RU2644260C1 - Штамм одноклеточной микроводоросли mallomonas kalinae - продуцент каротиноида фукоксантина - Google Patents
Штамм одноклеточной микроводоросли mallomonas kalinae - продуцент каротиноида фукоксантина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2644260C1 RU2644260C1 RU2017114369A RU2017114369A RU2644260C1 RU 2644260 C1 RU2644260 C1 RU 2644260C1 RU 2017114369 A RU2017114369 A RU 2017114369A RU 2017114369 A RU2017114369 A RU 2017114369A RU 2644260 C1 RU2644260 C1 RU 2644260C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fucoxanthin
- strain
- kalinae
- mallomonas
- production
- Prior art date
Links
- 241001429002 Mallomonas kalinae Species 0.000 title claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 9
- SJWWTRQNNRNTPU-ABBNZJFMSA-N fucoxanthin Chemical compound C[C@@]1(O)C[C@@H](OC(=O)C)CC(C)(C)C1=C=C\C(C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)C(=O)C[C@]1(C(C[C@H](O)C2)(C)C)[C@]2(C)O1 SJWWTRQNNRNTPU-ABBNZJFMSA-N 0.000 claims abstract description 49
- AQLRNQCFQNNMJA-UHFFFAOYSA-N fucoxanthin Natural products CC(=O)OC1CC(C)(C)C(=C=CC(=CC=CC(=CC=CC=C(/C)C=CC=C(/C)C(=O)CC23OC2(C)CC(O)CC3(C)C)C)CO)C(C)(O)C1 AQLRNQCFQNNMJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 49
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 claims description 7
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 6
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001043303 Isochrysis aff. galbana Species 0.000 description 2
- 241000091642 Odontella aurita Species 0.000 description 2
- 241000206744 Phaeodactylum tricornutum Species 0.000 description 2
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102220594896 Vasopressin-neurophysin 2-copeptin_M20A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- NZEPSBGUXWWWSI-FWFPOGQTSA-N (3e,5e,7e,9e,11e,13e,15e)-18-[(2r,4s)-2,4-dihydroxy-2,6,6-trimethylcyclohexylidene]-1-[(1r,3s,6s)-3-hydroxy-1,5,5-trimethyl-7-oxabicyclo[4.1.0]heptan-6-yl]-3,7,12,16-tetramethyloctadeca-3,5,7,9,11,13,15,17-octaen-2-one Chemical compound C([C@]12[C@@](O1)(C)C[C@@H](O)CC2(C)C)C(=O)C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)C=C=C1C(C)(C)C[C@H](O)C[C@@]1(C)O NZEPSBGUXWWWSI-FWFPOGQTSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- JEBFVOLFMLUKLF-IFPLVEIFSA-N Astaxanthin Natural products CC(=C/C=C/C(=C/C=C/C1=C(C)C(=O)C(O)CC1(C)C)/C)C=CC=C(/C)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)C(=O)C(O)CC2(C)C JEBFVOLFMLUKLF-IFPLVEIFSA-N 0.000 description 1
- 241000206761 Bacillariophyta Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000206751 Chrysophyceae Species 0.000 description 1
- 241001467589 Coscinodiscophyceae Species 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000243681 Eisenia bicyclis Species 0.000 description 1
- 241000206759 Haptophyceae Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000206745 Nitzschia alba Species 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 241001466487 Phaeocystis Species 0.000 description 1
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 1
- 241000015177 Saccharina japonica Species 0.000 description 1
- 241000287219 Serinus canaria Species 0.000 description 1
- 241001467596 Synurophyceae Species 0.000 description 1
- 241001364248 Tisochrysis lutea Species 0.000 description 1
- 241001261506 Undaria pinnatifida Species 0.000 description 1
- 241000206764 Xanthophyceae Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N all-trans beta-carotene Natural products CC=1CCCC(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 235000013793 astaxanthin Nutrition 0.000 description 1
- MQZIGYBFDRPAKN-ZWAPEEGVSA-N astaxanthin Chemical compound C([C@H](O)C(=O)C=1C)C(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)C(=O)[C@@H](O)CC1(C)C MQZIGYBFDRPAKN-ZWAPEEGVSA-N 0.000 description 1
- 239000001168 astaxanthin Substances 0.000 description 1
- 229940022405 astaxanthin Drugs 0.000 description 1
- 235000013734 beta-carotene Nutrition 0.000 description 1
- TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N beta-carotene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=CCCCC2(C)C TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N 0.000 description 1
- 239000011648 beta-carotene Substances 0.000 description 1
- 229960002747 betacarotene Drugs 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- ANWUQYTXRXCEMZ-NYABAGMLSA-L chlorophyllide a Chemical compound C1([C@H](C2=O)C(=O)OC)=C(N3[Mg]N45)C2=C(C)\C3=C\C(=N2)C(CC)=C(C)\C2=C\C4=C(C=C)C(C)=C5\C=C/2[C@@H](C)[C@H](CCC(O)=O)C1=N\2 ANWUQYTXRXCEMZ-NYABAGMLSA-L 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 description 1
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- LBCWAKKSVZUJKE-YGQWAKCJSA-N fucoxanthinol Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C(=O)CC12OC1(C)CC(O)CC2(C)C)C=CC=C(/C)C=C=C3C(O)CC(O)CC3(C)C LBCWAKKSVZUJKE-YGQWAKCJSA-N 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- CNOIXMULOQWVGR-IKYXTRRCSA-N halocyanthiaxanthin Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C(=O)CC12OC1(C)CC(O)CC2(C)C)C=CC=C(/C)C#CC3=C(C)CC(O)CC3(C)C CNOIXMULOQWVGR-IKYXTRRCSA-N 0.000 description 1
- CNOIXMULOQWVGR-ABUIXNMTSA-N halocynthiaxanthin Chemical compound C([C@]12[C@@](O1)(C)C[C@@H](O)CC2(C)C)C(=O)C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)C#CC1=C(C)C[C@@H](O)CC1(C)C CNOIXMULOQWVGR-ABUIXNMTSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000003863 metallic catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008239 natural water Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 208000030212 nutrition disease Diseases 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003711 photoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 150000004291 polyenes Chemical class 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011856 silicon-based particle Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
- C12N1/125—Unicellular algae isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/89—Algae ; Processes using algae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм одноклеточных микроводорослей Mallomonas kalinae SX-1 – продуцент фукоксантина - депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Al-23. Штамм может быть использован для получения фукоксантина с высоким выходом. 2 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью.
Уровень техники
Антиоксиданты – это вещества, ингибирующие процессы окисления органических соединений и защищающие организм от негативного воздействия свободных радикалов и других веществ, влияя на процессы старения, канцерогенеза, токсического повреждения органов и тканей и др. Одним из источников антиоксидантных соединений являются водоросли, способные к синтезу широкого спектра антиоксидантов, таких как астаксантин, фукоксантин, бета-каротин и т.д.
Фукоксантин является одним из наиболее распространенных каротиноидов в природе. Это доминирующий каротиноид у гетероконтных и гаптофитовых водорослей, которые включают в себя более 20 тысяч видов. Среди представителей этих групп водорослей есть планктонные водоросли, доминирующие в мировом океане, такие как диатомовые микроводоросли, кокколитофориды, представители группы Phaeocystis, и бурые макроводоросли, доминирующие в прибрежной части морей и океанов.
В водорослях фукоксантин выполняет функцию светопоглощающего пигмента и переноса энергии на хлорофилл-белковый комплекс в процессе фотосинтеза. Также фукоксантин обладает высокой антиксидантной активностью и может выполнять фотопротекторную функцию, защищая клетку от избыточного освещения. Недавно было показано, что фукоксантин оказывает положительное влияние на организмы и обладает противораковой, противогипертензивной, противовоспалительной активностями и способствует снижению веса при ожирении (Shiratori et al., 2005; Martin, 2015; Muradian et al., 2015).
Коммерческое производство фукоксантина встречает несколько проблем. Фукоксантин может быть синтезирован химически, однако эффективность выхода такой реакции достаточно низкая (Yamano et al., 1995). В настоящее время промышленное производство фукоксантина происходит из бурых водорослей, таких как Laminaria japonica, Eisenia bicyclis, Undaria pinnatifida и Hijikia fusiformis. Однако концентрация фукоксантина в бурых водорослях невысока (Kanazawa et al., 2008).
Микроводоросли являются перспективным источником фукоксантина для коммерческого производства. Они обладают более высокой концентрацией фукоксантина в биомассе по сравнению с макроводорослями. Также в связи с развитием методов промышленного культивирования микроводорослей в фотобиореакторах эффективность выращивания микроводорослей растет. Тем не менее, несмотря на большое количество видов микроводорослей, синтезирующих фукоксантин, только несколько видов используются для коммерческого производства фукоксантина (Kim et al., 2012; Xia et al., 2013). Эти виды относятся к двум группам фукоксантин-содержащих микроводорослей: диатомовых и примнезиофитовых.
Известен штамм пеннатной диатомовой микроводоросли Phaeodactylum tricornutum, депонированный в KMMCC (B-007), содержащий до 15,71 мг фукоксантина на грамм сухого веса (Kim et al., 2012).
Известен штамм примнезиофитовой микроводоросли Isochrysis aff. galbana (Tisochrysis lutea), депонированный в CCMP (1324), выделенный из морской воды, отобранной на острове Таити, и содержащий до 18,23 мг фукоксантина на грамм сухого веса (Kim et al., 2012).
Также известен штамм центрической диатомовой микроводоросли Odontella aurita, депонированный в SCCAP (K-1251), выделенный из морской воды, отобранной на Канарских островах, и содержащий до 21,67 мг фукоксантина на грамм сухого веса (Xia et al., 2013).
Недостатком этих штаммов является необходимость поддержания высокой концентрации солей в составе среды культивирования, что приводит к дополнительным затратам при производстве, а также недостаточно высокое содержание фукоксантина.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является получение нового штамма-продуцента фукоксантина, обладающего высоким содержанием фукоксантина, а также способного расти в средах с низкой концентрацией солей.
Задача решается путем получения нового штамма одноклеточных микроводорослей Mallomonas kalinae SX-1 - продуцента каротиноида фукоксантина.
Штамм Mallomonas kalinae SX-1 депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГБУ «ГосНИИгенетика» Министерства образования и науки РФ под регистрационным номером ВКПМ Al-23.
Предлагаемый штамм одноклеточной микроводоросли Mallomonas kalinae SX-1 ВКПМ Al-23 в качестве продуцента фукоксантина имеет ряд преимуществ, которые обеспечивают технический результат настоящего изобретения, заключающийся в следующем:
- наибольшая известная концентрация фукоксантина 28 мг фукоксантина на грамм сухого веса;
- способность расти в средах с низкой концентрацией солей, в том числе при концентрации 0 граммов NaCl на литр среды.
Подробное описание изобретения
Штамм Mallomonas kalinae SX-1 ВКПМ Al-23 был получен микробиологическим методом путем выделения на селективных средах и использованием микроманипуляции для получения отдельных клеток. Выделение проводили следующим способом. Образцы природной воды отбирали в Приморском крае (Россия) в пресноводном водоеме. Для этого использовали планктонную сеть с ячейкой 20 мкм. Из нефиксированных проб пипеткой выделяли отдельные клетки, промывали в каплях стерилизованной воды и помещали в лунку (300 мкл) планшета для иммуноферментного анализа. После трех недель роста альгологически чистые культуры переносили в чашки Петри диаметром 40 мм, содержащие жидкую минеральную среду WC следующего состава: CaCl2·2H2O – 36,8 мг, MgSO4·7H2O - 37 мг, NaHCO3 – 12,60 мг, K2HPO4·3H2O – 11,4 мг, NaNO3 – 85 мг, Na2SiO3·9H2O – 21,2 мг, раствор микроэлементов – 1 мл, витамины – 1 мл (Guillard & Lorenzen, 1972), водопроводная вода - 1 л. Инкубирование проводили при температуре 22 - 28°С в течение 1 месяца при непрерывном или переменном освещении (120 мкмоль/м2×с) с циклом день/ночь 16/8 часов.
Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических признаков в соответствии с критериями, приведенными в монографии Kristiansen&Preisig, 2007.
Хранение штамма одноклеточных водорослей Mallomonas kalinae SX-1 ВКПМ Al-23 осуществляется на жидкой минеральной среде WC. Инкубирование проводили при температуре 22 – 28 °С в течение 1 месяца при непрерывном или переменном освещении (120 мкмоль/м2×с) с циклом день/ночь 16/8 часов. Более длительное хранение осуществляется путем периодического (оптимально – один раз в месяц, максимально – один раз в несколько месяцев) пересева на свежую жидкую минеральную среду WC.
Штамм Mallomonas kalinae SX-1 ВКПМ Al-23 характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиологическими признаками и биологическими свойствами.
Культуральные свойства. На жидкой среде WC характеризуется ростом в виде бурой взвеси. Степень чистоты культуры – альгологически чистая. Отсутствие водорослей других видов контролировали при световой фазово-контрастной микроскопии.
Морфологические признаки. Клетки имеют удлиненно-эллипсоидную форму, размером 18-25 × 8-15 мкм. Клетки покрыты чешуйками. Хлоропласт одиночный, двухлопастной. Клетки с двумя жгутиками, коротким и длинными (виден только длинный). Кремнеземные чешуйки овальные 3,6–4,3 × 2,2–2,5 мкм. При хранении свыше 2-х месяцев без пересева клетки обездвиживаются и образуют скопления в слизи.
Молекулярная идентификация. Штамм Mallomonas kalinae SX-1 ВКПМ Al-23 обладает 97% сходства с Mallomonas kalinae CCMP3213 (KM817872.1). Нуклеотидная последовательность участка 18S рРНК: TTTTTGGAAGGGGGTGTTATTTATTAGATGGAAAACCAATGCGGGGGCAACCCCGGTATCTGGTGATTTCATAATAACTTTCGGATCGACTTTTGTCGATGCATCATTTCAAGTTTTTGCCCTATCAGCTTTGGATGGTAGGGTATTGGCCTACCATGGCTTTAACGGGTAACGGAGAATTTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAATGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATAAATATCGATGCCGGGCTTTTTTAAGTTTGGCAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTATCGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATACTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCTGATCGTGGCAACCGGTCCGCCTCTTCATGGGGTGTGTACCAGGTCTCTGCGGTCATCCTCGGGGTGCTCGTATCTGGCATTAAGTTGTCGGGTACGCTATCCTCGTCATTTACTGTGAGCAAAATAGAGTGTTCAAAGCAGGCTTAGGCCTTTGAATATCTTAGCATGGAATAATAAGATAGGACCTTGGTCTATTTTGTTGGTTTGTATTCCAAGGTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGTATTCGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGGAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTACCAAATATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATTGGTGGTTGCTCGTAATGACTCCATCAGCACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTTAATTTGAACTCAACACGGGGAAACTTACCAGGTCCAAGACATAGTGAGGATTGACAGATTGAAGAGCTCTTTCTTTGATTCTATGGGGTGGTGGTGCAATGGCCGTTTCTTTAGTTTGGTGGGAGTGATTTGTCTGGGTTAATTTCCGTTAACC
Физиологические свойства. Оптимальными условиями для максимальной продукции фукоксантина штаммом Mallomonas kalinae SX-1 ВКПМ Al-23 является жидкая минеральная среда WCx10 следующего состава: CaCl2·2H2O – 36,8 мг, MgSO4·7H2O - 37 мг, NaHCO3 – 12,60 мг, K2HPO4·3H2O – 114 мг, NaNO3 – 850 мг, Na2SiO3·9H2O – 21,2 мг, раствор микроэлементов – 1 мл, витамины – 1 мл, водопроводная вода - 1 л. Минерализация среды в диапазоне 0 - 0,1 г/л, наличие перемешивания, температура 22 – 28 °C, освещение люминесцентными лампами 120 мкмоль/м2×с (16 ч с перерывом 8 ч.).
В качестве источника CO2 использует воздух c концентрацией углекислого газа 5% при периодическом перемешивании на перемешивающем устройстве Multitron с частотой колебаний платформы 150 об/мин. Штамм не обладает инфекционным и общетоксическим действием. Штамм является непатогенным и не включен в списки, приведенные в санитарных правилах СП 1.3.2322-08; штамм не несет опасных генетических конструкций.
Штамм Mallomonas kalinae SX-1 депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГБУ «ГосНИИгенетика» Министерства образования и науки РФ под регистрационным номером ВКПМ Al-23.
Возможность применения на практике штамма одноклеточных водорослей Mallomonas kalinae SX-1 ВКПМ Al-23 обуславливается его способностью продуцировать биологически активные вещества, обладающие антиоксидантной активностью. Полученный штамм перспективен для создания на его основе биологически активной добавки (БАД), применяемой для непосредственного употребления в пищу, в качестве профилактического средства или для создания функциональных пищевых продуктов. Также штамм может использоваться в аквакультуре для кормления личинок креветки и других беспозвоночных, рыбы, получения биотоплива, липидов, белка, омега-3 полиненасыщенных жирных кислот, эйкозапентаеновой кислоты, наноструктурированных частиц кремния, пигментов, каротиноидов, в том числе антиоксидантов, фукоксантина, препаратов для похудения, биологически активных добавок для питания человека и т.д.
Перечисленные примеры применения изобретения на практике не являются ограничивающими и могут быть расширены.
Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученными в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.
Нижеследующие примеры приведены в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример 1. Производство биомассы, обогащенной фукоксантином с использованием штамма Mallomonas kalinae SX-1 ВКПМ Al-23 при фиксированном уровне освещения.
При выращивании штамма в емкостях, содержащих среду WCx10, при освещенности 120 мкмоль/м2×с и температуре 22 – 28 °С максимальное содержание фукоксантина достигается на 14-й день культивирования и составляет 10 мг фукоксантина на грамм сухой биомассы. При этом максимальное содержание сухой биомассы составляет 3 г/л, что соответствует 30 мг фукоксантина на литр среды. После окончания выращивания среда, содержащая биомассу, центрифугируется, собранная биомасса лиофилизируется. Биомасса может использоваться в полученном виде как компонент кормов, функционального питания и в других областях применения, не требующих использования очищенного фукоксантина. При необходимости фукоксантин может экстрагироваться из биомассы с использованием органических растворителей, таких как ацетонитрил, этанол или метанол. Для этого используют, например, хроматограф «Shimadzu» Nexera X2 (Япония), оснащенный фотодиодным детектором SPD M20A и капиллярной колонкой Discovery C18 (длина 15 см, внутренний диаметр 4,6 мм, диаметр частиц 5 мкм) («Supelco», США). Сбор и обработку данных проводят с помощью пакета программ «LabSolutions» с использованием персонального компьютера. Измерения проводят в трех повторностях.
Пример 2. Производство биомассы, обогащенной фукоксантином, с использованием штамма Mallomonas kalinae SX-1 ВКПМ Al-23 при переменном уровне освещения.
При выращивании штамма в емкостях, содержащих среду WCx10, при освещенности 240 мкмоль/м2×с и температуре 22 – 28 °С максимальное содержание биомассы достигается на 9-12 день культивирования и составляет 4 г сухой биомассы на литр среды. При этом содержание фукоксантина составляет 5 мг на грамм сухой биомассы, что соответствует 20 мг фукоксантина на литр среды. После достижения максимального содержания биомассы в среде на 9-12 день культивирования уровень освещенности культуры снижается с 240 мкмоль/м2×с до 20 мкмоль/м2×с, при этом все остальные параметры культивирования остаются неизменными. При низкой освещенности концентрация фукоксантина в течение 3-6 дней увеличивается с 5 мг на грамм сухой биомассы до 28 мг на грамм сухой биомассы, что соответствует 112 мг фукоксантина на литр среды. После окончания выращивания среда, содержащая биомассу, центрифугируется, собранная биомасса лиофилизируется.
При необходимости фукоксантин может экстрагироваться из биомассы с использованием органических растворителей, таких как ацетонитрил, этанол или метанол. Для этого может быть использован хроматограф «Shimadzu» Nexera X2 (Япония), оснащенный фотодиодным детектором SPD M20A и капиллярной колонкой Discovery C18 (длина 15 см, внутренний диаметр 4,6 мм, диаметр частиц 5 мкм) («Supelco», США). Сбор и обработку данных проводят с помощью пакета программ «LabSolutions» с использованием персонального компьютера.
Несмотря на то что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Источники информации
1. Shiratori K., Ohgami K., Ilieva I., Jin X.H., Koyama Y., Miyashita K., Yoshida K., S. Kase, S. Ohno, Effects of fucoxanthin on lipopolysaccharide-induced inflammation in vitro and in vivo // Experimental eye research. – 2005. – Т. 81. – №. 4. – С. 422-428.
2. Martin L.J. Fucoxanthin and its metabolite fucoxanthinol in cancer prevention and treatment //Marine drugs. – 2015. – Т. 13. – №. 8. – С. 4784-4798.
3. Muradian K., Vaiserman A., Min K.J., Fraifeld V.E. Fucoxanthin and lipid metabolism: A minireview //Nutrition, Metabolism and Cardiovascular Diseases. – 2015. – Т. 25. – №. 10. – С. 891-897.
4. Yamano Y., Tode C., Ito M. Carotenoids and related polyenes. Part 3. First total synthesis of fucoxanthin and halocynthiaxanthin using oxo-metallic catalyst //Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1. – 1995. – №. 15. – С. 1895-1904.
5. Kanazawa K., Ozaki Y., Hashimoto T., Das S.K., Matsushita S., Hirano M., Okada T., Komoto A., Mori N., Nakatsuka M. Commercial-scale preparation of biofunctional fucoxanthin from waste parts of brown sea algae Laminalia japonica //Food science and technology research. – 2008. – Т. 14. – №. 6. – С. 573-573.
6. Kim S.M., Kang S.W., Kwon O.N., Chung D., Pan C.H. Fucoxanthin as a major carotenoid in Isochrysis aff. galbana: Characterization of extraction for commercial application //Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry. – 2012. – Т. 55. – №. 4. – С. 477-483.
7. Xia S., Wang K., Wan L., Li A., Hu Q., Zhang C. Production, characterization, and antioxidant activity of fucoxanthin from the marine diatom Odontella aurita //Marine drugs. – 2013. – Т. 11. – №. 7. – С. 2667-2681.
8. Kim S.M., Jung Y.J., Kwon O.N., Cha K.H., Um B.H., Chung D., Pan C.H. A potential commercial source of fucoxanthin extracted from the microalga Phaeodactylum tricornutum //Applied biochemistry and biotechnology. – 2012. – Т. 166. – №. 7. – С. 1843-1855.
9. Guillard R.R.L., Lorenzen C.J. Yellow‐green algae with chlorophyllide C //Journal of Phycology. – 1972. – Т. 8. – №. 1. – С. 10-14.
10. Kristiansen J., Preisig, H.R. Chrysophyta and Haptophyta Algae, 2nd part. Synurophyceae. In: Büdel, B., Gärtner, G., Krienitz, L., Preisig, H.R. & Schagerl, M. (eds) Süsswasserflora von Mitteleuropa (Freshwater flora of Central Europe) 1/2. Springer-Verlag, Berlin, 2007, 252 pp.
Claims (2)
-
- Штамм одноклеточной микроводоросли Mallomonas kalinae SX-1 ВКПМ Al-23 - продуцент каротиноида фукоксантина.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017114369A RU2644260C1 (ru) | 2017-04-25 | 2017-04-25 | Штамм одноклеточной микроводоросли mallomonas kalinae - продуцент каротиноида фукоксантина |
| PCT/RU2018/050045 WO2018199814A1 (ru) | 2017-04-25 | 2018-04-25 | Штамм одноклеточной микроводоросли mallomonas kalinae - продуцент каротиноида фукоксантина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017114369A RU2644260C1 (ru) | 2017-04-25 | 2017-04-25 | Штамм одноклеточной микроводоросли mallomonas kalinae - продуцент каротиноида фукоксантина |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2644260C1 true RU2644260C1 (ru) | 2018-02-08 |
Family
ID=61173793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017114369A RU2644260C1 (ru) | 2017-04-25 | 2017-04-25 | Штамм одноклеточной микроводоросли mallomonas kalinae - продуцент каротиноида фукоксантина |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2644260C1 (ru) |
| WO (1) | WO2018199814A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2835138C1 (ru) * | 2024-10-24 | 2025-02-24 | Общество с ограниченной ответственностью "Ля Водоросля" | Морская микроводоросль - продуцент бета-каротина, лютеина и иных каротиноидов |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2054442C1 (ru) * | 1993-07-28 | 1996-02-20 | Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН | Способ получения фукоксантина |
| RU2399298C1 (ru) * | 2009-05-21 | 2010-09-20 | Тихоокеанский Институт Биоорганической Химии Дальневосточного Отделения Российской Академии Наук (Тибох Дво Ран) | Способ переработки бурых водорослей |
-
2017
- 2017-04-25 RU RU2017114369A patent/RU2644260C1/ru active IP Right Revival
-
2018
- 2018-04-25 WO PCT/RU2018/050045 patent/WO2018199814A1/ru active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2054442C1 (ru) * | 1993-07-28 | 1996-02-20 | Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН | Способ получения фукоксантина |
| RU2399298C1 (ru) * | 2009-05-21 | 2010-09-20 | Тихоокеанский Институт Биоорганической Химии Дальневосточного Отделения Российской Академии Наук (Тибох Дво Ран) | Способ переработки бурых водорослей |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KIM S.M., JUNG Yu- Jin, CHA K.H. et al. A potential commercial source of fucoxanthin extracted from the Microalga Phaeodactylum tricornutum, Applied biochemistry and biotechnology, 2012, v. 166, N 7, p. 1843-1855. * |
| РЯБУШКО В.И., ЖЕЛЕЗНОВА С.Н., и др. Влияние азота на накопление фукоксантина диатомовой водорослью Cylinrotheca closterium (EHRENB.) REIMANN ET LEWIN. Альгология. Физиология, биохимия, биофизика, 2017, N 1, 27(1), с. 15-21. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2835138C1 (ru) * | 2024-10-24 | 2025-02-24 | Общество с ограниченной ответственностью "Ля Водоросля" | Морская микроводоросль - продуцент бета-каротина, лютеина и иных каротиноидов |
| RU2835137C1 (ru) * | 2024-10-24 | 2025-02-24 | Общество с ограниченной ответственностью "Ля Водоросля" | Морская микроводоросль - продуцент лютеина и иных каротиноидов |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018199814A1 (ru) | 2018-11-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gómez-Loredo et al. | Growth kinetics and fucoxanthin production of Phaeodactylum tricornutum and Isochrysis galbana cultures at different light and agitation conditions | |
| KR20100120660A (ko) | 조류 배양물 생산, 수확 및 가공 | |
| Zanolla et al. | Protein, phycocyanin, and polysaccharide production by Arthrospira platensis grown with LED light in annular photobioreactors | |
| Priyadarshani et al. | Bioactive compounds from microalgae and cyanobacteria: utility and applications | |
| ES2658864T3 (es) | Producción de ácido docosahexanoico y/o de ácido eicosapentanoico y/o carotenoides en modo mixótrofo por Nitzschia | |
| Mousavi Nadushan et al. | Optimization of production and antioxidant activity of fucoxanthin from marine haptophyte algae, Isochrysis galbana | |
| Choi et al. | Biocompatible liquid-type carbon nanodots (C-paints) as light delivery materials for cell growth and astaxanthin induction of Haematococcus pluvialis | |
| Mal et al. | Facets of diatom biology and their potential applications | |
| Mutaf et al. | The effect of medium and light wavelength towards Stichococcus bacillaris fatty acid production and composition | |
| US20130309719A1 (en) | Heterotrophic microbial production of xanthophyll pigments | |
| Zhu et al. | Effect of air nanobubble water on the growth and metabolism of Haematococcus lacustris and Botryococcus braunii | |
| Zhao et al. | Effects of trophic modes, carbon sources, and salinity on the cell growth and lipid accumulation of tropic ocean oilgae strain Desmodesmus sp. WC08 | |
| Indrayani | Isolation and characterization of microalgae with commercial potential | |
| Fakhri et al. | Biomass, pigment production, and nutrient uptake of Chlorella sp. under different photoperiods | |
| EP3037542B1 (en) | Method for generating oil/fat component and method for producing higher unsaturated fatty acid | |
| Huang et al. | Growth effects on mixed culture of Dunaliella salina and Phaeodactylum tricornutum under different inoculation densities and nitrogen concentrations | |
| Anandapadmanaban et al. | Enhanced production of lipid as biofuel feedstock from the marine diatom Nitzschia sp. by optimizing cultural conditions | |
| RU2644260C1 (ru) | Штамм одноклеточной микроводоросли mallomonas kalinae - продуцент каротиноида фукоксантина | |
| Badar et al. | Growth evaluation of microalgae isolated from palm oil mill effluent in synthetic media | |
| CN113913298B (zh) | 提高微藻生物量的方法 | |
| RU2661116C1 (ru) | Штамм одноклеточной микроводоросли Eustigmatos magnus - продуцент эйкозапентаеновой кислоты | |
| SU1324627A1 (ru) | Штамм вольвоксовой водоросли DUNaLIeLLa SaLINa TeoD CALU-834-продуцент белково-каротиновой биомассы | |
| Sirotiya et al. | Biochemical Compounds in Phaeodactylum tricornutum | |
| RU2770484C1 (ru) | Штамм микроводоросли Chlorella sp. VADA 2020, продуцирующий биомассу, пригодную для использования в пищевых целях | |
| JP6625370B2 (ja) | 藻類の培養密度を向上させるための組成物およびその利用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200426 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20210204 |