RU2652955C1 - Monomolecular chimeric t-cellular receptor to cancer-embryonic antigen - Google Patents
Monomolecular chimeric t-cellular receptor to cancer-embryonic antigen Download PDFInfo
- Publication number
- RU2652955C1 RU2652955C1 RU2015155637A RU2015155637A RU2652955C1 RU 2652955 C1 RU2652955 C1 RU 2652955C1 RU 2015155637 A RU2015155637 A RU 2015155637A RU 2015155637 A RU2015155637 A RU 2015155637A RU 2652955 C1 RU2652955 C1 RU 2652955C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- lymphocytes
- cancer
- chimeric
- cea
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 125
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 47
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 14
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 10
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 9
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 3
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 3
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 2
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 101150068626 qua gene Proteins 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006786 activation induced cell death Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002494 anti-cea effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 229940093334 flomax Drugs 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
Abstract
Description
Изобретение относится к области пассивной иммунотерапии онкологических заболеваний, в частности к методу адоптивного переноса клеток, в котором используют генетически модифицированные аутологичные или аллогенные цитотоксические Т-лимфоциты, обладающие приобретенной иммуногенностью против клеток опухоли. И может быть использовано в Т-клеточной терапии рака.The invention relates to the field of passive immunotherapy of cancer, in particular to the method of adaptive cell transfer, which uses genetically modified autologous or allogeneic cytotoxic T-lymphocytes with acquired immunogenicity against tumor cells. And can be used in T-cell cancer therapy.
В настоящее время определено большое количество опухоль-асоциированных антигенов, которые по отдельности или в сочетании могут быть использованы для индукции иммунного ответа, направленного против опухолевой ткани. Разрабатываемые подходы иммунотерапии, такие как вакцинация и адоптивный перенос иммунных клеток продемонстрировали эффективность в ряде доклинических и клинических исследований [1, 2]. Однако, несмотря на огромный интерес исследователей к иммунотерапевтическим подходам и большой потенциал иммунотерапии, случаи полного излечения от раковых заболеваний с помощью таких подходов остаются редкими событиями.Currently, a large number of tumor-associated antigens have been identified, which individually or in combination can be used to induce an immune response directed against tumor tissue. Immunotherapy approaches under development, such as vaccination and adoptive transfer of immune cells, have been shown to be effective in a number of preclinical and clinical studies [1, 2]. However, despite the huge interest of researchers in immunotherapeutic approaches and the great potential of immunotherapy, cases of a complete cure for cancer using such approaches remain rare events.
Особое место в иммунотерапии занимает метод адоптивного переноса клеток, в котором используют генетически модифицированные аутологичные или аллогенные цитотоксические Т-лимфоциты, обладающие рецепторами, специфичными к антигенам клеток опухоли [2]. Исследования показали, что наиболее перспективным является получение лимфоцитов, экспрессирующих химерные иммуноглобулиновые мономолекулярные Т-клеточные рецепторы, в которых антиген-распознающая часть, представляющая собой вариабельный фрагмент антитела, объединена с эффекторным фрагментом Т-клеточного рецептора (обычно с ζ-цепью) [3]. Распознавание антигена таким химерным рецептором за счет иммуноглобулиновой части является независимым от представления антигена клетками главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), связывание с антигеном приводит к секреции модифицированными Т-лимфоцитами интерлейкина-2 (ИЛ-2) и ряда других цитокинов и проявлению цитотоксического действия, а объединение в химерном рецепторном комплексе различных ко-стимулирующих доменов позволяет повысить выживаемость лимфоцитов и усилить цитотоксический эффект [4, 5, 6].A special place in immunotherapy is occupied by the method of adaptive cell transfer, which uses genetically modified autologous or allogeneic cytotoxic T-lymphocytes with receptors specific for tumor cell antigens [2]. Studies have shown that the most promising is the production of lymphocytes expressing chimeric immunoglobulin monomolecular T-cell receptors in which the antigen-recognizing part, which is a variable fragment of an antibody, is combined with an effector fragment of a T-cell receptor (usually with a ζ chain) [3] . Recognition of the antigen by such a chimeric receptor due to the immunoglobulin part is independent of the presentation of the antigen by the cells of the main histocompatibility complex (MHC), binding to the antigen leads to the secretion of modified T-lymphocytes of interleukin-2 (IL-2) and a number of other cytokines and a cytotoxic effect, and the combination of various co-stimulating domains in the chimeric receptor complex allows to increase the survival of lymphocytes and enhance the cytotoxic effect [4, 5, 6].
На сегодняшний день сконструировано множество химерных иммунорецепторов к различным опухолевым антигенам, таким как антиген GD2 клеток нейробластомы [7], простатспецифический мембранный антиген (ПСМА) [8, 9], раково-эмбриональный антиген (РЭА) [10] и др.To date, many chimeric immunoreceptors have been constructed for various tumor antigens, such as the neuroblastoma cell antigen G D2 [7], prostate-specific membrane antigen (PSMA) [8, 9], cancer-embryonic antigen (CEA) [10], etc.
РЭА - гликопротеин, молекулярной массой 180 кДа, экспрессирующийся во всех аденокарциномах желудочно-кишечного тракта, в 50% случаев рака молочной железы и в 70% случаев немелкоклеточного рака легких и в клетках некоторых других видов рака [11]. В норме РЭА экспрессируется в тканях эмбриона в ходе внутриутробного развития, а после рождения его продукция дектируется в клетках желудочных ямок, эпителия толстой кишки и в других отделах желудочно-кишечного тракта, в основном на поверхности микроворсинок. Однако уровень экспрессии РЭА в опухолевых клетках значительно превышает его уровень экспрессии в нормальной ткани (в 35 раз и выше) [12]. Несмотря на успех доклинических экспериментальных исследований, описанные в литературе химерные Т-клеточные рецепторы к РЭА имеют свои недостатки, не позволяющие перейти к стадии клинического применения [13, 14]. В связи с этим остается актуальным создание новых конструкций химерных иммуноглобулиновых Т-клеточных рецепторов к другим эпитопам РЭА. Кроме того, в проявлении цитотоксического действия модифицированных клеток, содержащих химерные рецепторы, остается высокой гибель лимфоцитов после связывания антигена, обусловленная активацией лимфоцитов, точно не установлен набор сигнальных последовательностей, усиливающих цитотоксическое действие, весьма актуально повышение аффинности химерных рецепторов к антигену.CEA is a glycoprotein with a molecular mass of 180 kDa, which is expressed in all adenocarcinomas of the gastrointestinal tract, in 50% of cases of breast cancer and in 70% of cases of non-small cell lung cancer and in the cells of some other types of cancer [11]. Normally, CEA is expressed in the tissues of the embryo during fetal development, and after birth, its production is decanted in the cells of the gastric fossa, colon epithelium and in other parts of the gastrointestinal tract, mainly on the surface of the microvilli. However, the level of CEA expression in tumor cells significantly exceeds its expression level in normal tissue (35 times or higher) [12]. Despite the success of preclinical experimental studies, the chimeric T-cell receptors for CEA described in the literature have their drawbacks that do not allow transition to the stage of clinical use [13, 14]. In this regard, it remains relevant to create new designs of chimeric immunoglobulin T-cell receptors for other CEA epitopes. In addition, in the manifestation of the cytotoxic effect of modified cells containing chimeric receptors, the death of lymphocytes after antigen binding remains high due to activation of lymphocytes, a set of signal sequences that enhance the cytotoxic effect have not been established, it is very important to increase the affinity of chimeric receptors for antigen.
Задачей данного изобретения является получение лимфоцитов, экспрессирующих химерные иммуноглобулиновые мономолекулярные Т-клеточные рецепторы к РЭА, с усиленным цитотоксическим действием.The objective of the invention is to obtain lymphocytes expressing chimeric immunoglobulin monomolecular T-cell receptors for CEA, with enhanced cytotoxic effect.
Техническим результатом изобретения является увеличение более, чем на 50%, цитотоксического эффекта по отношению к опухолевым клеткам при использовании генетически модифицированных созданной конструкцией Т-лимфоцитов.The technical result of the invention is an increase of more than 50% of the cytotoxic effect in relation to tumor cells using genetically modified T-lymphocytes created by the design.
Технический результат достигается благодаря получению на основе уникальных участков, кодирующих аминокислотную последовательность, проявляющую высокий уровень связывания РЭА в том числе и в растворе, генетических конструкций, кодирующих мономолекулярные химерные Т-клеточные рецепторы, распознающие различные эпитопы РЭА, трансфекция которыми активированных лимфоцитов человека приводит к экспрессии этих рецепторов на поверхности лимфоцитов.The technical result is achieved by obtaining, on the basis of unique regions encoding the amino acid sequence exhibiting a high level of CEA binding, including in solution, genetic constructs encoding monomolecular chimeric T-cell receptors that recognize various CEA epitopes, the transfection of which activated human lymphocytes leads to expression these receptors on the surface of lymphocytes.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к одноцепочечному антителу к раково-эмбриональному антигену, которое кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.In one embodiment, the present invention provides a single chain antibody to a cancer-embryonic antigen that is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному мономолекулярному Т-клеточному рецептору, специфичному к раково-эмбриональному антигену, включающему одноцепочечное антитело, кодируемое нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.In one embodiment, the present invention relates to a chimeric monomolecular T-cell receptor specific for a cancer-embryonic antigen, comprising a single chain antibody encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
В предпочтительном варианте химерный мономолекулярный Т-клеточный рецептор кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3.In a preferred embodiment, the chimeric monomolecular T cell receptor is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к вектору для обеспечения экспрессии химерного мономолекулярного Т-клеточного рецептора, специфичного к раково-эмбриональному антигену, включающему нуклеотидную последовательность, представленную на SEQ ID NO: 1.In one embodiment, the invention relates to a vector for expressing a chimeric monomolecular T cell receptor specific for a cancer-embryonic antigen comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к клетке-хозяину, продуцирующей химерный мономолекулярный Т-клеточный рецептор, специфичный к раково-эмбриональному антигену.In one embodiment, the invention relates to a host cell producing a chimeric monomolecular T cell receptor specific for a cancer-embryonic antigen.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу диагностики или лечения заболеваний, характеризующихся наличием антигенов, способных связываться с химерным мономолекулярным Т-клеточным рецептором.In one embodiment, the invention relates to a method for diagnosing or treating diseases characterized by the presence of antigens capable of binding to a chimeric monomolecular T cell receptor.
Используемый в настоящем документе термин «одноцепочечное антитело» обозначает рекомбинантное антитело, т.н. одноцепочечные вариабельный фрагмент scFv (singl chain variable fragments), кодируется одним геном и содержит только один антиген-связывающий участок, состоящий из вариабельных доменов легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей, соединенных гибким пептидным линкером.As used herein, the term “single chain antibody” refers to a recombinant antibody, the so-called single-chain variable fragment scFv (singl chain variable fragments), encoded by one gene and contains only one antigen-binding site, consisting of the variable domains of light (VL) and heavy (VH) chains connected by a flexible peptide linker.
scFvscFv
3C103C10
Nucleotide Seq SEQ ID NO 1Nucleotide Seq
Am Ac Seq SEQ ID NO 2Am Ac Seq
Используемый в настоящем документе термин «химерный мономолекулярный Т-клеточный рецептор» включает в себя антиген-распознающую часть, представляющую собой вариабельный фрагмент антитела, объединенную с эффекторным фрагментом Т-клеточного рецептора (обычно с ζ-цепью). Распознавание антигена таким химерным рецептором за счет иммуноглобулиновой части является независимым от представления антигена клетками главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), связывание с антигеном приводит к секреции модифицированными Т-лимфоцитами интерлейкина-2 (ИЛ-2) и ряда других цитокинов и проявлению цитотоксического действия, а объединение в химерном рецепторном комплексе различных ко-стимулирующих доменов позволяет повысить выживаемость лимфоцитов и усилить цитотоксический эффект.As used herein, the term “chimeric monomolecular T-cell receptor” includes an antigen-recognizing portion, which is a variable fragment of an antibody, combined with an effector fragment of a T-cell receptor (usually with a ζ chain). Recognition of the antigen by such a chimeric receptor due to the immunoglobulin part is independent of the presentation of the antigen by the cells of the main histocompatibility complex (MHC), binding to the antigen leads to the secretion of modified T-lymphocytes of interleukin-2 (IL-2) and a number of other cytokines and a cytotoxic effect, and the combination of various co-stimulating domains in the chimeric receptor complex allows to increase the survival of lymphocytes and enhance the cytotoxic effect.
SEQ ID NO 3
Используемый в настоящем документе термин «экспрессионный вектор» включает в себя конструкцию рСЕА-5, созданую на основе распознающих участков антитела 3С10, путем клонирования в плазмиду pCI участков, кодирующих i) вариабельные фрагменты κ- (легких) и γ- (тяжелых) цепей выбранных моноклональных антител к РЭА, разделенных линкерным пептидом (G4S)3 (одноцепочечные миниантитела в scFv-формате), ii) «шарнирный» участок белка CD8 и iii) участок белка CD247 (ζ-цепь Т-клеточного рецептора) включающий трансмембранный и цитоплазматический домены (рис. 1).As used herein, the term “expression vector” includes the pCEA-5 construct, based on the recognition regions of the 3C10 antibody, by cloning into the plasmid pCI regions encoding i) the variable fragments of the κ- (light) and γ- (heavy) chains of the selected monoclonal antibodies to CEA, separated by a linker peptide (G 4 S) 3 (single-chain mini-antibodies in scFv format), ii) the “hinged” portion of the CD8 protein and iii) the portion of the CD247 protein (T-cell receptor ζ chain) including transmembrane and cytoplasmic domains (fig. 1).
Используемый в настоящем документе термин «клетка-хозяин» включает в себя трансфицированные указанными конструкциями лимфоциты периферической крови человека, характеризующихся высокой цитотоксической активностью в отношении РЭА-экспрессирующих клеток.As used herein, the term “host cell” includes human peripheral blood lymphocytes transfected with the indicated constructs, characterized by high cytotoxic activity against CEA-expressing cells.
Используемый в настоящем документе термин «заболевания, характеризующиеся наличием антигенов, способных связываться с химерным мономолекулярным Т-клеточным рецептором» включает в себя заболевания, при которых уровень экспрессии РЭА значительно превышает его уровень экспрессии в нормальной ткани (в 35 раз и выше) (12).As used herein, the term “diseases characterized by the presence of antigens capable of binding to a chimeric monomolecular T-cell receptor” includes diseases in which the expression level of CEA significantly exceeds its expression level in normal tissue (35 times or more) (12) .
Сущностью предлагаемого изобретения является создание оригинальной генетической конструкции, кодирующей химерный мономолекулярный Т-клеточный рецептор, в котором эффекторный фрагмент Т-клеточного рецептора объединен с антиген-распознающей частью, представляющей собой вариабельный фрагмент антитела к раково-эмбриональному антигену (РЭА). Было показано, что после трансфекции данные рецепторы экспрессировались на поверхности клеток и связывались с РЭА. Также продемонстрирована высокая цитотоксическая активность трансфицированных описанными конструкциями лимфоцитов периферической крови человека в отношении РЭА-экспрессирующих клеток.The essence of the invention is the creation of an original genetic construct encoding a chimeric monomolecular T-cell receptor, in which the effector fragment of the T-cell receptor is combined with an antigen-recognizing part, which is a variable fragment of an antibody to cancer-embryonic antigen (CEA). It was shown that after transfection, these receptors were expressed on the surface of the cells and bound to CEA. The high cytotoxic activity of human peripheral blood lymphocytes transfected with the described constructs against CEA-expressing cells was also demonstrated.
Серия мышиных моноклональных биотинилированных антител (изотип IgG1), способных связываться с РЭА в растворе, была предоставлена ООО «Хема-Медика» (Россия, Москва). В серию вошли следующие антитела: 2С5, 1С10, 1С11, 1С13, 1С3, 1С6, 3С1, 3С13, 3С2, 3С4, 3С5, 3С6, 3С8, 3С10 [17]. Для анализа способности антител имеющейся серии связывать РЭА на поверхности экспрессирующих его клеток были выбраны три клеточные линии человека: НТ29, А549 и НСТ116. Антитело 3С10 было отобрано как проявляющее высокий уровень связывания РЭА со всеми исследуемыми клеточными линиями. Фрагменты кДНК иммуноглобулиновых генов, кодирующие вариабельные участки антител (домены VL и VH) из гибридомы 3С10, были ПЦР-амплифицированы и клонированы для определения полной нуклеотидной последовательности.A series of murine monoclonal biotinylated antibodies (IgG1 isotype) capable of binding to CEA in solution was provided by Hema-Medica LLC (Moscow, Russia). The following antibodies were included in the series: 2C5, 1C10, 1C11, 1C13, 1C3, 1C6, 3C1, 3C13, 3C2, 3C4, 3C5, 3C6, 3C8, 3C10 [17]. To analyze the ability of the antibodies of the existing series to bind CEA on the surface of the cells expressing it, three human cell lines were selected: HT29, A549 and HCT116. Antibody 3C10 was selected as exhibiting a high level of binding of CEA to all studied cell lines. Fragments of the cDNA of immunoglobulin genes encoding the variable regions of antibodies (VL and VH domains) from 3C10 hybridoma were PCR amplified and cloned to determine the complete nucleotide sequence.
Конструкция рСЕА-5 была создана на основе распознающих участков антитела 3С10 путем клонирования в плазмиду pCI участков, кодирующих i) вариабельные фрагменты κ- (легких) и γ- (тяжелых) цепей выбранных моноклональных антител к РЭА, разделенных линкерным пептидом (G4S)3 (одноцепочечные миниантитела в scFv-формате), ii) «шарнирный» участок белка CD8 и iii) участок белка CD247 (ζ-цепь Т-клеточного рецептора) включающий трансмембранный и цитоплазматический домены (рис. 1).The pCEA-5 construct was created on the basis of the recognition sites of the 3C10 antibody by cloning into the pCI plasmid the sections encoding i) variable fragments of the κ- (light) and γ- (heavy) chains of the selected monoclonal antibodies to CEA separated by a linker peptide (G 4 S) 3 (single-chain mini-antibodies in scFv format), ii) the “hinge” region of the CD8 protein, and iii) the region of the CD247 protein (ζ-chain of the T-cell receptor) including the transmembrane and cytoplasmic domains (Fig. 1).
Для подтверждения правильного функционирования химерных иммунорецепторов, кодируемых созданными конструкциями, была выполнена трансфекция клеток HEK293. Через 24 ч после трансфекции методом проточной цитометрии было исследовано связывание с клетками антител к ζ-цепи Т-клеточного рецептора. Было показано, что положительный сигнал обнаруживался в трансфицированных клетках, тогда как сигнал в контрольной группе клеток, окрашенных изотипическими контрольными антителами, отсутствовал (рис. 2а, б). Кроме этого, трансфицированные клетки HEK293, связывали РЭА в растворе, что было показано после инкубации в течение 30 мин клеток с раствором РЭА, меченного ФИТЦ (рис. 2в, г).To confirm the correct functioning of chimeric immunoreceptors encoded by the created constructs, transfection of HEK293 cells was performed. 24 hours after transfection by flow cytometry, the binding of the antibodies to the ζ chain of the T cell receptor was investigated with flow cytometry. It was shown that a positive signal was detected in transfected cells, while the signal in the control group of cells stained with isotypic control antibodies was absent (Fig. 2a, b). In addition, transfected HEK293 cells bound CEA in solution, which was shown after incubation for 30 min of cells with a CEA solution labeled with FITC (Fig. 2c, d).
Далее была проведена трансфекция созданными генетическими конструкциями лимфоцитов человека. В работе использовали мононуклеарные клетки крови, стимулированные к пролиферации с помощью ФГА и активированные рекомбинантным ИЛ-2 человека (50 Ед/мл) в течение 3 суток. По истечении этого времени количество CD3+ Т-лимфоцитов среди всей популяции составляло около 60%. Спустя 24 ч после трансфекции, в ходе проведения ОТ-ПЦР, в лимфоцитах была выявлена экспрессия генов, кодирующих химерные иммунорецепторы.Next, transfection with the created genetic constructs of human lymphocytes was carried out. We used mononuclear blood cells stimulated to proliferate using PHA and activated by recombinant human IL-2 (50 U / ml) for 3 days. After this time, the number of CD3 + T-lymphocytes among the whole population was about 60%. 24 hours after transfection, during RT-PCR, expression of genes encoding chimeric immunoreceptors was detected in lymphocytes.
Способность трансфицированных лимфоцитов связывать РЭА, спустя 24 ч после электропорации, была подтверждена методом непрямого иммуноцитохимического окрашивания (рис. 3). При этом, количество модифицированных лимфоцитов, связавшихся с РЭА, было примерно в 4 раза выше для предварительно активированных ИЛ-2 лимфоцитов по сравнению с нестимулированными клетками.The ability of transfected lymphocytes to bind CEA, 24 hours after electroporation, was confirmed by indirect immunocytochemical staining (Fig. 3). Moreover, the number of modified lymphocytes bound to CEA was about 4 times higher for pre-activated IL-2 lymphocytes compared with unstimulated cells.
Исследование цитотоксичности лимфоцитов, трансфицированных исследуемыми плазмидами, проводили с использованием метода двойной окраски CFDA-SE/PI клеток НСТ116, экспрессирующих поверхностный РЭА. Было показано, что при добавлении к клеткам НСТ116, окрашенных с помощью CFDA-SE, трансфицированных лимфоцитов в соотношении 1:10 максимальный цитотоксический эффект достигался по истечении 5 ч совместной инкубации. При этом процент живых клеток НСТ116 после воздействия лимфоцитов, трансфицированных плазмидой рСЕА-3, составил 35%, а в случае с лимфоцитами, трансфицированными рСЕА-х, - 56.9% (рис. 4). Средний процент живых клеток НСТ116, инкубируемых в присутствии контрольных лимфоцитов, составил 86.7%, при инкубации с лимфоцитами, подверженными электрическому импульсу, но без добавления ДНК, процент живых НСТ116 равнялся 70.9%.The study of the cytotoxicity of lymphocytes transfected with the studied plasmids was carried out using the double staining method of CFDA-SE / PI HCT116 cells expressing surface CEA. It was shown that upon addition of transfected lymphocytes in the ratio 1:10 to the HCT116 cells stained with CFDA-SE, the maximum cytotoxic effect was achieved after 5 hours of joint incubation. The percentage of living HCT116 cells after exposure to lymphocytes transfected with plasmid pCEA-3 was 35%, and in the case of lymphocytes transfected with pCEA-x, it was 56.9% (Fig. 4). The average percentage of live HCT116 cells incubated in the presence of control lymphocytes was 86.7%, while incubating with lymphocytes susceptible to electrical impulse, but without the addition of DNA, the percentage of live HCT116 was 70.9%.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Рис. 1. Схема плазмиды, кодирующей химерные иммунорецепторы (а) и детализированная структура гена химерного иммунорецептора (б), sp - сигнальный пептид, κ, γ - вариабельные фрагменты кДНК легких и тяжелых цепей антител соответственно; CD8 - «шарнирная» область антигена CD8; CD247 - ζ-цепь Т-клеточного рецептора; ТМ - трансмембранный домен; PCMV - промотор CMV; SV40 polyA - сигнал полиаденилирования SV40; Ampr - ген устойчивости к ампициллину; Bg1II, HinDIII EcoR1, Xbal, Smal - сайты соответствующих эндонуклеаз рестрикции.Fig. 1. Scheme of the plasmid encoding the chimeric immunoreceptors (a) and the detailed gene structure of the chimeric immunoreceptor (b), sp — signal peptide, κ, γ — variable fragments of cDNA of light and heavy chains of antibodies, respectively; CD8 is the “hinge” region of CD8 antigen; CD247 - ζ-chain of the T-cell receptor; TM - transmembrane domain; PCMV - CMV promoter; SV40 polyA — SV40 polyadenylation signal; Ampr - ampicillin resistance gene; Bg1II, HinDIII EcoR1, Xbal, Smal - sites of the corresponding restriction endonucleases.
Рис. 2. Данные цитофлуорометрического анализа клеток HEK293, спустя 24 часа после трансфекции. а, б - связывание с клетками антител к ζ-цепи Т-клеточного рецептора на примере плазмиды рСЕА-5: а - клетки при добавлении антител к ζ-цепи; б - клетки при добавлении изотипических контрольных антител. R1 - область клеток, связавшихся с антителами к ζ-цепи. в, г - связывание клеток, трансфицированных плазмидой рСЕА-5 с РЭА в растворе: в - трансфицированные клетки; г - нетрансфицированные клетки (отрицательный контроль). По осям отложены значения флуоресценции в каналах: по оси абсцисс FL2, по оси ординат FL1.Fig. 2. Data from a cytofluorometric analysis of HEK293 cells, 24 hours after transfection. a, b - binding to cells of antibodies to the ζ-chain of the T-cell receptor on the example of plasmid pCEA-5: a - cells when antibodies are added to the ζ-chain; b - cells with the addition of isotypic control antibodies. R1 is the region of cells that bind to antibodies to the ζ chain. c, d - binding of cells transfected with plasmid pCEA-5 with CEA in solution: c - transfected cells; g - non-transfected cells (negative control). The fluorescence values in the channels are plotted along the axes: along the abscissa axis FL2, along the ordinate axis FL1.
Рис. 3. Данные цитофлуорометрического анализа лимфоцитов человека, активированных ИЛ-2 и трансфицированных мономолекулярными химерными Т-клеточными рецепторами, по связыванию с РЭА в растворе, спустя 24 часа после трансфекции. а, б - лимфоциты, трансфицированные плзмидами рСЕА-5 и рСЕА-х соответственно; в - нетрансфицированные лимфоциты (отрицательный контроль). RN1 - области клеток с флуоресценцией выше пороговой. По оси абсцисс отложены значения флуоресценции в канале FL2, по оси ординат число флуоресцирующих частиц.Fig. 3. Data of a cytofluorometric analysis of human lymphocytes activated by IL-2 and transfected with monomolecular chimeric T-cell receptors for binding to CEA in solution, 24 hours after transfection. a, b - lymphocytes transfected with plasmids pCEA-5 and pCEA-x, respectively; c - non-transfected lymphocytes (negative control). RN1 - region of cells with fluorescence above the threshold. The abscissa shows the fluorescence values in the FL2 channel; the ordinate shows the number of fluorescent particles.
Рис. 4. Цитотоксичность лимфоцитов, трансфицированных плазмидами рСЕА-5 (НСТ:pl-1) и рСЕА-х (НСТ:pl-2), в отношении экспрессирующих РЭА клеток НСТ116 (через 5 ч после добавления, соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней 10:1). Приведены средние проценты лизируемых клеток от общего количества клеток-мишеней и стандартные отклонения. НСТ: K-pulse - цитотоксичность лимфоцитов, подверженных электрическому пульсу без добавления ДНК. НСТ - клетки НСТ116 без добавления лимфоцитов. * - р<0.05 по сравнению с контрольными нетрансфицированными лимфоцитами (НСТ: K-lymph).Fig. 4. Cytotoxicity of lymphocytes transfected with plasmids pCEA-5 (HCT: pl-1) and pCEA-x (HCT: pl-2), in relation to CEA-expressing HCT116 cells (5 hours after addition, the ratio of effector cells and target cells 10 :one). The average percent of lysed cells of the total number of target cells and standard deviations are given. HCT: K-pulse - cytotoxicity of lymphocytes susceptible to electrical pulse without the addition of DNA. HCT - HCT116 cells without the addition of lymphocytes. * - p <0.05 compared with control untransfected lymphocytes (HCT: K-lymph).
Пример 1. Клеточные линииExample 1. Cell lines
При осуществлении изобретения клеточные линии человека НСТ116 (карцинома толстой кишки), НТ29 (аденокарцинома толстой кишки), А549 (карцинома легкого) и HEK293 (почка эмбриона) культивировали в среде DMEM. Мононуклеары периферической крови выделяли из гепаринизированной периферической крови пациентов ФГУ "Российский научный центр рентгенорадиологии" центрифугированием в градиенте фиколла. Лимфоциты культивировали в среде RPMI. Лимфоциты стимулировали к пролиферации добавлением 1 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) и активировали 50 Ед/мл ИЛ-2 (БИОТЕХ) в течение 72-120 ч.In an embodiment of the invention, human cell lines HCT116 (colon carcinoma), HT29 (colon adenocarcinoma), A549 (lung carcinoma) and HEK293 (embryo kidney) were cultured in DMEM. Peripheral blood mononuclear cells were isolated from heparinized peripheral blood of patients of the Federal State Institution Russian Scientific Center for Radiological Radiology by ficoll gradient centrifugation. Lymphocytes were cultured in RPMI medium. Lymphocytes were stimulated to proliferate by the addition of 1 μg / ml phytohemagglutinin (PHA) and activated 50 U / ml IL-2 (BIOTECH) for 72-120 hours.
HЕK293 (клетки почки эмбриона человека), Jurkat (CD4(+) клеточная линия Т-клеточного лейкоза), любезно предоставленные ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи.HEK293 (human embryonic kidney cells), Jurkat (CD4 (+) T-cell leukemia cell line), kindly provided by the N.F. Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology Gamalei.
Вся работа с культурами клеток выполнялась в стерильных условиях в ламинарном боксе в специально оборудованной для работы с клетками комнате.All work with cell cultures was performed under sterile conditions in a laminar box in a room specially equipped for working with cells.
Культивирование HEK293Cultivation HEK293
Среда для культивирования HEK293 имела следующий состав: DMEM (ПанЭко, Россия), 10% эмбриональная бычья сыворотка (ПанЭко) и антибиотики пенициллин, и стрептомицин в стандартной концентрации. Клетки культивировали в условиях высокой влажности при 37°С и 5% СО2. При достижении 80 - 90% конфлюэнтности клетки пассировали. Для этого клетки 2 раза промывали раствором стерильного фосфатно-солевого буфера (FBS, Invitrogen), обрабатывали 0,25% раствором трипсина-ЭДТА. Для повышения эффективности работы ферментов на этой стадии флаконы с клетками помещали на 37°С на 4-5 минут. После открепления всех клеток от подложки трипсин инактивировали добавлением среды с сывороткой, затем клетки разбивали до получения однородной суспензии, отбирали требуемое количество клеток, а к оставшимся клеткам добавляли соответствующее количество полной культуральной среды и продолжали культивирование.The HEK293 culture medium had the following composition: DMEM (PanEco, Russia), 10% fetal bovine serum (PanEco) and penicillin antibiotics, and streptomycin in standard concentration. Cells were cultured in high humidity at 37 ° C and 5% CO 2 . Upon reaching 80 - 90% confluency, the cells were passaged. For this, the cells were washed 2 times with a solution of sterile phosphate-buffered saline (FBS, Invitrogen), treated with 0.25% trypsin-EDTA solution. To increase the efficiency of enzymes at this stage, vials with cells were placed at 37 ° C for 4-5 minutes. After all cells were detached from the substrate, trypsin was inactivated by adding medium with serum, then the cells were broken to obtain a homogeneous suspension, the required number of cells was selected, and the remaining cells were added with the appropriate amount of complete culture medium and cultivation continued.
Заморозка и оттаивание HEK293Freezing and thawing HEK293
Среда для заморозки имела следующий состав: 90% полной среды для культивирования и 10% ДМСО (ПанЭко).The freezing medium had the following composition: 90% of the complete culture medium and 10% DMSO (PanEco).
От культивируемых клеток отбирали среду, промывали 2 раза PBS, добавляли 0,25% раствора трипсина-ЭДТА. Инкубировали при 37°С в течение 5 минут, пипетировали для получения одноклеточной суспензии, нейтрализовали трипсин полной культуральной средой, содержащей сыворотку. Полученную суспензию центрифугировали 5 минут при 1000 об./мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок суспендировали в соответствующем количестве среды для заморозки, переносили в криопробирки в концентрации 106 клеток в 1 мл среды и сразу помещали на -70°С на 24 часа. Через 24 часа криопробирки переносили в жидкий азот для продолжительного хранения. В одной криопробирке замораживали 1.0-2.0 млн клеток.Medium was taken from cultured cells, washed 2 times with PBS, 0.25% trypsin-EDTA solution was added. Incubated at 37 ° C for 5 minutes, pipetted to obtain a unicellular suspension, neutralized trypsin with a complete culture medium containing serum. The resulting suspension was centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm. The supernatant was removed, the precipitate was suspended in an appropriate amount of freezing medium, transferred to cryovials at a concentration of 10 6 cells in 1 ml of medium and immediately placed at -70 ° C for 24 hours. After 24 hours, cryovials were transferred to liquid nitrogen for long-term storage. In one cryovial, 1.0–2.0 million cells were frozen.
Криопробирки оттаивали на водяной бане при 37С, стерилизовали 70% этанолом, затем их содержимое переносили в пробирку, содержащую среду для культивирования прогретую до 37С, центрифугировали 5 минут при 1000 об./мин, надосадочную жидкость удаляли, осадок суспендировали в соответствующем количестве среды и переносили в флакон со средой. Клетки равномерно распределяли по культуральной поверхности и помещали в инкубатор на 37°С, 5% СО2. Через 24 ч, когда клетки прикреплялись к подложке и начинали пролиферировать, заменяли среду для устранения погибших в процессе заморозки клеток.Cryovials were thawed in a water bath at 37 ° C, sterilized with 70% ethanol, then their contents were transferred to a test tube containing culture medium heated to 37 ° C, centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm, the supernatant was removed, the precipitate was suspended in an appropriate amount of medium and transferred in a bottle of medium. Cells were evenly distributed over the culture surface and placed in an incubator at 37 ° C, 5% CO 2 . After 24 hours, when the cells attached to the substrate and began to proliferate, the medium was replaced to eliminate the cells that died during the freezing process.
Культивирование лимфоцитовLymphocyte Culture
Среда для культивирования лимфоцитов имела состав идентичный составу среды для культивирования Jurkat.The lymphocyte culture medium had a composition identical to that of the Jurkat culture medium.
Выделение лимфоцитов из периферической крови человекаIsolation of lymphocytes from human peripheral blood
Лимфоциты человека получали следующим образом. Свежую кровь человека отбирали в 5 мл. стерильную пробирку, обрабатывали антикоагулянтом (цитрат натрия). Цельную кровь либо отстаивали при комнатной температуре в течение часа для осаждения эритроцитов, а затем отбирали плазму, содержащую лейкоциты, либо брали кровь непосредственно после выделения и разбавляли в PBS в соотношении 1:2, полученный раствор наслаива ли на раствор фиколла-урографина (ПанЭко) в соотношении 2:1. Разделение клеток проводили центрифугированием в течение 30 мин. при 1500 об./мин., после чего отбирали кольцо лимфоцитов. Отмывали лимфоциты от фиколла в 5 мл PBS 2 раза, клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин. при 1000 об./мин. Осадок суспендировали в соответствующем количестве среды для культивирования лимфоцитов. Чистоту выделения популяции лимфоцитов и подсчет концентрации проводили на приборе Micros. Обычно среди выделенных клеток процент лимфоцитов составлял около 80-90%. Лимфоциты либо непосредственно использовали для опыта, либо помещали в культуральные чашки и инкубировали в стандартных условиях (37°С, 5% СО2).Human lymphocytes were obtained as follows. Fresh human blood was taken in 5 ml. sterile tube, treated with an anticoagulant (sodium citrate). Whole blood was either defended at room temperature for an hour to precipitate red blood cells, and then plasma containing leukocytes was taken, or blood was taken immediately after isolation and diluted in PBS in a ratio of 1: 2, the resulting solution was layered on a solution of ficoll-urographin (PanEco) in a ratio of 2: 1. Cell separation was carried out by centrifugation for 30 minutes. at 1500 rpm./min., after which the ring of lymphocytes was selected. The lymphocytes were washed from ficoll in 5 ml of
Пример 2. Получение генетических конструкцийExample 2. Obtaining genetic constructs
Тотальную РНК из лимфоцитов и культур гибридом выделяли при помощи набора RNeasy Mini Kit. Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием праймера олиго-dT и ревертазы RevertAid Н- (Fermentas). ПЦР проводили с помощью полимеразы TaqSE (СибЭнзим) и олигонуклеотидных праймеров, перечисленных в Табл. 1.Total RNA from lymphocytes and hybridomas was isolated using the RNeasy Mini Kit. The synthesis of the first cDNA strand was carried out using oligo-dT primer and RevertAid H- revertase (Fermentas). PCR was performed using TaqSE polymerase (SibEnzyme) and oligonucleotide primers listed in Table. one.
Фрагменты кДНК легких и тяжелых цепей, кодирующие вариабельные домены VL и VH иммуноглобулинов IgG1, были амплифицированы из препаратов РНК гибридомы 3С10 с использованием набора вырожденных праймеров и методов, описанных ранее [15]. Полученные ПЦР-продукты клонировали в плазмидный вектор pAL-TA (Евроген) при помощи стандартных методов [16] и секвенировали.Light and heavy chain cDNA fragments encoding the variable domains VL and VH of IgG1 immunoglobulins were amplified from 3C10 hybridoma RNA preparations using a set of degenerate primers and the methods described previously [15]. The obtained PCR products were cloned into the pAL-TA plasmid vector (Eurogen) using standard methods [16] and sequenced.
Для получения конструкций, кодирующих химерные иммунорецепторы, фрагменты кДНК генов CD8 и CD247 амплифицировали на матрице кДНК из лимфоцитов человека с использованием праймеров CD8-F, CD8-R, CD247-F, CD247-R. Полученные продукты лигировали между собой, реамплифицировали с использованием праймеров CD8-F, CD247-R, и клонировали в вектор pCI (GE-Amersham) по сайтам рестрикции XbaI и SmaI. Вариабельные фрагменты кДНК легких (κ) и тяжелых (γ) цепей антитела 3С10 амплифицировали с использованием праймеров из Табл. 1. ПЦР-продукты смешивали попарно для отжига перекрывающихся терминальных участков и реамплифицировали при помощи пар праймеров 3C8G-F/3C8K-R. Полученные фрагменты клонировали в плазмиду pCI/CD8-CD247 по сайтам EcoRI и XbaI. Сконструированную в итоге плазмиду pCI/3C10-CD8-CD247 сокращенно назвали рСЕА-5. Секвенирование рекомбинантной плазмиды проводили с использованием автоматического секвенатора CEQ8000 (Beckman-Coulter).To obtain constructs encoding chimeric immunoreceptors, cDNA fragments of the CD8 and CD247 genes were amplified on a cDNA matrix from human lymphocytes using primers CD8-F, CD8-R, CD247-F, CD247-R. The resulting products were ligated with each other, reamplified using CD8-F, CD247-R primers, and cloned into the pCI vector (GE-Amersham) at the XbaI and SmaI restriction sites. The variable cDNA fragments of the light (κ) and heavy (γ) chains of the 3C10 antibody were amplified using the primers from Table. 1. PCR products were mixed in pairs to anneal the overlapping terminal regions and reamplified using 3C8G-F / 3C8K-R primer pairs. The resulting fragments were cloned into the plasmid pCI / CD8-CD247 at EcoRI and XbaI sites. The resulting plasmid pCI / 3C10-CD8-CD247 was abbreviated as pCEA-5. Recombinant plasmid sequencing was performed using a CEQ8000 automatic sequencer (Beckman-Coulter).
Пример 3. Введение экзогенной ДНК в клеткиExample 3. The introduction of exogenous DNA into cells
Трансфекцию клеток HEK293 проводили с помощью реагента PolyFect (QIAGEN) согласно протоколу производителя. После обработки клетки инкубировали в стандартных условиях в течение 24-48 ч. В качестве положительного контроля использовали плазмиду, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP).HEK293 cells were transfected using PolyFect reagent (QIAGEN) according to the manufacturer's protocol. After treatment, the cells were incubated under standard conditions for 24-48 hours. As a positive control, a plasmid encoding a green fluorescent protein (GFP) was used.
Трансфекцию лимфоцитов периферической крови человека проводили методом электропорации на приборе Amaxa Nucleofector с использованием набора Human Т Cell Nucleofector Kit (Lonza) согласно инструкциям производителя. Для трансфекции одного образца использовали 4-5 млн клеток и 2 мкг плазмидной ДНК. Непосредственно после импульса клетки культивировали в полной среде RPMI в стандартных условиях в течение 4-5 ч, после чего к клеткам добавляли ИЛ-2 до концентрации 100 Ед/мл. Через 24 ч после электропорации культуральную среду, содержащую ИЛ-2, заменяли новой без добавления интерлейкина. Клетки культивировали еще сутки, после чего подвергали анализу. Экспрессию конструкций, кодирующих химерные Т-клеточные рецепторы, подтверждали методом полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) через 48 ч после трансфекции.Transfection of human peripheral blood lymphocytes was performed by electroporation on an Amaxa Nucleofector instrument using the Human T Cell Nucleofector Kit (Lonza) according to the manufacturer's instructions. For transfection of one sample, 4-5 million cells and 2 μg of plasmid DNA were used. Immediately after the pulse, the cells were cultured in complete RPMI medium under standard conditions for 4–5 h, after which IL-2 was added to the cells to a concentration of 100 U / ml. 24 hours after electroporation, the culture medium containing IL-2 was replaced with a new one without the addition of interleukin. Cells were cultured for another day, and then subjected to analysis. Expression of constructs encoding chimeric T-cell receptors was confirmed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 48 hours after transfection.
Трансфекция HEK293Transfection HEK293
Липосомальная трансфекцияLiposomal transfection
PolyFect (Quagene). Трансфекция PolyFect (Quagene) проводилась согласно прилагаемому протоколу производителя. Клетки пассировали за 1 день до трансфекции, рассаживая около 1,0-1,2⋅105 клеток на лунку 24-луночного планшета в 500 мкл культуральной среды и инкубировали при 37°С, 5% СО2. Процент конфлюэнтности на день трансфекции составлял около 60-80%. Всегда использовали 2 контрольных образца: первый - клетки, трансфецированные плазмидной ДНК, кодирующией зеленый флуоресцентный белок (pmaxGFP (Amaxa)), второй - нетрансфецированнные клетки. Трансфекция одного образца, согласно протоколу, проводилась следующим образом. В бессывороточной среде, не содержащей атнтибиотиков (DMEM), растворяли 0,4 мкг плазмиды до суммарного объема 15 мкл. К раствору ДНК добавляли 4 мкл агента PolyFect, тщательно суспендировали, инкубировали 5-10 мин. при комнатной температуре. Клеткам заменяли среду свежей полной культуральной средой до объема 400 мкл. По истечении 5-10 минут к комплексам ДНК-PolyFect добавляли 100 мкл. полной среды, пипетировали и немедленно добавляли к клеткам. Помешивали, покачивая планшет, и помещали в инкубатор на 24-48 часов.PolyFect (Quagene). Transfection of PolyFect (Quagene) was performed according to the attached protocol of the manufacturer. Cells were passaged 1 day prior to transfection, seedling about 1.0-1.2 × 10 5 cells per well of a 24-well plate in 500 μl of culture medium and incubated at 37 ° C, 5% CO 2 . The percentage of confluence on the day of transfection was about 60-80%. Always used 2 control samples: the first - cells transfected with plasmid DNA encoding a green fluorescent protein (pmaxGFP (Amaxa)), and the second - untransfected cells. Transfection of one sample, according to the protocol, was carried out as follows. 0.4 μg of plasmid was dissolved in a serum-free antibiotic-free medium (DMEM) to a total volume of 15 μl. 4 μl of PolyFect agent was added to the DNA solution, thoroughly suspended, incubated for 5-10 minutes. at room temperature. The cells were replaced with fresh, complete culture medium to a volume of 400 μl. After 5-10 minutes, 100 μl was added to the DNA-PolyFect complexes. complete medium, pipetted and immediately added to the cells. Stirred by shaking the tablet, and placed in an incubator for 24-48 hours.
Lipofectin (Invitrogene). Трансфекция с использованием lipofectin проводилась согласно прилагаемому протоколу производителя. Клетки рассаживали за 24 часа до трансфекции в количестве около 1,0-1,2⋅105 клеток на лунку 24-луночного планшета в 500 мкл культуральной среды и инкубировали стандартных условиях. Процент конфлюэнтности на день трансфекции составлял около 60-80%. Всегда использовали 2 контрольных образца: первый - клетки, трансфецированные плазмидной ДНК, кодирующией зеленый флуоресцентный белок (pmaxGFP), второй - нетрансфецированнные клетки. Для одной трансфекции 0.4 мкг плазмидной ДНК растворяли в 20 мкл безсывороточной среды в отсутствие антибиотиков. 4 мкл Lipofectin растворяли в 20 мкл среды без сыворотки и антибиотиков, оставляли раствор при комнатной температуре на 30-45 мин. После этого соединяли раствор ДНК и Lipofectin, осторожно их перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. От клеток отбирали среду, промывали 400 мкл среды без сыворотки и антибиотиков. По истечении времени инкубации к комплексам ДНК-lipofectin добавляли 160 мкл (на одну лунку) безсывороточной среды, осторожно перемешивали и добавляли к клеткам. Клетки инкубировали в стандартных условиях 24 часа, затем заменяли среду полной средой для культивирования и инкубировали еще 24 часа. Затем клетки снимали с субстрата стандартным образом и анализировали экспрессию плазмидной ДНК.Lipofectin (Invitrogene). Transfection using lipofectin was performed according to the attached protocol of the manufacturer. Cells were seeded 24 hours before transfection in an amount of about 1.0-1.2 × 10 5 cells per well of a 24-well plate in 500 μl of culture medium and incubated under standard conditions. The percentage of confluence on the day of transfection was about 60-80%. Always used 2 control samples: the first - cells transfected with plasmid DNA encoding a green fluorescent protein (pmaxGFP), the second - non-transfected cells. For one transfection, 0.4 μg of plasmid DNA was dissolved in 20 μl of serum-free medium in the absence of antibiotics. 4 μl of Lipofectin was dissolved in 20 μl of serum-free and antibiotic-free medium, and the solution was left at room temperature for 30-45 minutes. After that, the DNA solution and Lipofectin were combined, they were carefully mixed and incubated at room temperature for 10-15 minutes. Medium was taken from the cells, washed with 400 μl of medium without serum and antibiotics. After the incubation time, 160 μl (per well) of serum-free medium was added to the DNA-lipofectin complexes, gently mixed and added to the cells. Cells were incubated under standard conditions for 24 hours, then the medium was replaced with complete culture medium and incubated for another 24 hours. Then the cells were removed from the substrate in a standard manner and the expression of plasmid DNA was analyzed.
Lipofectamine (Invitrogene) Трансфекция с использованием lipofectamine проводили согласно протоколу производителя. Клетки рассаживали за 24 часа до трансфекции в количестве около 1,0-1,2⋅105 клеток на лунку 24-луночного планшета в 500 мкл культуральной среды и инкубировали при 37°С, 5% СО2. Процент конфлюэнтности на день трансфекции составлял около 60-80%. Всегда использовали 2 контрольных образца: первый - клетки, трансфецированные плазмидной ДНК, кодирующией зеленый флуоресцентный белок (pmaxGFP (Amaxa), второй - нетрансфецированнные клетки. Для одной трансфекции 0.4 мкг плазмидной ДНК растворяли в 25 мкл безсывороточной среды в отсутствие антибиотиков. Lipofectamine осторожно перемешивали, на одну трансфекцию брали 4 мкл Lipofectamine, растворяли в 25 мкл среды без сыворотки и антибиотиков, осторожно перемешивали. Затем соединяли раствор ДНК и Lipofectamine, осторожно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15-45 мин. После этого к комплексам ДНК-Lipofectamine добавляли 150 мкл безсывороточной среды. Среду у клеток заменяли 200 мкл среды без сыворотки и антибиотиков, добавляли комплексы ДНК-Lipofectamine и помешивали, покачивая планшет. Клетки инкубировали в стандартных условиях около 5 часов, затем добавляли среды и соответствующее количество сыворотки до 10% и суммарного объема среды 500-600 мкл. Анализ экспрессии плазмидной ДНК проводили далее спустя 24 часа.Lipofectamine (Invitrogene) Transfection using lipofectamine was performed according to the manufacturer's protocol. Cells were seeded 24 hours before transfection in an amount of about 1.0-1.2 × 10 5 cells per well of a 24-well plate in 500 μl of culture medium and incubated at 37 ° C, 5% CO 2 . The percentage of confluence on the day of transfection was about 60-80%. 2 control samples were always used: the first was cells transfected with plasmid DNA encoding a green fluorescent protein (pmaxGFP (Amaxa), the second was untransfected cells. For one transfection, 0.4 μg of plasmid DNA was dissolved in 25 μl of serum-free medium in the absence of antibiotics. Lipofectamine was gently mixed, 4 μl of Lipofectamine was taken per transfection, dissolved in 25 μl of serum-free and antibiotic-free medium, gently mixed, then the DNA solution and Lipofectamine were combined, gently mixed and incubated at room temperature atura for 15-45 minutes After this, 150 μl of serum-free medium was added to the DNA-Lipofectamine complexes, 200 μl of serum-free antibiotic medium was replaced in the cells, DNA-Lipofectamine complexes were added and stirred by shaking the plate.The cells were incubated under standard conditions for about 5 hours, then added the medium and the corresponding amount of serum up to 10% and the total volume of the medium 500-600 μl Analysis of expression of plasmid DNA was carried out further after 24 hours.
ЭлектропорацииElectroporation
Электропорация HEK293 проводилась на приборе Amaxa Nucleofector (Lonzabio), с использованием набора «Human Т Cell Nucleofector Kit» (Amaxa), согласно прилагаемому протоколу. Клетки пассировали за 24 часа до трансфекции стандартным образом в концентрации достаточной для того, чтобы на день трансфекции достигалось 80-90% конфлюэнтности. Всегда использовали 2 контрольных образца: первый - клетки, трансфецированные плазмидной ДНК, кодирующией зеленый флуоресцентный белок (pmaxGFP), второй - нетрасфецированнные клетки. Предварительно готовили и разогревали до комнатной температуры Nucleofection Solution (для трасфекции одного образца добавляли 18 мкл. Supplement к 82 мкл Human Т Cell Nucleofector Solution из набора Human Т Cell Nucleofector Kit). Клетки снимали с субстрата стандартным образом, подсчитывали их количество, помещали нужное количество клеток в отдельную пробирку и осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин. На одну трансфекцию брали около 1-2 млн клеток. После центрифугирования от осадка клеток отбирали досуха среду, добавляли 100 мкл раствора Nucleofection Solution и суспендировали в нем клетки для получения однородной суспензии. Затем в клеточную суспензию добавляли 2 мкг плазмидной ДНК и переносили в кювету (Human Т Cell Nucleofector Kit), избегая появления пузырей. Кювету помещали в держатель прибора Amaxa Nucleofector. Для трансфекции использовали программу Q-001. Сразу же после пульса в кювету добавляли 500 мкл предварительно прогретой до комнатной температуры культуральной среды, переносили в чашки Петри диаметром 3 см, содержащие 1,5 мл. культуральной среды, предварительно согретой до 37°С. Затем клетки помещали в инкубатор на 37°С, 5% СО2 на 24-48 часов.HEK293 electroporation was performed on an Amaxa Nucleofector (Lonzabio) instrument using the Human T Cell Nucleofector Kit (Amaxa) according to the attached protocol. Cells were passaged 24 hours before transfection in a standard manner at a concentration sufficient to achieve 80-90% confluence on the day of transfection. Always used 2 control samples: the first - cells transfected with plasmid DNA encoding a green fluorescent protein (pmaxGFP), the second - non-transfected cells. The Nucleofection Solution was preliminarily prepared and warmed to room temperature (18 μl Supplement was added to 82 μl Human T Cell Nucleofector Solution from the Human T Cell Nucleofector Kit to transfect one sample). Cells were removed from the substrate in a standard manner, their number was counted, the desired number of cells was placed in a separate tube, and they were precipitated by centrifugation at 1000 rpm for 5 min. About 1-2 million cells were taken per transfection. After centrifugation, the medium was taken to dryness from the cell pellet, 100 μl of the Nucleofection Solution was added and the cells were suspended in it to obtain a uniform suspension. Then, 2 μg of plasmid DNA was added to the cell suspension and transferred to a cuvette (Human T Cell Nucleofector Kit), avoiding the appearance of bubbles. The cuvette was placed in the Amaxa Nucleofector instrument holder. For transfection, the Q-001 program was used. Immediately after the pulse, 500 μl of the culture medium preheated to room temperature was added to the cuvette, transferred to 3 cm diameter Petri dishes containing 1.5 ml. culture medium preheated to 37 ° C. Then the cells were placed in an incubator at 37 ° C, 5% CO 2 for 24-48 hours.
Трансфекция лимфоцитов человекаTransfection of human lymphocytes
Трансфекцию проводили с использованием программы V-024, обеспечивающей высокую эффективность трансфекции Т-лимфоцитов на приборе Amaxa Nucleofector. Для трансфекции одного образца использовали 2-3 млн клеток. Остальные условия и процедура трансфекции лимфоцитов человека были идентичны условиям для HEK293.Transfection was performed using the V-024 program, which provides high efficiency of transfection of T-lymphocytes with an Amaxa Nucleofector instrument. For transfection of one sample used 2-3 million cells. The remaining conditions and the procedure for transfection of human lymphocytes were identical to the conditions for HEK293.
Цитофлуорометрический анализCytofluorometric analysis
Цитофлуорометрический анализ проводился на проточном цитофлуориметре DAKO Galaxy (Дания), в котором в качестве источника излучения используется аргоновый лазер (λ=488 нм). Полученные данные обрабатывали, используя программу FloMax, версия 3.0. Клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5-10 мин. Осадок промывали в 1 мл раствора PBS дважды. К полученному осадку добавляли 2 мл PBS и тщательно пипетировали. Полученный препарат клеток либо сразу анализировали на проточном цитофлуориметре, либо клетки затем подвергали фиксации и пермеабилизации и окраске с помощью антител (см. ниже).Cytofluorometric analysis was carried out on a DAKO Galaxy flow cytometer (Denmark), in which an argon laser (λ = 488 nm) was used as a radiation source. The data obtained were processed using the program FloMax, version 3.0. Cells were besieged by centrifugation at 1000 rpm for 5-10 minutes. The precipitate was washed in 1 ml of PBS solution twice. To the resulting precipitate was added 2 ml of PBS and thoroughly pipetted. The resulting cell preparation was either immediately analyzed on a flow cytometer or the cells were then fixed and permeabilized and stained with antibodies (see below).
Меченые антителами ζ-цепи Т-клеточного рецептораAntibody-labeled T cell receptor ζ chains
Фиксацию и пермеабилизацию клеток для мечения с помощью антител проводили с использованием набора «Fixation and permeabilization kit for flow cytometry» (DakoCytomation) согласно прилагаемой инструкции. Сухой остаток анализируемых клеток, содержащий не более 2 млн клеток, суспендировали в 100 мкл. раствора PBS, разделяли на 2 равные части (опытный образец и изотипический контроль) и к каждой части добавляли 100 мкл фиксирующего реагента А. Клетки тщательно суспендировали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Образцы промывали в 2 мл PBS, клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 минут, удаляли супернатант до жидкого остатка в 50 мкл. Затем клетки суспендировали для получения однородной суспензии, добавляли по 100 мкл пермобилизирующего раствора В к каждому образцу и тут же к образцам добавляли антитела на ζ-цепь (Dako), мышиные антитела на IgG (Dako) в качестве изотопического контроля соответственно, тщательно суспендировали. Образцы инкубировали в течение 15 мин в темноте, затем промывали в 2 мл PBS, осаждали клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 минут. К полученному осадку добавляли 2 мл PBS и тщательно пипетировали. После этого препараты сразу же анализировали на проточном цитофлуориметре способом, описанным выше.Fixation and permeabilization of cells for labeling with antibodies was performed using the Fixation and permeabilization kit for flow cytometry (DakoCytomation) kit according to the attached instructions. The dry residue of the analyzed cells, containing not more than 2 million cells, was suspended in 100 μl. PBS solution was divided into 2 equal parts (test sample and isotypic control), and 100 μl of fixing reagent A was added to each part. Cells were thoroughly suspended and incubated at room temperature for 15 minutes. Samples were washed in 2 ml of PBS, cells were pelleted by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed to a liquid residue of 50 μl. Then the cells were suspended to obtain a homogeneous suspension, 100 μl of permobilizing solution B was added to each sample, and then antibodies on the ζ chain (Dako) were added to the samples, mouse antibodies on IgG (Dako) as an isotopic control, respectively, were carefully suspended. Samples were incubated for 15 min in the dark, then washed in 2 ml of PBS, and cells were pelleted by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes. To the resulting precipitate was added 2 ml of PBS and thoroughly pipetted. After this, the preparations were immediately analyzed on a flow cytometer using the method described above.
Пример 4. Связывание экспрессируемых рецепторов с РЭА-ФИТЦExample 4. The binding of expressed receptors to CEA-FITC
Для оценки способности экспрессируемых химерных Т-клеточных рецепторов связывать РЭА клетки через 24 и 48 часов после трансфекции, инкубировали с раствором раково-эмбрионального антигена, меченного флуоресцентным красителем ФИТЦ (РЭА-ФИТЦ), в течение 30 минут. После чего клетки анализировали на проточном цитофлуориметре.To assess the ability of expressed chimeric T-cell receptors to bind CEA cells 24 and 48 hours after transfection, they were incubated with a solution of cancer-embryonic antigen labeled with fluorescent dye FITC (CEA-FITC) for 30 minutes. Then the cells were analyzed on a flow cytometer.
Цитофлуорометрические исследования проводили на проточном цитофлуориметре DAKO Galaxy (Dako). Фиксацию и пермеабилизацию клеток для мечения с помощью антител проводили с использованием соответствующего набора фирмы DakoCytomation. В работе использовали антитела к ζ-цепи Т-клеточного рецептора человека, мышиные антитела к IgG (Dako), биотинилированные антитела 1С11 и 3С5 (Beckman Coulter) поликлональные антитела к РЭА AS229 (Beckman Coulter).Cytofluorometric studies were performed on a DAKO Galaxy Flow Cytometer (Dako). Fixation and permeabilization of cells for labeling using antibodies was performed using the appropriate kit from DakoCytomation. We used antibodies to the ζ-chain of the human T-cell receptor, mouse antibodies to IgG (Dako), biotinylated antibodies 1C11 and 3C5 (Beckman Coulter) polyclonal antibodies to CEA AS229 (Beckman Coulter).
Для оценки способности изучаемых мономолекулярных химерных Т-клеточных рецепторов, экспрессируемых клетками HEK293, связывать РЭА, клетки спустя 24 после трансфекции инкубировали 30 мин с раствором РЭА, меченного флуоресцентным красителем ФИТЦ (РЭА-ФИТЦ, в конечной концентрации 0.06 мкг/мкл) и анализировали на проточном цитофлуориметре.To assess the ability of the studied monomolecular chimeric T-cell receptors expressed by HEK293 cells to bind CEA, the cells were incubated 24 minutes after transfection for 30 min with a CEA solution labeled with fluorescent dye FITC (CEA-FITC, at a final concentration of 0.06 μg / μl) and analyzed flow cytometer.
Оценку способности связывать поверхностно экспрессируемый РЭА биотинилированными моноклональными антителами на различные эпитопы РЭА, а также оценку способности сконструированных мономолекулярных химерных Т-клеточных рецепторов связывать РЭА после трансфекции лимфоцитов проводили методом непрямого иммуноцитохимического окрашивания. Для этого экспрессирующие РЭА клетки или лимфоциты, экспрессирующие мономолекулярные химерные рецепторы, через 48 ч после электропорации промывали раствором ФСБ и окрашивали биотнилированными антителами (около 3 мкл на 106 клеток) в течение 20 мин при комнатной температуре. Для выявления связавшихся антител отмытые клетки окрашивали стрептавидином, меченным фикоэритрином (РЕ), в соответствии с рекомендациями производителя (Beckman Coulter). Окрашенные клетки анализировали на проточном цитофлуориметре. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, к которым добавляли только стрептавидин, конъюгированный с РЕ.The ability to bind surface-expressed CEA with biotinylated monoclonal antibodies to various CEA epitopes was assessed, as well as the ability of engineered monomolecular chimeric T-cell receptors to bind CEA after transfection of lymphocytes was assessed by indirect immunocytochemical staining. For this, CEA-expressing cells or lymphocytes expressing monomolecular chimeric receptors were washed 48 hours after electroporation with a PBS solution and stained with biotinylated antibodies (about 3 μl per 106 cells) for 20 minutes at room temperature. To detect binding antibodies, washed cells were stained with phycoerythrin labeled streptavidin (PE) in accordance with the manufacturer's recommendations (Beckman Coulter). Stained cells were analyzed on a flow cytometer. As a negative control, cells were used to which only streptavidin conjugated with PE was added.
Анализ цитотоксического действия лимфоцитов с помощью двойной окраски CFDA-SE:PI. За 48 ч до постановки эксперимента клетки НСТ116 снимали с подложки стандартным методом, подсчитывали количество и окрашивали сукцинимидным эфиром карбоксифлуоресцеин-диацетата (CFDA-SE) в ФСБ в концентрации 0.625 мкг/мл в течение 7-8 мин в инкубаторе. Реакцию останавливали добавлением равного объема сыворотки. Клетки отмывали от невключившегося красителя, и рассаживали в чашки Петри в концентрации 2-3×105 кл/мл. Часть неокрашенных клеток рассаживали в такой же концентрации в качестве контроля. В день постановки эксперимента клетки НСТ116 неокрашенные и окрашенные (НСТ116/CFDA-SE) снимали с субстрата стандартным способом и смешивали с лимфоцитам в требуемых соотношениях. Эксперименты по цитотоксичности проводили в среде RPMI с добавлением 10% ЭТС. Смешанные культуры инкубировали в стандартных условиях необходимое время. По истечении времени инкубации среду с лимфоцитами отбирали и сохраняли, а прикрепленные клетки НСТ116 промывали и снимали с субстрата минимальным количеством раствора трипсина: ЭДТА стандартным образом. Затем отделенные клетки объединяли с ранее отобранной суспензией лимфоцитов, окрашивали йодидом пропидия (PI, 2.5 мкг/мл) и анализировали на проточном цитофлуориметре.Analysis of the cytotoxic effect of lymphocytes by double staining with CFDA-SE: PI. 48 hours before the experiment, the HCT116 cells were removed from the substrate by the standard method, the number was counted and stained with succinimide ether carboxyfluorescein diacetate (CFDA-SE) in PBS at a concentration of 0.625 μg / ml for 7-8 minutes in an incubator. The reaction was stopped by the addition of an equal volume of serum. Cells were washed from unincorporated dye, and were planted in Petri dishes at a concentration of 2-3 × 10 5 cells / ml. A portion of the unpainted cells were plated at the same concentration as a control. On the day of the experiment, unstained and stained HCT116 cells (HCT116 / CFDA-SE) were removed from the substrate in a standard manner and mixed with lymphocytes in the required proportions. Cytotoxicity experiments were performed in RPMI medium supplemented with 10% ETS. Mixed cultures were incubated under standard conditions for the required time. After the incubation time, the medium with lymphocytes was selected and stored, and the attached HCT116 cells were washed and removed from the substrate with a minimum amount of trypsin solution: EDTA in a standard manner. Then, the separated cells were combined with a previously selected suspension of lymphocytes, stained with propidium iodide (PI, 2.5 μg / ml) and analyzed on a flow cytometer.
Список литературы:Bibliography:
1. Murphy A., Westwood J.A., Teng M.W., Moeller M., Darcy P.K., Kershaw M.H. Gene modification strategies to induce tumor immunity // Immunity. - 2005. - V. 22. - N. 4. - P. 403-414.1. Murphy A., Westwood J.A., Teng M.W., Moeller M., Darcy P.K., Kershaw M.H. Gene modification strategies to induce tumor immunity // Immunity. - 2005. - V. 22. - N. 4. - P. 403-414.
2. Yee C. Adoptive therapy using antigen-specific T-cell clones // Cancer J. - 2010. - V. 16. - N. 4. - P. 367-373.2. Yee C. Adoptive therapy using antigen-specific T-cell clones // Cancer J. - 2010. - V. 16. - N. 4. - P. 367-373.
3. Chhabra A. TCR-engineered, customized, antitumor T cells for cancer immunotherapy: advantages and limitations // ScientificWorldJournal. - 2011. - V. 11. - P. 121-129.3. Chhabra A. TCR-engineered, customized, antitumor T cells for cancer immunotherapy: advantages and limitations // Scientific World Journal. - 2011. - V. 11. - P. 121-129.
4. Altenschmidt U., Moritz D., Groner B. Specific cytotoxic T lymphocytes in gene therapy // J. Mol. Med. - 1997. - V. 75. - N. 4. - P. 259-266.4. Altenschmidt U., Moritz D., Groner B. Specific cytotoxic T lymphocytes in gene therapy // J. Mol. Med. - 1997. - V. 75. - N. 4. - P. 259-266.
5. Chen J., Dave S.K., Simmons A. Prevention of genital herpes in a guinea pig model using a glycoprotein D-specific single chain antibody as a microbicide // Virol J. - 2004. - V. 1. - P. 11.5. Chen J., Dave SK, Simmons A. Prevention of genital herpes in a guinea pig model using a glycoprotein D-specific single chain antibody as a microbicide // Virol J. - 2004. - V. 1. - P. 11 .
6. Ma Q.Z., Gonzalo-Daganzo R., Junghans R.P. Genetically engineered T cells as adoptive immunotherapy of cancer // In: Giaccone, R.; Schlinsky, R.; Sondel, P., editors. Cancer Chemotherapy & Biological Response Modifiers - Annual 20. Oxford: Elsevier Science. - 2002. - P. 319-345.6. Ma Q.Z., Gonzalo-Daganzo R., Junghans R.P. Genetically engineered T cells as adoptive immunotherapy of cancer // In: Giaccone, R .; Schlinsky, R .; Sondel, P., editors. Cancer Chemotherapy & Biological Response Modifiers -
7. Rossig C., Bollard С.М., Nuchtern J.D., Merchant D.A., Brenner M.K. Targeting of GD2-positive tumor cells by human T lymphocytes engineered to express chimeric T-cell receptor genes // Int J Cancer. - 2001. - V. 94. - N. 2. - P. 228-236.7. Rossig C., Bollard S.M., Nuchtern J.D., Merchant D.A., Brenner M.K. Targeting of GD2-positive tumor cells by human T lymphocytes engineered to express chimeric T-cell receptor genes // Int J Cancer. - 2001. - V. 94. - N. 2. - P. 228-236.
8. Gade T.P., Hassen W., Santos E., Gunset G., Saudemont A., Gong M.C., Brentjens R., Zhong X.S., Stephan M., Stefanski J., Lyddane C., Osborne J.R., Buchanan I.M., Hall S.J., Heston W.D., 
9. Ma Q., Safar M., Holmes E., Wang Y., Boynton A.L., Junghans R.P. Anti-prostate specific membrane antigen designer T cells for prostate cancer therapy // Prostate. - 2004. - V. 61. - N. 1. - P. 12-25.9. Ma Q., Safar M., Holmes E., Wang Y., Boynton A.L., Junghans R.P. Anti-prostate specific membrane antigen designer T cells for prostate cancer therapy // Prostate. - 2004. - V. 61. - N. 1. - P. 12-25.
10. Ma Q., DeMarte L., Wang Y., Stanners C.P., Junghans R.P. Carcinoembryonic antigen-immunoglobulin Fc fusion protein (CEA-Fc) for identification and activation of anti-CEA immunoglobulin-T-cell receptor-modified T cells, representative of a new class of Ig fusion proteins // Cancer Gene Ther. - 2004. - V. 11. - N. 4. - P. 297-306.10. Ma Q., DeMarte L., Wang Y., Stanners C.P., Junghans R.P. Carcinoembryonic antigen-immunoglobulin Fc fusion protein (CEA-Fc) for identification and activation of anti-CEA immunoglobulin-T-cell receptor-modified T cells, representative of a new class of Ig fusion proteins // Cancer Gene Ther. - 2004. - V. 11. - N. 4. - P. 297-306.
11. Schwartz M.K. Cancer markers // In: DeVita, VT.; Hellman, S.; Rosenberg, SA., editors. Cancer: Principles and Practice of Oncology. Lippincott. - 1993. - P. 531-542.11. Schwartz M.K. Cancer markers // In: DeVita, VT .; Hellman, S .; Rosenberg, SA., Editors. Cancer: Principles and Practice of Oncology. Lippincott. - 1993 .-- P. 531-542.
12. Hammarstrom S. The carcinoembryonic antigen (CEA) family: structures, suggested functions and expression in normal and malignant tissues // Seminars in Cancer Biology. - 1999. - V. 9. - N.2. - P. 67-81.12. Hammarstrom S. The carcinoembryonic antigen (CEA) family: structures, suggested functions and expression in normal and malignant tissues // Seminars in Cancer Biology. - 1999. - V. 9. - N.2. - P. 67-81.
13. Emtage P.C., Lo A.S., Gomes E.M., Liu D.L., Gonzalo-Daganzo R.M., Junghans R.P. Second-generation anti-carcinoembryonic antigen designer T cells resist activation-induced cell death, proliferate on tumor contact, secrete cytokines, and exhibit superior antitumor activity in vivo: a preclinical evaluation // Clin Cancer Res. - 2008. - V. 14. - N. 24. - P. 8112-8122.13. Emtage P.C., Lo A.S., Gomes E.M., Liu D.L., Gonzalo-Daganzo R.M., Junghans R.P. Second-generation anti-carcinoembryonic antigen designer T cells resist activation-induced cell death, proliferate on tumor contact, secrete cytokines, and exhibit superior antitumor activity in vivo: a preclinical evaluation // Clin Cancer Res. - 2008. - V. 14. - N. 24. - P. 8112-8122.
14. Ma Q., DeMarte L., Wang Y., Stanners C.P., Junghans R.P. Carcinoembryonic antigen-immunoglobulin Fc fusion protein (CEA-Fc) for identification and activation of anti-CEA immunoglobulin-T-cell receptor-modified T cells, representative of a new class of Ig fusion proteins // Cancer Gene Ther. - 2004. - V. 11. - N. 4. - P. 297-306.14. Ma Q., DeMarte L., Wang Y., Stanners C.P., Junghans R.P. Carcinoembryonic antigen-immunoglobulin Fc fusion protein (CEA-Fc) for identification and activation of anti-CEA immunoglobulin-T-cell receptor-modified T cells, representative of a new class of Ig fusion proteins // Cancer Gene Ther. - 2004. - V. 11. - N. 4. - P. 297-306.
15. Chen J., Dave S.K., Simmons A. Prevention of genital herpes in a guinea pig model using a glycoprotein D-specific single chain antibody as a microbicide // Virol J. - 2004. - V. 1. - P. 11.15. Chen J., Dave SK, Simmons A. Prevention of genital herpes in a guinea pig model using a glycoprotein D-specific single chain antibody as a microbicide // Virol J. - 2004. - V. 1. - P. 11 .
16. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. - 2001.16. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. - 2001.
17. Bjerner J., Lebedin Y., Bellanger L., Kuroki M., Shively J.E., Varaas Т., Nustad K., 
Claims (4)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015155637A RU2652955C1 (en) | 2015-12-24 | 2015-12-24 | Monomolecular chimeric t-cellular receptor to cancer-embryonic antigen |
| PCT/RU2016/000903 WO2017111665A1 (en) | 2015-12-24 | 2016-12-20 | Monomolecular chimeric t-cell receptor for carcinoembryonic antigen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015155637A RU2652955C1 (en) | 2015-12-24 | 2015-12-24 | Monomolecular chimeric t-cellular receptor to cancer-embryonic antigen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2652955C1 true RU2652955C1 (en) | 2018-05-03 |
Family
ID=59090828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015155637A RU2652955C1 (en) | 2015-12-24 | 2015-12-24 | Monomolecular chimeric t-cellular receptor to cancer-embryonic antigen |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2652955C1 (en) |
| WO (1) | WO2017111665A1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2077725C1 (en) * | 1992-03-05 | 1997-04-20 | Любовь Львовна Сольская | Method of detection of cancer-embryonic antigen using special antibody diagnosticum |
| US20030027994A1 (en) * | 1996-10-31 | 2003-02-06 | Anderson W. H. Kerr | High affinity humanized anti-CEA monoclonal antibodies |
| US8642742B2 (en) * | 2011-03-02 | 2014-02-04 | Roche Glycart Ag | Anti-CEA antibodies |
| RU2522004C2 (en) * | 2012-04-10 | 2014-07-10 | Владимир Константинович Боженко | Single-chain antibody to carcinoembryonic antigen, chimeric monomolecular t-cell receptor, vector and host cell for provision of such receptor and method of diagnostics or treatment |
-
2015
- 2015-12-24 RU RU2015155637A patent/RU2652955C1/en active
-
2016
- 2016-12-20 WO PCT/RU2016/000903 patent/WO2017111665A1/en active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2077725C1 (en) * | 1992-03-05 | 1997-04-20 | Любовь Львовна Сольская | Method of detection of cancer-embryonic antigen using special antibody diagnosticum |
| US20030027994A1 (en) * | 1996-10-31 | 2003-02-06 | Anderson W. H. Kerr | High affinity humanized anti-CEA monoclonal antibodies |
| US8642742B2 (en) * | 2011-03-02 | 2014-02-04 | Roche Glycart Ag | Anti-CEA antibodies |
| RU2522004C2 (en) * | 2012-04-10 | 2014-07-10 | Владимир Константинович Боженко | Single-chain antibody to carcinoembryonic antigen, chimeric monomolecular t-cell receptor, vector and host cell for provision of such receptor and method of diagnostics or treatment |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2017111665A1 (en) | 2017-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210324071A1 (en) | Chimeric antigen receptors and methods of making | |
| JP7202512B2 (en) | Antigen-binding protein that recognizes MAGE-A4-derived peptide | |
| Koneru et al. | IL-12 secreting tumor-targeted chimeric antigen receptor T cells eradicate ovarian tumors in vivo | |
| JP2020012000A (en) | Engineering and delivery of therapeutic compositions of freshly isolated cells | |
| TWI802557B (en) | Methods of transducing and expanding immune cells and uses thereof | |
| WO2018233589A1 (en) | Method for preparing clinical-grade car-t cell preparation by transfecting t cell with minicircle dna | |
| JP2022526372A (en) | CAR for use in the treatment of HvG disease | |
| Hassani et al. | Engineered jurkat cells for targeting prostate-specific membrane antigen on prostate cancer cells by nanobody-based chimeric antigen receptor | |
| RU2522004C2 (en) | Single-chain antibody to carcinoembryonic antigen, chimeric monomolecular t-cell receptor, vector and host cell for provision of such receptor and method of diagnostics or treatment | |
| da Silva et al. | The war is on: the immune system against glioblastoma—how can nk cells drive this battle? | |
| RU2652955C1 (en) | Monomolecular chimeric t-cellular receptor to cancer-embryonic antigen | |
| RU2650858C2 (en) | Monomolecular chemeric t-cellular receptor to cancer-embryonic antigen | |
| WO2018205344A1 (en) | Cea.car-t, preparation method therefor and use thereof | |
| WO2023284875A1 (en) | Chimeric antigen receptor | |
| Çelik | A Systemic comparison of different chimeric antigen receptor (car) designs for retargeting of NK-92 cells against tumor antigens | |
| WO2023123225A1 (en) | Application of sirt1-7 protein in immunotherapy | |
| Bozhenko et al. | Characteristics of new monomolecular chimeric T-cell receptors to carcinoembryonic antigen | |
| Houtenbos et al. | The novel bispecific diabody αCD40/αCD28 strengthens leukaemic dendritic cell‐induced T‐cell reactivity | |
| WO2020085480A1 (en) | High-efficiency method for producing genetically modified cells | |
| Kennewick et al. | Nonsignaling Extracellular Spacer Regulates Tumor Antigen Selectivity of CAR T Cells | |
| Dow et al. | The Development of Adoptive T-Cell Immunotherapies for Cancer: Challenges and Prospects | |
| JP2022533247A (en) | CCR4-targeted chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of CCR4-positive malignancies | |
| IL303809A (en) | Peptide markers to track genetically engineered cells |