RU2662082C2 - Photostable pharmaceutical composition for the therapy of foci of bacterial disease - Google Patents
Photostable pharmaceutical composition for the therapy of foci of bacterial disease Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662082C2 RU2662082C2 RU2017134429A RU2017134429A RU2662082C2 RU 2662082 C2 RU2662082 C2 RU 2662082C2 RU 2017134429 A RU2017134429 A RU 2017134429A RU 2017134429 A RU2017134429 A RU 2017134429A RU 2662082 C2 RU2662082 C2 RU 2662082C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pharmaceutical composition
- bacteriopurpurinimide
- methyl ester
- methylnicotinyl
- aqueous solution
- Prior art date
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title abstract description 6
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 title 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 title 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 18
- POCFBDFTJMJWLG-UHFFFAOYSA-N dihydrosinapic acid methyl ester Natural products COC(=O)CCC1=CC(OC)=C(O)C(OC)=C1 POCFBDFTJMJWLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N trappsol cyclo Chemical compound CC(O)COC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)COCC(O)C)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1COCC(C)O ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims abstract 2
- -1 N-methylnicotinyl Chemical group 0.000 claims description 32
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 16
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 10
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 23
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- IWMJORKECAFMRX-USANWJRDSA-N CCCCOC(C)c1c(C)c2cc3nc([C@@H](CCC(=O)OC)[C@@H]3C)c3c4[nH]c(cc5[nH]c(cc1n2)[C@H](C)[C@H]5CC)c(C)c4c(=O)n(CCCC)c3=O Chemical compound CCCCOC(C)c1c(C)c2cc3nc([C@@H](CCC(=O)OC)[C@@H]3C)c3c4[nH]c(cc5[nH]c(cc1n2)[C@H](C)[C@H]5CC)c(C)c4c(=O)n(CCCC)c3=O IWMJORKECAFMRX-USANWJRDSA-N 0.000 description 11
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 11
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 5
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 5
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 5
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 3
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 3
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 3
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 3
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M crystal violet Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C+](C=1C=CC(=CC=1)N(C)C)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 208000008281 urolithiasis Diseases 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010007027 Calculus urinary Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 238000001159 Fisher's combined probability test Methods 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000913 Kidney Calculi Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 206010029148 Nephrolithiasis Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000009911 Urinary Calculi Diseases 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000036592 analgesia Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 201000001883 cholelithiasis Diseases 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000035617 depilation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000006201 parenteral dosage form Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000036211 photosensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
- A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
- A61K47/40—Cyclodextrins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/02—Local antiseptics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к микробиологии и медицине, а именно к фармацевтической композиции, используемой для терапии очагов бактериального поражения.The present invention relates to microbiology and medicine, in particular to a pharmaceutical composition used to treat foci of bacterial damage.
Проблема борьбы с инфекционными заболеваниями, связанная с возрастающей резистентностью штаммов патогенных бактерий, вызывающих хронические заболевания различной локализации, к антибиотикам широкого спектра действия, стала одной из основных проблем современной медицины. В последнее время установлено, что имеющие сложную структуру организованные сообщества патогенных бактерий (так называемые бактериальные биопленки) практически не поддаются терапии с помощью антибиотиков и являются причиной не только хронических инфекционных заболеваний (таких как гнойные раны, трофические язвы), но и возникающих тяжелых осложнений в кардиохирургии, урологии и других областях медицины, при которых в организм пациента вводятся медицинские изделия (катетеры, стенты, искусственные клапаны и суставы). Кроме того, установлено, что одной из причин образования почечных камней и камней желчного пузыря, а также до 80% инфекционных рецидивов мочекаменной болезни являются именно бактериальные пленки (Романова Ю.М. и др. Микробные сообщества на мочевых камнях // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015. №2. С. 20-25).The problem of combating infectious diseases associated with the increasing resistance of strains of pathogenic bacteria that cause chronic diseases of various localization to broad-spectrum antibiotics has become one of the main problems of modern medicine. Recently, it has been established that organized communities of pathogenic bacteria (the so-called bacterial biofilms) with a complex structure are practically not amenable to antibiotic therapy and are the cause of not only chronic infectious diseases (such as purulent wounds, trophic ulcers), but also serious complications arising in cardiac surgery, urology and other areas of medicine, in which medical devices (catheters, stents, artificial valves and joints) are introduced into the patient’s body. In addition, it was found that one of the causes of the formation of kidney stones and gallbladder stones, as well as up to 80% of infectious relapses of urolithiasis, are bacterial films (Romanova Yu.M. et al. Microbial communities on urinary stones // Molecular Genetics, Microbiology and virology. 2015. No. 2. S. 20-25).
Сложная инфраструктура и иерархия бактерий в бактериальной пленке, формирование ею специальных средств жизнеобеспечения и защиты в виде пленочного матрикса приводят к тому, что для лечения таких бактериальных поражений дозы антибиотиков надо было бы увеличивать в сотни раз, что выходит за пределы реальных возможностей организма.The complex infrastructure and hierarchy of bacteria in the bacterial film, the formation by it of special means of life support and protection in the form of a film matrix, lead to the fact that for the treatment of such bacterial lesions, the doses of antibiotics would have to be increased hundreds of times, which goes beyond the real capabilities of the body.
Обнаружено, что для инактивации бактерий и биопленок может быть использована фотодинамическая терапия, причем у бактерий не формируется резистентность к этому способу лечения. Наиболее целесообразно для повышения эффективности фотодинамической инактивации бактерий и биопленок использовать катионные фотосенсибилизаторы, которые позволяют эффективно воздействовать как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии (RU 2282647 C1, RU 2397172 С1). Возбуждение этих фотосенсибилизаторов осуществляется в спектральном диапазоне 670-770 нм.It was found that photodynamic therapy can be used to inactivate bacteria and biofilms, and bacteria do not form resistance to this treatment method. To increase the efficiency of the photodynamic inactivation of bacteria and biofilms, it is most appropriate to use cationic photosensitizers that can effectively act on both gram-positive and gram-negative bacteria (RU 2282647 C1, RU 2397172 C1). The excitation of these photosensitizers is carried out in the spectral range of 670-770 nm.
Известна группа изобретений относящихся к фармацевтической химии, а именно к катионному пурпуринимиду и его применению в качестве фотосенсибилизатора (ФС) для фотодинамической инактивации бактериальных биопленок. Группа изобретений раскрывает катионный пурпуринимид, представляющий собой метиловый эфир 133-N-(N-метилникотинил)пурпуринимида, и его применение в виде кремофорной дисперсии для фотодинамической инактивации бактериальных биопленок (RU 2565450 С1).A known group of inventions related to pharmaceutical chemistry, namely to cationic purpurinimide and its use as a photosensitizer (PS) for the photodynamic inactivation of bacterial biofilms. The group of inventions discloses a cationic purpurinimide, which is a methyl ester of 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) purpurinimide, and its use as a cremophor dispersion for the photodynamic inactivation of bacterial biofilms (RU 2565450 C1).
Самым близким является способ фотодинамической терапии локальных очагов инфекции, включающий сенсибилизацию очагов катионным фотосенсибилизатором и их облучение светом на длине волны поглощения фотосенсибилизатора, используют фотосенсибилизатор с поглощением в спектральном диапазоне 810-850 нм, в качестве фотоактивной субстанции фотосенсибилизатора используют метиловый эфир 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида. При этом для введения субстанции фотосенсибилизатора используется композиция на основе метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил) бактериопурпуринимида и гидрогенизированного касторового масла (Кремофора). Данная композиция используется для приготовления жидкой лекарственной формы метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида в виде эмульсии (RU 2610566 С1).The closest is the method of photodynamic therapy of local foci of infection, including sensitizing the foci with a cationic photosensitizer and irradiating them with light at the absorption wavelength of the photosensitizer, using a photosensitizer with absorption in the spectral range of 810-850 nm, 13 3- N methyl ester is used as the photoactive substance (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide. In this case, a composition based on 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide and hydrogenated castor oil (Cremophor) is used to administer the photosensitizer substance. This composition is used to prepare a liquid dosage form of methyl ester 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide in the form of an emulsion (RU 2610566 C1).
К недостаткам такой композиции следует отнести низкий уровень фотостабильности получаемой жидкой лекарственной формы метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил) бактериопурпуринимида, что приводит к недостаткам, обусловленным коротким сроком хранения вышеуказанной жидкой лекарственной формы, и, как следствие, к существенным ограничениям при проведении терапии. К таким ограничениям относится необходимость приготовления жидкой лекарственной формы метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил) бактериопурпуринимида в виде эмульсии на основе вышеуказанной композиции непосредственно перед проведением терапии. Другим ограничением при использовании вышеуказанной композиции является низкий уровень эффективности терапии очагов бактериального поражения жидкой лекарственной формы метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил) бактериопурпуринимида в виде эмульсии на основе вышеуказанной композиции, обусловленный низким уровнем биодоступности молекул 133-N-(N-метилникотинил) бактериопурпуринимида для вследствие гетерогенности используемой эмульсии.The disadvantages of this composition include the low level of photostability of the obtained liquid dosage form of methyl ester of 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide, which leads to disadvantages due to the short shelf life of the above liquid dosage form, and, as a result, to significant limitations when conducting therapy. Such limitations include the need to prepare a liquid dosage form of 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide methyl ester in the form of an emulsion based on the above composition immediately prior to therapy. Another limitation when using the above composition is the low level of effectiveness of therapy for foci of bacterial lesions of the liquid dosage form of methyl ester of 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide in the form of an emulsion based on the above composition, due to the low bioavailability of 13 3 -N- (N -methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide for due to the heterogeneity of the emulsion used.
Задачей данного изобретения является создание фармацевтической композиции для терапии локальных очагов инфекции, обладающей высоким уровнем фотостабильности, а также высоким уровнем эффективности терапии очагов бактериального поражения.The objective of the invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of local foci of infection with a high level of photostability, as well as a high level of effectiveness of treatment of foci of bacterial damage.
Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что фармацевтическая композиция для терапии локальных очагов инфекции, содержит (% мас.):The solution to this problem is provided by the fact that the pharmaceutical composition for the treatment of local foci of infection contains (% wt.):
Как вариант осуществления изобретения, заявленная фармацевтическая композиция используется для приготовления лекарственных форм для парентерального введения. Заявленную фармацевтическую композицию получают путем:As an embodiment of the invention, the claimed pharmaceutical composition is used for the preparation of parenteral dosage forms. The claimed pharmaceutical composition is obtained by:
- смешения Твина - 80 и воды с получением водного раствора Твина-80,- mixing Tween - 80 and water to obtain an aqueous solution of Tween-80,
- одновременного растворения гидроксипропил-бета-циклодекстрина и метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил) бактериопурпуринимида при равномерном перемешивании и нагревании до температуры 60°С с получением водного раствора Твина-80, гидроксипропил-бета-цикл о декстрина и метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил) бактериопурпуринимида,- simultaneous dissolution of hydroxypropyl-beta-cyclodextrin and 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide methyl ester with uniform stirring and heating to a temperature of 60 ° C to obtain an aqueous solution of Tween-80, hydroxypropyl beta-cycle o dextrin and methyl ether 133-N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide,
- фильтрации водного раствора Твина-80, гидроксипропил-бета-циклодекстрина и метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида с получением водного раствора заявленной фармацевтической композиции,- filtering an aqueous solution of Tween-80, hydroxypropyl-beta-cyclodextrin and methyl ester 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide to obtain an aqueous solution of the claimed pharmaceutical composition,
- высушивания водного раствора заявленной фармацевтической композиции с получением заявленной фармацевтической композиции.- drying an aqueous solution of the claimed pharmaceutical composition to obtain the claimed pharmaceutical composition.
Заявителем экспериментально установлен высокий уровень фотостабильности и эффективности предложенной фармацевтической композиции при терапии локальных очагов инфекции.The applicant experimentally established a high level of photostability and effectiveness of the proposed pharmaceutical composition in the treatment of local foci of infection.
Вышеуказанная композиция обладает высоким уровнем фотостабильности за счет стабилизации метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида молекулами гидроксипропил-бета-циклодекстрина посредством образования водородных и Ван-дер-Ваальсовых связей, а также за счет гидрофобных взаимодействий. При этом композиция обладает высоким уровнем эффективности терапии локальных очагов инфекции за счет высокого уровня биодоступности молекул метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида за счет эффекта, заключающегося в стабилизации метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида молекулами гидроксипропил-бета-циклодекстрина при повышении растворимости заявленной фармацевтической композиции в воде за счет Твина-80 (Полисорбата-80).The above composition has a high level of photostability due to the stabilization of 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide methyl ester by hydroxypropyl-beta-cyclodextrin molecules through the formation of hydrogen and van der Waals bonds, as well as due to hydrophobic interactions. Moreover, the composition has a high level of effectiveness in treating local foci of infection due to the high bioavailability of 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide methyl ester molecules due to the effect of stabilizing 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide methyl ester hydroxypropyl beta-cyclodextrin molecules while increasing the solubility of the claimed pharmaceutical composition in water due to Tween-80 (Polysorbate-80).
Примеры осуществления вышеизложенного изобретенияExamples of the foregoing invention
Пример 1Example 1
Оценка эффективности заявленной фармацевтической композиции при терапии очагов бактериального поражения.Evaluation of the effectiveness of the claimed pharmaceutical composition in the treatment of foci of bacterial damage.
Целью исследования является оценка эффективности заявленной фармацевтической композиции при терапии очагов бактериального поражения.The aim of the study is to evaluate the effectiveness of the claimed pharmaceutical composition in the treatment of foci of bacterial damage.
Заявленная фармацевтическая композиция (Группа 1) представляет собой аморфный порошок от розового цвета, растворимый в воде, практически не растворимый в хлороформе, ацетоне, гексане. Водные растворы композиции прозрачные, не содержат механических включений. В составе композиции содержится Метиловый эфир 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида, гидроксипропил-бета-циклодекстрин (ГПЦД) и Твин-80 (Полисорбат-80).The claimed pharmaceutical composition (Group 1) is an amorphous powder from a pink color, soluble in water, practically insoluble in chloroform, acetone, hexane. Aqueous solutions of the composition are transparent, do not contain mechanical impurities. The composition contains 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide methyl ester, hydroxypropyl beta-cyclodextrin (HCPD) and tween-80 (Polysorbate-80).
Состав композиции (% мас.):The composition (% wt.):
В качестве положительного контроля (Группа 2) использовали композицию, содержащую метиловый эфир 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида, а также гидрогенизированное касторовое масло (Кремофор) в качестве стабилизатора.As a positive control (Group 2), a composition containing 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide methyl ester and hydrogenated castor oil (Cremophor) as a stabilizer was used.
Состав композиции (% мас.):The composition (% wt.):
Для моделирования раневой инфекции, вызванной клиническими изолятами Р. aeruginosa, и S. aureus были использованы мыши Balb/c, приобретенные в питомниках «Столбовая» и «Андреевское», которые поддерживались в виварии ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ в соответствии с Требованиями по содержанию животных МЗ РФ №775. Воду и пищу животные получали ad libitum. В опытах были использованы самцы, весом 18-20 г. Количество животных, используемых в исследовании, по 18 голов в 1 и 2 группе и в 3 группе 6 голов, что является достаточным для полной регистрации изучаемых эффектов.To simulate wound infection caused by clinical isolates of P. aeruginosa and S. aureus, Balb / c mice purchased from Stolbovaya and Andreevskoye nurseries, which were maintained in the vivarium of FSBI FNITsEM im. N.F. Gamalei ”of the Ministry of Health of the Russian Federation in accordance with the requirements for the maintenance of animals of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 775. Animals received water and food ad libitum. In the experiments, males weighing 18-20 g were used. The number of animals used in the study was 18 animals in group 1 and 2 and group 6 in 6 animals, which is sufficient to fully register the effects studied.
Бактериальную культуру выращивали в жидкой среде LB (LB - бульон), при 37°С в течение 18 часов, затем разводили в 100 раз средой LB и культивировали с аэрацией в течение 3-х часов. После окончания периода культивирования культуру центрифугировали (6000 об/мин, 5 мин.), бактериальный осадок ресуспендировали в физиологическом растворе до оптической плотности 0,9 при 600 нм и использовали для заражения животных. Для определения количества КОЕ отбирали аликвоту полученной суспензии (100 мкл), готовили серию десятикратных разведений и по 500 мкл разведенной культуры наносили на чашки Петри с агаром LB. Чашки Петри культивировали при 37°С, через 18 часов производили подсчет колоний. Титр бактерий в суспензии выражали числом КОЕ/мл.The bacterial culture was grown in liquid LB medium (LB - broth), at 37 ° C for 18 hours, then diluted 100 times with LB medium and cultured with aeration for 3 hours. After the cultivation period, the culture was centrifuged (6000 rpm, 5 min), the bacterial sediment was resuspended in physiological saline to an optical density of 0.9 at 600 nm and used to infect animals. An aliquot of the resulting suspension (100 μl) was taken to determine the number of CFU, a series of ten-fold dilutions was prepared, and 500 μl of the diluted culture was applied to Petri dishes with LB agar. Petri dishes were cultured at 37 ° C; after 18 hours, colonies were counted. The bacterium titer in suspension was expressed as CFU / ml.
Для создания экспериментальной раневой инфекции мышам после депиляции участка задней конечности и анестезии были нанесены хирургические раны путем отрезания ножницами участка кожи размером 0,5 см2 на полную глубину. Салфетку из стерильного бинта клали на поверхность раны и закрывали липкой стерильной повязкой OPSITE. Бактериальные суспензии P. aeruginosa или S. aureus в объеме 100 мкл вносили шприцем через повязку и бинт на поверхность раны, в дозах от 1×108 до 1×104 КОЕ/мышь.To create an experimental wound infection in mice, surgical wounds were inflicted to the mice after depilation of the hind limb area and anesthesia by cutting a 0.5 cm 2 skin section with scissors to the full depth. A sterile bandage napkin was placed on the surface of the wound and covered with an OPSITE sticky sterile dressing. Bacterial suspensions of P. aeruginosa or S. aureus in a volume of 100 μl were injected with a syringe through a dressing and bandage onto the surface of the wound, in doses of 1 × 10 8 to 1 × 10 4 CFU / mouse.
На 1 сутки после инфицирования раны животным в Группах 1 и 2 однократно внутривенно вводили соответствующие композиции в различных дозах в пересчете на метиловый эфир 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида. Дизайн экспериментов представлен в таблицах 1 и 2. Также в качестве отрицательного контроля (Группа 3) животным вводили растворитель. ФДТ проводили под обезболиванием. За 4-5 минут до облучения животное было анестезировано. Во время процедуры мышь фиксировали и накрывали защитным экраном из черной фотобумаги. Для облучения животных был использован светодиодный источник СФД-820 с длиной волны спектрального максимума 822 нм и полушириной 35 нм. Формы спектров излучения заявленной фармацевтической композиции и положительного контроля были близки к форме контура спектра абсорбции метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида. Источник формировал на облучаемой поверхности равномерное пятно света квадратной формы размером 1×1 см2. Мощность и плотность мощности контролировалась с помощью измерителя мощности «Coherentlabmax" ("Coherent", USA). Плотность дозы облучения регулировалась изменением длительности экспозиции и вычислялось по формуле:On the 1st day after infection of the wound, the animals in Groups 1 and 2 were injected once intravenously with the corresponding compositions in various doses in terms of 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide methyl ester. The design of the experiments is presented in tables 1 and 2. Also, as a negative control (Group 3), the animals were injected with a solvent. PDT was performed under analgesia. 4-5 minutes before irradiation, the animal was anesthetized. During the procedure, the mouse was fixed and covered with a protective screen made of black photo paper. To irradiate animals, an SFD-820 LED source was used with a wavelength of a spectral maximum of 822 nm and a half-width of 35 nm. The forms of the emission spectra of the claimed pharmaceutical composition and the positive control were close to the shape of the contour of the absorption spectrum of 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide methyl ester. The source formed a uniform 1 × 1 cm 2 square spot of light on the irradiated surface. Power and power density were monitored using a Coherentlabmax power meter (Coherent, USA). The radiation dose density was controlled by changing the exposure time and was calculated by the formula:
D=P×T,D = P × T,
где D [Дж/см2] - плотность дозы,where D [J / cm 2 ] is the dose density,
Р [Вт/см2] - плотность мощности,P [W / cm 2 ] - power density,
Т - время экспозиции, сек.T - exposure time, sec.
После облучения регистрировалось общее состояние животных, наличие отека и струпа в зоне облучения. Рану после облучения закрывали стерильной повязкой Тегадерм, которую меняли ежедневно. Эффективность заявленной фармацевтической композиции (Группа 1) при терапии очагов бактериального поражения оценивалась по статистически достоверному сокращению сроков полной эпителизации раны. Также определяли минимальную эффективную дозу фармацевтической композиции (Группа 1) при плотности световой энергии (дозе света) 15 Дж/см.After irradiation, the general condition of the animals, the presence of edema and scab in the irradiation zone were recorded. After irradiation, the wound was closed with a Tegaderm sterile dressing, which was changed daily. The effectiveness of the claimed pharmaceutical composition (Group 1) in the treatment of foci of bacterial lesions was evaluated by a statistically significant reduction in the time of complete epithelization of the wound. The minimum effective dose of the pharmaceutical composition (Group 1) was also determined at a light energy density (light dose) of 15 J / cm.
На основании полученных данных были рассчитаны следующие критерии: средний срок полной эпителизации раны для всех групп от дня инфицирования, стандартная ошибка средней, доверительный интервал. При сравнении групп использовали метод Стьюдента-Фишера, по которому различия между группами можно считать достоверными при p≤0,05.Based on the data obtained, the following criteria were calculated: average term of complete epithelialization of the wound for all groups from the day of infection, standard error of the mean, confidence interval. When comparing groups, the Student-Fisher method was used, according to which the differences between groups can be considered significant at p≤0.05.
Все данные, полученные в ходе настоящего исследования, были занесены в специальные регистрационные карты.All data obtained in the course of this study were recorded in special registration cards.
Результаты исследования приведены в таблицах 3 и 4.The results of the study are shown in tables 3 and 4.
В группах мышей, подвергнутых ФДТ, общее состояние удовлетворительное. В зоне облучения отеков не обнаружено, с первого дня лечения раневой экссудат не выделяется. Состояние контрольных мышей (Группы 2 и 3) также удовлетворительное, но в зоне раны обнаружен отек и гной.In groups of mice subjected to PDT, the general condition is satisfactory. No edema was detected in the irradiation zone; no wound exudate was released from the first day of treatment. The condition of the control mice (Groups 2 and 3) is also satisfactory, but edema and pus were found in the wound area.
В результате проведенных исследований была выявлена минимальная эффективная доза фармацевтической композиции, составляющая:As a result of the studies, the minimum effective dose of the pharmaceutical composition was identified, comprising:
Проведенные in vivo на модели инфицированных ран у белых мышей исследования, целью которых было оценка эффективности заявленной фармацевтической композиции при терапии очагов бактериального поражения, показали следующее:Studies conducted in vivo on a model of infected wounds in white mice studies, the purpose of which was to evaluate the effectiveness of the claimed pharmaceutical composition in the treatment of foci of bacterial lesions, showed the following:
- заявленная фармацевтическая композиция при однократном внутривенном введении эффективна при раневых инфекциях, вызванных как S. aureus, так и P. aeruginosa, что выражается в достоверном сокращении времени заживления ран у животных, подвергнутых терапии, по сравнению с положительным и отрицательным контролем; заявленная фармацевтическая композиция эффективна при терапии очагов бактериального поражения;- the claimed pharmaceutical composition with a single intravenous administration is effective in wound infections caused by both S. aureus and P. aeruginosa, which is expressed in a significant reduction in the healing time of wounds in animals treated, compared with the positive and negative control; the claimed pharmaceutical composition is effective in the treatment of foci of bacterial damage;
- оптимальная доза заявленной фармацевтической композиции для S. aureus составила 10 мг/кг, а для P. aeruginosa - 20 мг/кг.- the optimal dose of the claimed pharmaceutical composition for S. aureus was 10 mg / kg, and for P. aeruginosa - 20 mg / kg.
Пример 2Example 2
Исследование фотостабильности фармацевтической композиции (Образец 1) для терапии очагов бактериального поражения следующего состава (% мас.):The study of the photostability of the pharmaceutical composition (Sample 1) for the treatment of foci of bacterial lesions of the following composition (% wt.):
Навеску 35,8 мг, содержащую 0,5 мг активного вещества, растворили в 1 мл 0,9% хлорида натрия. Композиция легко растворяется в хлориде натрия с образованием раствора розового цвета. Концентрация активного вещества - 0,5 мг/мл.A portion of 35.8 mg, containing 0.5 mg of the active substance, was dissolved in 1 ml of 0.9% sodium chloride. The composition is readily soluble in sodium chloride to form a pink solution. The concentration of the active substance is 0.5 mg / ml.
В качестве положительного контроля (Образец 2) в 1 мл 0,9% хлорида натрия растворили 40,5 мг композиции, содержащей 0,5 мг активного вещества (Метиловый эфир 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида), а также 40 мг гидрогенизированного касторового масла (Кремофор) в качестве стабилизатора. Концентрация активного вещества - 0,5 мг/мл.As a positive control (Sample 2), 40.5 mg of a composition containing 0.5 mg of active substance (13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide methyl ester) was dissolved in 1 ml of 0.9% sodium chloride, as well as 40 mg hydrogenated castor oil (Cremophor) as a stabilizer. The concentration of the active substance is 0.5 mg / ml.
Оценку фотостабильности проводили методом флуоресцентной спектроскопии. Спектры флуоресценции регистрировали на лазерной установке для флуоресцентной диагностики и контроля за фото динамической терапией «ЛЭСА-06». Спектры регистрировали в 0,9% растворе хлорида натрия и 3% растворе ЧСА. Концентрация по активному веществу при измерении спектров флуоресценции составляла 0,1 мг/мл. Флуоресценцию измеряли ex tempore, через 1, 2 и 4 часа. Интенсивность флуоресценции представлена в таблице 5.Evaluation of photostability was performed by fluorescence spectroscopy. Fluorescence spectra were recorded on a laser setup for fluorescence diagnostics and monitoring of LESA-06 photo-dynamic therapy. Spectra were recorded in a 0.9% sodium chloride solution and a 3% HSA solution. The concentration of the active substance in measuring the fluorescence spectra was 0.1 mg / ml. Fluorescence was measured ex tempore after 1, 2, and 4 hours. The fluorescence intensity is presented in table 5.
Из полученных в результате исследования данных можно сделать вывод о повышенном уровне фотостабильности заявленной фармацевтической композиции по сравнению с контролем в виде композиции, содержащей Кремофор.From the data obtained as a result of the study, we can conclude about the increased level of photostability of the claimed pharmaceutical composition compared to the control in the form of a composition containing Cremophor.
Пример 3Example 3
Оценка эффективности инактивации биопленок путем использования заявленной фармацевтической композиции.Evaluation of the effectiveness of inactivation of biofilms by using the claimed pharmaceutical composition.
Целью исследования является оценка эффективности заявленной фармацевтической композиции при инактивации биопленок.The aim of the study is to evaluate the effectiveness of the claimed pharmaceutical composition in the inactivation of biofilms.
Заявленная фармацевтическая композиция (ФК) представляет собой аморфный порошок розового цвета, растворимый в воде, практически не растворимый в хлороформе, ацетоне, гексане. Водные растворы продукта прозрачные, не содержат механических включений. В составе продукта содержится Метиловый эфир 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида, гидроксипропил-бета-циклодекстрин (ГПЦЦ) и Твин-80 (Полисорбат-80).The claimed pharmaceutical composition (FC) is an amorphous pink powder, soluble in water, practically insoluble in chloroform, acetone, hexane. Aqueous solutions of the product are transparent, do not contain mechanical impurities. The product contains 13 3 -N- (N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide methyl ester, hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HPCC) and Tween-80 (Polysorbate-80).
Состав композиции (% мас.):The composition (% wt.):
Бактерии и их культивирование.Bacteria and their cultivation.
Использовали эталонные штаммы бактерий Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa (из международных и региональных коллекций) и изоляты из образцов клинического материала из коллекции ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Культуры бактерий пересевали каждый месяц, делая не более 5 пассажей с агара на агар, после чего использовали исходную культуру со среды хранения.Used reference strains of bacteria Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa (from international and regional collections) and isolates from samples of clinical material from the collection of them. N.F. Gamalei. Bacterial cultures were reseeded every month, making no more than 5 passages from agar to agar, after which the initial culture from the storage medium was used.
Тест-штаммы бактерий хранили при температуре -74°С в среде LB с глицерином 1:1.Bacterial test strains were stored at a temperature of -74 ° C in LB medium with 1: 1 glycerol.
Питательные среды:Culture media:
Для приготовления питательного агара LB добавляли 1% агара.To prepare LB nutrient agar, 1% agar was added.
Фосфатно-солевой буфер 0,01 М (ЭКО сервис, Россия) (в таблетках)0.01 M phosphate buffered saline (IVF service, Russia) (tablets)
Проверка способности бактерий к образованию биопленокTesting the ability of bacteria to form biofilms
Для изучения способности микроорганизмов формировать биопленки ночную культуру бактерий, выращенную в бульоне LB, в разведении 1:100 в LB вносили по 100 мкл в 4 лунки 96-ти луночного плоскодонного полистиролового планшета. После 24 ч инкубации в термостате при 37°С во влажной камере интенсивность роста культуры оценивали в фотометре при длине волны 540 нм, затем планктонные клетки удаляли, в лунки вносили по 100 мкл 0,1% раствора кристалл-виолета для окраски сформировавшихся биопленок в течение 1 часа. После окраски биопленки трижды промывали дистиллированной водой и в лунки вносили по 100 мкл 96% этанола для экстракции связавшегося с биопленками красителя. По истечении 1 часа интенсивность экстрагированного спиртом красителя измеряли на фотометре при длине волны 540 нм. Вычисляли среднее арифметическое значение из 4 лунок. Контролем служили лунки, заполненные LB-бульоном. Превышение оптической плотности кристалл-виолета над контролем свидетельствовало об образовании бактериями биопленок.To study the ability of microorganisms to form biofilms, an overnight bacterial culture grown in LB broth, at a dilution of 1: 100, 100 μl in 4 wells of a 96-well flat-bottomed polystyrene plate was added to LB. After 24 hours of incubation in a thermostat at 37 ° C in a humid chamber, the growth rate of the culture was evaluated in a photometer at a wavelength of 540 nm, then plankton cells were removed, 100 μl of a 0.1% crystal-violet solution was added to the wells to stain the formed biofilms for 1 hour After staining, the biofilms were washed three times with distilled water and 100 μl of 96% ethanol were added to the wells to extract the dye bound to the biofilms. After 1 hour, the intensity of the dye extracted with alcohol was measured on a photometer at a wavelength of 540 nm. The arithmetic average of 4 wells was calculated. Controls were filled with LB broth wells. The excess of the optical density of the crystal-violet over the control indicated the formation of biofilms by the bacteria.
Выращивание ночной культуры тест-микроорганизмовGrowing night culture of test microorganisms
В стерильный LB-бульон засевали культуру бактерий с чашки Петри и выращивали в термостате при 37°С с интенсивной аэрацией 18 ч.A bacterial culture was seeded into a sterile LB broth from a Petri dish and grown in an incubator at 37 ° C with intensive aeration of 18 hours.
Выращивание биопленок бактерий на стеклянных пластинкахGrowing bacteria biofilms on glass plates
Для определения фотоинактивации бактерий в биопленках использовали плоские стеклянные пластинки и механическое разрушение биопленок Вортексом. Стеклянные пластинки 8×12 мм толщиной 1 мм стерилизовали в 70% этаноле и подсушивали в чашке Петри 90 мм диаметром в стерильных условиях (в ламинарном боксе). Ночную культуру бактерий разводили 1:100 бульоном LB и 22 мл разведенной культуры переносили в чашку со стерильными пластинками. Чашку инкубировали при 37°С в течение 20 ч при покачивании 10 раз в минуту, угол наклона 4°.To determine the photoinactivation of bacteria in biofilms, flat glass plates and mechanical destruction of biofilms by Vortex were used. Glass plates of 8 × 12 mm with a thickness of 1 mm were sterilized in 70% ethanol and dried in a 90 mm diameter Petri dish under sterile conditions (in a laminar box). An overnight bacterial culture was diluted 1: 100 with LB broth and 22 ml of the diluted culture was transferred to a dish with sterile plates. The cup was incubated at 37 ° C for 20 hours with shaking 10 times per minute, the angle of inclination 4 °.
Пластинки переносили в лунки двух 24-луночных планшетов (один для освещения, другой для неосвещенного контроля). Лунки заполняли 400 мкл ФСБ и через 1 мин жидкость отбирали аспиратором. Следующие процедуры проводили при затемнении.The plates were transferred to the wells of two 24-well plates (one for illumination, the other for unlit control). Wells were filled with 400 μl of PBS and after 1 min the fluid was taken with an aspirator. The following procedures were performed with dimming.
ФотосенсибилизацияPhotosensitivity
В каждую лунку вносили по 400 мкл раствора заявленной фармацевтической композиции определенной концентрации из двукратных разведений, в контроле - 400 мкл ФСБ. Планшеты инкубировали в течение 1 ч в темноте при 37°С. Затем жидкость отбирали аспиратором и в лунки добавляли по 400 мкл ФСБ.400 μl of a solution of the claimed pharmaceutical composition of a certain concentration from double dilutions were added to each well; in the control, 400 μl of FSB. The plates were incubated for 1 h in the dark at 37 ° C. Then, the liquid was taken with an aspirator and 400 μl of PBS were added to the wells.
ОблучениеIrradiation
Для облучения использовали светодиодный источник СФД-820 с длиной волны спектрального максимума 821 нм и полушириной 35 нм. Форма спектра излучения была близкой к форме контура спектра поглощения фармацевтической композиции. Источник формировал на облучаемой поверхности равномерное пятно света круглой формы размером 8×8 см. Мощность и плотность мощности контролировалась с помощью измерителя мощности «Coherent labmax" ("Coherent ",USA).For irradiation, an SFD-820 LED source with a wavelength of a spectral maximum of 821 nm and a half-width of 35 nm was used. The shape of the radiation spectrum was close to the shape of the contour of the absorption spectrum of the pharmaceutical composition. The source formed a uniform 8 × 8 cm round spot of light on the irradiated surface. The power and power density were monitored using a Coherent labmax power meter (Coherent, USA).
Разрушение биопленокThe destruction of biofilms
Пластинки и жидкость из лунок переносили в пробирки «Eppendorf», биопленку с обеих сторон стекла снимали одноразовыми гинекологическими зондами, щеточки зондов отрезали и оставляли в пробирках. Пробирки обрабатывали на Вортексе 10 мин на максимальном режиме.The plates and the fluid from the wells were transferred to Eppendorf tubes, the biofilm was removed from both sides of the glass with disposable gynecological probes, the probe brushes were cut off and left in the tubes. The tubes were treated at Vortex 10 min at maximum speed.
Высев и учет результатаSowing and accounting of the result
Из каждой пробирки отбирали по 30 мкл для приготовления пяти десятикратных разведений в микротитровальном планшете, в лунки которого был налит ФСБ по 270 мкл. На чашку Петри диаметром 90 мм, разделенную на 6 секторов высевали по 20 мкл из каждой лунки, начиная с 5 разведения и заканчивая неразведенной пробой. Таким образом производили высев с каждой пластинки на 3 чашки. Чашки инкубировали в темноте при 37°С в течение 20 ч, затем производили подсчет колоний, в разведениях, где это возможно, и вычисляли титр КОЕ/мл по формуле:30 μl were taken from each tube to prepare five ten-fold dilutions in a microtiter plate, in the wells of which FSB 270 μl was poured. On a Petri dish with a diameter of 90 mm, divided into 6 sectors, 20 μl were sown from each well, starting from 5 dilutions and ending with an undiluted sample. Thus, 3 plates were plated from each plate. The cups were incubated in the dark at 37 ° C for 20 hours, then the colonies were counted, in dilutions, where possible, and the CFU / ml titer was calculated by the formula:
N=C*50*10x/3,N = C * 50 * 10 x / 3,
где N - число КОЕ в 1 мл,where N is the number of CFU in 1 ml,
С - сумма колоний на 3 чашках в одном разведении,C is the sum of the colonies on 3 plates in one dilution,
x - номер разведения.x is the dilution number.
Результатыresults
Опыты по фотоинактивации бактерий в биопленках были проведены на 4 штаммах грамположительных S. aureus и 4 грамотрицательных P. aeruginosa. Результаты приведены в таблицах 6 и 7 для S. aureus (с облучением и без) и в таблицах 8 и 9 для P. aeruginosa (с облучением и без него).Experiments on photoinactivation of bacteria in biofilms were performed on 4 strains of gram-positive S. aureus and 4 gram-negative P. aeruginosa. The results are shown in tables 6 and 7 for S. aureus (with and without radiation) and in tables 8 and 9 for P. aeruginosa (with and without radiation).
Из таблиц 6 и 7 следует, что штаммы S. aureus в составе биопленок чувствительны к фотодинамическому воздействию и при фотосенсибилизации раствором фармацевтической композиции в концентрации 1000 мкМ облучение приводит к снижению титра бактерий (КОЕ/мл) более, чем на 99%, по сравнению с контролем без ГЛФ. Инкубация бактериальных биопленок с растворами ГЛФ в темноте не вызывает снижения титра КОЕ/мл. Штаммы 963 и К-160 более чувствительны к фотоинактивации при действии изучаемой фармацевтической композиции.From tables 6 and 7 it follows that S. aureus strains in the biofilms are sensitive to photodynamic effects and when photosensitized with a solution of the pharmaceutical composition at a concentration of 1000 μM, irradiation leads to a decrease in bacterial titer (CFU / ml) of more than 99%, compared with control without GLF. Incubation of bacterial biofilms with GLF solutions in the dark does not cause a decrease in CFU / ml titer. Strains 963 and K-160 are more sensitive to photoinactivation under the action of the studied pharmaceutical composition.
Как следует из данных таблиц 8 и 9, штаммы P. aeruginosa значительно различаются по чувствительности к фотоинактивации при действии изучаемой фармацевтической композиции: стандартные штаммы РАО и РА 103 в составе биопленок не чувствительны к испытанным концентрациям ГЛФ и дозам света, при фотодинамическом воздействии их значения КОЕ/мл снижаются менее чем на 99%. Эти штаммы являются мукоидными и отличаются повышенной продукцией слизи, что, по-видимому, и является причиной их устойчивости. Однако, клинические изоляты, множественно резистентные к антибиотикам и немукоидные, в составе биопленок чувствительны к фотоинактивации при концентрации ГЛФ 1000 мкМ и дозе света 100 Дж/см2.As follows from the data in Tables 8 and 9, P. aeruginosa strains significantly differ in sensitivity to photoinactivation under the action of the studied pharmaceutical composition: standard RAO and RA 103 strains in the composition of biofilms are not sensitive to tested concentrations of GLF and doses of light, with photodynamic effects of their CFU values / ml decrease by less than 99%. These strains are mucoid and are characterized by increased production of mucus, which, apparently, is the reason for their stability. However, clinical isolates that are multi-resistant to antibiotics and non-mucoid, as part of biofilms, are sensitive to photoinactivation at a concentration of 1000 μM GLF and a light dose of 100 J / cm 2 .
На основании проведенных экспериментов сделан вывод: фотодинамическое воздействие с исследуемой фармацевтической композицией обладает бактерицидным действием на все испытанные штаммы грамположительных бактерий S. aureus в виде биопленок; стандартные мукоидные штаммы грамотрицательных бактерий P. aeruginosa в виде биопленок устойчивы к испытанным концентрациям фармацевтической композиции и дозам света, однако, клинические изоляты, множественно резистентные к антибиотикам и немукоидные, чувствительны в виде биопленок к фотоинактивации при концентрации ГЛФ 1000 мкМ и дозе света 100 Дж/см2 при этом значение КОЕ/мл снижается более, чем на 99%.Based on the experiments, the conclusion was made: the photodynamic effect with the studied pharmaceutical composition has a bactericidal effect on all tested strains of gram-positive bacteria S. aureus in the form of biofilms; standard mucoid strains of gram-negative bacteria P. aeruginosa in the form of biofilms are resistant to tested concentrations of the pharmaceutical composition and doses of light, however, clinical isolates that are multiply resistant to antibiotics and non-mucoid are sensitive in the form of biofilms to photoinactivation at a concentration of 1000 μM GLF and a light dose of 100 J / cm 2 while the value of CFU / ml is reduced by more than 99%.
Из приведенных выше данных можно сделать вывод о высокой эффективности инактивации биопленок путем использования заявленной фармацевтической композиции.From the above data, we can conclude that the high efficiency of inactivation of biofilms by using the claimed pharmaceutical composition.
Пример 4Example 4
Получение фармацевтической композиции для терапии локальных очагов инфекции.Obtaining a pharmaceutical composition for the treatment of local foci of infection.
В мерной колбе объемом 100 мл растворили 0, 94 г Твина-80 в 100 мл воды очищенной с получением водного раствора Твина - 80. Затем в полученный раствор одновременно добавили 25 г гидроксипропил-бета-циклодекстрина и 0,376 г метилового эфира 133-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида при равномерном перемешивании и нагревании до температуры 60°С до полного растворения компонентов. Затем полученный водный раствор подвергли стерилизующей фильтрации и высушиванию досуха методом лиофильной сушки с получением фармацевтической композиции следующего состава (% мас.):In a 100 ml volumetric flask, 0.9 g of Tween-80 was dissolved in 100 ml of purified water to obtain an aqueous Tween-80 solution. Then, 25 g of hydroxypropyl-beta-cyclodextrin and 0.376 g of 133-N- methyl ester were simultaneously added to the resulting solution. N-methylnicotinyl) bacteriopurpurinimide with uniform stirring and heating to a temperature of 60 ° C until the components are completely dissolved. Then, the resulting aqueous solution was subjected to sterilizing filtration and drying to dryness by freeze drying to obtain a pharmaceutical composition of the following composition (% wt.):
Таким образом, полученная фармацевтическая композиция обладает высоким уровнем фотостабильности и эффективности для терапии локальных очагов бактериального поражения.Thus, the resulting pharmaceutical composition has a high level of photostability and effectiveness for the treatment of local foci of bacterial damage.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017134429A RU2662082C2 (en) | 2017-10-03 | 2017-10-03 | Photostable pharmaceutical composition for the therapy of foci of bacterial disease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017134429A RU2662082C2 (en) | 2017-10-03 | 2017-10-03 | Photostable pharmaceutical composition for the therapy of foci of bacterial disease |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017134429A RU2017134429A (en) | 2017-11-30 |
| RU2017134429A3 RU2017134429A3 (en) | 2018-06-06 |
| RU2662082C2 true RU2662082C2 (en) | 2018-07-23 |
Family
ID=60580929
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017134429A RU2662082C2 (en) | 2017-10-03 | 2017-10-03 | Photostable pharmaceutical composition for the therapy of foci of bacterial disease |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2662082C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7501509B2 (en) * | 2002-06-27 | 2009-03-10 | Health Research, Inc. | Water soluble tetrapyrollic photosensitizers for photodynamic therapy |
| US9303165B2 (en) * | 2011-05-31 | 2016-04-05 | North Carolina State University | Bacteriochlorin imides |
| RU2610566C1 (en) * | 2015-09-17 | 2017-02-13 | Сергей Сергеевич Брусов | Method for photodynamic therapy of local foci of infection |
-
2017
- 2017-10-03 RU RU2017134429A patent/RU2662082C2/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7501509B2 (en) * | 2002-06-27 | 2009-03-10 | Health Research, Inc. | Water soluble tetrapyrollic photosensitizers for photodynamic therapy |
| US9303165B2 (en) * | 2011-05-31 | 2016-04-05 | North Carolina State University | Bacteriochlorin imides |
| RU2610566C1 (en) * | 2015-09-17 | 2017-02-13 | Сергей Сергеевич Брусов | Method for photodynamic therapy of local foci of infection |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017134429A (en) | 2017-11-30 |
| RU2017134429A3 (en) | 2018-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hanakova et al. | The application of antimicrobial photodynamic therapy on S. aureus and E. coli using porphyrin photosensitizers bound to cyclodextrin | |
| ES2280533T3 (en) | BIOLOGICALLY ACTIVE METHYLENE BLUE DERIVATIVES. | |
| Wardlaw et al. | Photodynamic therapy against common bacteria causing wound and skin infections | |
| EP3003375B1 (en) | Method of applying a composition and pharmaceutical composition with a regimen of administering it | |
| JP2011529898A (en) | Compositions and methods for the treatment of MRSA | |
| Wu et al. | Regulating the bacterial oxygen microenvironment via a perfluorocarbon-conjugated bacteriochlorin for enhanced photodynamic antibacterial efficacy | |
| CN106620695B (en) | Photosensitive medicinal preparation for photodynamic sterilization and application thereof | |
| RU2455355C1 (en) | Pseudomonas aeruginosa BACTERIOPHAGE STRAIN USED AS BASE FOR PREPARING ASEPTIC FOR P AERUGINOSA | |
| Vallejo et al. | An insight into the role of non-porphyrinoid photosensitizers for skin wound healing | |
| Solovieva et al. | Combined laser and photodynamic treatment in extensive purulent wounds | |
| Li et al. | Chitosan-based composite film dressings with efficient self-diagnosis and synergistically inflammation resolution for accelerating diabetic wound healing | |
| Yin et al. | Antimicrobial photodynamic therapy involving a novel photosensitizer combined with an antibiotic in the treatment of rabbit tibial osteomyelitis caused by drug-resistant bacteria | |
| Huang et al. | MXene‐Decorated Nanofibrous Membrane with Programmed Antibacterial and Anti‐Inflammatory Effects via Steering NF‐κB Pathway for Infectious Cutaneous Regeneration | |
| JP4366528B2 (en) | Indoor disinfection method | |
| RU2662082C2 (en) | Photostable pharmaceutical composition for the therapy of foci of bacterial disease | |
| Tao et al. | Facile antibacterial materials with turbine-like structure for P. aeruginosa infected scald wound healing | |
| CN110790258A (en) | Nano tinidazole carbon dots and preparation method and application thereof | |
| RU2610566C1 (en) | Method for photodynamic therapy of local foci of infection | |
| CN113197839A (en) | Nano fiber for treating bacterial infection diabetic wound surface, preparation method and application thereof | |
| TWI736995B (en) | Novel small molecule compounds and their uses | |
| RU2606834C2 (en) | Gel-photosensitizer for photodynamic therapy | |
| CN108042544A (en) | A kind of toluidines blue light dynamic pasteurization and promotion healing composition and its application | |
| RU2795607C1 (en) | Method for studying the control of staphylococcus aureus biofilms with a medicinal product based on silver nanoparticles and dimethyl sulfoxide | |
| RU2670201C1 (en) | Photosensitizers for photodynamic inactivation of bacteria, including in biofilms | |
| RU2822551C2 (en) | Method of reducing biofilm formation by streptococcus pyogenes using a preparation containing silver nanoparticles |