RU2662171C1 - Method for detecting heparin in blood - Google Patents
Method for detecting heparin in blood Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662171C1 RU2662171C1 RU2017140532A RU2017140532A RU2662171C1 RU 2662171 C1 RU2662171 C1 RU 2662171C1 RU 2017140532 A RU2017140532 A RU 2017140532A RU 2017140532 A RU2017140532 A RU 2017140532A RU 2662171 C1 RU2662171 C1 RU 2662171C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood
- heparin
- sample
- calcium chloride
- solution
- Prior art date
Links
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 96
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 96
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 88
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 title claims abstract description 88
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 title claims abstract description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 claims abstract description 37
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 30
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims abstract description 26
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 26
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000004904 shortening Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims abstract description 6
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims abstract description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 36
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 38
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 36
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 36
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 description 33
- 238000013169 thromboelastometry Methods 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 5
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- 206010020608 Hypercoagulation Diseases 0.000 description 2
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000002612 cardiopulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003027 hypercoagulation Effects 0.000 description 2
- 230000000023 hypocoagulative effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 2
- KZKAYEGOIJEWQB-UHFFFAOYSA-N 1,3-dibromopropane;n,n,n',n'-tetramethylhexane-1,6-diamine Chemical compound BrCCCBr.CN(C)CCCCCCN(C)C KZKAYEGOIJEWQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000008960 Diabetic foot Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 108010058861 Fibrin Fibrinogen Degradation Products Proteins 0.000 description 1
- 208000024659 Hemostatic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 241000605114 Pedobacter heparinus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002586 coronary angiography Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000208 fibrin degradation product Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229950007870 hexadimethrine bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 150000003220 pyrenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000012959 renal replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к инструментальным способам оценки функционального состояния системы гемостаза.The invention relates to medicine, namely to instrumental methods for assessing the functional state of the hemostatic system.
Гепарин - это сульфатированный полисахарид, играющий в организме важную роль в различных физиологических и патологических процессах, таких как свертывание крови, транспорт липидов, воспаление, иммунный ответ, дифференциация и рост клеток, тромбоэмболические осложнения. Гепарин также используется как антикоагулянт при лечении тромботических осложнений, сердечно-сосудистых заболеваний, при проведении экстракорпоральных методов детоксикации, искусственном кровообращении и т.п. Терапевтическая концентрация гепарина колеблется от 0,2-1,2 ед/мл в послеоперационном периоде и до 2-18 ед/мл при кардиохирургических операциях [Dai Q, Liu W, Zhuang X, Wu J, Zhang H, Wang P: Ratiometric Fluorescence Sensor Based on a Pyrene Derivative and Quantification Detection of Heparin in Aqueous Solution and Serum. Anal Chem 2011, 83:6559-6564]. Недостаточная доза гепарина при проведении гепаринотерапии может привести к тромботическим осложнениям, избыток вводимого гепарина может осложниться геморрагическим синдромом. Поэтому выявление гепарина в образцах крови имеет большое практическое значение. Известны различные методы выявления гепарина в крови.Heparin is a sulfated polysaccharide that plays an important role in various physiological and pathological processes in the body, such as blood coagulation, lipid transport, inflammation, immune response, cell differentiation and growth, and thromboembolic complications. Heparin is also used as an anticoagulant in the treatment of thrombotic complications, cardiovascular diseases, during extracorporeal detoxification methods, cardiopulmonary bypass, etc. The therapeutic concentration of heparin ranges from 0.2-1.2 u / ml in the postoperative period to 2-18 u / ml for cardiac surgery [Dai Q, Liu W, Zhuang X, Wu J, Zhang H, Wang P: Ratiometric Fluorescence Sensor Based on a Pyrene Derivative and Quantification Detection of Heparin in Aqueous Solution and Serum. Anal Chem 2011, 83: 6559-6564]. An insufficient dose of heparin during heparin therapy can lead to thrombotic complications, an excess of heparin administered can be complicated by hemorrhagic syndrome. Therefore, the detection of heparin in blood samples is of great practical importance. Various methods are known for detecting heparin in the blood.
В работах Долгова В.В. и Свирина П.В. рассмотрены способы определения гепарина в крови с помощью хромогенных субстратов. Гепарин определяют опосредованно: используя его способность усиливать комплексообразование фактора Ха или тромбина с эдтитромбином и тем самым подавлять активность этих протеаз, после чего определяют их остаточную активность. Тест может выполняться в разных модификациях: как кинетический метод, определение по начальной скорости или метод по конечной точке. На результаты теста с хромогенными субстратами не оказывают влияния продукты деградации фибрина. Однако этот тест требует специального лабораторного оборудования, адаптированных биохимических анализаторов, хромогенных субстратов. Он не может выполняться у постели больного. Также этими авторами рассмотрен и способ определения гепарина с помощью коагуляционных методов. Определение основано на ингибировании свободного фактора свертывания крови Ха на первом этапе. После инкубационного периода выпадение сгустка вызывается добавлением реактивов, содержащих фосфолипиды с адсорбированными на них фактором V, протромбином, фибриногеном из бычьей плазмы и CaCl2. Автоматизация этого метода затруднена, так как сигнал достаточно слабый для оптического метода. Тест может выполняться на цельной крови на коагулометрах с механической системой регистрации. Метод также требует специального оборудования и может выполняться только в лабораторных условиях [Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. М., Тверь, ООО издательство «Триада», 2005, с. 129-130].In the works of Dolgov V.V. and Svirin P.V. Methods for determining heparin in the blood using chromogenic substrates are considered. Heparin is determined indirectly: using its ability to enhance the complexation of factor Xa or thrombin with edtithrombin and thereby suppress the activity of these proteases, after which their residual activity is determined. The test can be carried out in various modifications: as a kinetic method, determination by the initial speed or method by the end point. Fibrin degradation products do not affect the test results with chromogenic substrates. However, this test requires special laboratory equipment, adapted biochemical analyzers, chromogenic substrates. It cannot be performed at the patient’s bedside. Also, these authors considered a method for determining heparin using coagulation methods. The determination is based on the inhibition of free coagulation factor Xa in the first stage. After the incubation period, clot loss is caused by the addition of reagents containing phospholipids with factor V, prothrombin, bovine plasma fibrinogen and CaCl 2 adsorbed on them. Automation of this method is difficult because the signal is weak enough for the optical method. The test can be performed on whole blood on coagulometers with a mechanical recording system. The method also requires special equipment and can only be performed in laboratory conditions [Dolgov VV, Svirin P.V. Laboratory diagnosis of hemostatic disorders. M., Tver, LLC publishing house "Triad", 2005, p. 129-130].
Наиболее близким техническим решением является способ определения гепарина в крови путем тромбоэластографии - метода, основанного на графической регистрации изменений вязкости и упруго-эластических свойств крови в процессе образования фибринового сгустка. Тромбоэластография (ТЭГ), в отличие от классических клотинговых исследований, отображает кинетику всех стадий формирования тромба, а также фибринолиз (Авдушкина Л.А., Вавилова Т.В. Метод тромбоэластографии/ тромбоэластометрии в оценке системы гемостаза: прошлое и настоящее. Референтные интервалы. Ж. Клинико-лабораторный крнсилиум., Санкт-Петербург, 2009, №5, с. 26-33). Ротационная тромбоэластография (РОТЭГ) является усовершенствованной и переработанной формой классической тромбоэластографии. В 2003 году метод был переименован в ротационную тромбоэластометрию (РОТЭМ). В основе ТЭГ и РОТЭМ лежат одни и те же фундаментальные принципы работы, имеются сходства оборудования, графики изображения, но есть и различия. В отличие от ТЭГ в РОТЭМ предусмотрено не ручное, а автоматическое пипетирование исследуемых образцов, ТЭГ измеряет эластичность сгустка крови при движении кюветы, РОТЭМ - при движении оси, передача сигнала в ТЭГ электромеханическая, а в РОТЭМ - оптическая. Параметры, регистрируемые ТЭГ и РОТЭМ схожи.The closest technical solution is the method for determining heparin in the blood by thromboelastography, a method based on the graphic recording of changes in the viscosity and elastic properties of blood during the formation of a fibrin clot. Thromboelastography (TEG), in contrast to classical clotting studies, displays the kinetics of all stages of the formation of a thrombus, as well as fibrinolysis (Avdushkina L.A., Vavilova T.V. The method of thromboelastography / thromboelastometry in assessing the hemostasis system: past and present. Reference intervals. J. Clinical and laboratory krnsilium., St. Petersburg, 2009, No. 5, p. 26-33). Rotational thromboelastography (RTEG) is an improved and revised form of classical thromboelastography. In 2003, the method was renamed Rotational Thromboelastometry (ROTEM). The TEG and ROTEM are based on the same fundamental principles of operation, there are similarities of equipment, image graphics, but there are also differences. In contrast to TEGs, ROTEM does not provide for manual but automatic pipetting of the samples, TEG measures the elasticity of a blood clot when the cell moves, ROTEM measures the axis, the signal is electromechanical in TEG, and optical in ROTEM. The parameters recorded by TEG and ROTEM are similar.
- R (Reaction Time в ТЭГ) или СТ (Clotting time в РОТЭМ) - время от начала свертывания до образования первых волокон фибрина, мин;- R (Reaction Time in TEG) or CT (Clotting time in ROTEM) - time from the beginning of coagulation to the formation of the first fibrin fibers, min;
- К (ТЭГ) или CFT (Clot formation time в РОТЭМ) - время изменения амплитуды свертывания, его нарастания или замедления, мин;- K (TEG) or CFT (Clot formation time in ROTEM) - time of change in the coagulation amplitude, its increase or decrease, min;
- Угол α - (Angle deg в ТЭГ и РОТЭМ) - отражает скорость свертывания крови, процесс полимеризации фибрина;- Angle α - (Angle deg in TEG and ROTEM) - reflects the rate of blood coagulation, fibrin polymerization process;
- MA (Maximum amplitude в ТЭГ) или MCF (Maximum clot firmness в РОТЭМ) максимальная амплитуда кривой, характеризующая плотность образовавшегося сгустка, зависящая от функции и количества тромбоцитов, от концентрации фибриногена, содержания XIII фактора свертывания крови.- MA (Maximum amplitude in TEG) or MCF (Maximum clot firmness in ROTEM) is the maximum amplitude of the curve characterizing the density of the formed clot, depending on the function and number of platelets, on the concentration of fibrinogen, and the content of XIII coagulation factor.
- LY30, LY45, LY60 (ТЭГ и РОТЭМ) - оценка фибринолиза, %.- LY30, LY45, LY60 (TEG and ROTEM) - fibrinolysis score,%.
Для выявления гепарина в образцах крови ТЭГ/РОТЭМ выполняют с цельной или стабилизированной цитратом кровью, а полученные результаты сравнивают с данными ТЭГ/РОТЭМ, выполненными с теми же образцами крови, но с добавлением гепариназы (кюветы, покрытые гепариназой в ТЭГ или добавляемый реактив в РОТЭМ). Гепариназа - это фермент, продуцируемый Flavobacterium heparinum, который нейтрализует гепарин путем энзиматического расщепления альфа-гликозидных связей в месте связывания с антитромбином III. Уменьшение R, K и увеличение угла α и МА в ТЭГ или уменьшение СТ, CFT и увеличение угла α и MCF в РОТЭМ свидетельствуют о наличии в пробе гепарина [Т.Н. Гриневич; А.В. Наумов и др. Ротационная тромбоэластометрия (ROTEM), Журнал ГрГМУ, 2010, №1, с.7-9]. Однако тест с гепариназой требует использования дорогостоящих реактивов или кювет, что ограничивает его широкое применение.To detect heparin in blood samples, TEG / ROTEM is performed with whole or stabilized citrate blood, and the results are compared with TEG / ROTEM data obtained with the same blood samples, but with heparinase (cells coated with heparinase in TEG or an added reagent in ROTEM ) Heparinase is an enzyme produced by Flavobacterium heparinum that neutralizes heparin by enzymatic cleavage of alpha-glycosidic bonds at the site of binding to antithrombin III. A decrease in R, K and an increase in the angle α and MA in the TEG or a decrease in CT, CFT and an increase in the angle α and MCF in the RTEM indicate the presence of heparin in the sample [T.N. Grinevich; A.V. Naumov et al. Rotational thromboelastometry (ROTEM), Journal of the State Medical University, 2010, No. 1, pp. 7-9]. However, the heparinase test requires the use of expensive reagents or ditches, which limits its widespread use.
Сущность изобретения.SUMMARY OF THE INVENTION
Технический результат заключается в упрощении выявления гепарина в пробах крови с высокой точностью за счет изменения параметров тромбоэластограммы, выполненной с нативной цитратной кровью с добавлением полибрен-кальциевого реактива, который нейтрализует гепарин, по сравнению с тромбоэластограммой, выполненной с нативной цитратной кровью с добавлением только 0,2 М кальция хлорида.The technical result consists in simplifying the detection of heparin in blood samples with high accuracy by changing the parameters of a thromboelastogram performed with native citrate blood with the addition of calcium polybren reagent, which neutralizes heparin, compared with a thromboelastogram performed with native citrate blood with only 0 added. 2 M calcium chloride.
Технический результат достигается тем, что выявление гепарина в пробах крови, проводят путем выполнения тромбоэластографии с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и тромбоэластографии с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и инактиватора гепарина, а наличие в пробе крови гепарина выявляют по показателям времени от начала свертывания до образования первых волокон фибрина, мин (R), времени изменения амплитуды свертывания, его нарастания или замедления, мин (K), по показателям максимальной амплитуды (МА) и угла альфа (угол α) в пробе с инактиватором по сравнению с пробой без него, отличающийся тем, что в качестве инактиватора гепарина используют полибрен в конечной концентрации 15-30 мкг/мл, а наличие в пробе крови гепарина выявляют по укорочению показателей R и K и увеличению МА и угла α в пробе с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и полибрена по сравнению с пробой с цельной цитратной кровью и добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида.The technical result is achieved by the fact that the detection of heparin in blood samples is carried out by performing thromboelastography with whole citrate blood with the addition of a solution of 0.2 M calcium chloride and thromboelastography with whole citrate blood with the addition of a solution of 0.2 M calcium chloride and heparin inactivator, and the presence of in a blood sample, heparin is detected by indicators of time from the beginning of coagulation to the formation of the first fibrin fibers, min (R), time of change in the coagulation amplitude, its growth or deceleration, min (K), according to maximum amplitude (MA) and angle alpha (angle α) in the sample with an inactivator compared to a sample without it, characterized in that polybrene is used as a heparin inactivator in a final concentration of 15-30 μg / ml, and the presence of heparin in the blood sample is detected by shortening the R and K indices and increasing the MA and angle α in the sample with whole citrate blood with the addition of a solution of 0.2 M calcium chloride and polybrene compared to the sample with whole citrate blood and the addition of a solution of 0.2 M calcium chloride.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Кровь больного для исследования набирают в пробирку, содержащую 3.2% раствор трехзамещенного двуводного цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата, 9 частей крови). ТЭГ выполняют на тромбоэластографе TEG 5000 ("Haemoscope Corporation", США). Используют два канала тромбоэластографа. На первом канале в кювету для тромбоэластографии вносят 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида, затем 340 мкл цельной цитратной крови. На втором канале тромбоэластографа в чистую кювету вносят 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида с полибреном (полибрен-кальциевый реактив), затем 340 мкл цельной цитратной крови. Концентрация полибрена в готовом для проведения исследования растворе составляет 15-30 мкг/мл. Выполняют тромбоэластографию. При сравнении двух тромбоэластограмм, выполненных с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и тромбоэластографии с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и полибрена в конечной концентрации 15-30 мкг/мл отмечают показатели времени R, K, угла альфа и максимальной амплитуды.Patient's blood for research is drawn into a test tube containing a 3.2% solution of trisubstituted two-water sodium citrate in a ratio of 1: 9 (1 part citrate solution, 9 parts blood). TEG is performed on a TEG 5000 thromboelastograph (Haemoscope Corporation, USA). Two channels of thromboelastograph are used. On the first channel, 20 μl of 0.2 M calcium chloride solution is added to the thromboelastography cuvette, then 340 μl of whole citrate blood. On the second channel of the thromboelastograph, 20 μl of a 0.2 M solution of calcium chloride with polybrene (polybren-calcium reagent) is added to a clean cuvette, then 340 μl of whole citrate blood. The concentration of polybrene in the solution ready for the study is 15-30 μg / ml. Thromboelastography is performed. When comparing two thromboelastograms performed with whole citrate blood with the addition of a solution of 0.2 M calcium chloride and thromboelastography with whole citrate blood with the addition of a solution of 0.2 M calcium chloride and polybrene in a final concentration of 15-30 μg / ml, time indices R, K, alpha angle and maximum amplitude.
В отличие от лабораторных методов определения гепарина предлагаемый метод может осуществляться с цельной кровью, т.е. без центрифугирования крови и получения плазмы крови. Метод может осуществляться у постели больного. В отличие от методов ТЭГ с гепариназой и РОТЭМ с гепариназой для настоящего метода не нужно специальных кювет с гепариназой, а использование полибрен-кальциевого реактива делает его значительно дешевле, что позволит широко использовать метод.Unlike laboratory methods for determining heparin, the proposed method can be carried out with whole blood, i.e. without centrifuging blood and obtaining blood plasma. The method can be carried out at the bedside of the patient. In contrast to the TEG methods with heparinase and ROTEM with heparinase, for this method, special cuvettes with heparinase are not necessary, and the use of polybren-calcium reagent makes it much cheaper, which will make it possible to widely use the method.
Особенностью метода является создание полибрен-кальциевого реактива для ТЭГ и выявление с его помощью гепарина в образцах крови. Полибрен или гексадиметрина бромид является синтетическим положительно заряженным полимером (поликатионом), в то время как гепарин является сильной органической кислотой (полианионом) (фиг. 1) (Sigma-Aldrich: Hexadimethrine Bromide. Technical Bulletin). Полибрен, связываясь с гепарином, нейтрализует его действие. Нейтрализующий эффект длится несколько часов (Preston FW, Hohf R, Trippel О: The neutralization of heparin with polybrene. Q Bull Northwest Univ Med Sch 1956, 30:138-43). Имеется прямая корреляция между количеством гепарина и количеством полибрена, способным нейтрализовать его действие. Полибрен позволяет измерять гепарин в дозах от 0,6 ед/мл плазмы в организме, в то время как по Ли-Уйату время свертывания крови не определяется. 0,04 мг полибрена нейтрализует гепарин в дозе, удлиняющей время свертывания в 2-6 раз, 0,08 мг - в дозе, удлиняющей время свертывания 8 раз (Grann V, Homewood K, Golden W: Polybrene Neutralization as a Rapid Means of Monitoring Blood Heparin Levels. AJCP 1972, 58:26-32). Нейтрализующий эффект полибрена после применения аппарата искусственного кровообращения был показан как в опытах на собаках, так и в клинической практике на больных (Rothnie N., Kinmonth J.: The Neutralization Of Heparin After Perfusion: A Comparison Of Protamine And "Polybrene." Br Med J 1960, 2:1194-1197).A feature of the method is the creation of a polybren-calcium reagent for TEG and the detection with its help of heparin in blood samples. Polybrene or hexadimethrin bromide is a synthetic positively charged polymer (polycation), while heparin is a strong organic acid (polyanion) (Fig. 1) (Sigma-Aldrich: Hexadimethrine Bromide. Technical Bulletin). Polybrene, binding to heparin, neutralizes its effect. The neutralizing effect lasts several hours (Preston FW, Hohf R, Trippel O: The neutralization of heparin with polybrene. Q Bull Northwest Univ Med Sch 1956, 30: 138-43). There is a direct correlation between the amount of heparin and the amount of polybrene, which can neutralize its effect. Polybrene allows you to measure heparin in doses of 0.6 u / ml of plasma in the body, while Li-Uyatu blood clotting time is not determined. 0.04 mg of polybrene neutralizes heparin in a dose that lengthens clotting time by 2-6 times, 0.08 mg in a dose that lengthens clotting time by 8 times (Grann V, Homewood K, Golden W: Polybrene Neutralization as a Rapid Means of Monitoring Blood Heparin Levels. AJCP 1972, 58: 26-32). The neutralizing effect of polybrene after the use of the cardiopulmonary bypass was shown both in experiments on dogs and in clinical practice on patients (Rothnie N., Kinmonth J .: The Neutralization Of Heparin After Perfusion: A Comparison Of Protamine And "Polybrene." Br Med J 1960, 2: 1194-1197).
В методе ТЭГ полибрен-кальциевый реактив для определения гепарина в образцах плазмы или цельной крови не применялся.In the TEG method, a polybren-calcium reagent was not used to determine heparin in plasma or whole blood samples.
Таким образом, отличительными особенностями метода являются:Thus, the distinguishing features of the method are:
1) Принцип действия полибрен-кальциевого реактива, заключающийся в анио-катионном взаимодействии с гепарином, отличается от гепариназного, где расщепление гепарина происходит путем энзиматического воздействия;1) The principle of the polybren-calcium reagent, which consists in the anion-cationic interaction with heparin, differs from heparinase, where heparin is cleaved by enzymatic action;
2) Графическое изображение процесса свертывания крови с полибрен-кальциевым реактивом, что ранее в методе тромбоэластографии никогда не использовалось;2) A graphical representation of the blood coagulation process with polybren-calcium reagent, which had never been used in the method of thromboelastography;
3) Использование цельной крови, не требующей центрифугирования, для определения наличия в ней гепарина в крови с помощью полибрен-кальциевого реактива, в отличие от коагулогических методов, где тест выполнялся на плазме, полученной в результате центрифугирования крови.3) The use of whole blood, which does not require centrifugation, to determine the presence of heparin in the blood using a polybren-calcium reagent, in contrast to coagulological methods, where the test was performed on plasma obtained by centrifugation of blood.
4) Создание полибрен-кальциевого реактива, в котором подобраны концентрация полибрена и кальция хлорида, позволяющие выполнять этот тест с помощью тромбоэластографии.4) The creation of polybren-calcium reagent, in which the concentration of polybren and calcium chloride is selected, allowing this test to be performed using thromboelastography.
5) Создание реактива, который позволил значительно удешевить метод, сделав его широко доступным для применения на территории России, выполнив таким образом задачу импортозамещения.5) The creation of a reagent, which allowed to significantly reduce the cost of the method, making it widely available for use on the territory of Russia, thus fulfilling the task of import substitution.
Была подобрана концентрация полибрена, позволяющая нейтрализовать гепарин в крови у больных, которым проводилась гепаринотерапия. Для контроля за антикоагулянтной терапией гепарином забиралась кровь больных, получающих гепарин, путем венепункции периферической вены в пробирку S-Monovette, содержащую 3.2% раствор цитрата натрия. Затем выполнялась тромбоэластография с цельной цитратной кровью путем добавления к 340 мкл крови 20 мкл 0,2 М кальция хлорида (фиг. 2) и тромбоэластография с кюветами с гепариназой путем добавления к 340 мкл крови 20 мкл 0,2 М кальция хлорида в кювете с гепариназой (фиг. 3). На двух других каналах тромбоэластографа выполнены тромбоэластограммы с цельной цитратной кровью путем добавления к 340 мкл крови 20 мкл полибрен-кальциевого реактива с различной концентрацией полибрена: фигура 4-15 мкг/мл, фигура 5-30 мкг/мл. При сравнении тромбоэластограмм с различными концентрациями полибрена наиболее близкими по значению параметров R, K, угол альфа, МА с ТЭГ в кюветах с гепариназой выявлен полибрен-кальциевый реактив с концентрацией полибрена 15-30 мкг/мл (фиг. 4, 5).The concentration of polybrene was selected, which allows to neutralize heparin in the blood in patients who underwent heparin therapy. To monitor heparin anticoagulant therapy, the blood of patients receiving heparin was taken by venipuncture of a peripheral vein into an S-Monovette tube containing a 3.2% sodium citrate solution. Thromboelastography was then performed with whole citrate blood by adding 20 μl of 0.2 M calcium chloride to 340 μl of blood (Fig. 2) and thromboelastography with heparinase cuvettes by adding 20 μl of 0.2 M calcium chloride to 340 μl of blood in a heparinase cuvette (Fig. 3). On the other two channels of the thromboelastograph, thromboelastograms with whole citrate blood were made by adding 20 μl of calcium polybrenum reagent with different polybrene concentration to 340 μl of blood: figure 4-15 μg / ml, figure 5-30 μg / ml. When comparing thromboelastograms with different concentrations of polybrene closest in value to the parameters R, K, angle alpha, MA with TEG in cuvettes with heparinase, a calcium polybrene reagent with a polybrene concentration of 15-30 μg / ml was revealed (Fig. 4, 5).
Примеры осуществления способа.Examples of the method.
Пример 1. Корреляционный анализ изменений параметров тромбоэластограммы в тестах с полибрен-кальциевым реактивом и кюветах с гепариназой у больных, получающих гепарин.Example 1. Correlation analysis of changes in thromboelastogram parameters in tests with polybren-calcium reagent and cuvettes with heparinase in patients receiving heparin.
Проведен корреляционный анализ изменений параметров R, K, угла α и МА при выполнении проб с полибрен-кальциевым реактивом и в кюветах с гепариназой по сравнению с нативными образцами крови у больных, получающих гепарин. Как указано выше, при наличии в крови гепарина добавление к пробе крови кроме кальция хлорида полибрена или гепариназы приводит к укорочению R, K и увеличению угла альфа и максимальной амплитуды по сравнению с образцами цельной цитратной крови, выполненной с добавлением только 0,2 М кальция хлорида. Исследовано 74 образца крови, полученных у 56 больных, получавших нефракционированный гепарин в различных дозах. Кровь получали путем венепункции одной из периферических вен и собирали в пробирки S-Monovette с 3.2% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата, 9 частей крови).A correlation analysis of changes in the parameters R, K, angle α, and MA was performed when performing tests with a polybren-calcium reagent and in cuvettes with heparinase as compared to native blood samples in patients receiving heparin. As indicated above, in the presence of heparin in the blood, addition of polybrene chloride or heparinase to the blood sample, in addition to calcium, leads to a shortening of R, K and an increase in the alpha angle and maximum amplitude compared to samples of whole citrate blood made with the addition of only 0.2 M calcium chloride . We examined 74 blood samples obtained from 56 patients who received unfractionated heparin in various doses. Blood was obtained by venipuncture of one of the peripheral veins and collected in S-Monovette tubes with a 3.2% sodium citrate solution in a ratio of 1: 9 (1 part citrate solution, 9 parts blood).
ТЭГ выполняли на тромбоэластографе TEG 5000 ("Haemoscope Corporation", США). Использовали три канала тромбоэластографа. В кювету первого канала тромбоэластографа вносили 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида, затем 340 мкл цельной цитратной крови. В кювету второго канала тромбоэластографа вносили 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида и гепариназу, затем 340 мкл цельной цитратной крови. На третьем канале тромбоэластографа в кювету вносили 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида и полибрен до конечной концентрации в кювете 15 или 30 мкг/мл. После чего провели тромбоэластографию и сравнили изменения показателей R, K, углов α и максимальную амплитуду в пробах с гепариназой и полибреном (второй и третий каналы ТЭГ) по сравнению с пробами с цитратной кровью первого канала.TEG was performed on a TEG 5000 thromboelastograph (Haemoscope Corporation, USA). Three channels of thromboelastograph were used. In the cuvette of the first channel of the thromboelastograph, 20 μl of 0.2 M calcium chloride solution was added, then 340 μl of whole citrate blood. In the cuvette of the second channel of the thromboelastograph, 20 μl of a 0.2 M solution of calcium chloride and heparinase were added, then 340 μl of whole citrate blood. On the third channel of the thromboelastograph, 20 μl of 0.2 M calcium chloride solution and polybrene were added to the cuvette to a final concentration in the cuvette of 15 or 30 μg / ml. Then they performed thromboelastography and compared the changes in R, K, angles α and the maximum amplitude in samples with heparinase and polybrene (second and third channels of TEG) compared with samples with citrate blood of the first channel.
Выявлена сильная корреляция (r=0,9839, р=0,001) (фиг. 6) при сравнении разницы между изменениями величины R в тестах с нативной цитратной кровью и цитратной кровью после добавления гепариназы или полибрен-кальциевого реактива. Это означает, что полибрен-кальциевый реактив вызывал схожие с гепариназой изменения показателя R на тромбоэластограмме при наличии в пробе гепарина.A strong correlation was revealed (r = 0.9839, p = 0.001) (Fig. 6) when comparing the difference between the changes in the R value in tests with native citrate blood and citrate blood after addition of heparinase or calcium polybrenum reagent. This means that the polybren-calcium reagent caused changes in the R index in the thromboelastogram similar to heparinase in the presence of heparin in the sample.
Также сильная корреляция имеется между изменениями величины МА при нейтрализации гепарина с гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом (r=0,964, р=0,001) (фиг. 7). Это означает, что полибрен-кальциевый реактив вызывает схожие с гепариназой изменения максимальной амплитуды на тромбоэластограмме при наличии в пробе гепарина.There is also a strong correlation between changes in the MA value during neutralization of heparin with heparinase and calcium polybrenum reagent (r = 0.964, p = 0.001) (Fig. 7). This means that the calcium polybrene reagent causes changes in the maximum amplitude in the thromboelastogram similar to heparinase in the presence of heparin in the sample.
При сравнении показателей угла α в пробах с гепариназой и полибреном (фиг. 8) коэффициент корреляции составил 0,827; р<0,001, что также свидетельствует о схожих изменениях.When comparing the angle α in samples with heparinase and polybrene (Fig. 8), the correlation coefficient was 0.827; p <0.001, which also indicates similar changes.
При сравнении изменений показателя K в пробах с гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом (фиг. 9) коэффициент корреляции составил 0,979; р<0,001. Следовательно, полибрен-кальциевый реактив и гепариназа, нейтрализуя гепарин, вызывают схожие изменения K.When comparing the changes in K in samples with heparinase and calcium polybrenum reagent (Fig. 9), the correlation coefficient was 0.979; p <0.001. Therefore, the polybren-calcium reagent and heparinase, neutralizing heparin, cause similar changes in K.
Таким образом, при анализе изменений параметров тромобоэластограммы (R, K угла α и МА) в пробах с гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом по сравнению с цитратной кровью без нейтрализации гепарина установлены схожие изменения этих показателей. То есть ТЭГ с полибрен-кальциевым реактивом позволяет выявить гепарин в пробах крови с высокой точностью при относительной простоте исследования.Thus, when analyzing changes in the parameters of the thromoboelastogram (R, K angle α and MA) in samples with heparinase and calcium polybrenum reagent compared with citrate blood without neutralizing heparin, similar changes in these parameters were found. That is, TEG with polybren-calcium reagent allows you to identify heparin in blood samples with high accuracy with the relative simplicity of the study.
Пример 2. Полибрен-кальциевый реактив в выявлении гепарина с помощью ТЭГ в крови у больного лимфомой.Example 2. Polybren-calcium reagent in the detection of heparin using TEG in the blood of a patient with lymphoma.
Больной Г., 27 лет, диагноз лимфома Беркитта, получает гепарин в виде непрерывной внутривенной инфузии в дозе 800 ед/ч. Для контроля за антикоагулянтной терапией у больного взята кровь путем венепункции периферической вены в пробирку S-Monovette, содержащую 3.2% раствор цитрата натрия. В результате гепаринотерапии у больного активированное частичное тромбопластиновое время составляло 40 сек, тромбиновое время 44 сек. Выполнена тромбоэластография с цельной цитратной кровью путем добавления к 20 мкл 0,2 М кальция хлорида 340 мкл крови (фиг. 10). На двух других каналах тромбоэластографа выполнены тромбоэластограммы с цельной цитратной кровью путем добавления к 20 мкл 0,2 М кальция хлорида и полибрена 340 мкл крови до конечной концентрации полибрена в кювете 15 мкг/мл (фиг. 11), и с цельной цитратной кровью путем добавления к 20 мкл 0,2 М кальция и гепариназы 340 мкл крови (фиг. 12). При сравнении тромбоэластограммы с нативной цитратной кровью (фиг. 10) и тромбоэластограммой с полибрен-кальциевым реактивом (фиг. 11) и в гепариназной (фиг. 12) отмечено укорочение времени R, K, увеличение угла α и максимальной амплитуды, что свидетельствует о наличии в образце крови гепарина.Patient G., 27 years old, diagnosed with Burkitt’s lymphoma, receives heparin in the form of continuous intravenous infusion at a dose of 800 units / h. To monitor anticoagulant therapy, the patient was sampled by venipuncture of a peripheral vein in an S-Monovette tube containing a 3.2% sodium citrate solution. As a result of heparin therapy, the patient's activated partial thromboplastin time was 40 seconds, and thrombin time was 44 seconds. Thromboelastography was performed with whole citrate blood by adding 340 μl of blood to 20 μl of 0.2 M calcium chloride (Fig. 10). On the other two channels of the thromboelastograph, thromboelastograms were made with whole citrate blood by adding to 20 μl 0.2 M calcium chloride and polybrene 340 μl of blood to a final polybrene concentration in the cuvette of 15 μg / ml (Fig. 11), and with whole citrate blood by adding to 20 μl of 0.2 M calcium and heparinase 340 μl of blood (Fig. 12). When comparing thromboelastogram with native citrate blood (Fig. 10) and thromboelastogram with polybren-calcium reagent (Fig. 11) and in heparinase (Fig. 12), a shortening of the time R, K, an increase in the angle α and maximum amplitude are noted, which indicates the presence of in a blood sample of heparin.
Таким образом, заявленный способ обеспечивает выявление гепарина в пробах крови больного с высокой точностью при относительной простоте исследования.Thus, the claimed method provides for the detection of heparin in blood samples of a patient with high accuracy with the relative simplicity of the study.
Пример 3. Изменения тромбоэластограммы после добавления к пробе полибрен-кальциевого реактива у больной до и после назначения болюсно большой дозы гепарина.Example 3. Changes in thromboelastogram after adding a polybren-calcium reagent to a patient’s sample before and after administration of a bolus-large dose of heparin.
Больной Л., 71 года, диагноз ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, рестеноз огибающей артерии. 12.10.2017 г., во время проведения коронарографии и баллонной ангиопластики огибающей артерии выполнена инфузия 5000 ME гепарина. Выполнена тромбоэластография до и после инфузии гепарина. Для контроля за антикоагулянтной терапией у больного взята кровь путем венепункции периферической вены в пробирку S-Monovette, содержащую 3.2% раствор цитрата натрия. Исследование цельной цитратной крови до инфузии гепарина проведено путем добавления к 20 мкл 0,2 М кальция хлорида 340 мкл крови (фиг. 13). На другом канале тромбоэластографа выполнена тромбоэластограмма с цельной цитратной кровью путем добавления к 20 мкл 0,2 М кальция хлорида и полибрена 340 мкл крови до конечной концентрации полибрена в кювете 15 мкг/мл (фиг. 14).Patient L., 71 years old, diagnosed with coronary heart disease, angina pectoris, restenosis of the envelope artery. On October 12, 2017, during the course of coronary angiography and balloon angioplasty of the envelope of the artery, infusion of 5000 ME of heparin was performed. Thromboelastography was performed before and after heparin infusion. To monitor anticoagulant therapy, the patient was sampled by venipuncture of a peripheral vein in an S-Monovette tube containing a 3.2% sodium citrate solution. The study of whole citrated blood before heparin infusion was carried out by adding 340 μl of blood to 20 μl of 0.2 M calcium chloride (Fig. 13). On the other channel of the thromboelastograph, a thromboelastogram was made with whole citrate blood by adding to 20 μl 0.2 M calcium chloride and polybrene 340 μl of blood to a final polybrene concentration in the cuvette of 15 μg / ml (Fig. 14).
После внутривенного введения 5000 ед гепарина активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) не определяется. Выполнена повторно тромбоэластография без добавления и с добавлением полибрен-кальциевого реактива. В нативной цитратной крови отмечается резкое удлинение показателя R, K, а угол α и МА не определяются, фактически сгусток не образуется (фиг. 15). В пробе с полибрен-кальциевым реактивом отмечено образование сгустка, нейтрализация действия гепарина, укорочение времени R, K, увеличение угла α, максимальной амплитуды, что свидетельствует о наличии в образце крови гепарина (фиг. 16).After intravenous administration of 5000 units of heparin, the activated partial thromboplastin time (APTT) is not determined. Thromboelastography was repeated without and with the addition of calcium polybrene reagent. In native citrated blood, a sharp elongation of the R, K index is noted, and the angle α and MA are not determined, in fact, a clot does not form (Fig. 15). In the sample with polybren-calcium reagent, clot formation, neutralization of heparin, shortening of the time R, K, increase in the angle α, maximum amplitude were observed, which indicates the presence of heparin in the blood sample (Fig. 16).
Пример 4. Изменения тромбоэластограммы у больной до назначения гепарина и после длительной внутривенной инфузии нефракционированного гепарина.Example 4. Changes in thromboelastogram in a patient before heparin and after a long intravenous infusion of unfractionated heparin.
Больная К., 62 лет. Поступила в связи с сахарным диабетом II типа в стадии декомпенсации, синдромом «диабетической стопы». При поступлении АЧТВ 28 сек, тромбиновое время 21 сек, протромбин по Квику 60%, фибриноген 5,4 г/л. По данным ТЭГ с цитратной нативной кровью и 20 мкл 0,2М кальция хлорида выявлена гиперкоагуляция (фиг. 17). Гиперкоагуляция выявлялась и в пробе с гепариназой (фиг. 18) и полибрен-кальциевым реактивом (фиг. 19). Причем использование гепариназы и полибрен-кальциевого реактива при отсутствии в крови гепарина существенно не влияло на результаты тромбоэластографии (фиг. 17, 18, 19).Patient K., 62 years old. Received in connection with type II diabetes mellitus in the stage of decompensation, diabetic foot syndrome. Upon receipt of APTT 28 sec,
Была начата постоянная внутривенная инфузия нефракционированного гепарина со скоростью 1300 ед/ч. АЧТВ при этом удлинилось до 48 ск, тромбиновое время - 30 с. После начала терапии гепарином отмечена гипокоагуляция по данным тромбоэластограммы с нативной цитратной кровью (фиг. 20). В тромбоэластограммах в кюветах с гепариназой (фиг. 21) и с полибрен-кальциевым реактивом (фиг. 22) отмечено значимое укорочение R, K, увеличение угла и максимальной амплитуды по сравнению с цитрат нативной кровью (рис. 20), что свидетельствует о действии гепарина и наличии его в пробах крови.A continuous intravenous infusion of unfractionated heparin was started at a rate of 1300 u / h. APTT at the same time lengthened to 48 ck, thrombin time - 30 s. After initiation of heparin therapy, hypocoagulation was noted according to thromboelastogram data with native citrate blood (Fig. 20). In thromboelastograms in cuvettes with heparinase (Fig. 21) and with a polybren-calcium reagent (Fig. 22), a significant shortening of R, K, an increase in the angle and maximum amplitude compared to native blood citrate (Fig. 20), which indicates the action heparin and its presence in blood samples.
Пример 5. Исследование полибрен-кальциевого реактива в сравнении с гепариназой после назначения болюсно большой дозы гепарина.Example 5. The study of polybren-calcium reagent in comparison with heparinase after the appointment of a bolus large dose of heparin.
Больная З., 29 лет. У больной хроническая почечная недостаточность, в связи с чем проводятся сеансы заместительной почечной терапии. Во время проведения диализа антикоагуляцию обеспечивали гепарином в виде болюсного введения в дозе 7500 ед. Через 15 мин после начала процедуры выполнена тромбоэластография с цельной цитратной кровью, в кюветах с гепариназой и с полибрен-кальциевыми реактивами в конечной концентрации 30, 20, 15 и 10 мкг/мл. В нативной цитратной крови отмечается резкое удлинение периода R, угол альфа К и МА не определяются, фактически сгусток не образуется (фиг. 23). В пробе с гепариназой показано некоторое укорочение периода R (фиг. 24), однако из-за наличия в крови большой дозы гепарина сохраняется гипокоагуляция, т.е. количества гепариназы, находившейся в кювете, недостаточно для инактивации антикоагулянта. В пробах с полибрен-кальциевым реактивом (фиг. 25, 26, 27) отмечено образование сгустка, нейтрализация действия гепарина, укорочение периодов R, К увеличение угла альфа, максимальной амплитуды, что свидетельствует о наличии в образцах крови гепарина. Использование полибрен-кальциевого реактива с конечной концентрацией полибрена в кювете менее 15 мкг/мл менее эффективно (фиг. 27, 28).Patient Z., 29 years old. The patient has chronic renal failure, in connection with which sessions of renal replacement therapy are performed. During dialysis, anticoagulation was provided with heparin in the form of a bolus at a dose of 7500 units. 15 minutes after the start of the procedure, thromboelastography was performed with whole citrate blood, in cuvettes with heparinase and with polybren-calcium reagents at a final concentration of 30, 20, 15 and 10 μg / ml. In native citrate blood, a sharp lengthening of the period R is observed, the angle alpha K and MA are not determined, in fact a clot does not form (Fig. 23). In the sample with heparinase, a certain shortening of the period R is shown (Fig. 24), however, due to the presence of a large dose of heparin in the blood, hypocoagulation persists, i.e. the amount of heparinase in the cuvette is not enough to inactivate the anticoagulant. In samples with a polybren-calcium reagent (Fig. 25, 26, 27), clot formation, neutralization of heparin, shortening of the R, K periods, an increase in the alpha angle, and maximum amplitude were observed, which indicates the presence of heparin in the blood samples. The use of calcium polybrene reagent with a final concentration of polybrene in a cuvette of less than 15 μg / ml is less effective (Fig. 27, 28).
Таким образом, индукция образования сгустка в цельной цитратной крови методом тромбоэластографии добавлением полибрен-кальциевого реактива, содержащего 0,2 М раствора кальция хлорида и полибрен до конечной концентрации 15-30 мкг/мл, позволяет выявлять наличие гепарина при введении больших доз гепарина, когда даже не определяются клоттинговые тесты.Thus, the induction of the formation of a clot in whole citrate blood by thromboelastography by adding a polybren-calcium reagent containing 0.2 M calcium chloride solution and polybrene to a final concentration of 15-30 μg / ml allows the presence of heparin to be detected when large doses of heparin are administered, even clotting tests are not determined.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017140532A RU2662171C1 (en) | 2017-11-22 | 2017-11-22 | Method for detecting heparin in blood |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017140532A RU2662171C1 (en) | 2017-11-22 | 2017-11-22 | Method for detecting heparin in blood |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2662171C1 true RU2662171C1 (en) | 2018-07-24 |
Family
ID=62981745
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017140532A RU2662171C1 (en) | 2017-11-22 | 2017-11-22 | Method for detecting heparin in blood |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2662171C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1429025A1 (en) * | 1986-05-28 | 1988-10-07 | Казанский медицинский институт им.С.В.Курашова | Method of analysing heparin in blood |
| RU2440575C1 (en) * | 2010-08-23 | 2012-01-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Новые Энергетические Технологии" | Method of determining physiological concentrations of heparin in analysed liquid samples |
-
2017
- 2017-11-22 RU RU2017140532A patent/RU2662171C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1429025A1 (en) * | 1986-05-28 | 1988-10-07 | Казанский медицинский институт им.С.В.Курашова | Method of analysing heparin in blood |
| RU2440575C1 (en) * | 2010-08-23 | 2012-01-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Новые Энергетические Технологии" | Method of determining physiological concentrations of heparin in analysed liquid samples |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| P.Tientadakul et al. Use of an Automated Coagulation Analyzer to Perform Heparin Neutralization With Polybrene in Blood Samples for Routine Coagulation Testing. Practical, Rapid, and Inexpensive / Arch Pathol Lab Med, 2013, vol. 137, pages 1641-1647. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7246559B2 (en) | Detection and Classification of Anticoagulants Using Coagulation Analysis | |
| Hardy et al. | Management of the thrombotic risk associated with COVID-19: guidance for the hemostasis laboratory | |
| US20090130645A1 (en) | Method for assessing the fibrinogen contribution in coagulation | |
| Artang et al. | Fully automated thromboelastograph TEG 6s to measure anticoagulant effects of direct oral anticoagulants in healthy male volunteers | |
| Schöchl et al. | Thromboelastometry (TEM®) findings in disseminated intravascular coagulation in a pig model of endotoxinemia | |
| Herring et al. | Diagnostic approach to small animal bleeding disorders | |
| Prisco et al. | Point-of-care testing of hemostasis in cardiac surgery | |
| JP7192944B2 (en) | Blood coagulation system analysis device, blood coagulation system analysis system, blood coagulation system analysis method, blood coagulation system analysis program, blood loss prediction device, blood loss prediction system, blood loss prediction method, and blood loss prediction program | |
| JP6461125B2 (en) | Means and methods for universal calibration of anti-factor Xa test | |
| US7202048B2 (en) | Onset of force development as a marker of thrombin generation | |
| Kalinskaya et al. | Dynamics of coagulopathy in patients with different COVID-19 severity | |
| US20170234853A1 (en) | Method for determining the structural profile of a fibrin clot reflecting the stability thereof, in order to predict the risk of bleeding, thrombosis or rethrombosis | |
| Wiegele et al. | Thrombin generation and platelet function in ICU patients undergoing CVVHD using regional citrate anticoagulation | |
| RU2662171C1 (en) | Method for detecting heparin in blood | |
| RU2703541C1 (en) | Method for determining fibrinogen during recalcification of citrate plasma and evaluating its functionality | |
| Gruenwald et al. | Whole blood heparin concentrations do not correlate with plasma antifactor Xa heparin concentrations in pediatric patients undergoing cardiopulmonary bypass | |
| Haynes et al. | Accuracy of coagulation studies performed on blood samples obtained from arterial cannulae | |
| Rodrigues et al. | Viscoelastic tests in the evaluation of haemostasis disturbances in SARS-CoV2 infection | |
| Understedt et al. | Measurement of blood and plasma coagulation time using free oscillating rheometry | |
| Shore-Lesserson | Coagulation monitoring | |
| Abdullah | Shortened activated partial thromboplastin time (APTT): a simple but important marker of hypercoagulable state during acute coronary event | |
| JPH06324048A (en) | Reagent and method for inspecting coagulation efficiency of blood | |
| RU2431841C1 (en) | Diagnostic technique for latent intravascular fibrin formation | |
| RU2789822C1 (en) | Method for optimizing laboratory diagnosis of thrombinemia in patients with covid-19 infection | |
| Nguyen et al. | Sources of errors in coagulation testing |