RU2644677C2 - Msi-specific peptides with shifted reading frame (srf) for prevention and treatment of cancer - Google Patents
Msi-specific peptides with shifted reading frame (srf) for prevention and treatment of cancer Download PDFInfo
- Publication number
- RU2644677C2 RU2644677C2 RU2015115785A RU2015115785A RU2644677C2 RU 2644677 C2 RU2644677 C2 RU 2644677C2 RU 2015115785 A RU2015115785 A RU 2015115785A RU 2015115785 A RU2015115785 A RU 2015115785A RU 2644677 C2 RU2644677 C2 RU 2644677C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vaccine according
- peptide
- mch
- cancer
- vaccine
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 44
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 11
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 36
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 208000032818 Microsatellite Instability Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 20
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 7
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 7
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 229940023860 canarypox virus HIV vaccine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 3
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 claims description 2
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 claims description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 2
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 claims 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 claims 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 8
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 8
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 8
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 102000004060 Transforming Growth Factor-beta Type II Receptor Human genes 0.000 description 6
- 108010082684 Transforming Growth Factor-beta Type II Receptor Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 101000837903 Homo sapiens TATA box-binding protein-associated factor RNA polymerase I subunit B Proteins 0.000 description 5
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 5
- 102100028546 TATA box-binding protein-associated factor RNA polymerase I subunit B Human genes 0.000 description 5
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108060000255 AIM2 Proteins 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 102100024064 Interferon-inducible protein AIM2 Human genes 0.000 description 4
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 208000015768 polyposis Diseases 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000008051 Hereditary Nonpolyposis Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010051922 Hereditary non-polyposis colorectal cancer syndrome Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000005027 Lynch syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100033254 Tumor suppressor ARF Human genes 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 2
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane-2,5-dione Chemical compound O=C1COC(=O)CO1 RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical group [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000037051 Chromosomal Instability Diseases 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100037787 Protein-tyrosine kinase 2-beta Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000021991 hereditary neoplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000043557 human IFNG Human genes 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 208000014680 small intestine neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Abstract
Description
Изобретение обеспечивает вакцину для предотвращения и лечения рака, характеризующегося микросателлитной нестабильностью (МН). Вакцина содержит МСН-специфичный пептид со смещенной рамкой считывания (ПСРС), обеспечивающий гуморальный и клеточный иммунные ответы против опухолевых клеток или нуклеиновых кислот, кодирующих ПСРС.The invention provides a vaccine for the prevention and treatment of cancer characterized by microsatellite instability (MN). The vaccine contains an MCH-specific peptide with a shifted reading frame (PSRS), which provides humoral and cellular immune responses against tumor cells or nucleic acids encoding PSRS.
Опухоли человека развиваются через два главных пути генетической нестабильности: хромосомная нестабильность и микросателлитная нестабильность (МСН), которая возникает в результате дефектов в системе репарации ошибочно спаренных оснований в ДНК. МСН встречается в 15% случаев колоректального рака и в ряде других внекишечных злокачественных новообразований с недостаточной активностью системы репарации ошибочно спаренных оснований в ДНК, таких как рак эндометрия, рак желудка, рак тонкой кишки и опухоли других органов. Раковые заболевания, связанные с МСН, могут развиваться спорадически или в контексте наследственного опухолевого синдрома, наследуемого неполипозного колоректального рака и синдрома Линча.Human tumors develop through two main pathways of genetic instability: chromosomal instability and microsatellite instability (MCH), which occurs as a result of defects in the DNA base repair system. MCH is found in 15% of cases of colorectal cancer and in a number of other extraintestinal malignancies with insufficient activity of the DNA base repair system, such as endometrial cancer, stomach cancer, small intestine cancer, and tumors of other organs. Cancers associated with SIT can develop sporadically or in the context of hereditary tumor syndrome, inherited nonpolyposis colorectal cancer, and Lynch syndrome.
Колоректальные раковые заболевания с МСН характеризуются высокой иммуногенностью, которая является результатом образования многочисленных пептидов со смещенной рамкой считывания (ПСРС) в ходе развития опухолей с МСН, образующихся как результат недостаточной активности системы репарации ошибочно спаренных оснований в ДНК, приводящей к изменениям в рамке считывания при трансляции, в случае мутаций микросателлитов в кодирующих гены участках (Фиг. 1).Colorectal cancers with MSN are characterized by high immunogenicity, which is the result of the formation of numerous peptides with a shifted reading frame (PSRS) during the development of tumors with MSN, which are formed as a result of insufficient activity of the DNA base repair system, which leads to changes in the reading frame during translation , in the case of mutations of microsatellites in gene coding regions (Fig. 1).
Многочисленность предсказуемых специфичных МСН-специфичных антигенов - ПСРС и тот факт, что их образование напрямую связано с процессом злокачественной трансформации, делает ПРСР весьма перспективными мишенями для иммунной терапии. Считается, что человеческая иммунная система является потенциальным ресурсом для уничтожения опухолевых клеток и что может быть разработан эффективный способ лечения, если компоненты иммунной системы должным образом стимулировать для распознавания и уничтожения раковых клеток. Таким образом, иммунотерапия, которая включает составы и способы для активации иммунной системы организма, напрямую или опосредованно направленной на подавление или уничтожение рака, на протяжении многих лет исследуется как дополнение к обычной терапии раковых заболеваний.The large number of predictable specific MCH-specific antigens, PSRS, and the fact that their formation is directly related to the process of malignant transformation, makes CPRS very promising targets for immune therapy. It is believed that the human immune system is a potential resource for killing tumor cells and that an effective treatment method can be developed if the components of the immune system are properly stimulated to recognize and destroy cancer cells. Thus, immunotherapy, which includes compositions and methods for activating the body's immune system, directly or indirectly aimed at suppressing or killing cancer, has been studied for many years as an adjunct to conventional cancer therapy.
Общепризнано, что рост и метастазирование опухолей в большой степени зависят от их способности избегать надзора иммунной системы больного. Большинство опухолей экспрессируют антигены, которые с разной степенью успешности распознаются иммунной системой больного, но во многих случаях ответ иммунной системы недостаточен. Неспособность вызвать сильную активацию эффекторных Т-клеток может быть результатом слабой иммуногенности антигенов опухолевых клеток или недостаточной или отсутствующей экспрессией костимуляторных молекул опухолевыми клетками. Для большинства Т-клеток продукция интерлейкина 2 и пролиферация требуют костимуляторного сигнала одновременно с активацией рецепторов Т-клеток, иначе Т-клетки могут войти в функционально нечувствительное состояние, известное как клональная анергия.It is generally accepted that the growth and metastasis of tumors to a large extent depends on their ability to avoid surveillance of the patient's immune system. Most tumors express antigens that are recognized by the patient’s immune system with varying degrees of success, but in many cases the response of the immune system is insufficient. Failure to induce strong activation of effector T cells may result from poor immunogenicity of tumor cell antigens or insufficient or absent expression of co-stimulatory molecules by tumor cells. For most T cells,
Несмотря на продолжительность исследования этих видов терапии, остается потребность в улучшенных стратегиях усиления иммунного ответа против опухолевых антигенов.Despite the length of the study of these therapies, there remains a need for improved strategies for enhancing the immune response against tumor antigens.
Тем не менее, в данной области существует потребность в безопасных и эффективных составах, которые могли бы стимулировать иммунную систему, в качестве иммунотерапии раковых заболеваний.However, in this area there is a need for safe and effective formulations that could stimulate the immune system as an immunotherapy for cancer.
Согласно представленному изобретению безопасная и эффективная стимуляция иммунной системы в качестве иммунотерапии рака достигается благодаря объектам, определенным в формуле изобретения. Полученные in vitro данные показали, что ПСРС высокоиммуногенны и могут вызывать выраженный ПСРС-специфичный Т-клеточный ответ (innebacher et al., 2001, Ripberger et al., 2003, Schwitalle et al., 2004). В дальнейших исследованиях по изучению переферической крови, взятой у пациентов со связанным с МСН раком кишки, была показана высокая частота ПСРС-специфичных Т-клеточных ответов (Schwitalle et al. 2008). Несмотря на большое количество ПСРС-специфичных Т-клеток в опухоли и периферической крови, пациенты не имели признаков аутоиммунной реакции, что позволяет предположить, что подходы с вакцинацией ПСРС не будут иметь побочных эффектов, связанных с аутоиммунной реакцией.According to the present invention, a safe and effective stimulation of the immune system as a cancer immunotherapy is achieved thanks to the objects defined in the claims. In vitro data showed that PSRS is highly immunogenic and can elicit a pronounced PSRS-specific T-cell response (innebacher et al., 2001, Ripberger et al., 2003, Schwitalle et al., 2004). Further studies of peripheral blood taken from patients with MSN-related colon cancer showed a high incidence of PSRS-specific T-cell responses (Schwitalle et al. 2008). Despite the large number of PSRS-specific T cells in the tumor and peripheral blood, patients did not show signs of an autoimmune reaction, suggesting that approaches to vaccination with PSRS will not have side effects associated with the autoimmune reaction.
Иммунологический анализ индивидов, несущих мутацию в генах системы репарации ошибочно спаренных оснований в ДНК в зародышевой линии, обуславливающую предрасположенность к наследуемому неполипозному колоректальному раку, также показал клеточный иммунный ответ против ПСРС даже в отсутствие клинически обнаружимой опухоли.Immunological analysis of individuals carrying a mutation in the genes of the system of repair of mismatched bases in DNA in the germ line, causing a predisposition to inherited non-polypous colorectal cancer, also showed a cellular immune response against PSRS even in the absence of a clinically detectable tumor.
Это позволяет предположить, что ПСРС-специфичный иммунный ответ может играть защитную роль у индивидов с наследуемым неполипозным колоректальным раком, что дает возможность предположить, что ПСРС-вакцинация также может быть использована в качестве превентивной меры как первичный превентивный подход для пациентов с наследственной предрасположенностью к раку.This suggests that the PSRS-specific immune response may play a protective role in individuals with inherited non-polyposis colorectal cancer, which suggests that PSRS vaccination can also be used as a preventive measure as a primary preventive approach for patients with a hereditary cancer susceptibility .
Таким образом:In this way:
A. Пептиды со смещенной рамкой считывания (ПСРС) специфичны для микросателлитной нестабильности и являются прямым результатом патогенеза связанных с МСН опухолей.A. Peptides with a shifted reading frame (PSRS) are specific for microsatellite instability and are a direct result of the pathogenesis of MSN-related tumors.
Б. Не ожидается клинически значимых побочных эффектов.B. No clinically significant side effects are expected.
B. Ожидается, что комбинации ПСРС будут направлены на все опухоли с МСН.B. It is expected that combinations of PSRS will be directed to all tumors with MCH.
Г. Была разработана ПСРС-вакцинация для терапии 15% раковых заболеваний кишки, опухолей эндометрия, желудка, тонкой кишки и других органов.D. PSRS vaccination has been developed for the treatment of 15% of cancers of the intestine, tumors of the endometrium, stomach, small intestine and other organs.
Д. Молекулярный анализ опухоли может определить пациентов, для которых ПСРС-вакцинация может быть полезна (таргетная терапия).D. Molecular analysis of the tumor can identify patients for whom PSRS vaccination may be useful (targeted therapy).
Е. ПСРС-вакцинация может использоваться в качестве превентивной вакцинации для групп высокого риска.E. PSRS vaccination can be used as a preventive vaccination for high-risk groups.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Фиг. 1: Схематическая иллюстрация кодирующей микросателлитной нестабильности, вызванной недостаточностью системы репарации ошибочно спаренных оснований в ДНК (Kloor et al., 2010).FIG. 1: Schematic illustration of coding microsatellite instability caused by a deficiency in the DNA base repair system (Kloor et al., 2010).
Укороченные белки, охватывающие последовательности ПСРС, образуются, когда мутации кодирующих микросателлитных участков приводят к сдвигу рамки считывания (пример: белок TGFBR2).Shortened proteins spanning the PSRS sequence are formed when mutations in the coding microsatellite regions lead to a shift in the reading frame (example: TGFBR2 protein).
Фиг. 2: Примеры Т-клеточных ответов против новых ПСРС в периферической крови от трех пациентов со связанным с МСН раком кишки.FIG. 2: Examples of T-cell responses against new PSRS in peripheral blood from three patients with MSN-related bowel cancer.
Фиг. 3: Гуморальный иммунный ответ на ПСРС, полученные из АIМ2(-1), HT001(-1), TAF1B(-1) и TGFBR2(-1). Твердофазный иммуноферментный анализ показал, что ПСРС-специфичный ответ антител, направленный против неопептидов, полученных из - AIM2(-1), HT001(-1), TAF1B(-1) и TGFBR2(-1). Специфичность пептидов была продемонстрирована преципитацией соответствующих антител в сыворотке, как было описано ранее (Reuschenbach et al., 2008).FIG. 3: Humoral immune response to PSRS derived from AIM2 (-1), HT001 (-1), TAF1B (-1) and TGFBR2 (-1). Enzyme-linked immunosorbent assay showed that the PSRS-specific antibody response directed against neopeptides derived from - AIM2 (-1), HT001 (-1), TAF1B (-1) and TGFBR2 (-1). The specificity of the peptides was demonstrated by precipitation of the corresponding antibodies in serum, as described previously (Reuschenbach et al., 2008).
Фиг. 4: Цитотоксические ответы, определенные по экспрессии поверхностного CD107аFIG. 4: Cytotoxic responses determined by expression of surface CD107a
А. Значительные ПСРС-специфичные ответы наблюдались у различных здоровых доноров после стимуляции Т-клеток антигеном на протяжении 4 недель. Иммунный ответ возникал только в присутствии антигенпрезентирующих В-клеток и ПСРС-антигена. Репрезентативные реакции показаны на гистограммах.A. Significant PSRS-specific responses were observed in various healthy donors after stimulation of T cells with antigen for 4 weeks. The immune response occurred only in the presence of antigen-presenting B cells and the PSRS antigen. Representative reactions are shown in bar graphs.
Б. Репрезентативный анализ методом FACS CD107а для Т-клеток, инкубированных с В-клетками, служащими в качестве антигенпрезентирующих клеток в отсутствие (левая панель) и в присутствии (правая панель) ПСРС-антигена НТ001(-1).B. Representative FACS analysis of CD107a for T cells incubated with B cells serving as antigen-presenting cells in the absence (left panel) and in the presence (right panel) of the PS00 antigen HT001 (-1).
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает вакцину, содержащую пептиды со смещенной рамкой считывания (ПСРС), специфические для микросателлитной нестабильности, например, полученные из TAF1B (№ доступа L39061), НТ001 (№ доступа AF113539), AIM2 (Acc.No, AF024714) или TGFBR2 (№ доступа NM 003242) или нуклеиновую кислоту, кодирующую названные ПСРС, причем указанные ПСРС способны вызывать иммунный ответ против связанного с МСН рака.Thus, the present invention provides a vaccine containing peptides with a shifted reading frame (PSRS) specific for microsatellite instability, for example, obtained from TAF1B (access no. L39061), HT001 (access no. AF113539), AIM2 (Acc.No, AF024714) or TGFBR2 (accession number NM 003242) or a nucleic acid encoding these PSRS, and these PSRS are able to elicit an immune response against MSN-related cancer.
В предпочтительном варианте реализации вакцина согласно настоящему изобретению содержит:In a preferred embodiment, the vaccine of the present invention comprises:
(a) ПСРС, содержащий следующую последовательность аминокислот или состоящий из нее:(a) PSRS containing the following amino acid sequence or consisting of it:
илиor
(b) функциональный эквивалент ПСРС согласно (b) или(b) the functional equivalent of the PSRS according to (b) or
(c) комбинацию ПСРС согласно (а) и/или (b).(c) a combination of PSDP according to (a) and / or (b).
Термин «функциональный эквивалент» в настоящем тексте относится например, к вариантам или фрагментам ПСРС, которые сохраняют способность вызывать иммунный ответ, направленный против рака, то есть, могут быть использованы в качестве эффективной вакцины. Иммунный ответ определяется как состояние, отвечающее по меньшей мере одному из следующих критериев: 1. Индукция СD8-положительных Т-клеток, обнаруживаемых с помощью анализов цитотоксичности или по секреции интерферона гамма, экспрессии перфоринов, экспрессии гранизима В, или других цитокинов, которые могут продуцироваться СD8-положительными Т-клетками, которая может быть измерена как значение выше фонового методом иммуноферментных пятен (ELISpot), или внутриклеточного окрашивания на цитокины, или с использованием ИФА (ELISA) на цитокины, или эквивалентными методами. 2. Индукция СD4-положительных Т-клеток, обнаружимая по секреции цитокинов, которая может быть измерена как значение выше фонового методом иммуноферментных пятен (ELISpot), или методом внутриклеточного окрашивания на цитокины, или с использованием ИФА (ELISA) на цитокины, или эквивалентными методами. Цитокины могут включать интерферон альфа, интерферон гамма, интерлейкин-2, интерлейкин-5, интерлейкин-6, интерлейкин-10, интерлейкин-12, интерлейкин-13, интерлейкин-17, фактор некроза опухоли альфа, фактор некроза опухоли бета или другие цитокины, которые продуцируются CD4-положительными Т-клетками. 3. Индукция антител, обнаружимая методом вестерн-блоттинга, ИФА или эквивалентными или связанными с ними методами. 4. Индукция клеточного иммунного ответа любого типа, не опосредованного CD8-положительными Т-клетками и СD4-положительными Т-клетками, описанными в пп. 1 и 2.The term "functional equivalent" in this text refers, for example, to variants or fragments of PSRS that retain the ability to elicit an immune response directed against cancer, that is, can be used as an effective vaccine. An immune response is defined as a condition that meets at least one of the following criteria: 1. Induction of CD8-positive T cells detected by cytotoxicity assays or by secretion of interferon gamma, expression of perforins, expression of granisim B, or other cytokines that can be produced CD8-positive T cells, which can be measured as a value higher than the background by enzyme immunoassay (ELISpot), or intracellular staining for cytokines, or using ELISA (ELISA) for cytokines, or vivalent methods. 2. Induction of CD4-positive T cells, detectable by the secretion of cytokines, which can be measured as a value above the background by enzyme-linked immunosorbent stains (ELISpot), or by intracellular staining for cytokines, or using ELISA (ELISA) for cytokines, or equivalent methods . Cytokines may include interferon alpha, interferon gamma, interleukin-2, interleukin-5, interleukin-6, interleukin-10, interleukin-12, interleukin-13, interleukin-17, tumor necrosis factor alpha, tumor necrosis factor beta, or other cytokines, which are produced by CD4-positive T cells. 3. Induction of antibodies detected by Western blotting, ELISA, or equivalent or related methods. 4. Induction of a cellular immune response of any type not mediated by CD8-positive T cells and CD4-positive T cells described in paragraphs. 1 and 2.
Варианты характеризируются делециями, заменами и/или вставками аминокислот. В предпочтительном варианте аминокислотные различия связаны с одной или более консервативными заменами аминокислот. Термин «консервативные замены аминокислот» включает замены алифатических или гидрофобных аминокислот Ala, Val, Leu, Ilе; замену гидроксильных остатков Ser и Thr; замену кислотных остатков Asp и Glu; замену амидных остатков Asn и Gln; замену основных остатков Lys, Arg и His; замену ароматических остатков Phe, Tyr и Тrр; замену некрупных аминокислот Ala, Ser, Thr, Met и Gly.Variants are characterized by deletions, substitutions and / or insertions of amino acids. In a preferred embodiment, amino acid differences are associated with one or more conservative amino acid substitutions. The term "conservative amino acid substitutions" includes substitutions of aliphatic or hydrophobic amino acids Ala, Val, Leu, Il; replacement of hydroxyl residues Ser and Thr; replacement of acid residues Asp and Glu; replacement of amide residues Asn and Gln; replacement of the main residues of Lys, Arg and His; replacement of aromatic residues Phe, Tyr and Trr; replacing the small amino acids Ala, Ser, Thr, Met, and Gly.
Для создания пептидов, обладающих определенной степенью идентичности с ПСРС, может использоваться, например, генетическая инженерия для введения изменений аминокислот в определенных положенииях клонированной последовательности ДНК для определения участков, критически важных для функционирования пептида. Например, могут быть использованы сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (введение единичных аланиновых мутаций при каждом остатке в молекуле) (Cunningham and Wells, 1989). Полученные мутантные молекулы можно исследовать с использованием анализа, показанного в Примере 1.To create peptides with a certain degree of identity with PSRS, genetic engineering, for example, can be used to introduce changes in amino acids at certain positions of a cloned DNA sequence to determine sites critical for the functioning of the peptide. For example, site-directed mutagenesis or alanine-scanning mutagenesis can be used (introducing single alanine mutations at each residue in the molecule) (Cunningham and Wells, 1989). The resulting mutant molecules can be investigated using the analysis shown in Example 1.
Предпочтительные варианты характеризируются не более чем 8 аминокислотными, желательно не более чем 6 аминокислотными, и, еще более предпочтительно, не более чем 4 аминокислотными заменами, делециями и/или вставками.Preferred options are characterized by no more than 8 amino acid, preferably no more than 6 amino acid, and, even more preferably, no more than 4 amino acid substitutions, deletions and / or inserts.
Во фрагменте ПСРС по меньшей мере 5 последовательных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 10 последовательных аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере 15 последовательных аминокислот и еще более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательных аминокислот определенной аминокислотной последовательности остаются неизменными. Фрагмент сохраняет способность вызвать иммунный ответ.In the PSRS fragment, at least 5 consecutive amino acids, preferably at least 10 consecutive amino acids, even more preferably at least 15 consecutive amino acids and even more preferably at least 20 consecutive amino acids of a particular amino acid sequence remain unchanged. The fragment retains the ability to elicit an immune response.
В более предпочтительном варианте реализации вакцина согласно настоящему изобретению дополнительно содержит адъювант и/или иммуностимулирующий цитокин или хемокин.In a more preferred embodiment, the vaccine of the present invention further comprises an adjuvant and / or an immunostimulatory cytokine or chemokine.
Подходящими адъювантами являются соли алюминия, такие как гель из гидроксида алюминия или фосфат алюминия, но могут также использоваться соли кальция, железа или цинка, или может использоваться нерастворимая суспензия ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, анионные или катионные производные полисахаридов или полифосфазенов. Другие адъюванты включают CpG-содержащие олигонуклеотиды. Олигонуклеотиды характеризуются наличием неметилированных динуклеотидов CpG. Подобные олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в WO 96/02555.Suitable adjuvants are aluminum salts, such as aluminum hydroxide gel or aluminum phosphate, but calcium, iron or zinc salts can also be used, or an insoluble suspension of acylated tyrosine or acylated sugars, anionic or cationic derivatives of polysaccharides or polyphosphazenes can be used. Other adjuvants include CpG-containing oligonucleotides. Oligonucleotides are characterized by the presence of unmethylated CpG dinucleotides. Such oligonucleotides are well known and described, for example, in WO 96/02555.
Применение иммуностимулирующих цитокинов открывает все новые перспективы в иммунотерапии рака. Главной задачей является активация опухольспецифичных Т-лимфоцитов, способных удалять опухолевые клетки у пациентов с низкой опухолевой нагрузкой или защищать пациента от рецидивов заболевания. Стратегии, которые обеспечивают высокие уровни иммуностимулирующих цитокинов локально в месте нахождения антигена, продемонстрировали эффективность в доклинических и клинических тестах. Предпочтительные иммуностимулирующие цитокины включают интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-7, интерлейкин-12, интерлейкин-13, имунноглобулины, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и фактор некроза опухоли альфа.The use of immunostimulatory cytokines opens up new perspectives in cancer immunotherapy. The main objective is the activation of tumor-specific T-lymphocytes that can remove tumor cells in patients with low tumor burden or protect the patient from relapse of the disease. Strategies that provide high levels of immunostimulatory cytokines locally at the site of antigen have been shown to be effective in preclinical and clinical tests. Preferred immunostimulatory cytokines include interleukin-2, interleukin-4, interleukin-7, interleukin-12, interleukin-13, immunoglobulins, granulocyte macrophage colony stimulating factor and tumor necrosis factor alpha.
Хемокины представляют собой небольшие (7-16 кДа) секретируемые структурно близкие растворимые белки, которые вовлечены хемотаксис лейкоцитов и дендритных клеток, дегрануляцию полиморфноядерных лейкоцитов и ангиогенез. Хемокины продуцируются в ходе начальной фазы реакции организма на повреждения, аллергены, антигены и вторгающиеся микроорганизмы. Хемокины избирательно привлекают лейкоциты в место воспаления, индуцируя активацию и миграцию клеток. Хемокины могут усиливать собственный иммунитет против опухолей и, таким образом, также могут быть полезны в комбинации с ПСРС.Chemokines are small (7-16 kDa) secreted structurally close soluble proteins that involve chemotaxis of leukocytes and dendritic cells, degranulation of polymorphonuclear leukocytes and angiogenesis. Chemokines are produced during the initial phase of the body's response to damage, allergens, antigens and invading microorganisms. Chemokines selectively attract white blood cells to the site of inflammation, inducing cell activation and migration. Chemokines can enhance their own immunity against tumors and, thus, can also be useful in combination with PSRS.
Вакцина согласно настоящему изобретению может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую ПСРС, для ДНК-иммунизации, как методика, используемая для стимуляции гуморальной и клеточной иммунной реакции на белковые антигены. Прямое введение генетического материала в живой организм приводит к тому, что небольшое количество его клеток продуцируют продукты введенного гена. Эта анормальная экспрессия гена имеет важные иммунологические последствия, приводя к специфической иммунной активации организма против антигена, привнесенного геном. Прямое введение ни с чем не связанной плазмидной ДНК вызывает сильный иммунный ответ на антиген, кодируемый геном вакцины. Как только плазмидный конструкт вводится в клетки организма, они начинают экспрессировать ген вируса и производить ПСРС внутри клетки. Эта форма презентации и процессинга антигена индуцирует активацию как рецепторов главного комплекса гистосовместимости I, так и рецепторов главного комплекса гистосовместимости II, вызывая клеточный и гуморальный иммунный ответ. ДНК-вакцины состоят из векторов, в норме содержащих два блока: антиген-экспрессирующий блок состоит из промотерных/энхансерных последовательностей, за которыми следует участок, кодирующий ПСРС-антиген, и полиадениловую последовательность; блок продукции состоит из последовательностей, необходимых для отбора и амплификации вектора. Конструирование векторов со вставками вакцины осуществляется при помощи технологии рекомбинантной ДНК, и специалистам в данной области известны векторы, которые могут использоваться в данном подходе. Эффективность ДНК-иммунизации может быть повышена путем стабилизации ДНК против деградации и повышения эффективности доставки ДНК в антигенпрезентирующие клетки. Это было продемонстрировано путем покрытия биодеградируемых катионных микрочастиц (таких как состоящие из полилактид-гликолида, связанного с цетилтриметиламмоний-бромида) молекулами ДНК. Такие покрытые ДНК микрочастицы могут быть также эффективны в увеличении числа цитотоксичных Т-лимфоцитов в крови, как и рекомбинантные вирусы вакциния, особенно, в смеси с квасцами. Оказалось, что частицы диаметром 300 нм наиболее эффективно поглощаются антигенпрезентирующими клетками.The vaccine according to the present invention may also contain a nucleic acid encoding PSRS for DNA immunization, as a technique used to stimulate a humoral and cellular immune response to protein antigens. Direct introduction of genetic material into a living organism leads to the fact that a small number of its cells produce products of the introduced gene. This abnormal gene expression has important immunological consequences, leading to specific immune activation of the body against the antigen introduced by the gene. Direct administration of unrelated plasmid DNA induces a strong immune response to the antigen encoded by the vaccine gene. As soon as the plasmid construct is introduced into the cells of the body, they begin to express the virus gene and produce PSRS inside the cell. This form of antigen presentation and processing induces the activation of both the receptors of the main histocompatibility complex I and the receptors of the main histocompatibility complex II, causing a cellular and humoral immune response. DNA vaccines consist of vectors normally containing two blocks: an antigen-expressing block consists of promoter / enhancer sequences, followed by a region encoding the PSRS antigen and a polyadenyl sequence; the product block consists of the sequences necessary for the selection and amplification of the vector. The construction of vectors with vaccine inserts is carried out using recombinant DNA technology, and vectors that can be used in this approach are known to those skilled in the art. The effectiveness of DNA immunization can be improved by stabilizing DNA against degradation and increasing the efficiency of DNA delivery to antigen-presenting cells. This has been demonstrated by coating biodegradable cationic microparticles (such as those consisting of polylactide glycolide bound to cetyltrimethylammonium bromide) with DNA molecules. Such DNA-coated microparticles can also be effective in increasing the number of cytotoxic T-lymphocytes in the blood, as well as recombinant vaccination viruses, especially when mixed with alum. It turned out that particles with a diameter of 300 nm are most effectively absorbed by antigen-presenting cells.
Различные экспрессионные векторы, например, плазмиды или вирусные векторы, могут быть использованы для переноса и экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих ПСРС согласно настоящему изобретению.Various expression vectors, for example, plasmids or viral vectors, can be used for transfer and expression of nucleotide sequences encoding PSRS according to the present invention.
Предпочтительными вирусными векторами являются поксивирус, аденовирус, ретровирус, герпевирус или аденоассоциированный вирус. Особенно предпочтительными среди поксивирусов являются вирус вакциния, NYVAC, авипоксвирус, канарипокс вирус, ALVAC, ALVAC(2), оспа птиц и TROVAC.Preferred viral vectors are poxivirus, adenovirus, retrovirus, herpevirus or adeno-associated virus. Particularly preferred among poxiviruses are vaccinia virus, NYVAC, avipoxvirus, canarypox virus, ALVAC, ALVAC (2), avian pox and TROVAC.
Рекомбинантные векторы на основе альфавируса также используются для улучшения эффективности ДНК-вакцинации. Ген, кодирующий ПСРС, был введен в репликон альфавируса вместо структурных генов, при этом неструктурные гены репликаз остаются интактными. Для построения рекомбинантного репликона альфавируса используются вирус Синдбис и вирус леса Семлики. Однако, в отличие от обычных ДНК-вакцин, экспрессия векторов на основе алифавирусов является временной. Альфавирусные репликоны вызывают иммунный ответ благодаря высокому уровню экспрессии белка, кодируемого данным вектором, репликон-индуцированным цитокинным ответам или репликон-индуцированному апоптозу, ведущим к усиленному поглощению антигена дендритными клетками.Alphavirus-based recombinant vectors are also used to improve the effectiveness of DNA vaccination. The gene encoding PSRS was introduced into the alphavirus replicon instead of structural genes, while non-structural replicase genes remain intact. To build a recombinant replicon of the alphavirus, the Sindbis virus and the Semliki forest virus are used. However, unlike conventional DNA vaccines, the expression of vectors based on alifaviruses is temporary. Alphavirus replicons induce an immune response due to the high level of expression of the protein encoded by this vector, replicon-induced cytokine responses, or replicon-induced apoptosis, leading to enhanced antigen uptake by dendritic cells.
Согласно следующему конкретному варианту реализации ПСРС содержит маркерную последовательность, предпочтительно на С-конце, которая использована для очистки полученного рекомбинантным путем ПСРС. Предпочтительной маркерной последовательностью является His-маркер. Особенно предпочтительно использование His-маркера, содержащего 6 остатков His.According to a further specific embodiment, the PSRS contains a marker sequence, preferably at the C-terminus, which is used to purify recombinantly obtained PSRS. A preferred marker sequence is His marker. Especially preferred is the use of a His marker containing 6 His residues.
Вакцину, представленную в настоящем изобретении, вводят в количестве, подходящем для иммунизации индивида и, в предпочтительном варианте, она дополнительно содержит один или более обычных вспомогательных веществ. Используемый термин «количество, подходящее для иммунизации индивида» включает в себя любое количество ПСРС, которым может быть иммунизирован индивид. Количество вакцины зависит от того, предназначается ли иммунизация для профилактического или терапевтического лечения. В дополнение, возраст, пол и вес индивида влияют на количество вводимой вакцины. Таким образом, количество, подходящее для иммунизации индивида, относится к количествам активных ингредиентов, достаточным для воздействия на прогрессирование и тяжесть опухоли, обеспечивающего уменьшение или ремиссию такой патологии. «Количество, подходящее для иммунизации индивида» может быть определено путем использования методов, известных профессионалу в данной области (например, Fingl et al., 1975). Термин «индивид» в настоящем тексте включает индивидов любого вида, которые могут заболевать карциномами. Примерами индивидов служат люди и животные, равно как и их клетки.The vaccine of the present invention is administered in an amount suitable for immunizing an individual and, in a preferred embodiment, it further comprises one or more conventional excipients. The term “amount suitable for immunizing an individual” as used includes any number of PSIRs with which an individual can be immunized. The amount of vaccine depends on whether immunization is intended for prophylactic or therapeutic treatment. In addition, an individual's age, gender, and weight affect the amount of vaccine administered. Thus, an amount suitable for immunization of an individual refers to the amount of active ingredients sufficient to influence the progression and severity of the tumor, providing a reduction or remission of such a pathology. “An amount suitable for immunizing an individual” can be determined using methods known to one skilled in the art (eg, Fingl et al., 1975). The term “individual,” as used herein, includes individuals of any kind that may develop carcinomas. Examples of individuals are humans and animals, as well as their cells.
Введение вакцины путем инъекции может осуществляться в разные участки тела индивида внутримышечно, подкожно, внутрикожно или в любой другой форме применения. Также может быть предпочтительным введение одной или более «поддерживающих инъекций», имеющих примерно равные объемы.The introduction of the vaccine by injection can be carried out in different parts of the body of an individual intramuscularly, subcutaneously, intradermally or in any other form of application. It may also be preferred to administer one or more “maintenance injections” having approximately equal volumes.
Используемый термин «обычные вспомогательные вещества» включает вспомогательные вещества, подходящие для вакцинации для иммунизации индивида. Подобными вспомогательными веществами являются, например, буферные солевые растворы, вода, эмульсии, такие как водно-масляная эмульсия, смачивающие вещества, стерильные растворы и т.д.The term “conventional excipients” as used includes excipients suitable for vaccination to immunize an individual. Such auxiliary substances are, for example, buffered saline solutions, water, emulsions such as a water-in-oil emulsion, wetting agents, sterile solutions, etc.
ПСРС, последовательность нуклеиновых кислот или вектор согласно настоящему изобретению могут присутствовать в вакцине отдельно или в комбинации с носителями. В предпочтительном варианте носители неиммуногенны в организме данного индивида. Подобными носителями могут быть собственные белки индивида, чужеродные белки или их фрагменты. Предпочтительны такие носители, как альбумин сыворотки крови, фибриноген и трансферин или их фрагменты.PSRS, a nucleic acid sequence or vector according to the present invention may be present in the vaccine alone or in combination with carriers. In a preferred embodiment, the carriers are non-immunogenic in the body of the individual. Such carriers may be the individual's own proteins, foreign proteins, or fragments thereof. Carriers such as serum albumin, fibrinogen, and transferrin or fragments thereof are preferred.
Вакцина согласно настоящему изобретению может быть терапевтической, т.е. относится к веществам, которые вводят для лечения существующего ракового заболевания, или применяться для предотвращения рецидива рака, или профилактической, т.е. относиться к веществам, которые для предотвращения или задержки развития ракового заболевания. Если композиции имеют терапевтическое назначение, их вводят пациентам с раковыми заболеваниями и они предназначены для стимуляции иммунного ответа для стабилизации опухоли путем предотвращения или замедления роста существующей опухоли, для предотвращения распространения опухоли или ее метастазов, для уменьшения размеров опухоли, для предотвращения рецидива опухоли, которую лечат, или для устранения раковых клеток, которые не были уничтожены в процессе предшествующего лечения. Вакцина может использоваться в качестве профилактического лечения и вводиться индивидам, у которых нет ракового заболевания, в этом случае она предназначена для того, чтобы вызвать иммунный ответ против потенциальных раковых клеток.The vaccine according to the present invention may be therapeutic, i.e. refers to substances that are administered to treat an existing cancer, or used to prevent cancer recurrence, or prophylactic, i.e. relate to substances that are to prevent or delay the development of cancer. If the compositions have a therapeutic purpose, they are administered to patients with cancer and are intended to stimulate the immune response to stabilize the tumor by preventing or slowing the growth of an existing tumor, to prevent the spread of the tumor or its metastases, to reduce the size of the tumor, to prevent the recurrence of the tumor that is being treated , or to eliminate cancer cells that were not destroyed during the previous treatment. The vaccine can be used as a preventive treatment and administered to individuals who do not have cancer, in which case it is intended to elicit an immune response against potential cancer cells.
Настоящее изобретение также относится к применению ПСРС и их функциональных эквивалентов, последовательностей нуклеиновых кислот или векторов, как определено выше, для изготовления вакцины для предотвращения карциномы, например, превентивной вакцинации групп высокого риска, или лечения карциномы. Например, это может быть колоректальный рак, предпочтительно наследственный неполипозный колоректальный рак, рак эндометрия, рак желудка или рак тонкой кишки.The present invention also relates to the use of PSRS and their functional equivalents, nucleic acid sequences or vectors, as defined above, for the manufacture of a vaccine for the prevention of carcinoma, for example, preventive vaccination of high-risk groups, or treatment of carcinoma. For example, it can be colorectal cancer, preferably hereditary non-polypous colorectal cancer, endometrial cancer, stomach cancer, or small intestine cancer.
Настоящее изобретение обеспечивает возможность иммунизировать индивидов, в частности, людей и животных. Иммунизация происходит как благодаря индукции образования антител, так и стимуляции CD8+ Т-клеток. Таким образом, возможно принимать профилактические и терапевтические меры против карцином.The present invention provides the ability to immunize individuals, in particular humans and animals. Immunization occurs both due to the induction of antibody formation and stimulation of CD8 + T cells. Thus, it is possible to take preventive and therapeutic measures against carcinomas.
Нижеследующие примеры описывают изобретение более подробно:The following examples describe the invention in more detail:
Пример 1Example 1
Детектирование ПСРС-специфичных Т-клеток в периферической крови пациентов со связанным с МСН раком толстой кишки и у здоровых носителей мутации наследуемого неполипозного колоректального ракаDetection of PSRS-specific T cells in the peripheral blood of patients with MSN-related colon cancer and in healthy carriers of mutations of inherited non-polypous colorectal cancer
(А) Методы: Метод иммуноферментных пятен (ELISpot).(A) Methods: Enzyme-linked immunosorbent stain method (ELISpot).
Частоту обнаружения ПСРС-специфических периферических Т-клеток (ПТК) оценивали путем определения количества специфических Т-клеток, секретирующих интерферон гамма, направленных против новых ПСРС, полученных из трех содержащих солирующие микросателлиты кандидатных генов, используя анализ ELISpot. Анализ ELISpot проводили в 96-луночных нитроцеллюлозных планшетах (Multiscreen; Millipore, Бэдфорд, Массачусетс, США), покрытых мышиными моноклональными антителами, против человеческого интерферона-гамма (Mabtech, Нака, Швеция) в течение ночи и блокированных средой, содержащей сыворотку. ПТК (День 0, концентрация 1×105 на лунку) были высеяны шестикратно с аутологичными СD40-активированными В-лимфоцитами (4×104 на лунку, Т-независимые и плазматические В-клетки соответственно) в качестве антигенпрезентирующих клеток в 200 микролитрах среды IMDM с добавлением 10% сыворотки человека АВ. В качестве положительного контроля ПТК обрабатывали форбол-12-миристат-13 ацетатом в концентрации 20 нмоль/л в комбинации с 350 нмоль/л иономицина. После 24-часовой инкубации при температуре в 37°С планшеты тщательно промывали и инкубировали с биотинилированными моноклональными антителами кролика против интерферона-гамма в течение 4 часов, затем снова промывали, инкубировали с конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза в течение 2 часов с последующей конечной промывкой. Пятна обнаруживались после инкубации с NBT/BCIP (Sigma-Aldrich) в течение 1 часа, реакция останавливалась водой, и после просушки подсчет пятен проводился путем микроскопирования. Методика подробно описана в статье Schwitalle et al., 2008.The detection rate of PSRS-specific peripheral T cells (PTKs) was estimated by determining the number of specific T cells secreting interferon gamma directed against new PSRS derived from three candidate microsatellite solitons using ELISpot analysis. ELISpot analysis was performed in 96-well nitrocellulose plates (Multiscreen; Millipore, Badford, Mass., USA) coated with murine monoclonal antibodies against human interferon-gamma (Mabtech, Naka, Sweden) overnight and blocked with serum-containing medium. PTCs (Day 0,
(Б) Результаты(B) Results
Для проверки, будет ли ПСРС-специфическая реакция Т-клеток обнаруживаться в периферической крови пациентов со связанным с МСН колоректальным раком, провели анализ ELISpot. Аутологичные плазматические В-клетки, которые показали высокий уровень экспрессии белков главного комплекса гистосовместимости I и II класса и костимуляторов (CD40, CD80 и CD86), так же как и специфических В-клеточных антигенов (CD19 и CD23), использовали в качестве антигенпрезентирующих клеток.An ELISpot assay was performed to test whether the PSRS-specific T cell response would be detected in the peripheral blood of patients with MSN-associated colorectal cancer. Autologous plasma B cells, which showed a high level of expression of proteins of the main histocompatibility complex of class I and II and costimulators (CD40, CD80 and CD86), as well as specific B-cell antigens (CD19 and CD23), were used as antigen-presenting cells.
Наблюдали выраженную реактивность по отношению к новым ПСРС, полученным из AIM-2(-1), НТ001(-1), TAF1B(-1) и TGFBR2(-1):A pronounced reactivity was observed with respect to the new PSRS obtained from AIM-2 (-1), HT001 (-1), TAF1B (-1) and TGFBR2 (-1):
(подчеркнуты неопептидные последовательности)(underlined non-peptide sequences)
В таблице 1 показаны результаты, полученные от пациентов (n=8). Репрезентативные результаты ELISpot показаны на фигуре 2.Table 1 shows the results obtained from patients (n = 8). Representative ELISpot results are shown in Figure 2.
Приведено среднее количество пятен из анализа в репликате для каждого пептида и исследуемого индивида. MSI01-MS07 - пациенты с МН колоректальным раком, МС01-МС06 - здоровые пациенты носители мутации наследуемого неполипозного колоректального рака.The average number of spots from the analysis in the replicate for each peptide and the individual under study is given. MSI01-MS07 - patients with MN colorectal cancer, MS01-MS06 - healthy patients carriers of mutations of inherited non-polyposis colorectal cancer.
Пример 2Example 2
Детектирование ПСРС-специфического гуморального иммунного ответа в периферической крови пациентов со связанным с МСН колоректальным раком и здоровых носителей мутации наследуемого неполипозного колоректального ракаDetection of the PSRS-specific humoral immune response in the peripheral blood of patients with MSN-associated colorectal cancer and healthy carriers of mutations of inherited non-polyposis colorectal cancer
(А) Методы (Твердофазный ИФА (ELISA))(A) Methods (Solid State ELISA (ELISA))
Для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) пептидами покрывали лунки 96-луночных полистирольных микротитровальных планшетов «Максисорп» (Nunc, Роскильде, Дания) в конечной концентрации 40 мкг/мл в фосфатно-буферном растворе (PBS) и выдержаны в течение ночи при температуре 4°С. После этого ячейки были промыты 4 раза с помощью ФБР (с добавлением 0,05% Tween) и блокированы в течение 1 часа 0,5% казеином в ФБР. Связывание пептидов с микротитровальными планшетами и оптимальную концентрацию насыщения для пептидов оценивали, используя конкурентный анализ пептид-щелочная фосфатаза. Для слежения за индивидуальной фоновой реактивностью каждой сыворотки добавляли контрольный пептид, полученный из белка p16INK4a (р16 76-105), реактивность антител к которому была выявлена у большой когорты индивидов (Rueshenbach et al., 2008). Каждую сыворотку разбавляли в отношении 1:100 в блокирующем буфере (0,5% казеина в ФБР) и исследовали в дупликатах на присутствие антител ко всем ПСРС и контрольному пептиду. В качестве эталона для определения межпланшетной вариации в каждый планшет включали одну контрольную сыворотку, и пептид-специфические оптические плотности контрольной сыворотки использовали для нормировки. Разведенную сыворотку (50 мкл/лунка) инкубировали в течение 1 часа, после этого промывали, планшеты инкубировали с меченными пероксидазой хрена антителами кролика, специфичными к человеческому иммуноглобулину G (Jackson Immunoreserach, Уэст Гроув, Пенсильвания; 1:10000 в блокирующем буфере) в течение 1 часа. После последующей промывки в каждую лунку добавляли по 50 мкл реагента ТМВ (Sigma, Дейзенхофен, Германия), через 30 минут фурментативную реакцию останавливали добавлением в каждую ячейку по 50 мкл 1Н H2SO4. Поглощение измеряли при воздействии излучения с длиной волны в 450 нм (референсная длина волны 595 нм). Предварительную адсорбцию антител сыворотки для контроля специфичности осуществляли в соответствии с методом, подробно описанным у Reuschenbach et al., 2008.For enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), peptides were coated with the wells of 96-well Maxisorp polystyrene microtiter plates (Nunc, Roskilde, Denmark) at a final concentration of 40 μg / ml in phosphate-buffered saline (PBS) and kept overnight at 4 ° C FROM. After this, the cells were washed 4 times using the FBI (with the addition of 0.05% Tween) and blocked for 1 hour with 0.5% casein in the FBI. The binding of peptides to microtiter plates and the optimal saturation concentration for peptides were evaluated using competitive peptide-alkaline phosphatase analysis. To monitor the individual background reactivity of each serum, a control peptide derived from p16 INK4a protein (p16 76-105) was added, the reactivity of antibodies to which was detected in a large cohort of individuals (Rueshenbach et al., 2008). Each serum was diluted 1: 100 in blocking buffer (0.5% casein in the FBI) and examined in duplicates for the presence of antibodies to all PSRS and the control peptide. As a reference for determining platelet variation, one control serum was included in each plate, and peptide-specific optical densities of the control serum were used for normalization. Diluted serum (50 μl / well) was incubated for 1 hour, then washed, the plates were incubated with horseradish peroxidase labeled rabbit antibodies specific for human immunoglobulin G (Jackson Immunoreserach, West Grove, PA; 1: 10000 in blocking buffer) for 1 hour After the subsequent washing, 50 μl TMB reagent (Sigma, Deisenhofen, Germany) was added to each well, after 30 minutes the enzymatic reaction was stopped by adding 50 μl 1N H 2 SO 4 to each well. The absorption was measured when exposed to radiation with a wavelength of 450 nm (reference wavelength 595 nm). Pre-adsorption of serum antibodies to control specificity was carried out in accordance with the method described in detail in Reuschenbach et al., 2008.
(Б) Результаты(B) Results
Для оценки возможности детектирования ПСРС-специфических антител в периферической крови пациентов со связанным с МСН колоректальным раком, здоровых носителей синдрома Линча и здоровых контрольных пациентов, использовали твердофазный ИФА-анализ. Наблюдалась выраженная реактивность по отношению к новым ПСРС, полученным из AIM2(-1), НТ001(-1), TAF1B(-1) и TGFBR2(-1). Результаты ИФА показаны на фигуре 3.To assess the possibility of detecting PSRS-specific antibodies in the peripheral blood of patients with MSN-associated colorectal cancer, healthy carriers of Lynch syndrome and healthy control patients, solid-phase ELISA analysis was used. There was a pronounced reactivity with respect to the new PSRS derived from AIM2 (-1), HT001 (-1), TAF1B (-1) and TGFBR2 (-1). The results of ELISA are shown in figure 3.
Пример 3Example 3
Определение ПСРС-специфической Т-клеточного цитотоксического ответаDetermination of the PSRS-specific T-cell cytotoxic response
Измеряли поверхностную экспрессию CD107а на эффекторных Т-клетках после стимуляции клиническими ПСРС-антигенами. Тесты на CD107а использовали для демонстрации секреции цитотоксических гранул, содержащих ферменты перфорин и гранзим В, из эффекторных клеток. Молекулы CD107а экспрессируются на поверхности цитотоксических гранул и могут детектироваться на поверхности клетки, когда гранула высвобождается в условиях Т-клеточного цитотоксического ответа.The surface expression of CD107a on effector T cells was measured after stimulation with clinical PSRS antigens. CD107a tests were used to demonstrate the secretion of cytotoxic granules containing perforin and granzyme B enzymes from effector cells. CD107a molecules are expressed on the surface of cytotoxic granules and can be detected on the cell surface when the granule is released under conditions of a T-cell cytotoxic response.
Для определения способности ПСРС-пептидов вызывать цитотоксическую реакцию, брали кровь здоровых доноров, и Т-клетки стимулировали пептидом ПСРС, используя дендритные клетки и антигенпрезентирующие клетки. Стимуляцию проводили еженедельно в течение четырех недель. По истечении четырех недель Т-клетки собирали и инкубировали и впоследствии проводилась проба, и тест на ПСРС с CD107а использовали для анализа пептид-специфической индукции цитотоксического ответа Т-клеток.To determine the ability of the PSRS peptides to induce a cytotoxic reaction, healthy donor blood was taken and T cells were stimulated with the PSRS peptide using dendritic cells and antigen-presenting cells. Stimulation was performed weekly for four weeks. After four weeks, T cells were harvested and incubated, and a sample was subsequently performed, and the PSRS test with CD107a was used to analyze the peptide-specific induction of the T cell cytotoxic response.
Цитотоксические ответы, определяемые по поверхностной экспрессии CD107а, наблюдали у Т-клеток, инкубированных с В-клетками, служащими в качестве антигенпрезентирующих клеток, в присутствии антигенных ПСРС (Фиг. 4А). Значительные ответы наблюдали у различных здоровых доноров после стимуляции Т-клеток антигеном в течение четырех недель. Репрезентативные реакции показаны на гистограммах. На фиг. 4Б показан репрезентативный результат проточной цитофлуориметрии в тесте на CD107а для Т-клеток, инкубированных с В-клетками, служащими в качестве антигенпрезентирующих клеток, в отсутствие (левая панель) и в присутствии (правая панель) ПСРС-антигена НТ001(-1).Cytotoxic responses determined by surface expression of CD107a were observed in T cells incubated with B cells serving as antigen presenting cells in the presence of antigenic PSRS (Fig. 4A). Significant responses were observed in various healthy donors after stimulation of T cells with antigen for four weeks. Representative reactions are shown in bar graphs. In FIG. 4B shows a representative result of flow cytometry in a CD107a test for T cells incubated with B cells serving as antigen-presenting cells in the absence (left panel) and in the presence (right panel) of the PS00 antigen HT001 (-1).
Источники информацииInformation sources
Cunningham and Wells, Science 244 (1989), 1081-1085.Cunningham and Wells, Science 244 (1989), 1081-1085.
Fingl et al., The Pharmocological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. acmillan Publishing Co., New York, pp.1-46 (1975).Fingl et al., The Pharmocological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. acmillan Publishing Co., New York, pp. 1-46 (1975).
Kloor M, Michel S, von Knebel Doeberitz M. Immune evasion of microsatellite unstable colorectal cancers.Kloor M, Michel S, von Knebel Doeberitz M. Immune evasion of microsatellite unstable colorectal cancers.
Int J Cancer. 2010 Mar 2. [Epub ahead of print]Int J Cancer. 2010
Linnebacher M, Gebert J, Rudy W, Woerner S, Yuan YP, Bork P, von Knebel Doeberitz M. Frameshift peptide-derived T-cell epitopes: a source of novel tumor-specific antigens. Int J Cancer. 2001 Jul 1; 93 (1): 6-11.Linnebacher M, Gebert J, Rudy W, Woerner S, Yuan YP, Bork P, von Knebel Doeberitz M. Frameshift peptide-derived T-cell epitopes: a source of novel tumor-specific antigens. Int J Cancer. 2001
Reuschenbach M, Waterboer T, Wallin KL, Einenkel J, Dillner J, Hamsikova E, Eschenbach D, Zimmer H, Heilig B, Kopitz J, Pawlita M, von Knebel Doeberitz M, Wentzensen N. Characterization of humoral immune responses against pl6, p53, HPV16 E6 and HPV16 E7 in patients with HPV-associated cancers.Reuschenbach M, Waterboer T, Wallin KL, Einenkel J, Dillner J, Hamsikova E, Eschenbach D, Zimmer H, Heilig B, Kopitz J, Pawlita M, von Knebel Doeberitz M, Wentzensen N. Characterization of humoral immune responses against pl6, p53 , HPV16 E6 and HPV16 E7 in patients with HPV-associated cancers.
Int J Cancer. 2008 Dec 1; 123 (11): 2626-31.Int J Cancer. 2008
Reuschenbach M, Kloor M, Morak M, Wentzensen N, Germann A, Garbe Y, Tariverdian M, Findeisen P, Neumaier M, Holinski-Feder E, von Knebel Doeberitz M. Serum antibodies against frameshift peptides in microsatellite unstable colorectal cancer patients with Lynch syndrome.Reuschenbach M, Kloor M, Morak M, Wentzensen N, Germann A, Garbe Y, Tariverdian M, Findeisen P, Neumaier M, Holinski-Feder E, von Knebel Doeberitz M. Serum antibody against frameshift peptides in microsatellite unstable colorectal cancer patients with Lynch syndrome.
Fam Cancer. 2009 Dec 2. [Epub ahead of print]Fam Cancer. 2009
Ripberger E, Linnebacher M, Schwitalle Y, Gebert J, von Knebel Doeberitz M. Identification of an HLA-A0201-restricted CTL epitope generated by a tumor-specific frameshift mutation in a coding microsatellite of the OGT gene. J Clin Immunol. 2003 Sep; 23 (5): 415-23.Ripberger E, Linnebacher M, Schwitalle Y, Gebert J, von Knebel Doeberitz M. Identification of an HLA-A0201-restricted CTL epitope generated by a tumor-specific frameshift mutation in a coding microsatellite of the OGT gene. J Clin Immunol. 2003 Sep; 23 (5): 415-23.
Schwitalle Y, Kloor M, Eiermann S, Linnebacher M, Kienle P, Knaebel HP, Tariverdian M, Benner A, von Knebel Doeberitz M. Immune response against frameshift-induced neopeptides in HNPCC patients and healthy HNPCC mutation carriers. Gastroenterology. 2008 Apr; 134(4): 988-97.Schwitalle Y, Kloor M, Eiermann S, Linnebacher M, Kienle P, Knaebel HP, Tariverdian M, Benner A, von Knebel Doeberitz M. Immune response against frameshift-induced neopeptides in HNPCC patients and healthy HNPCC mutation carriers. Gastroenterology. 2008 Apr; 134 (4): 988-97.
Schwitalle Y, Linnebacher M, Ripberger E, Gebert J, von Knebel Doeberitz M. Immunogenic peptides generated by frameshift mutations in DNA mismatch repair-deficient cancer cells. Cancer Immun. 2004 Nov 25; 4:14.Schwitalle Y, Linnebacher M, Ripberger E, Gebert J, von Knebel Doeberitz M. Immunogenic peptides generated by frameshift mutations in DNA mismatch repair-deficient cancer cells. Cancer Immun. 2004
Claims (36)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/EP2012/005154 WO2014090265A1 (en) | 2012-12-13 | 2012-12-13 | Msi-specific frameshift peptides (fsp) for prevention and treatment of cancer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015115785A RU2015115785A (en) | 2017-01-16 |
| RU2644677C2 true RU2644677C2 (en) | 2018-02-13 |
Family
ID=47552936
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015115785A RU2644677C2 (en) | 2012-12-13 | 2012-12-13 | Msi-specific peptides with shifted reading frame (srf) for prevention and treatment of cancer |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101810840B1 (en) |
| CN (1) | CN104853764B (en) |
| BR (1) | BR112015013737B1 (en) |
| RU (1) | RU2644677C2 (en) |
| WO (1) | WO2014090265A1 (en) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018223093A1 (en) * | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Universal cancer vaccines and methods of making and using same |
| CN111328420B (en) * | 2017-07-12 | 2023-07-25 | Nouscom股份公司 | Universal vaccine based on consensus tumor neoantigen for prevention and treatment of microsatellite instability (MSI) cancers |
| KR20230019859A (en) | 2020-05-28 | 2023-02-09 | 휴브로 테라퓨틱스 에이에스 | peptide cocktail |
| EP4052716A1 (en) | 2021-03-04 | 2022-09-07 | Deutsches Krebsforschungszentrum - Stiftung des öffentlichen Rechts / Universität Heidelberg | Cancer therapy involving car-engineered t-cells and parvovirus h-1 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003087162A2 (en) * | 2002-04-18 | 2003-10-23 | Mtm Laboratories Ag | Neopeptides and methods useful for detection and treatment of cancer |
| RU2424247C2 (en) * | 2005-11-30 | 2011-07-20 | Интернэшнл Инститьют Оф Кэнсер Иммьюнолоджи, Инк. | Cytotoxic t-cell (ctc) inducing peptide, method of inducing ctc, antibody bound to said peptide, use of said peptide in pharmaceutical composition and for treating or preventing cancer, antigen-presenting cell |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2194761C (en) | 1994-07-15 | 2006-12-19 | Arthur M. Krieg | Immunomodulatory oligonucleotides |
| PT2572725E (en) * | 2011-09-21 | 2015-10-20 | Ruprecht Karls Universität Heidelberg | Msi-specific frameshift peptides (fsp) for prevention and treatment of cancer |
-
2012
- 2012-12-13 RU RU2015115785A patent/RU2644677C2/en active
- 2012-12-13 WO PCT/EP2012/005154 patent/WO2014090265A1/en active Application Filing
- 2012-12-13 KR KR1020157015802A patent/KR101810840B1/en active IP Right Grant
- 2012-12-13 CN CN201280077683.XA patent/CN104853764B/en active Active
- 2012-12-13 BR BR112015013737-7A patent/BR112015013737B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003087162A2 (en) * | 2002-04-18 | 2003-10-23 | Mtm Laboratories Ag | Neopeptides and methods useful for detection and treatment of cancer |
| RU2424247C2 (en) * | 2005-11-30 | 2011-07-20 | Интернэшнл Инститьют Оф Кэнсер Иммьюнолоджи, Инк. | Cytotoxic t-cell (ctc) inducing peptide, method of inducing ctc, antibody bound to said peptide, use of said peptide in pharmaceutical composition and for treating or preventing cancer, antigen-presenting cell |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| LINNEBACHER M., Frameshift peptide-derived T-cell epitopes: a source of novel tumor-specific antigens, Int. J. Cancer, 2001,v.93, p.6-11. * |
| LINNEBACHER M., Frameshift peptide-derived T-cell epitopes: a source of novel tumor-specific antigens, Int. J. Cancer, 2001,v.93, p.6-11. SCHWITALLE Y., Immunogenic peptides generated by frameshift mutations in DNA mismatch repair-deficient cancer cells, Cancer Immunity, 2004, v.4, p.14. SCHWITALLE Y., Immune Response Against Frameshift-Induced Neopeptides in HNPCC Patients and Healthy HNPCC Mutation Carriers, Gastroenterology, 2008, v.134. * |
| SCHWITALLE Y., Immune Response Against Frameshift-Induced Neopeptides in HNPCC Patients and Healthy HNPCC Mutation Carriers, Gastroenterology, 2008, v.134. * |
| SCHWITALLE Y., Immunogenic peptides generated by frameshift mutations in DNA mismatch repair-deficient cancer cells, Cancer Immunity, 2004, v.4, p.14. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112015013737B1 (en) | 2021-07-27 |
| CN104853764A (en) | 2015-08-19 |
| BR112015013737A2 (en) | 2017-07-11 |
| WO2014090265A1 (en) | 2014-06-19 |
| KR20150084060A (en) | 2015-07-21 |
| KR101810840B1 (en) | 2017-12-20 |
| CN104853764B (en) | 2018-06-22 |
| RU2015115785A (en) | 2017-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10682402B2 (en) | MSI-specific frameshift peptides (FSP) for prevention and treatment of cancer | |
| JP6916231B2 (en) | Neoplasmic vaccine preparation | |
| RU2753246C2 (en) | Compositions of vaccines against neoplasia and methods for obtaining thereof | |
| UA109891C2 (en) | COMPOSITION OF TUMOR ASSOCIATED PEPTIDES FOR TREATMENT OF CANCER DISEASES | |
| JP2024045776A (en) | Neoantigens and their uses | |
| RU2644677C2 (en) | Msi-specific peptides with shifted reading frame (srf) for prevention and treatment of cancer | |
| WO2021074655A1 (en) | Cancer vaccine | |
| EP2572725B1 (en) | MSI-specific frameshift peptides (FSP) for prevention and treatment of cancer | |
| US9808504B2 (en) | Immunogenic epitopes as targets for universal cancer vaccines | |
| WO2018032501A1 (en) | Novel tumor-specific polypeptide and application thereof | |
| JP5890769B2 (en) | MSI-specific frameshift peptides (FSP) for cancer prevention and treatment | |
| JP2016028025A (en) | Msi-specific frameshift peptides (fsp) for prevention and treatment of cancer | |
| WO2018058489A1 (en) | Cacna1h-derived tumour antigen polypeptide and use thereof | |
| JP2021180677A (en) | Polyepitope construct for use in immunotherapy | |
| JP2021043204A (en) | Identification of immunogenic mhc class ii peptides for immune-based therapy | |
| CA2799803C (en) | Msi-specific frameshift peptides (fsp) for prevention and treatment of cancer | |
| AU2016201986B2 (en) | MSI-specific Frameshift Peptides (FSP) for Prevention and Treatment of Cancer | |
| WO2018058490A1 (en) | Col14a1-derived tumour antigen polypeptide and use thereof | |
| RU2805196C2 (en) | Neoantigens and their application | |
| US20150313979A1 (en) | P16ink4a derived peptides for prophylaxis and therapy of hpv-associated tumors and other p16ink4a expressing tumors | |
| Aurisicchio et al. | Harnessing the immune system to fight cancer: the promise of genetic cancer vaccines | |
| WO2002068653A2 (en) | Tri-hybrid melanoma antigen | |
| AU2002244196A1 (en) | Tri-hybrid melanoma antigen |