RU2661114C1 - Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий in vitro - Google Patents
Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- RU2661114C1 RU2661114C1 RU2017140664A RU2017140664A RU2661114C1 RU 2661114 C1 RU2661114 C1 RU 2661114C1 RU 2017140664 A RU2017140664 A RU 2017140664A RU 2017140664 A RU2017140664 A RU 2017140664A RU 2661114 C1 RU2661114 C1 RU 2661114C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tooth
- biofilm
- substrate
- silicone
- teeth
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241000605986 Fusobacterium nucleatum Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000605862 Porphyromonas gingivalis Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000194023 Streptococcus sanguinis Species 0.000 claims abstract description 6
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 16
- 210000004262 dental pulp cavity Anatomy 0.000 claims description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 6
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000003672 processing method Methods 0.000 claims description 5
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000001114 tooth apex Anatomy 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002978 dental impression material Substances 0.000 claims description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 4
- 208000004480 periapical periodontitis Diseases 0.000 claims description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 3
- 208000006860 root resorption Diseases 0.000 claims description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 210000004268 dentin Anatomy 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N Menadione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C)=CC(=O)C2=C1 MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 2
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000606749 Aggregatibacter actinomycetemcomitans Species 0.000 description 1
- 239000000120 Artificial Saliva Substances 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000000913 Kidney Calculi Diseases 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029148 Nephrolithiasis Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241001135221 Prevotella intermedia Species 0.000 description 1
- 241001135235 Tannerella forsythia Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M crystal violet Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C+](C=1C=CC(=CC=1)N(C)C)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003298 dental enamel Anatomy 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 229960001235 gentian violet Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000009343 monoculture Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 210000004261 periodontium Anatomy 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N triacetic acid Chemical compound CC(=O)CC(=O)CC(O)=O ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012711 vitamin K3 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011652 vitamin K3 Substances 0.000 description 1
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004018 waxing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Dental Tools And Instruments Or Auxiliary Dental Instruments (AREA)
Abstract
Изобретение относится к микробиологии. Предложен способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий in vitro. Способ включает внесение на подложку бактериальной взвеси чистых культур Streptococcus sanguinis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis в концентрации 106-108 КОЕ/мл. Подложку помещают в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, который помещают в шейкер-термостат при 37°C. В качестве подложки используют человеческие удаленные однокорневые зубы, предварительно подготовленные, с минимальным размером 19 мм. Культивацию проводят в течение двух недель. Изобретение обеспечивает воссоздание многовидовой смешанной биопленки в тканях зуба в среде, приближенной к условиям развития периодонтита in vivo, для исследования эффективности методов хемомеханической обработки зубов. 12 ил.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и стоматологии, и предназначено для формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro.
Известно, что бактерии, находящиеся в составе микробных сообществ и, в частности, биопленок, становятся менее доступными для действия различных внешних факторов, включая антибиотики, пестициды, биоциды и др. Процесс роста и формирования биопленок зависит от характеристики раствора, свойств носителя, состава популяции микроорганизмов и разнообразия адгезивных механизмов при использовании различных поверхностей. В медицине, а в частности в стоматологии, формирование такого рода моделей является очень актуальной задачей для исследования различных способов воздействия на микробной биопленку в корневых каналах, так как модель эта сформирована в максимальном приближении к естественным условиям.
Известны способы формирования биопленки in vitro в аэробных (но не анаэробных) условиях, которые предполагают нанесение планктонных форм в виде бактериальной взвеси на пластиковые или стеклянные поверхности, погруженные в жидкую (полужидкую) питательную среду или на плотной питательной среде, погруженной в жидкую среду (двухфазная питательная среда).
Так, например, из уровня техники известен способ моделирования образования биопленок холерных вибрионов в условиях эксперимента, включающий формирование биопленок на твердом носителе, отличающийся тем, что биопленку создают на покровных стеклах, установленных наклонно под углом 10-12° к вертикальной оси в количестве 8-9 штук, которые помещают между витками пружинообразного приспособления, размещенного внутри емкости объемом 100 мл, затем емкость заполняют экспериментальной средой в объеме 40-50 мл до полного погружения покровных стекол, добавляют в емкость суспензию холерных вибрионов и инкубируют при конечной концентрации холерных вибрионов в n×108 КОЕ/мл с доведением до минимального порога чувствительности 0,1 КОЕ/мл при комнатной температуре (Патент РФ №2559546 от 10.08.2015).
Известен способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на поверхности твердой фазы, включающий окрашивание сформировавшихся биопленок красителем с последующим экстрагированием связавшегося с биопленками красителя этиловым спиртом и оценкой интенсивности окрашивания спиртового раствора на фотометре, отличающийся тем, что в качестве твердой фазы используют биологический субстрат - измельченные и простерилизованные натуральные почечные камни различной химической природы (Патент РФ №2461631 от 20.09.2012).
Известен способ оценки взаимного влияния микроорганизмов методом совместного культивирования с контрольным высевом и определением численности тест-культуры и изучаемого штамма по количеству выросших колоний на плотной питательной среде (Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях. Дисс. к.м.н. Оренбург, 2009).
Известен способ оценки характера межмикробных взаимодействий, отличающийся тем, что тестируемые моно- и смешанные культуры микроорганизмов культивируют в лунках полистиролового планшета на LB-бульоне до формирования биопленки, осуществляют промывание сформированных биопленок, окрашивание в течение 45 мин в темноте красителем, в качестве которого используют 0,1% раствор генцианвиолета, трехкратное промывание биопленок с последующим высушиванием планшета, краситель элюируют спиртом и определяют оптическую плотность элюатов на спектрофотометре, усредненные показатели оптической плотности элюата из смешанных биопленок сравнивают с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур и при отсутствии достоверных отличий делают вывод о нейтральном характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки меньше суммы показателей монопленок, делают вывод об антагонистическом характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки больше суммы показателей монопленок, делают вывод о синергическом характере в межмикробном взаимодействии (Патент РФ №2448161, 20.04.2012).
Все эти способы моделирования не позволяют воссоздать анаэробные условия и потому не пригодны для изучения такой области стоматологической микробиологии, как внутрикорневая биопленка (эндопатогены), которая по современным данным является этиологическим фактором апикального периодонтита.
Весьма относительные условия анаэробиоза (отсутствия кислорода в среде) удалось создать при использовании полужидких редуцирующих сред, в частности пулированной слюны, на которой были получены моно- и мультивидовые биопленки, растущие на гидроксиапатите (Guggenheim В et al., 2009). Инновационные подходы в искусственной слюне разработали Peyyala R. с соавторами, которые применили подобные модели биопленок для демонстрации различий цитокинового и хемокинового ответов на различные бактериальные биопленки.
Однако во всех перечисленных способах моделирования биопленок отсутствует решение двух важнейших моментов, которые непосредственно связаны с патологией полости рта:
1. Биопленки в ротовой полости формируются при движении жидкой фазы, то есть в условиях текучей среды.
2. Возбудителями пародонтита являются анаэробные бактерии, а создание анаэробиоза не предусмотрено в предложенных моделях.
Одним из важнейших условий перехода планктонных бактерий из взвеси в биопленкообразующую колонию считается истощение среды. Однако в естественных природных условиях (в том числе, в организме человека) биопленка формируется в условиях омывания жидкими секретами, то есть в условиях текучих сред. Это обеспечивает дифференцировку клеточных слоев биопленки и постоянный приток питательных веществ и отток продуктов метаболизма. При патологии пародонта биопленка является смешанной (мультивидовой). Однако воссоздание этого условия было технически трудновыполнимо при попытке получения биопленки из анаэробных бактерий, ибо не удавалось обеспечить движение жидкости (питательной среды) в анаэростатах, используемых для культивирования анэробных бактерий, или создать необходимый температурный режим 37°С.
Так из уровня техники известен способ формирования смешанной биоплёнки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro (Патент РФ №2619169, 20.11.2015 г.), являющийся наиболее близким по технической сущности к предлагаемому нами способу и принятый нами за прототип.
Данный способ осуществляется следующим образом. Бактериальную взвесь из чистой культуры, разведенной в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне (BHI, LIM или АС), содержащей 0,01% менадиона и 0,1% гемина - стимуляторов роста анаэробных бактерий, до концентрации 106-108 КОЕ/мл помещать на подложку из полимерных материалов (метилметакрилат, полиуретан, триацетат или плотную агаровую питательную среду) в замкнутой емкости, которая помещается в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа, который, в свою очередь, помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий возвратно-поступательные движения в заданном режиме, в диапазоне 60-120 движений в минуту при постоянной температуре культивирования биопленки 37°С; и при этом формирование смешанной биопленки осуществляется в несколько этапов, на начальном производится внесение микроба с высокой адгезивной активностью - Streptococcussanguinis с последующим культивированием 48 часов, на следующем этапе проводят внесение микроба-промежуточного колонизатора - Fusobacteriumnucleatum с культивированием 72 часа, и на заключительном этапе внесение микроба пародонтопатогена Porphyromonasgingivalis (или Aggregatibacteractinomycetemcomitans, или Tannerellaforsythia, или Prevotellaintermedia, или их комбинации) с последующим культивированием в течение 5 суток для получения смешанной биопленки.
Главным недостатком такого метода является отсутствие возможности исследовать эффективность способов хемомеханической обработки корневых каналов, так как все они нуждаются в воссоздании системы корневых каналов.
Таким образом, существует потребность в способе формирования смешанной биопленки эндопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro, лишенном вышеуказанных недостатков.
Техническим результатом предлагаемого способа является максимально близкое воссоздание многовидовой смешанной бактериальной биопленки непосредственно в тканях зуба в среде, приближенной к условиям развития периодонтита in vivo с возможностью симуляции закрытости системы корневого канала in vivo при дальнейшем тестировании способов хемомеханической обработки на полученной модели. Возможности исследования воздействия на микробную биопленку, сформированную предлагаемым способом, очень широки, а их результаты являются достоверными, так как данная модель по сравнению с известными наиболее точно отражает развитие многовидовой биопленки непосредственно в условиях зубных тканей.
Для достижения указанного технического результата предлагается способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий in vitro, включающий внесение на подложку в замкнутой емкости бактериальной взвеси чистых культур Streptococcus sanguinis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis и их культивацию, при этом бактериальную взвесь разводят в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне BHI, до концентрации 106-108 КОЕ/мл, подложку помещают в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа, который, в свою очередь, помещают в шейкер-термостат, обеспечивающий возвратно-поступательные движения в диапазоне 120 движений в минуту, при температуре 37°С с получением смешанной биопленки, отличающийся тем, что в качестве подложки выступают человеческие удаленные однокорневые зубы с минимальным размером 19 мм, сохраняемые в растворе 0,01% гипохлорита натрия непосредственно до проведения формирования биопленки, проводят стандартную подготовку корневого канала и измерение его длины для вхождения любого инструмента, позволяющую обрабатывать только канал, не выходя за его границы; зуб разделяют продольно через центр канала в щечно-язычном направлении, затем на стенку каждого канала бором наносят стандартизированные бороздки, имитирующие слепо оканчивающиеся апикальные каналы, от 1 до 4 мм от апекса зуба, размерами 0,3 мм в ширину, 0,4 мм в глубину и 0,4 мм в длину, по 3-5 бороздок с каждой стороны канала; на внешнюю поверхность зуба также наносят в таком же количестве насечки, имитирующие резорбцию корня во время прогрессирования апикального периодонтита; разделенные половинки зубов собирают заново, на кончик корня наносят шарик диаметром 4-5 мм из промышленного бюгельного воска, в качестве разделителя на зуб наносят тонкий слой стерильного глицерина, после чего зуб с воском укладывают в стоматологический оттискной материал из силикона, после застывания силикона полученную силиконовую форму освобождают от зуба, воск удаляют путем выпаривания, а полученную силиконовую форму используют для точного сопоставления половинок зуба перед началом тестирования способов хемомеханической обработки, разделенные половинки зуба промывают 17% ЭДТА в количестве 3 мл в течение 3-х минут и 10 мл солевым изотоническим раствором хлорида натрия в количестве 10 мл в течение 10 минут, в каждую половинку зуба вводят смесь культур биопленкообразующих штаммов в 5 мл среды, культивацию проводят в течение двух недель.
На фиг. 1-12 приведены основные этапы предлагаемого способа.
Фиг. 1-2. Стандартизация внешних и внутренних апикальных бороздок.
Фиг. 3. Воссоздание закрытой апикальной системы из стандартизированных половинок зуба: нанесение воска на апикальную часть зуба.
Фиг. 4. Вид сформированной апикальной части зуба, после выпаривания воска.
Фиг. 5. Сопоставленные половинки зуба в силиконовом блоке.
Фиг. 6. Методика проведения типической произвольной выборки изображений при проведении СЭМ: увеличение 15х. Место для учета результатов СЭМ образца было определено при малом увеличении (содержимое бороздок не видно).
Фиг. 7. Увеличение 500х, видны отверстия дентинных канальцев.
Фиг. 8. Культивирование смешанной микробной биопленки в условиях анаэробиоза и текучей жидкости: а - аппаратура для культивирования;
Фиг. 9. Микробная биопленка, покрывающая поверхность эмали и цемента зуба (тест с распространением роста на плотной питательной среде).
Фиг. 10. Поверхность в области бороздок в дентине зуба при увеличении 4000х сканирующего электронного микроскопа (СЭМ): поверхность дентина с устьями дентинных канальцев и бугристыми образованиями мантии биопленки.
Фиг. 11. Поверхность в области бороздок в дентине зуба при увеличении 7800х сканирующего электронного микроскопа (СЭМ): скопления микробных клеток биопленки трудно различной морфологии.
Фиг. 12. Поверхность в области бороздок в дентине зуба при увеличении 10000х сканирующего электронного микроскопа (СЭМ): отдельные микробные клетки биопленки кокковидной и бактероидной морфологии.
Способ осуществляют следующим образом.
Отбирают человеческие удаленные по показаниям однокорневые зубы. Выбирают именно однокорневые, поскольку у многокорневых зубов провести распилы в одном направлении невозможно. На примере одного корня можно воссоздать внутреннюю анатомию в полном объеме, так как она не изменяется в зависимости от количества корней в зубе и одинаково сложна во всех группах зубов. Выбирают зубы с минимальным размером 19 мм - это средняя топографическая длина корневых каналов. До проведения формирования биопленки по предлагаемому способу соответствующие вышеуказанным категориям зубы хранили в растворе 0,01% гипохлорита натрия (гипохлорит натрия указанной концентрации является слабым антисептическим раствором, позволяющим продезинфицировать зуб и подготовить к культивированию новых микроорганизмов, не давая рост собственных микроорганизмов зуба).
После извлечения зуба из раствора гипохлорита натрия приступают к стандартной подготовке корневого канала и измерению его длины для вхождения любого инструмента, позволяющей обрабатывать только канал, не выходя за его границы. После препарирования и создания доступа с помощью К-файла 10 размера определяют рабочую длину канала на 1 мм короче апикального отверстия, в среднем 18 мм, которую определяют дистанцией, когда кончик файла показывается из апикального отверстия. Для стандартизации исследования апикальной части зуба ее обрабатывали последовательно К-файлами до 20-ого размера, а затем вращающимися файлами MTWOVDW на всю рабочую длину.
Под стоматологическим микроскопом при помощи абразивного алмазного диска на внешней поверхности зуба наносят насечки, имитирующие резорбцию корня во время прогрессирования апикального периодонтита (Фиг. 1). Зуб распиливают продольно через центр канала в щечно-язычном направлении. Затем на стенку каждого канала бором наносят стандартизированные бороздки от 1 до 4 мм от апекса зуба 0,3 мм в ширину 0,4 мм в глубину и 0,4 мм в длину, по 3-5 бороздок с каждой стороны канала (Фиг. 2). Нанесенные таким образом бороздки имитируют латеральные каналы. Важно отметить, что кроме основных каналов существуют дополнительные, латеральные каналы. Они встречаются очень часто, обычно отходят под углом от основного канала. Латеральные каналы могут находиться на любом уровне и в любых морфологических группах зубов, могут встречаться и в области фуркации многокорневых зубов, но чаще всего встречаются в апикальной трети, чем и обоснован выбор этой области. Они могут заканчиваться слепо или сообщаться с периодонтом. Нами был выбран первый, наиболее часто встречающийся вариант. Эти участки делают их очень трудными для инструментальной обработки и дезинфекции и являются причиной персистирования инфекции. Поэтому очень важно все появляющиеся системы испытывать именно на моделях с воссозданием сложной анатомии.
Так как доказано, что биопленка существует как внутри корневого канала, так и на внешней его поверхности, усугубляя течение заболевания.
Разделенные половинки зубов собирают заново для воссоздания закрытой апикальной системы и на кончик корня наносят шарик (диаметром около 5 мм) из промышленного бюгельного воска (мы использовали Воск-02, фирма Стома, Россия), имитирующий апикальную зону. Это обусловлено тем, что в процессе воспаления за верхушкой образуется полость, которая мешает проникновению ирриганта в апикальную зону, поэтому нами принято решение с помощью воска (так как он подвержен легкому выпариванию) воссоздать эту зону в силиконе.
В качестве разделителя на зуб наносят тонкий слой стерильного глицерина (Liquidstrip, IvoclarVivadent, Швейцария) для облегчения процесса выпаривания воска и дальнейшего извлечения зуба из стоматологического оттискного материала. Силиконовую форму используют в дальнейшем для точного сопоставления половинок зуба перед началом тестирования способов хемомеханической обработки. Дополнительным плюсом глицерина является его водорастворимость и отсутствие масляной пленки.
Затем зуб с воском укладывают в стоматологический оттискной материал из силикона (мы использовали силикон Speedex, фирма Coltene, Швейцария). После застывания силикона полученную силиконовую форму освобождают от зуба, воск удаляют путем выпаривания для создания стандартизированной зоны. Силиконовая форма используется для точного восстановления разделенных половинок зуба, симуляции закрытости системы корневого канала in vivo и эффекта «газового замка» для сопротивления при применении ирриганта (Фиг. 3-5).
Получение смешанной микробной биопленки проводят с использованием стандартной смеси культур биопленкообразующих штаммов S. sanguis, F. nucleatum, P. gingivalis в условиях анаэробиоза по прототипу (Патент РФ №2619169, 20.11.2015 г.). Культивирование многовидовой биопленки в модификации предлагаемого способа для корневого канала зуба осуществляют следующим образом.
Для удаления смазанного слоя, образующегося после механической обработки корневых каналов, разделенные половинки зуба промывают 17% ЭДТА в количестве 3 мл в течение 3-х минут и 10 мл солевым изотонического раствора хлорида натрия в количестве 10 мл в течение 10 минут. В каждую половинку зуба вводят смесь культур биопленкообразующих штаммов Streptococcus sanguis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis в 5 мл сердечно-мозгового бульона (BHI; Difco) в чашке Петри диаметром 50 мм, помещают в микроанаэростат в анаэробной газовой среде (HimediaLabs, India). Культивирование осуществляют при температуре 37°С в автоматическом программируемом биокультиваторе (Interscience, USA), создающем движение жидкой питательной среды с частотой 120 возвратно-поступательных (качательных) движений в минуту в течение 2-х недель (Фиг. 8).
В апикальной (1-2 мм от рабочей длины), средней (2-3 мм от рабочей длины) и коронковой (3-4 мм от рабочей длины) третях были сделаны электронные микрофотографии (СЭМ) борозд и примыкающих участков снаружи, в каждой группе. Для нивелирования погрешностей СЭМ использовалась типическая произвольная выборка (ТПВ). Произвольность подразумевала предопределение места выборки в бороздках при малом увеличении (примерно 15-кратном), при этом детали были не видны, а затем приближение в центр этого участка при большем увеличении для снятия образца (Фиг. 6-7).
Для бактериологического контроля роста микробной биопленки половинку зуба с выращенной смешанной биопленкой помещали на питательную среду - 5% кровяной гемин-агар в анаэробных условиях, где наблюдался быстрый рост в случае наличия исходной биопленки в каналах (Фиг. 9).
Через 2 недели при соблюдении указанного режима культивирования наблюдали рост многовидовой биопленки, схожий с ростом in vivo, что подтверждала электронная микроскопия (СЭМ) при сильном увеличении от 4000 до 10000 раз (Фиг. 10, 11, 12).
Далее для достижения поставленных нами целей подготовленные предлагаемым способом зубы с многовидовой моделью биопленки использовались для исследования эффективности различных методов хемомеханической обработки зубов; проводился микробиологический контроль сохранившихся микроорганизмов и исследование с помощью сканирующего микроскопа.
Модель многовидовой биопленки, выращенной in vitro в однокорневых зубах с искусственными стандартизированными бороздками в апикальном канале, имитирующей эндодонтическую инфекцию, может быть использована для сравнительной оценки эффективности различных технологий удаления (эрадикации) бактериальной биопленки.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет максимально близко воссоздать многовидовую смешанную бактериальную биопленку непосредственно в тканях зуба в среде, приближенной к условиям развития периодонтита in vivo с возможностью симуляции закрытости системы корневого канала in vivo при дальнейшем тестировании способов хемомеханической обработки на полученной модели. Возможности исследования воздействия на микробную биопленку, сформированную предлагаемым способом, очень широки, а их результаты являются достоверными, так как данная модель по сравнению с известными наиболее точно отражает развитие многовидовой биопленки непосредственно в условиях зубных тканей.
Claims (1)
- Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий in vitro, включающий внесение на подложку бактериальной взвеси чистых культур Streptococcus sanguinis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis и их культивацию, при этом бактериальную взвесь разводят в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне BHI, до концентрации 106-108 КОЕ/мл, подложку помещают в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа, который, в свою очередь, помещают в шейкер-термостат, обеспечивающий возвратно-поступательные движения в диапазоне 120 движений в минуту, при температуре 37°C с получением смешанной биопленки, отличающийся тем, что в качестве подложки используют человеческие удаленные однокорневые зубы с минимальным размером 19 мм, сохраняемые в растворе 0,01% гипохлорита натрия непосредственно до проведения формирования биопленки, проводят подготовку корневого канала и измерение его длины для вхождения любого инструмента, позволяющую обрабатывать только канал, не выходя за его границы; зуб разделяют продольно через центр канала в щечно-язычном направлении, затем на стенку каждого канала бором наносят стандартизированные бороздки, имитирующие слепо оканчивающиеся апикальные каналы, от 1 до 4 мм от апекса зуба, размерами 0,3 мм в ширину, 0,4 мм в глубину и 0,4 мм в длину, по 3-5 бороздок с каждой стороны канала; на внешнюю поверхность зуба также наносят в таком же количестве насечки, имитирующие резорбцию корня во время прогрессирования апикального периодонтита; разделенные половинки зубов собирают заново, на кончик корня наносят шарик диаметром 4-5 мм из промышленного бюгельного воска, в качестве разделителя на зуб наносят тонкий слой стерильного глицерина, после чего зуб с воском укладывают в стоматологический оттискной материал из силикона, после застывания силикона полученную силиконовую форму освобождают от зуба, воск удаляют путем выпаривания, а полученную силиконовую форму используют для точного сопоставления половинок зуба перед началом тестирования способов хемомеханической обработки, разделенные половинки зуба промывают 17% ЭДТА в количестве 3 мл в течение 3-х мин и 10 мл изотоническим раствором хлорида натрия в количестве 10 мл в течение 10 мин, в каждую половинку зуба вводят смесь культур биопленкообразующих штаммов в 5 мл среды, культивацию проводят в течение двух недель.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017140664A RU2661114C1 (ru) | 2017-11-22 | 2017-11-22 | Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий in vitro |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017140664A RU2661114C1 (ru) | 2017-11-22 | 2017-11-22 | Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий in vitro |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2661114C1 true RU2661114C1 (ru) | 2018-07-11 |
Family
ID=62916820
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017140664A RU2661114C1 (ru) | 2017-11-22 | 2017-11-22 | Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий in vitro |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2661114C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012024897A1 (en) * | 2010-08-24 | 2012-03-01 | Hawley & Hazel Chemical Company (Zhongshan) Limited | Methods, devices and uses related to biofilms |
RU2626183C1 (ru) * | 2016-03-30 | 2017-07-24 | Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования Московский медицинский Медико-стоматологический Университет им. А.И. Евдокимова Министерства Здравоохранения Российской Федерации РФ (ГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова МЗ РФ) | Способ определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов в биопленке к антимикробным средствам |
-
2017
- 2017-11-22 RU RU2017140664A patent/RU2661114C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012024897A1 (en) * | 2010-08-24 | 2012-03-01 | Hawley & Hazel Chemical Company (Zhongshan) Limited | Methods, devices and uses related to biofilms |
RU2626183C1 (ru) * | 2016-03-30 | 2017-07-24 | Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования Московский медицинский Медико-стоматологический Университет им. А.И. Евдокимова Министерства Здравоохранения Российской Федерации РФ (ГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова МЗ РФ) | Способ определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов в биопленке к антимикробным средствам |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ИППОЛИТОВ Е.В., "Мониторинг формирования микробной биопленки и оптимизация диагностики воспалительных заболеваний пародонта".// Дисс. докт. медиц.наук., ГБОУ ВПО МГМСУ им.А.И.Евдокимова, 29.06.2016, с.94, 117-120. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Guerreiro-Tanomaru et al. | Comparative analysis of Enterococcus faecalis biofilm formation on different substrates | |
Yang et al. | Evaluation of the susceptibility of multispecies biofilms in dentinal tubules to disinfecting solutions | |
Bukhari et al. | The antimicrobial effect of bioceramic sealer on an 8-week matured Enterococcus faecalis biofilm attached to root canal dentinal surface | |
Stojicic et al. | Effect of the source of biofilm bacteria, level of biofilm maturation, and type of disinfecting agent on the susceptibility of biofilm bacteria to antibacterial agents | |
Schmidlin et al. | Polyspecies biofilm formation on implant surfaces with different surface characteristics | |
De Avila et al. | Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces | |
Love | Regional variation in root dentinal tubule infection by Streptococcus gordonii | |
Zapata et al. | Confocal laser scanning microscopy is appropriate to detect viability of Enterococcus faecalis in infected dentin | |
Shen et al. | Evaluation of the effect of two chlorhexidine preparations on biofilm bacteria in vitro: a three-dimensional quantitative analysis | |
Ran et al. | Assessment of dentinal tubule invasion capacity of Enterococcus faecalis under stress conditions ex vivo | |
Jurič et al. | Antimicrobial efficacy of photodynamic therapy, Nd: YAG laser and QMiX solution against Enterococcus faecalis biofilm | |
Lundstrom et al. | Bactericidal activity of stabilized chlorine dioxide as an endodontic irrigant in a polymicrobial biofilm tooth model system | |
Tavares et al. | An in vitro model of Fusobacterium nucleatum and Porphyromonas gingivalis in single-and dual-species biofilms | |
Kirsch et al. | Is it really penetration? Locomotion of devitalized Enterococcus faecalis cells within dentinal tubules of bovine teeth | |
Ashraf et al. | Presence of Candida albicans in root canal system of teeth requiring endodontic retreatment with and without periapical lesions | |
Жумаев | Method for assessing the state of the oral mucosa in dental defects | |
RU2661114C1 (ru) | Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий in vitro | |
Okeke | Three-minute herbal treatment to reduce dental caries with a Newbouldia laevis based extract | |
Sidaway et al. | The artificial mouth in caries research | |
Gänsbauer et al. | Comparison of simplistic biofilm models for evaluating irrigating solutions. | |
RU2619169C1 (ru) | Способ формирования смешанной биоплёнки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro | |
Halib et al. | A simplified system for simulation of Streptococcus mutans biofilm on healthy extracted human tooth as dental plaque model | |
Dezhurko-Korol et al. | The influence of centrifugation and inoculation time on the number, distribution, and viability of intratubular bacteria and surface biofilm in deciduous and permanent bovine dentin | |
Drake et al. | Continuous‐Culture Chemostat Systems and Flowcells as Methods To Investigate Microbial Interactions | |
Tomazinho et al. | Use of a dissolved oxygen microsensor for assessing the viability and thickness of microbial biofilm on root surfaces |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191123 |