RU2662997C2 - Способ экспресс-оценки жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях - Google Patents

Способ экспресс-оценки жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях Download PDF

Info

Publication number
RU2662997C2
RU2662997C2 RU2016145875A RU2016145875A RU2662997C2 RU 2662997 C2 RU2662997 C2 RU 2662997C2 RU 2016145875 A RU2016145875 A RU 2016145875A RU 2016145875 A RU2016145875 A RU 2016145875A RU 2662997 C2 RU2662997 C2 RU 2662997C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
chemiluminescence
viability
nnvh
intensity
fsw
Prior art date
Application number
RU2016145875A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2016145875A3 (ru
RU2016145875A (ru
Inventor
Елена Александровна Губарева
Елена Вячеславовна Куевда
Александр Александрович Басов
Степан Сергеевич Джимак
Александр Сергеевич Сотниченко
Иван Сергеевич Гуменюк
Оксана Михайловна Лясота
Ирина Валерьевна Гилевич
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный медицинский университет" Минздрава России (ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России)
Елена Александровна Губарева
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный медицинский университет" Минздрава России (ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России), Елена Александровна Губарева filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный медицинский университет" Минздрава России (ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России)
Priority to RU2016145875A priority Critical patent/RU2662997C2/ru
Publication of RU2016145875A3 publication Critical patent/RU2016145875A3/ru
Publication of RU2016145875A publication Critical patent/RU2016145875A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2662997C2 publication Critical patent/RU2662997C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ экспресс-оценки жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях. Способ включает биофизическую оценку качества биологического образца по спектру хемилюминесценции. Причём данная оценка характеризуется тем, что в нативных, децеллюляризированных и рецеллюляризированных биологических образцах оценивают по интенсивности вспышки хемилюминесценции показатели свободнорадикального окисления и вычисляют показатель жизнеспособности клеточных структур по соответствующей формуле. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выполнения протоколов при подготовке тканеинженерных конструкций, осуществление способа в короткие сроки без применения специальных активаторов хемилюминесценции и химических индукторов, а также проведение количественной оценки особенностей генерации свободных радикалов в исследуемых тканях и определение жизнеспособности клеточных структур для различных типов тканей. 3 ил., 3 табл., 3 пр.

Description

Предлагаемое изобретение относится к медицине и биологии, позволяет быстро и эффективно оценивать жизнеспособность клеточных структур и определять завершенность протоколов при децеллюляризации внутренних органов и тканей животных и человека и рецеллюляризации биологических матриксов, что способно повысить эффективность тканеинженерных конструкций и сократить число неблагоприятных исходов у пациентов при трансплантации искусственно созданных органов.
Оценка качества полученных каркасов, основанная на изучении жизнеспособности клеточных структур в децеллюляризированных и рецеллюляризированных матриксах, является одной из важнейших задач современной регенеративной медицины во всем мире [Badylak S.F. et al., 2011; Nagata S. et al., 2010; Zhang Q. et al., 2010]. Основная цель децеллюляризации - максимально полное удаление клеток из тканей при минимальных повреждениях внеклеточного матрикса [Badylak S.F. и др., 2001]. Тканеинженерные конструкции, предварительно подвергшиеся децеллюляризации, не должны содержать клеток донора, включая такие клеточные компоненты, как цитоплазма и ядра. Их присутствие во внеклеточном матриксе может способствовать нарушению клеточной биосовместимости in vitro и вызывать побочные реакции в условиях in vivo при последующей рецеллюляризации [Nagata S. et al., 2010; Zhang Q. et al., 2010]. Известно значение реакций свободнорадикального окисления в регуляции различных биологических процессов, в том числе обеспечивающих жизнедеятельность клеток, их рост, дифференцировку и старение [Скулачев В.П., 2012; Джатдоева А.А. и соавт., 2016]. В связи с этим исследование показателей интенсивности образования свободных радикалов в нативных и рецеллюляризированных тканях органов человека и животных, а также в децеллюляризированных матриксах может служить одним из экспресс-критериев, позволяющих осуществлять количественную оценку жизнеспособности клеточных структур. Указанные параметры позволят определять качество выполненных мероприятий как при децеллюляризации тканей, так и после рецеллюляризации матрикса аллогенными или аутологичными клетками. В живых клетках при физиологических условиях стационарная концентрация свободных радикалов достаточно низкая, тем не менее, современные способы их обнаружения и идентификации позволяют выявлять их с высокой точностью [Созарукова М.М. и соавт., 2016]. Метод хемилюминесценции является весьма чувствительным при обнаружении именно свободных радикалов, так как определяет не их стационарную концентрацию, а скорость реакции образования свободных радикалов [Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., 2009], что расширяет возможности изучения различных особенностей свободнорадикального окисления в нативных, децеллюляризированных и рецеллюляризированных тканях органов человека и животных.
Известен способ определения функционального состояния биологической ткани [Izmaylov D.Yu. et al., Publication date: Jan 9, 2014. Filing date: Jun 24, 2013. Priority date: Jul 4, 2012], при котором образец ткани инкубируют в физиологически приемлемых условиях в среде, содержащей активатор хемилюминесценции. Среду с образцом аэрируют кислородсодержащей газовой смесью с разной интенсивностью, далее биообразец подвергают фотометрии; функциональное состояние биологической ткани определяют по изменению интенсивности свечения при разной интенсивности аэрации.
Указанный способ имеет следующие недостатки:
а) требует использования дополнительного оборудования и является достаточно трудоемким, так как проведение аэрации среды с биообразцом должно проводиться с постоянной интенсивностью, которую впоследствии уменьшают на предварительно заданный период времени (анаэробный период), после чего возобновляют с прежней интенсивностью. Описанную операцию повторяют, по меньшей мере, один раз с уменьшением интенсивности аэрации в анаэробном периоде на предварительно заданную величину при каждом повторе. При этом повторы выполняют по существу до тех пор, пока сохраняется влияние аэрации на интенсивность свечения биообразца, что существенно удлиняет время получения результатов исследования;
б) использование в качестве активатора хемилюминесценции вещества с высокой специфичностью к супероксидным анион-радикалам (п. 8 - люцигенина), может занижать чувствительность метода, так как не учитывается вероятная продукция в биологической ткани других свободных радикалов (алкилов, алкоксилов,
Figure 00000001
, гидроксильного радикала), что приводит к получению ложноотрицательных результатов;
в) при данном способе исследования в качестве аналитического параметра используют интенсивность свечения и/или интеграл интенсивности свечения (светосумму), абсолютные значения которой довольно сильно варьируют в зависимости от типа ткани в разных органах и условий измерения хемилюминесценции, однако при этом форму получаемого спектра не подвергают анализу, что снижает его чувствительность.
Способ отличается невысокой достоверностью из-за указанных недостатков.
При анализе литературы выявлена необходимость сокращения числа неблагоприятных исходов у пациентов при трансплантации искусственно созданных органов и для этого важна оценка жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях.
За ближайший аналог принят способ определения функциональной активности клеток крови с помощью хемилюминесцентного анализа методом двухстадийной стимуляции [Образцов И.В. Годков М.А., Полимова A.M., Демин Е.М., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Оценка функциональной активности нейтрофилов цельной крови методом двухстадийной стимуляции: новый подход к хемилюминесцентному анализу. Российский иммунологический журнал 2015, Т. 9(18), №4, С. 418-425], основанный на последовательной активации нейтрофилов двумя стимулами с различным механизмом действия и последующей регистрацией аналитического сигнала методом активированной хемилюминесценции с оценкой максимального радикал-продуцирующего ресурса нейтрофилов.
Для этого в системе с люминолом и пробой крови: 1) регистрировали спонтанную хемилюминесценцию в течение 15 минут, затем вносили форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) в конечной концентрация 50 нг/мл; после 20 минут инкубации проводили стимуляцию N-формил-метионин-лейцин-фенилаланином (фМЛФ) в конечной концентрации 10 мкМ и 2) регистрировали индуцированный хемилюминесцентный ответ в течение не менее 60 минут.
Указанный способ имеет следующие недостатки:
а) позволяет оценивать функциональную активность преимущественно иммунокомпетентных клеток: полиморфно-ядерных лейкоцитов и мононуклеаров [Образцов И.В. и соавт., 2013]), тогда как продукция активных форм кислорода может осуществляться и в других клеточных популяциях, например, содержащих митохондрии [Zorov D.B. et al., 2016; Плотников, Е.Ю. и соавт., 2005];
б) использование активатора хемилюминесценции (люминола) и стимулов оксидативного взрыва гранулоцитов (ФМА и фМЛФ) может несколько уменьшать точность способа, приводя к получению ложноположительных результатов за счет значительного усиления интенсивности хемилюминесценции при их синергизме [Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., 2009; Гордеева А.В., Лабас Ю.А., 2002];
в) анализируют кривую развития хемилюминесценции, состоящую из трех частей: 1) спонтанной хемилюминесценции нейтрофилов, 2) ФМА-предстимулированной хемилюминесценции, 3) ФМА+фМЛФ стимулированной хемилюминесценции нейтрофилов, которая позволяет рассчитывать коэффициент затухания Kd, равный отношению интенсивностей хемилюминесценции на 23-й минуте после вспышки к амплитуде пика А+23 фМЛФ /АфМЛФ. Анализ кривой развития достаточно трудоемкий процесс, занимает длительное время (не менее 1 часа), а в ряде случаев при этом наступает еще и замедление спада хемилюминесценции. Однако, в ряде случаев при обследовании пациентов с острым воспалительным процессом (например, при ожоговом сепсисе) регистрируется развитие дополнительного свечения [Образцов И.В. и соавт., 2015], что снижает диагностическую эффективность предложенного способа.
Способ неэффективен из-за указанных недостатков, поэтому остается актуальной задачей разработка нового экспресс-способа, обладающего высокой воспроизводимостью и однозначностью трактовки полученных результатов.
Задача заключается в создании несложного для реализации экспресс-способа определения наличия жизнеспособных клеточных структур при рецеллюляризации биологических и синтетических каркасов, а также при децеллюляризации тканей различных органов человека и животных, на основании которого возможно определение завершенности проведенных мероприятий при децеллюляризации и рецеллюляризации.
Сущностью изобретения является способ экспресс-оценки жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях, включающий биофизическую оценку качества биологического образца (БО) по спектру хемилюминесценции тканей внутренних органов (легкого, сердца, диафрагмы, пищевода), отличающийся тем, что в нативных, децеллюляризированных и рецеллюляризированных БО оценивают по интенсивности вспышки хемилюминесценции показатели свободнорадикального окисления для чего после впрыскивания через зонд 100 мкл 0,3% раствора пероксида водорода определяют в условных единицах (усл. ед.) интенсивность свечения по восходящему наклону вспышки (вНВХ) H2O2-индуцированной хемилюминесценции (ИХ), соответствующему средней скорости изменения интенсивности свечения от момента инициации вспышки ИХ до достижения ее максимальной интенсивности (МВИХ), и нисходящему наклону (нНВХ) вспышки ИХ (усл. ед.), соответствующему средней скорости изменения интенсивности свечения от МВИХ до момента достижения плато вспышки ИХ; затем вычисляют показатель жизнеспособности клеточных структур (ЖКСБО) по формуле:
ЖКСБО=(вНВХБО⋅нНВХБО)/(вНВХНТ⋅нНВХНТ),
где вНВХБО и нНВХБО - соответственно восходящий и нисходящий наклоны вспышки ИХ в биологическом образце, вНВХНТ и нНВХНТ - соответственно восходящий и нисходящий наклоны вспышки ИХ в нативном образце сравнения, и при значении показателя ЖКСБО более 1,0 определяют жизнеспособность клеточных структур в БО и успешность проведения рецеллюляризации, а при значении показателя ЖКСБО менее 0,5 определяют практическое отсутствие жизнеспособных клеточных структур в БО и завершение протокола децеллюляризации.
Техническим результатом предлагаемого способа является:
1) определение с помощью разработанного показателя ЖКС наличия жизнеспособных клеточных структур в тканеинженерных конструкциях после рецеллюляризации и тканях различных органов человека и животных после децеллюляризации, что позволит повысить эффективность выполнения протоколов при подготовке тканеинженерных конструкций;
2) способ включает определение восходящего и нисходящего наклонов вспышки H2O2-индуцированной хемилюминесценции, что позволяет осуществлять его экспресс-методом (в короткие сроки - менее 20 минут), не требует применения специальных активаторов хемилюминесценции (например, люминола) и химических индукторов (стимулов, например, ФМА или фМЛФ), выполнения трудоемких процедур и дополнительного дорогостоящего оборудования;
3) разработанный показатель ЖКС позволяет проводить количественную оценку особенностей генерации свободных радикалов в исследуемых биологических образцах (тканях) за счет анализа формы спектра H2O2-индуцированной хемилюминесценции (по отношению к ее максимальной интенсивности);
4) определение жизнеспособности клеточных структур по разработанному способу универсально для различных типов тканей, так как учитывает естественные особенности продукции в них свободных радикалов, поэтому способ является доступным, информативным, легко воспроизводимым и не требует специальной подготовки персонала.
Способ апробирован в течение года на биологическом материале (нативные, децеллюляризированные и рецеллюляризированные ткани внутренних органов) экспериментальных животных (крысах). Результаты полностью подтвердили решаемые задачи. Разработан экспресс-способ оценки жизнедеятельности клеток в тканеинженерных конструкциях.
Способ осуществляют следующим образом
Исследования проводят на аппаратно-программном комплексе «Хемилюминометр Lum-5773» (МГУ, Россия), предназначенном для регистрации и анализа сверхслабых световых потоков, сопровождающих химические и биологические процессы, протекающие с образованием свободных радикалов. Регистрацию и обработку сигналов осуществляют с помощью специализированного программного обеспечения «PowerGraph 3.x Professional». При подготовке к исследованию вначале регистрируют фоновое свечение (ФС) хемилюминометра, что представляет собой измерение интенсивности свечения контрольного источника, которое проводят при пустом кюветном отделении и должно составлять менее 100 милливольт, чтобы исключить погрешности, связанные с засветкой ФЭУ прибора. При выполнении измерений используют стеклянные кюветы диаметром 10±1 мм и высотой от 30 до 70 мм. Диаметр исследуемых биологических образцов ткани составляет 6,0±0,5 мм, толщина составляет 4,0±0,5 мм. Биологические образцы помещают на дно кюветы при температуре 25°С, далее вспышку хемилюминесценции инициируют впрыскиванием через зонд 100 мкл 0,3% раствора пероксида водорода (Н2О2). После регистрации вспышки H2O2-индуцированной хемилюминесценции и математической обработки данных с привлечением специализированного специализированного программного обеспечения «PowerGraph 3.x Professional» определяют следующие показатели:
1) восходящий наклон кривой вспышки индуцированной хемилюминесценции (вНВХ), характеризующий среднюю скорость изменения интенсивности свечения от момента инициации вспышки H2O2-индуцированной хемилюминесценции до достижения максимальной интенсивности H2O2-индуцированной хемилюминесценции, что отражает изменение скорости образования радикалов и рассчитывается как средний дифференциал восходящей кривой H2O2-индуцированной хемилюминесценции;
2) нисходящий наклон кривой вспышки индуцированной хемилюминесценции (нНВХ), который характеризует среднюю скорость изменения интенсивности свечения от максимальной интенсивности Н2О2-индуцированной хемилюминесценции до момента окончания регистрации вспышки индуцированной хемилюминесценции (выхода сигнала на плато).
Показатели свободнорадикального окисления оценивают в нативных, децеллюляризированных, децеллюляризированных с последующей обработкой растворами антисептиков и рецеллюляризированных образцах внутренних органов и тканей лабораторных животных (легких, сердца, пищевода, диафрагмы и других), а также рецеллюляризированных матриксах, предварительно подвергшихся воздействию антисептиков. При этом оценивают показатели свободнорадикального окисления и определяют в условных единицах (усл. ед.) интенсивность свечения по восходящему наклону вспышки (вНВХ) H2O2-индуцированной хемилюминесценции (ИХ), соответствующему средней скорости изменения интенсивности свечения от момента инициации вспышки ИХ до достижения ее максимальной интенсивности (МВИХ), и нисходящему наклону (нНВХ) вспышки ИХ (усл. ед.), соответствующему средней скорости изменения интенсивности свечения от МВИХ до момента достижения плато вспышки ИХ; затем вычисляют показатель жизнеспособности клеточных структур (ЖКСБО) по формуле:
ЖКСБО=(вНВХБО⋅нНВХБО)/(вНВХНТ⋅нНВХНТ),
где вНВХБО и нНВХБО - соответственно восходящий и нисходящий наклоны вспышки ИХ в биологическом образце, вНВХНТ и нНВХНТ - соответственно восходящий и нисходящий наклоны вспышки ИХ в нативном образце сравнения, и при значении показателя ЖКСБО более 1,0 определяют жизнеспособность клеточных структур в БО и успешность проведения рецеллюляризации, а при значении показателя ЖКСБО менее 0,5 определяют практическое отсутствие жизнеспособных клеточных структур в БО и завершение протокола децеллюляризации.
Обоснование полученных результатов.
Новизна предлагаемого способа заключается в определении наиболее значимой достоверной закономерности изменения показателей хемилюминесценции нативных, децеллюляризированных и рецеллюляризированных тканей внутренних органов, установленной при изучении формы H2O2-индуцированной вспышки хемилюминесценции, которая характеризуется крутизной ее восходящего и нисходящего наклона (по отношению к максимальной интенсивности H2O2-индуцированной вспышки хемилюминесценции). Для большинства биологических образцов нативных и рецеллюляризированных тканей внутренних органов в среднем было характерно более резкое нарастание (табл. 1), а затем ускоренное снижение H2O2-индуцированной вспышки хемилюминесценции по сравнению с децеллюляризированными тканями этих же органов (табл. 2). Для подтверждения приведенных утверждений также было изучено влияние различных антисептических растворов (хлоргексидина и октенисепта) на показатели хемилюминесценции децеллюляризированных и рецеллюляризированных тканей легкого.
Figure 00000002
Примечание: М - среднее арифметическое, Р - перцентиль.
Figure 00000003
Figure 00000004
Примечание: М - среднее арифметическое, Р - перцентиль.
В исследованиях, проведенных при поддержке комплексной НИР «Клеточные механизмы регенерации интраторакальных органов и тканей. Разработка тканеинженерных конструкций с использованием биологических и синтетических каркасов», установлено, что в биологических образцах нативного легкого (n=5) средние показатели H2O2-индуцированой хемилюминесценции составили: вНВХлегкое НТ=4,739⋅10-3 усл. ед., нНВХлегкое НТ=-2,749⋅10-4 усл. ед., вНВХНТ⋅нНВХлегкое НТ=-1,320⋅10-6 усл. ед., ЖКСлегкое НТ=1,00 усл. ед.; в биологических образцах нативного сердца (n=5) средние показатели H2O2-индуцированой хемилюминесценции составили: вНВХсердце НТ=4,398⋅10-3 усл. ед., нНВХсердце НТ=-7,356⋅10-5 усл. ед., вНВХНТ⋅нНВХсердце НТ=-3,283⋅10-7 усл. ед., ЖКСсердце НТ=1,00 усл. ед.; в биологических образцах нативной диафрагмы (n=5) средние показатели H2O2-индуцированой хемилюминесценции составили: вНВХдиафрагма НТ=3,164⋅10-3 усл. ед., нНВХдиафрагма НТ=-1,396⋅10-4 усл. ед., вНВХНТ⋅нНВХдиафрагма НТ=-4,248⋅10-7 усл. ед., ЖКСдиафрагма НТ=1,00 усл. ед.; в биологических образцах нативного пищевода (n=5) средние показатели H2O2-индуцированой хемилюминесценции составили: вНВХпищевод НТ=9,241⋅10-3 усл. ед., нНВХпищевод НТ=-2,028⋅10-4 усл. ед., вНВХНТ⋅нНВХпищевод НТ=-2,140⋅10-6 усл. ед., ЖКСпищевод НТ=1,00 усл. ед.
Рассчитанные показатели жизнеспособности клеточных структур в биологических образцах децеллюляризированных и рецеллюляризированных тканей внутренних органов соответственно представленным выше средним данным вНВХНТ⋅нНВХ аналогичных нативных образцов представлены в таблице 3.
Figure 00000005
Примечание: М - среднее арифметическое, Р - перцентиль.
Из представленных в таблице 3 показателей ЖКС видно, что для указанных образцов рецеллюляризированных тканей характерны его значения выше 1,0 усл. ед., тогда как для образцов децеллюляризированных тканей характерны его значения, не превышающие 0,5 усл. ед. и не зависящие от способа антисептической обработки биологического образца.
Таким образом, способ обеспечивает экспресс-детекцию жизнеспособных клеток в тканях при проведении децеллюляризации или рецеллюляризации.
Пример №1
В лаборатории фундаментальных исследований в области регенеративной медицины ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России 28 апреля 2016 года был получен образец легкого после проведения рецеллюляризации предварительно децеллюляризированного детергент-энзиматическим методом матрикса и обработки указанного матрикса хлоргексидином (соотношение 1:10). Для оценки качества выполненной рецеллюляризации определяли показатель ЖКС данного биологического объекта.
Для определения ЖКС из образца легкого выбран участок диаметром 6,0 мм, толщиной 3,9 мм. Образец поместили на дно стеклянной кюветы диаметром 9,9 мм и высотой 68 мм при температуре 25°С. Вспышку хемилюминесценции инициировали впрыскиванием через зонд 100 мкл 0,3% раствора Н2О2. После регистрации вспышки Н2О2-индуцированной хемилюминесценции на аппаратно-программном комплексе «Хемилюминометр Lum-5773» (МГУ, Россия) проводили математическую обработку данных с привлечением специализированного компьютерного программного обеспечения «PowerGraph 3.x Professional» (фиг. 1, см. приложение) и определяли следующие показатели: вНВХлегкое БО=3,114⋅10-2 усл. ед., нНВХлегкое БО=-1,576⋅10-3 усл. ед. Затем рассчитали вНВХНТ⋅нНВХлегкое БО, составившее -4,906⋅10-5 усл. ед., и определили жизнеспособность клеточных структур (ЖКС) биологического каркаса легкого = 37,18 условным единицам.
В эксперименте показано, что у исследованного биологического образца показатель ЖКС больше 1,0 усл. ед., что оценили как эффективное проведение протокола рецеллюляризации легкого крысы и, следовательно, жизнеспособность клеток соответствовала требованиям для использования в качестве тканеинженерных конструкций.
Пример №2
В лаборатории фундаментальных исследований в области регенеративной медицины ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России 10 февраля 2015 года был получен образец сердца после проведения децеллюляризации детергент-энзиматическим методом. Для оценки качества выполненной децеллюляризации определяли показатель ЖКС данного биологического объекта.
Для расчета ЖКС из образца сердца выделен участок диаметром 6,2 мм, толщина составляет 4,1 мм. Образец поместили на дно стеклянной кюветы диаметром 10 мм и высотой 69 мм при температуре 25°С. Затем инициировали вспышку хемилюминесценции впрыскиванием через зонд 100 мкл 0,3% раствора Н2О2. После регистрации вспышки H2O2-индуцированной хемилюминесценции на аппаратно-программном комплексе «Хемилюминометр Lum-5773» (МГУ, Россия) проводили математическую обработку данных с привлечением специализированного компьютерного программного обеспечения «PowerGraph 3.x Professional» (фиг. 2) и определяли следующие показатели: вНВХсердце БО=1,023⋅10-3 усл. ед., нНВХсердце БО=-1,198⋅10-4 усл. ед.
Далее рассчитывали вНВХНТ⋅нНВХсердце БО, составившее -1,225⋅10-7 усл. ед., и определяли жизнеспособности клеточных структур (ЖКС) биологического образца сердца = 0,37 условным единицам.
При проведении исследований показано, что у исследованного биологического образца показатель ЖКС меньше 0,5 усл. ед., что оценили как эффективное проведение протокола децеллюляризации сердца крысы.
Пример №3
В лаборатории фундаментальных исследований в области регенеративной медицины ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России 12 мая 2016 года был получен образец легкого после проведения децеллюляризации детергент-энзиматическим методом и обработки антисептиком октенисептом (соотношение 1:6). Для оценки качества выполненной децеллюляризации определяли показатель ЖКС данного биологического объекта.
Для определения ЖКС из образца легкого выделен участок диаметром 5,9 мм, толщиной 4,1 мм. Образец поместили на дно стеклянной кюветы диаметром 10,2 мм и высотой 70 мм при температуре 25°С. Далее вспышку хемилюминесценции инициировали впрыскиванием через зонд 100 мкл 0,3% раствора Н2О2. После регистрации вспышки Н2О2-индуцированной хемилюминесценции на аппаратно-программном комплексе «Хемилюминометр Lum-5773» (МГУ, Россия) проводили математическую обработку данных с привлечением специализированного компьютерного программного обеспечения «PowerGraph 3.x Professional» (фиг. 3) и определяли следующие показатели: вНВХлегкое БО=3,401⋅10-3 усл. ед., нНВХлегкое БО=-8,462⋅10-5 усл. ед.
Далее рассчитывали вНВХНТ⋅нНВХлегкое БО, составившее -2,879⋅10-7 усл. ед., и определяли жизнеспособности клеточных структур (ЖКС) биологического образца легкого = 0,22 условным единицам.
При проведении исследований показано, что у исследованного биологического образца показатель ЖКС менее 0,5 усл. ед., что оценили как эффективное проведение протокола децеллюляризации легкого крысы.
Таким образом, с помощью предложенного показателя определения жизнеспособности клеточных структур можно эффективно оценивать завершенность протоколов при рецеллюляризации тканеинженерных конструкций и децеллюляризации внутренних органов и тканей человека и животных. В дальнейшем полученные данные возможно использовать для прогнозирования эффективности планируемых манипуляций с биологическим материалом, что сократит число неблагоприятных исходов у пациентов при трансплантации искусственно созданных органов.
Данное изобретение позволяет:
- экспресс-методом исследовать показатели жизнеспособности клеточных структур в тканях различных внутренних органов человека и животных после децеллюляризации, что позволит повысить эффективность ее выполнения и повысит качество данного способа;
- разработать новый биофизический критерий оценки качества децеллюляризированного матрикса;
- исследовать показатели жизнеспособности клеточных структур в тканеинженерных конструкциях после проведения рецеллюляризации, что позволит повысить эффективность выполнения трансплантации экспериментальным животным и пациентам искусственно созданных органов,
- позволяет проводить количественную оценку особенностей генерации свободных радикалов в биологических образцах (тканях) внутренних органов и осуществлять мониторинг жизнеспособности клеточных структур по универсальному алгоритму для различных типов тканей, так как учитывает естественные особенности продукции в них свободных радикалов.
Практическим результатом предложения является возможность исследования завершенности процесса при рецеллюляризации тканеинженерных конструкций и децеллюляризации тканей внутренних органов человека и животных с оптимальной коррекцией протоколов децеллюляризации или рецеллюляризации, направленных на предупреждение осложнений при пересадке искусственно созданных органов.

Claims (3)

  1. Способ экспресс-оценки жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях, включающий биофизическую оценку качества биологического образца (БО), представляющего собой ткань внутреннего органа, а именно легкого, сердца, диафрагмы и пищевода, по спектру хемилюминесценции, отличающийся тем, что в нативных, децеллюляризированных и рецеллюляризированных БО оценивают по интенсивности вспышки хемилюминесценции показатели свободнорадикального окисления, для чего после впрыскивания через зонд 100 мкл 0,3% раствора пероксида водорода определяют в условных единицах (усл. ед.) интенсивность свечения по восходящему наклону вспышки (вНВХ) H2O2-индуцированной хемилюминесценции (ИХ), соответствующему средней скорости изменения интенсивности свечения от момента инициации вспышки ИХ до достижения ее максимальной интенсивности (МВИХ), и нисходящему наклону (нНВХ) вспышки ИХ (усл. ед.), соответствующему средней скорости изменения интенсивности свечения от МВИХ до момента достижения плато вспышки ИХ; затем вычисляют показатель жизнеспособности клеточных структур (ЖКСБО) по формуле:
  2. ЖКСБО=(вНВХБО⋅нНВХБО)/(вНВХНТ⋅нНВХНТ),
  3. где вНВХБО и нНВХБО - соответственно восходящий и нисходящий наклоны вспышки ИХ в биологическом образце, вНВХНТ и нНВХНТ - соответственно восходящий и нисходящий наклоны вспышки ИХ в нативном образце сравнения, и при значении показателя ЖКСБО более 1,0 определяют жизнеспособность клеточных структур в БО и успешность проведения рецеллюляризации, а при значении показателя ЖКСБО менее 0,5 определяют практическое отсутствие жизнеспособных клеточных структур в БО и завершение протокола децеллюляризации.
RU2016145875A 2016-11-22 2016-11-22 Способ экспресс-оценки жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях RU2662997C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016145875A RU2662997C2 (ru) 2016-11-22 2016-11-22 Способ экспресс-оценки жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016145875A RU2662997C2 (ru) 2016-11-22 2016-11-22 Способ экспресс-оценки жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2016145875A3 RU2016145875A3 (ru) 2018-05-23
RU2016145875A RU2016145875A (ru) 2018-05-23
RU2662997C2 true RU2662997C2 (ru) 2018-07-31

Family

ID=62202196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016145875A RU2662997C2 (ru) 2016-11-22 2016-11-22 Способ экспресс-оценки жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2662997C2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2720807C1 (ru) * 2019-06-04 2020-05-13 Международная общественная организация "Международная академия аграрного образования" (МААО) Способ определения химического участия активатора хемилюминесценции в липопероксидазной реакции

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2289138C2 (ru) * 2004-12-14 2006-12-10 Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации Способ аллергодиагностики по показателям хемилюминесцентного свечения нейтрофилов
RU2389020C2 (ru) * 2008-07-14 2010-05-10 Министерство Сельского Хозяйства И Продовольствия Омской Области Способ прижизненной диагностики туберкулеза
RU2408019C1 (ru) * 2009-06-08 2010-12-27 Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН) Способ экспресс-диагностики тяжести ишемических повреждений сердца у больного с ишемической болезнью сердца и предрасположенности больного к прогрессированию атеросклероза
EA018686B1 (ru) * 2012-07-04 2013-09-30 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ДИСофт" Способ определения функционального состояния биологической ткани и применение этого способа для определения ее жизнеспособности и/или степени некротизации

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2289138C2 (ru) * 2004-12-14 2006-12-10 Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации Способ аллергодиагностики по показателям хемилюминесцентного свечения нейтрофилов
RU2389020C2 (ru) * 2008-07-14 2010-05-10 Министерство Сельского Хозяйства И Продовольствия Омской Области Способ прижизненной диагностики туберкулеза
RU2408019C1 (ru) * 2009-06-08 2010-12-27 Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН) Способ экспресс-диагностики тяжести ишемических повреждений сердца у больного с ишемической болезнью сердца и предрасположенности больного к прогрессированию атеросклероза
EA018686B1 (ru) * 2012-07-04 2013-09-30 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ДИСофт" Способ определения функционального состояния биологической ткани и применение этого способа для определения ее жизнеспособности и/или степени некротизации

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2720807C1 (ru) * 2019-06-04 2020-05-13 Международная общественная организация "Международная академия аграрного образования" (МААО) Способ определения химического участия активатора хемилюминесценции в липопероксидазной реакции

Also Published As

Publication number Publication date
RU2016145875A3 (ru) 2018-05-23
RU2016145875A (ru) 2018-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0912085B1 (en) Precise efficacy assay methods for active agents including chemotherapeutic agents
RU2662997C2 (ru) Способ экспресс-оценки жизнеспособности клеток в тканеинженерных конструкциях
RU2728601C1 (ru) Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови
JPH04500912A (ja) 乏精子症男性における受精能の客観的生化学的測定法
RU2431838C1 (ru) Способ диагностики гиперагрегации тромбоцитов
RU2803893C1 (ru) Ускоренный способ послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота с применением иммуноферментного анализа
RU2470303C1 (ru) Способ определения функциональной активности тромбоцитов
Shams et al. The satellite cell colony forming cell assay as a tool to measure self-renewal and differentiation potential
RU2157531C1 (ru) Способ определения суммарной антиоксидантной активности крови
EA018686B1 (ru) Способ определения функционального состояния биологической ткани и применение этого способа для определения ее жизнеспособности и/или степени некротизации
RU2611386C2 (ru) Способ оценки эффективности эндотелиотропной терапии после реконструктивных операций на артериях
JPWO2019049705A1 (ja) アルツハイマー症診断装置及び方法
RU2310196C2 (ru) Способ определения функциональной активности симпато-адреналовой системы
Liu et al. A new method for accurate prediction of spermatogenesis: FSH/T and T in seminal plasma
RU2814543C1 (ru) Способ дифференциальной оценки функционального состояния коров
RU2470298C2 (ru) Способ ранней (донозологической) диагностики развития сенсибилизации к аллергенам воздуха рабочей зоны птицеводческого комплекса
RU2815908C1 (ru) Способ оценки качества спермы жеребцов по концентрации тестостерона в сыворотке крови
RU2457488C2 (ru) Способ определения резерва реактивности нейтрофилов (оксидантного потенциала)
Stegniy et al. Comparative diagnostics of Cattle leukemia by ELISA method in test kits of various constructions
Gubareva et al. Estimation of Decellularization and Recellularization Quality of Tissue-Engineered Constructions by the Chemiluminescence Method
RU2738092C1 (ru) Способ оценки адаптационных качеств крупного рогатого скота по элементному составу шерсти
RU2636891C1 (ru) Способ диагностики гипоксии плода в модели общей пренатальной гипоксической гипоксии у кроликов
RU2008684C1 (ru) Способ диагностики иерсиниоза
CN105779568A (zh) 一种体外获能后精子质量评估的试剂盒及其使用方法
JP2014222185A (ja) 免疫蛍光染色を用いた効率的なスクリーニング法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20181123