were placed in a CO ₂ incubator (Sanyo MCO-20AIC, Japan) for 4 hours to form a hydrogel at 37 ° C, 5% CO ₂ . Then, 1 ml of ORS of the composition was added to the bottom of the well of the 6-well plate: medium F12 (PanEco, Russia), glutamine (PanEco, Russia) 0.44 mg / ml, gentamicin (PanEco, Russia) 1.25 μg / ml, buffer HEPES solution 1 mM (PanEco, Russia) 1 ml / 100 ml of medium, 5% ETS (Gibco, USA). Plates were placed in a CO ₂ incubator (Sanyo MCO-20AIC, Japan) and maintained microculture at 37 ° C, 5% CO _2. In the process of cultivation, the ORS of the composition specified in paragraph 1 was periodically added to form an LT-based hydrogel, with the same selection of the same amount of liquid phase from the bottom of the plate well. The state of the cells in the hydrogel was estimated by light microscopy.

На Фиг. 4 показано спонтанное формирование фолликулов ЩЖ из одиночных тиреоцитов через 2,5 месяца культивирования.In FIG. Figure 4 shows the spontaneous formation of thyroid follicles from single thyrocytes after 2.5 months of cultivation.

Таким образом, гидрогель на основе ЛТ человека способствует формированию органоспецифических структур ЩЖ при долгосрочном культивировании.Thus, a hydrogel based on human LT promotes the formation of organ-specific thyroid structures during long-term cultivation.

Важно отметить, что замена ЭТС на ЛТ человека в качестве ростовой добавки для культивирования исключает трансмиссию бактериальных, вирусных, прионных и иных неиндентифицированных инфекционных агентов, а также аллергические реакции на ксеногенные компоненты при производстве биомедицинских клеточных продуктов, предназначенных для введения в организм человека. В этом плане экономический эффект определяется производством ЛТ в качестве импортозамещающего аналога имеющихся на рынке препаратов (табл. 8), отличающегося от них рядом значимых признаков и преимуществ, в соответствии с формулой изобретения.It is important to note that replacing EF with human RT as a growth supplement for cultivation excludes the transmission of bacterial, viral, prion and other unidentified infectious agents, as well as allergic reactions to xenogenic components in the production of biomedical cell products intended for introduction into the human body. In this regard, the economic effect is determined by the production of RT as an import-substituting analogue of the drugs available on the market (Table 8), which differs from them in a number of significant features and advantages, in accordance with the claims.

Анализ источников показал, что описанный способ получения лиофилизированного лизата тромбоцитов крови человека и 4-х продуктов на его основе, в том числе гидрогеля, не имеет аналогов.An analysis of sources showed that the described method for producing a lyophilized lysate of human blood platelets and 4 products based on it, including hydrogel, has no analogues.

Полученные таким образом продукты на основе ЛТ предназначены для:Thus obtained products based on LT are intended for:

- культивирования клеток (стволовых, дифференцированных, опухолевых) клеточных ассоциатов (сфероидов) и микроорганов в 2D и 3D вариантах.- cultivation of cells (stem, differentiated, tumor) of cellular associates (spheroids) and microorganisms in 2D and 3D versions.

- формирования тканеинженерных 3D конструкций и 3D биопечати.- the formation of tissue engineering 3D structures and 3D bioprinting.

- накожного применения в целях регенеративной медицины: заживление хронических ран, трофических язв, предотвращения рубцевания, а также для создания косметических средств ухода за кожей и против морщин.- skin application for regenerative medicine: the healing of chronic wounds, trophic ulcers, the prevention of scarring, as well as for the creation of cosmetic skin care products and anti-wrinkles.

Гидрогель на основе ЛТ, представленный в настоящей заявке, является оригинальным продуктом. Использование гидрогеля на основе лиофилизированного ЛТ человека (который представляет собой смесь в физиологических соотношениях биоактивных молекул плазмы крови и тромбоцитов) облегчит, а в ряде случаев сделает возможным тканеинженерное органотипическое конструирование эквивалентов органов и тканей in vitro.The hydrogel based on LT presented in this application is an original product. The use of a hydrogel based on lyophilized human RT (which is a mixture in physiological ratios of bioactive blood plasma molecules and platelets) will facilitate, and in some cases make tissue-engineering organotypic design of organ and tissue equivalents in vitro.

И, наконец, ЛТ человека, сделанный по представленному методу, проявил выраженные свойства регенератора дефектов кожных покровов. Использование его в этом аспекте будет способствовать трудовой и социальной реабилитации больных с плохо заживающими после оперативных вмешательств кожными ранами (например, у пожилых людей, у онкологических больных после лучевой терапии с последующим оперативным вмешательством), при трофических язвах (при диабете, критической ишемии нижних конечностей).And finally, human RT, made according to the presented method, showed the expressed properties of the regenerator of skin defects. Its use in this aspect will contribute to the labor and social rehabilitation of patients with skin wounds that do not heal well after surgical interventions (for example, in elderly people, in cancer patients after radiation therapy with subsequent surgical intervention), in trophic ulcers (in diabetes, critical lower limb ischemia) )

При производстве ЛТ из ТМ может быть использована тромбоцитарная масса с истекающим сроком годности, который составляет лишь несколько дней и обусловлен разрушением тромбоцитов, которое препятствует ее клиническому использованию, но является первым этапом получения ЛТ. Таким образом, может быть произведена реутилизация биологического материала с формированием новых высокоактивных продуктов.In the production of LT from TM, platelet mass with an expiring shelf life of only a few days can be used and is due to the destruction of platelets, which impedes its clinical use, but is the first step in obtaining LT. In this way, biological material can be recycled to form new highly active products.

Claims

A method of obtaining a culture growth supplement for the cultivation of tumor cells, including normalizing a platelet mass (TM) sample by platelet count by centrifuging the TM at 3130 g for 40 minutes at 20 ° C and resuspending the pellet in the supernatant of a given volume to a platelet concentration of 1.75 × 10 ⁹ cells / ml, 3x temperature platelet lysis by freezing on the day prior to -80 ° C and thawing at + 37 ° C, precipitation of cell debris by centrifugation at 3130 g, 40 minutes, 20 ° C, collecting the supernatant, micro copy control (× 200) for the presence in the field of view of no more than 3 platelet fragments, and then its standardization by pooling equal in volume of samples obtained from TM of at least 12 donors of both tender groups, then centrifugation of the pulled RT at 3130 g, 40 minutes, 20 ° C and filtering the sample on filters of 0.45 μm and 0.22 μm, finally pouring into aliquots of the required volume and lyophilization.