RU2651521C1 - Method of microvesicules insulation from blood - Google Patents
Method of microvesicules insulation from blood Download PDFInfo
- Publication number
- RU2651521C1 RU2651521C1 RU2017122918A RU2017122918A RU2651521C1 RU 2651521 C1 RU2651521 C1 RU 2651521C1 RU 2017122918 A RU2017122918 A RU 2017122918A RU 2017122918 A RU2017122918 A RU 2017122918A RU 2651521 C1 RU2651521 C1 RU 2651521C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood
- exosomes
- cell
- ultrafiltration
- centrifugation
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к биотехнологии и диагностической медицине может использоваться для изоляции, а также исследования микровезикул крови в различных целях, в том числе и диагностических.The invention relates to biotechnology and diagnostic medicine can be used for isolation, as well as the study of blood microvesicles for various purposes, including diagnostic.
Уровень техникиState of the art
Экзосомы представляют собой микровезикулы размером 20-100 нм, активно секретируемые через каскад экзоцитоза. Экзосомы секретируются в определенных физиологических условиях из различных типов клеток организма и предназначены для межклеточных взаимодействий (см. Гусаченко О.Н., Зенкова М.А., Власов В.В. Нуклеиновые кислоты экзосом: маркеры заболеваний и молекулы межклеточной коммуникации // Биохимия. 2013. Т. 78. №1. С. 5-13). Экзосомы переносят биомаркеры состояния продуцирующих их клеток, служат для ранней диагностики, определения стадии и факта прогрессии различных заболеваний, в том числе онкологической патологии, что поможет оказать своевременное лечение и оценить его эффективность (См. Medvedeva, N.V. Nanobiotechnology and nanomedicine. / N.V. Medvedeva, О.M. Ipatova, D. IvanovIu // Biomed Khim. - 2006. - T 52. - №6. - C. 529-546). Для повышения доступности данного метода диагностики необходимо создание новых способов получения микровезикул, не требующих дорогостоящих реактивов и оборудования, а также сократить трудоемкость процесса.Exosomes are microvesicles 20-100 nm in size, actively secreted through the cascade of exocytosis. Exosomes are secreted under certain physiological conditions from various types of body cells and are designed for intercellular interactions (see Gusachenko O.N., Zenkova M.A., Vlasov V.V. Exosome nucleic acids: disease markers and intercellular communication molecules // Biochemistry. 2013.V. 78. No. 1. S. 5-13). Exosomes transfer biomarkers of the state of the cells that produce them, serve for early diagnosis, determine the stage and fact of the progression of various diseases, including oncological pathology, which will help provide timely treatment and evaluate its effectiveness (See Medvedeva, NV Nanobiotechnology and nanomedicine. / NV Medvedeva, O. M. Ipatova, D. IvanovIu // Biomed Khim. - 2006. - T 52. - No. 6. - C. 529-546). To increase the availability of this diagnostic method, it is necessary to create new methods for producing microvesicles that do not require expensive reagents and equipment, as well as reduce the complexity of the process.
Известен способ выделения микровезикул эритроцитов из надосадочной жидкости, который включает забор крови, промывание эритроцитов, инкубацию отмытых клеток в присутствии кальция и ионофора А 23187, центрифугирование при 1000 g в течение 10 мин для получения супернатанта, ультрацентрифугирование супернатанта при 100000 g в течение 60 мин, получение осадка, содержащего микровезикулы (см. Allan D, Thomas P, Limbrick AR:The isolation and characterization of 60 nm vesicles ('nanovesicles') produced during ionophore A23187-induced budding of human erythrocytes. Biochem J 1980, 188: 881-887).A known method of isolating erythrocyte microvesicles from a supernatant, which includes blood sampling, washing of red blood cells, incubation of washed cells in the presence of calcium and ionophore A 23187, centrifugation at 1000 g for 10 min to obtain a supernatant, ultracentrifugation of the supernatant at 100000 g for 60 min obtaining a sediment containing microvesicles (see Allan D, Thomas P, Limbrick AR: The isolation and characterization of 60 nm vesicles ('nanovesicles') produced during ionophore A23187-induced budding of human erythrocytes. Biochem J 1980, 188: 881-887 )
Недостатками способа являются длительность и трудоемкость выделения экзосом, низкий выход микровезикул, выделенных из крови.The disadvantages of the method are the duration and complexity of the selection of exosomes, low yield of microvesicles isolated from the blood.
Известен способ получения экзосом из плазмы крови, заключающийся в следующем. Образцы плазмы фильтровали через фильтры с диаметром пор 0,220 мкм для удаления клеточного дебриса и более крупных частиц и разделяли компоненты плазмы при помощи белковой жидкостной хроматографии. Фракции объединяли и концентрировали путем центрифугирования с помощью 3 кДа-отсекающих фильтров (Millipore). Затем сконцентрированный препарат наносили на сахарозный градиент (0.2-2.5 М в 20 мМ трис, pH 8.0) и ультрацентрифугировали (175000 g, 16 ч). Частицы, находящиеся в диапазоне концентрации сахарозы 1.08-1.15 г/мл, объединяли, отмывали раствором PBS (10 мМ фосфатный буфер, 0,15 М NaCl, pH 7,5) и осаждали при помощи ультрацентрифугирования (175000 g, 2 ч) (см. Looze С, Yui D., Leung L., Ingham M, Kaler M., Yao X., Wu W.W., Shen R.-F., Daniels M.P., Levine S.J. Proteomic profiling of human plasma exosomes identifies PPAR as an exosome-associated protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 378. P. 433-438).A known method of producing exosomes from blood plasma, which consists in the following. Plasma samples were filtered through 0.220 μm filters to remove cell debris and larger particles, and plasma components were separated using protein liquid chromatography. Fractions were combined and concentrated by centrifugation using 3 kDa cut-off filters (Millipore). Then, the concentrated preparation was applied on a sucrose gradient (0.2–2.5 M in 20 mM Tris, pH 8.0) and ultracentrifuged (175000 g, 16 h). Particles in the sucrose concentration range of 1.08-1.15 g / ml were combined, washed with PBS solution (10 mM phosphate buffer, 0.15 M NaCl, pH 7.5) and precipitated by ultracentrifugation (175000 g, 2 h) (cm Looze C, Yui D., Leung L., Ingham M, Kaler M., Yao X., Wu WW, Shen R.-F., Daniels MP, Levine SJ Proteomic profiling of human plasma exosomes identifies PPAR as an exosome- associated protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 378. P. 433-438).
Недостатками способа являются недостаточная чистота целевого продукта (примесь микрочастиц диаметром 100-220 нм), трудоемкость и длительность выделения экзосом (более 23 ч), а также необходимость использования дорогостоящего оборудования, что затрудняет воспроизводство данной методики в широкой лабораторно-диагностической практике.The disadvantages of the method are the insufficient purity of the target product (an admixture of microparticles with a diameter of 100-220 nm), the complexity and duration of the isolation of exosomes (more than 23 hours), and the need to use expensive equipment, which makes it difficult to reproduce this technique in wide laboratory diagnostic practice.
Известен способ получения экзосом из плазмы крови, заключающийся в следующем. Клетки и дебрис удаляли путем последовательного центрифугирования периферической крови, супернатант фильтровали через фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Экзосомы плазмы крови выделяли с помощью коммерческого набора ExoQuick™ Exosome Precipitation Solution (System Biosciences Inc., Mountain View, CA, USA) (см. Ge Q., Zhou Y., Lu J., Bai Y., Xie X., Lu Z. miRNA in plasma exosome is stable under different storage conditions // Molecules. 2014. V. 19. P. 1568-1575).A known method of producing exosomes from blood plasma, which consists in the following. Cells and debris were removed by sequential centrifugation of peripheral blood, the supernatant was filtered through filters with a pore diameter of 0.2 μm. Blood plasma exosomes were isolated using a commercial ExoQuick ™ Exosome Precipitation Solution kit (System Biosciences Inc., Mountain View, CA, USA) (see Ge Q., Zhou Y., Lu J., Bai Y., Xie X., Lu Z. miRNA in plasma exosome is stable under different storage conditions // Molecules. 2014. V. 19. P. 1568-1575).
Недостатками способа являются недостаточная чистота целевого продукта (примесь микрочастиц диаметром 100-200 нм), длительность выделения экзосом (более 10 ч), высокая стоимость коммерческого набора для выделения экзосом, что затрудняет воспроизводство данной методики в широкой лабораторно-диагностической практике.The disadvantages of the method are the lack of purity of the target product (an admixture of microparticles with a diameter of 100-200 nm), the duration of the isolation of exosomes (more than 10 hours), the high cost of a commercial kit for the isolation of exosomes, which complicates the reproduction of this technique in wide laboratory diagnostic practice.
Известен способ получения экзосом из крови, заключающийся в следующем. Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 300 g в течение 10 мин. Далее клеточную фракцию крови подвергают последовательной двухстадийной обработке сначала буферным раствором PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, с последующим инкубированием в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием в течение 20 мин при 300 g и собирают супернатант №1. Затем клетки обрабатывают равным объемом 0,15% раствора трипсина в PBS, добавляют ингибитор трипсина, перемешивают, клетки осаждают центрифугированием в течение 20 мин при 300 g и собирают супернатант №2. Плазму, супернатант №1 и супернатант №2 объединяют и используют в качестве исходного материала для получения суммарного пула экзосом крови. Для этого из объединенного образца удаляют клеточный дебрис и частицы неэкзосомального происхождения центрифугированием при 20000 g в течение 10 мин с последующей фильтрацией через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, а экзосомы осаждают ультрацентрифугированием при 160000 g в течение 60 минут (см. пат. RU 2556825, МПК. C12N 5/00 (2006.01), опубл. 20.07.2015 г.).A known method of producing exosomes from the blood, which consists in the following. Blood is separated into plasma and cell fraction by centrifugation at 300 g for 10 minutes. Next, the blood cell fraction is subjected to a sequential two-stage treatment, first with PBS buffer solution containing 5 mM EDTA, followed by incubation for 5 minutes. Cells are pelleted by centrifugation for 20 min at 300 g and supernatant No. 1 is collected. Then the cells are treated with an equal volume of a 0.15% trypsin solution in PBS, a trypsin inhibitor is added, mixed, the cells are pelleted by centrifugation for 20 min at 300 g and supernatant No. 2 is collected. Plasma, supernatant No. 1 and supernatant No. 2 are combined and used as starting material to obtain a total pool of blood exosomes. For this purpose, cell debris and particles of non-exosomal origin are removed from the combined sample by centrifugation at 20,000 g for 10 min, followed by filtration through filters with a pore diameter of 0.1 μm, and exosomes are precipitated by ultracentrifugation at 160,000 g for 60 minutes (see US Pat. 2556825, IPC.
Недостатком данного способа является длительность, сложность воспроизводства, необходимость использования дорогостоящего оборудования, что затрудняет воспроизводство данной методики в широкой лабораторно-диагностической практике.The disadvantage of this method is the duration, complexity of reproduction, the need to use expensive equipment, which makes it difficult to reproduce this technique in wide laboratory diagnostic practice.
Наиболее близким к заявленному способу прототипом является способ получения экзосом из крови, заключающийся в следующем. Разделяют кровь на бесклеточную и клеточную фракции с помощью центрифугирования, затем плазму фильтруют через фильтры с диаметром пор 100 нм и проводят два раунда ультрацентрифугирования при 100000 g в течение 1,5 ч (О.С. Тутанов, С.Н. Тамкович, А.Е. Григорьева, Е.И. Рябчикова, Т.Г. Дужак, П.П. Лактионов // Сибирский онкологический журнал, 2015. Приложение №1. С. 82-83).Closest to the claimed method, the prototype is a method for producing exosomes from blood, which consists in the following. Separate blood into cell-free and cell fractions by centrifugation, then filter the plasma through filters with a pore diameter of 100 nm and conduct two rounds of ultracentrifugation at 100,000 g for 1.5 hours (O.S. Tutanov, S.N. Tamkovich, A. E. Grigoryeva, E.I. Ryabchikova, T.G. Duzhak, P.P. Laktionov // Siberian Oncology Journal, 2015. Appendix No. 1. P. 82-83).
Недостатком данного способа является длительность и необходимость использования дорогостоящего оборудования, что затрудняет воспроизводство данной методики в широкой лабораторно-диагностической практике.The disadvantage of this method is the duration and necessity of using expensive equipment, which complicates the reproduction of this technique in wide laboratory diagnostic practice.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа изоляции микровезикул из крови, обладающего сокращением длительности и снижением трудоемкости способа, а также увеличением выхода экзосом.The objective of the invention is to develop a method of isolation of microvesicles from blood, having a reduction in duration and a decrease in the complexity of the method, as well as an increase in the yield of exosomes.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к увеличению выхода экзосом до 27,03±5,01 мкг/мл (пример 3) против 25,02±5,74 мкг/мл по прототипу.The technical result that can be obtained using the present invention is to increase the yield of exosomes to 27.03 ± 5.01 μg / ml (Example 3) against 25.02 ± 5.74 μg / ml according to the prototype.
Технический результат достигается с помощью способа изоляции микровезикул из крови, включающий разделение крови на бесклеточную и клеточную фракции с помощью центрифугирования с последующим получением экзосом путем ультрафильтрации, отличающийся тем, что разделения исходного образца крови на плазму и клеточную фракцию проводят путем центрифугирования при 300 g, затем клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS, с последующим центрифугированием в течение 20 мин при 400 g, затем производят удаление клеточного дебриса посредством ультрафильтрации через ультрафильтрационную ячейку с мембраной МФ АС-ОС-1 под давлением 2 атм, причем полученный фильтрат подвергают повторной ультрафильтрации через мембрану УПМ-50 под давлением 2 атм.The technical result is achieved using a method of isolating microvesicles from blood, including the separation of blood into cell-free and cell fractions by centrifugation followed by exosomes by ultrafiltration, characterized in that the separation of the original blood sample into plasma and cell fraction is carried out by centrifugation at 300 g, then the cell fraction of blood is subjected to sequential treatment with PBS buffer solution, followed by centrifugation for 20 min at 400 g, then remove letochnogo debris by ultrafiltration through an ultrafiltration cell with a membrane MF AU-OS-1 under a pressure of 2 atm, and the obtained filtrate was subjected to repeated ultrafiltration through a membrane IMOD 50 under a pressure of 2 atm.
Таким образом, способ изоляции экзосом из крови, включающего разделение крови на плазму и клеточную фракцию с помощью центрифугирования при 300 g в течение 15 мин, последовательную обработку клеточной фракции крови буферным раствором PBS, сбор супернатанта №1, затем встряхивание пробирки посредством встряхивателя V3 типа «Vortex» (скорость вращения 2000 об/мин) с последующим центрифугированием 25 мин при 400 g, сбор супернатанта №2, с последующим получением пула экзосом 27,03±5,01 мкг/мл путем последовательной ультрафильтрации через мембрану МФ АС-ОС-1 (диаметр пор 0,220 мкм) и УПМ-50 (диаметр пор 0,05 мкм) под давлением 2 атм.Thus, a method for isolating exosomes from blood, including separation of blood into plasma and the cell fraction by centrifugation at 300 g for 15 min, sequentially processing the cell fraction of blood with PBS buffer solution, collecting supernatant No. 1, then shaking the tube with a V3 shaker type Vortex ”(rotation speed 2000 rpm), followed by centrifugation for 25 min at 400 g, collecting supernatant No. 2, followed by obtaining an exosome pool of 27.03 ± 5.01 μg / ml by successive ultrafiltration through an MF AC-OS-1 membrane (di pore ameter 0.220 μm) and UPM-50 (pore diameter 0.05 μm) under a pressure of 2 atm.
В результате получают суммарный пул экзосом крови, который включает экзосомы плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови, что позволяет повысить выход целевого продукта и в последующем повысить чувствительность диагностических систем путем увеличения количества диагностического материала в анализе.The result is a total pool of blood exosomes, which includes plasma exosomes and exosomes associated with the surface of blood cells, which allows to increase the yield of the target product and subsequently increase the sensitivity of diagnostic systems by increasing the amount of diagnostic material in the analysis.
Определяющим отличием предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, является то, что разделение исходного образца крови на плазму и клеточную фракцию проводят путем центрифугирования при 300 g. Клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS, с последующим центрифугированием 25 мин при 400 g, удаление клеточного дебриса посредством ультрафильтрации через ультрафильтрационную ячейку (8200, 200 мл, Millipore) с мембраной МФ АС-ОС-1 (диаметр пор 0,220 мкм) под давлением 2 атм. В качестве источника давления используют закись азота. Полученный фильтрат подвергают повторной ультрафильтрации через мембрану УПМ-50 (диаметр пор 0,05 мкм) под давлением 2 атм.The defining difference of the proposed method, compared with the prototype, is that the separation of the original blood sample into plasma and the cell fraction is carried out by centrifugation at 300 g. The blood cell fraction is subjected to sequential treatment with PBS buffer solution, followed by centrifugation for 25 min at 400 g, removal of cell debris by ultrafiltration through an ultrafiltration cell (8200, 200 ml, Millipore) with a MF AC-OS-1 membrane (pore diameter 0.220 μm) under pressure of 2 atm. Nitrous oxide is used as a pressure source. The obtained filtrate is subjected to repeated ultrafiltration through a UPM-50 membrane (pore diameter 0.05 μm) under a pressure of 2 atm.
Сущность способа изоляции микровезикул из крови заключается в следующем. Производят сбор крови в вакутейнер с антикоагулянтом. Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 300 g в течение 15 мин, затем клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS (5-мин инкубация с последующим центрифугированием 25 мин при 400 g), сбор супернатанта №1; затем встряхивание пробирки с последующим центрифугированием 25 минут при 400 g, сбор супернатанта №2, затем плазму и полученные супернатанты из клеточной фракции, содержащие экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов, объединяют и используют в качестве исходного материала для получения суммарного пула экзосом крови, затем из полученного образца удаляют клеточный дебрис посредством ультрафильтрации через ультрафильтрационную ячейку (8200, 200 мл, Millipore) с мембраной МФ АС-ОС-1 (диаметр пор 0,220 мкм) под давлением 2 атм. В качестве источника давления используют закись азота, затем полученный фильтрат подвергают повторной ультрафильтрации через мембрану УПМ-50 (диаметр пор 0,05 мкм) под давлением 2 атм.The essence of the method of isolation of microvesicles from blood is as follows. Blood is collected in a vakuteyner with an anticoagulant. Blood is separated into plasma and cell fraction by centrifugation at 300 g for 15 min, then the cell fraction of blood is subjected to sequential treatment with PBS buffer solution (5 min incubation, followed by centrifugation 25 min at 400 g), collection of supernatant No. 1; then shaking the tube, followed by centrifugation for 25 minutes at 400 g, collecting supernatant No. 2, then the plasma and the obtained supernatants from the cell fraction containing exosomes associated with the surface of the shaped elements are combined and used as starting material to obtain a total pool of blood exosomes, then cell debris is removed from the obtained sample by ultrafiltration through an ultrafiltration cell (8200, 200 ml, Millipore) with a MF AC-OS-1 membrane (pore diameter 0.220 μm) under a pressure of 2 atm. Nitrous oxide is used as a pressure source, then the obtained filtrate is subjected to repeated ultrafiltration through a UPM-50 membrane (pore diameter 0.05 μm) under a pressure of 2 atm.
Способ изоляции микровезикул из крови поясняется таблицей, в которой приведены результаты определения концентрации белка в полученных фильтратах (см. в конце описания).The method of isolation of microvesicles from blood is illustrated by the table, which shows the results of determining the concentration of protein in the obtained filtrates (see the end of the description).
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Примеры конкретного выполнения способа изоляции микровезикул из крови.Examples of specific performance of the method of isolation of microvesicles from blood.
Пример 1.Example 1
Проводят сбор крови в вакутейнер с антикоагулянтом. Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 500 g в течение 10 мин. Клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS (5-мин инкубация с последующим центрифугированием 15 мин при 600 g), сбор супернатанта №1; затем резкое встряхивание пробирки с последующим центрифугированием 20 мин при 400 g, сбор супернатанта №2. Плазму и полученные супернатанты из клеточной фракции, содержащие экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов, объединяют и используют в качестве исходного материала для получения суммарного пула экзосом крови.Blood is collected in a vakuteyner with an anticoagulant. Blood is separated into plasma and cell fraction by centrifugation at 500 g for 10 minutes. The blood cell fraction is subjected to sequential treatment with PBS buffer solution (5 min incubation, followed by centrifugation for 15 min at 600 g), collecting supernatant No. 1; then vigorously shaking the tube, followed by centrifugation for 20 min at 400 g, collecting supernatant No. 2. Plasma and the obtained supernatants from the cell fraction containing exosomes associated with the surface of the formed elements are combined and used as starting material to obtain a total pool of blood exosomes.
Затем из полученного образца удаляют клеточный дебрис посредством ультрафильтрации через ультрафильтрационную ячейку (8200, 200 мл, Millipore) с мембраной МФ АС-ОС-1 (диаметр пор 0,220 мкм) под давлением 2 атм. В качестве источника давления используют закись азота.Then, cell debris was removed from the obtained sample by ultrafiltration through an ultrafiltration cell (8200, 200 ml, Millipore) with a MF AC-OS-1 membrane (pore diameter 0.220 μm) under a pressure of 2 atm. Nitrous oxide is used as a pressure source.
Полученный фильтрат подвергают повторной ультрафильтрации через мембрану УПМ-50 (диаметр пор 0,05 мкм) под давлением 1 атм.The obtained filtrate is subjected to repeated ultrafiltration through a UPM-50 membrane (pore diameter 0.05 μm) under a pressure of 1 atm.
Для оценки количества выделенных экзосом с использованием способа-прототипа и предлагаемого способа была измерена концентрация белка в 1 мл анализируемого вещества с использованием коммерческого набора NanoOrange Quantification Kit (Invitrogen, США) по протоколу, рекомендованному производителем.To assess the number of isolated exosomes using the prototype method and the proposed method, the protein concentration in 1 ml of the analyte was measured using a commercial NanoOrange Quantification Kit (Invitrogen, USA) according to the protocol recommended by the manufacturer.
В примере 1 получают невысокий суммарный пул экзосом крови, который включает экзосомы плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови, что не позволяет сохранить выход целевого продукта.In example 1, receive a low total pool of blood exosomes, which includes plasma exosomes and exosomes associated with the surface of blood cells, which does not allow to preserve the yield of the target product.
Пример 2.Example 2
Проводят сбор крови в вакутейнер с антикоагулянтом. Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 400 g в течение 10 мин. Клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS (10-мин инкубация с последующим центрифугированием 20 мин при 500 g), сбор супернатанта №1; затем резкое встряхивание пробирки с последующим центрифугированием 20 мин при 400 g, сбор супернатанта №2. Плазму и полученные супернатанты из клеточной фракции, содержащие экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов, объединяют и используют в качестве исходного материала для получения суммарного пула экзосом крови.Blood is collected in a vakuteyner with an anticoagulant. Blood is separated into plasma and cell fraction by centrifugation at 400 g for 10 minutes. The blood cell fraction is subjected to sequential treatment with PBS buffer solution (10 min incubation, followed by centrifugation for 20 min at 500 g), collecting supernatant No. 1; then vigorously shaking the tube, followed by centrifugation for 20 min at 400 g, collecting supernatant No. 2. Plasma and the obtained supernatants from the cell fraction containing exosomes associated with the surface of the formed elements are combined and used as starting material to obtain a total pool of blood exosomes.
Затем из полученного образца удаляют клеточный дебрис посредством ультрафильтрации через ультрафильтрационную ячейку (8200, 200 мл, Millipore) с мембраной МФ АС-ОС-1 (диаметр пор 0,220 мкм) под давлением 1 атм. В качестве источника давления используют закись азота.Then, cell debris was removed from the obtained sample by ultrafiltration through an ultrafiltration cell (8200, 200 ml, Millipore) with a MF AC-OS-1 membrane (pore diameter 0.220 μm) under a pressure of 1 atm. Nitrous oxide is used as a pressure source.
Полученный фильтрат подвергают повторной ультрафильтрации через мембрану УПМ-50 (диаметр пор 0,05 мкм) под давлением 2 атм.The obtained filtrate is subjected to repeated ultrafiltration through a UPM-50 membrane (pore diameter 0.05 μm) under a pressure of 2 atm.
Для оценки количества выделенных экзосом с использованием способа-прототипа и предлагаемого способа была измерена концентрация белка в 1 мл анализируемого вещества с использованием коммерческого набора NanoOrange Quantification Kit (Invitrogen, США) по протоколу, рекомендованному производителем. Результаты исследования представлены в таблице (см. пример 2).To assess the number of isolated exosomes using the prototype method and the proposed method, the protein concentration in 1 ml of the analyte was measured using a commercial NanoOrange Quantification Kit (Invitrogen, USA) according to the protocol recommended by the manufacturer. The results of the study are presented in the table (see example 2).
В результате получают высокий суммарный пул экзосом крови, который включает экзосомы плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови, что позволяет сохранить выход целевого продукта, а также сократить трудовые и финансовые затраты.The result is a high total pool of blood exosomes, which includes plasma exosomes and exosomes associated with the surface of blood cells, which allows you to save the yield of the target product, as well as reduce labor and financial costs.
Пример 3.Example 3
Проводят сбор крови в вакутейнер с антикоагулянтом. Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 300 g в течение 15 мин. Клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS (5-мин инкубация с последующим центрифугированием 25 мин при 400 g), сбор супернатанта №1; затем резкое встряхивание пробирки с последующим центрифугированием 20 мин при 400 g, сбор супернатанта №2. Плазму и полученные супернатанты из клеточной фракции, содержащие экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов, объединяют и используют в качестве исходного материала для получения суммарного пула экзосом крови.Blood is collected in a vakuteyner with an anticoagulant. Blood is separated into plasma and cell fraction by centrifugation at 300 g for 15 minutes. The blood cell fraction is subjected to sequential treatment with PBS buffer solution (5 min incubation, followed by centrifugation for 25 min at 400 g), collecting supernatant No. 1; then vigorously shaking the tube, followed by centrifugation for 20 min at 400 g, collecting supernatant No. 2. Plasma and the obtained supernatants from the cell fraction containing exosomes associated with the surface of the formed elements are combined and used as starting material to obtain a total pool of blood exosomes.
Затем из полученного образца удаляют клеточный дебрис посредством ультрафильтрации через ультрафильтрационную ячейку (8200, 200 мл, Millipore) с мембраной МФ АС-ОС-1 (диаметр пор 0,220 мкм) под давлением 2 атм. В качестве источника давления используют закись азота.Then, cell debris was removed from the obtained sample by ultrafiltration through an ultrafiltration cell (8200, 200 ml, Millipore) with a MF AC-OS-1 membrane (pore diameter 0.220 μm) under a pressure of 2 atm. Nitrous oxide is used as a pressure source.
Полученный фильтрат подвергают повторной ультрафильтрации через мембрану УПМ-50 (диаметр пор 0,05 мкм) под давлением 2 атм.The obtained filtrate is subjected to repeated ultrafiltration through a UPM-50 membrane (pore diameter 0.05 μm) under a pressure of 2 atm.
Для оценки количества выделенных экзосом с использованием способа-прототипа и предлагаемого способа была измерена концентрация белка в 1 мл анализируемого вещества с использованием коммерческого набора NanoOrange Quantification Kit (Invitrogen, США) по протоколу, рекомендованному производителем. Результаты исследования представлены в таблице (см. пример 3).To assess the number of isolated exosomes using the prototype method and the proposed method, the protein concentration in 1 ml of the analyte was measured using a commercial NanoOrange Quantification Kit (Invitrogen, USA) according to the protocol recommended by the manufacturer. The results of the study are presented in the table (see example 3).
В результате получают высокий суммарный пул экзосом крови, который включает экзосомы плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови, что позволяет повысить выход целевого продукта, а также сократить трудовые и финансовые затраты.The result is a high total pool of blood exosomes, which includes plasma exosomes and exosomes associated with the surface of blood cells, which allows to increase the yield of the target product, as well as reduce labor and financial costs.
Пример 4Example 4
Проводят сбор крови в вакутейнер с антикоагулянтом. Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 400 g в течение 10 мин. Клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS (5-мин инкубация с последующим центрифугированием 15 мин при 600 g), сбор супернатанта №1; затем резкое встряхивание пробирки с последующим центрифугированием 20 минут при 400 g, сбор супернатанта №2. Плазму и полученные супернатанты из клеточной фракции, содержащие экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов, объединяют и используют в качестве исходного материала для получения суммарного пула экзосом крови.Blood is collected in a vakuteyner with an anticoagulant. Blood is separated into plasma and cell fraction by centrifugation at 400 g for 10 minutes. The blood cell fraction is subjected to sequential treatment with PBS buffer solution (5 min incubation, followed by centrifugation for 15 min at 600 g), collecting supernatant No. 1; then vigorously shaking the tubes, followed by centrifugation for 20 minutes at 400 g, collecting supernatant No. 2. Plasma and the obtained supernatants from the cell fraction containing exosomes associated with the surface of the formed elements are combined and used as starting material to obtain a total pool of blood exosomes.
Затем из полученного образца удаляют клеточный дебрис посредством ультрафильтрации через ультрафильтрационную ячейку (8200, 200 мл, Millipore) с мембраной МФ АС-ОС-1 (диаметр пор 0,220 мкм) под давлением 2 атм. В качестве источника давления используют закись азота.Then, cell debris was removed from the obtained sample by ultrafiltration through an ultrafiltration cell (8200, 200 ml, Millipore) with a MF AC-OS-1 membrane (pore diameter 0.220 μm) under a pressure of 2 atm. Nitrous oxide is used as a pressure source.
Полученный фильтрат подвергают повторной ультрафильтрации через мембрану УПМ-50 (диаметр пор 0,05 мкм) под давлением 1 атм.The obtained filtrate is subjected to repeated ultrafiltration through a UPM-50 membrane (pore diameter 0.05 μm) under a pressure of 1 atm.
Для оценки количества выделенных экзосом с использованием способа-прототипа и предлагаемого способа была измерена концентрация белка в 1 мл анализируемого вещества с использованием коммерческого набора NanoOrange Quantification Kit (Invitrogen, США) по протоколу, рекомендованному производителем.To assess the number of isolated exosomes using the prototype method and the proposed method, the protein concentration in 1 ml of the analyte was measured using a commercial NanoOrange Quantification Kit (Invitrogen, USA) according to the protocol recommended by the manufacturer.
В результате, получают суммарный пул экзосом крови, который включает экзосомы плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови, что позволяет сохранить выход целевого продукта, а также сократить трудовые и финансовые затраты.As a result, a total pool of blood exosomes is obtained, which includes plasma exosomes and exosomes associated with the surface of blood cells, which allows you to save the yield of the target product, as well as reduce labor and financial costs.
Таким образом, наиболее оптимальным является пример 3, причем реализация предлагаемого способа позволяет сохранить эффективность изоляции экзосом из крови (см. таблица), при этом сокращаются трудоемкость, стоимость используемых реактивов и оборудования, а также длительность проведения методики (время на проведение изоляции экзосом) с 4-х до 2,5 часов.Thus, the most optimal is example 3, and the implementation of the proposed method allows you to save the efficiency of isolation of exosomes from the blood (see table), while reducing the complexity, cost of reagents and equipment used, as well as the duration of the technique (time to conduct isolation of exosomes) with 4 to 2.5 hours.
Предлагаемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:The proposed method has the following advantages compared to the prototype:
- позволяет снизить финансовые затраты на получение экзосом из крови;- allows you to reduce the financial costs of getting exosomes from the blood;
- позволяет обеспечить доступность диагностических исследований на основе анализа экзосом для небольших лабораторий;- allows to ensure the availability of diagnostic studies based on exosome analysis for small laboratories;
- позволяет уменьшить длительность способа с 4-х часов до 2,5 часов.- allows to reduce the duration of the method from 4 hours to 2.5 hours.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017122918A RU2651521C1 (en) | 2017-06-27 | 2017-06-27 | Method of microvesicules insulation from blood |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017122918A RU2651521C1 (en) | 2017-06-27 | 2017-06-27 | Method of microvesicules insulation from blood |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2651521C1 true RU2651521C1 (en) | 2018-04-19 |
Family
ID=61976876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017122918A RU2651521C1 (en) | 2017-06-27 | 2017-06-27 | Method of microvesicules insulation from blood |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2651521C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2741776C1 (en) * | 2020-02-25 | 2021-01-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for plasma exosome release |
| RU2771096C1 (en) * | 2021-02-04 | 2022-04-26 | Гордейчук Владимир Евгеньевич | Method for isolating microvesicles from plants of the amaranth family |
| RU2803918C1 (en) * | 2023-01-25 | 2023-09-21 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный университет" | Method of producing purified cultured blood serum depleted in growth factors |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016033695A1 (en) * | 2014-09-05 | 2016-03-10 | Exerkine Corporation | Exosome isolation |
| RU2605853C1 (en) * | 2015-07-27 | 2016-12-27 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет" (ФГАОУ ВПО КФУ) | Method of producing a medicinal preparation based on human cell vesicles |
-
2017
- 2017-06-27 RU RU2017122918A patent/RU2651521C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016033695A1 (en) * | 2014-09-05 | 2016-03-10 | Exerkine Corporation | Exosome isolation |
| RU2605853C1 (en) * | 2015-07-27 | 2016-12-27 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет" (ФГАОУ ВПО КФУ) | Method of producing a medicinal preparation based on human cell vesicles |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THERY C. ET AL. "Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids".//Curr Protoc Cell Biol., 2006, 3, unit 3.221-3.229. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2741776C1 (en) * | 2020-02-25 | 2021-01-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for plasma exosome release |
| RU2771096C1 (en) * | 2021-02-04 | 2022-04-26 | Гордейчук Владимир Евгеньевич | Method for isolating microvesicles from plants of the amaranth family |
| WO2022169383A1 (en) * | 2021-02-04 | 2022-08-11 | ГОРДЕЙЧУК, Владимир Евгеньевич | Method for isolating microvesicules from plants of the amaranthaceae family |
| RU2803918C1 (en) * | 2023-01-25 | 2023-09-21 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный университет" | Method of producing purified cultured blood serum depleted in growth factors |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2608509C1 (en) | Method of obtaining blood exosomes | |
| Abramowicz et al. | Proteomic analysis of exosomal cargo: the challenge of high purity vesicle isolation | |
| JP5823031B2 (en) | Vesicle capture device and method for using the same | |
| ES2762677T3 (en) | Methods for isolating microvesicles and nucleic acid extraction from biological samples | |
| Witwer et al. | Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research | |
| US9829483B2 (en) | Methods of isolating extracellular vesicles | |
| CN106399250A (en) | Method and kit for separating exosome | |
| US20190301985A1 (en) | Methods for affinity-based non-antibody capture and purification of extracellular vesicles | |
| CN114591905B (en) | Method for preparing apoptotic vesicles from human erythrocytes and application of apoptotic vesicles | |
| RU2745613C1 (en) | Method and device for recovering extracellular vesicles from biological fluids by means of cascade ultrafiltration | |
| RU2651521C1 (en) | Method of microvesicules insulation from blood | |
| WO2018172384A1 (en) | Methods and kits for exosome isolation and quantification | |
| WO2017136430A1 (en) | Exosome-total-isoloation-chip (exotic) device for isolation of exosome-based biomarkers | |
| WO2017154951A1 (en) | Method for recovering extracellular vesicles | |
| CN113249302A (en) | Efficient exosome separation and purification method | |
| ES2908932T3 (en) | Nucleic acid microvesicle profiling and uses thereof as hallmarks in kidney transplant rejection diagnosis | |
| JP2020521443A (en) | Microvesicle nucleic acids and/or proteins and their use as markers for renal transplant rejection | |
| CN104833805A (en) | Circulating tumor cell detection and identification kit and application thereof | |
| CN108362535B (en) | Method for extracting extracellular vesicles from body fluid based on aqueous two-phase system | |
| US20120164634A1 (en) | Method for Separating Particles and/or Cells Having 2 and More Surface Specificities | |
| CN103900890A (en) | Method for extracting urinary micro vesicle using nanofilm concentration | |
| EP4353815A1 (en) | Method for isolating extracellular vesicle using salt fractional precipitation | |
| CN110551680A (en) | Method and system for extracting pleural effusion exosomes | |
| CN205898536U (en) | Separation and extraction secretes stromatolite centrifugal filtration device of body outward | |
| CN113913367A (en) | Exosome separation and enrichment method based on exosome enrichment device |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190628 |