RU2639498C1 - Set of oligonucleotide primers and fluorescence marked probes for identifying of blastomycesis dermatitis irritant - Google Patents
Set of oligonucleotide primers and fluorescence marked probes for identifying of blastomycesis dermatitis irritant Download PDFInfo
- Publication number
- RU2639498C1 RU2639498C1 RU2016132105A RU2016132105A RU2639498C1 RU 2639498 C1 RU2639498 C1 RU 2639498C1 RU 2016132105 A RU2016132105 A RU 2016132105A RU 2016132105 A RU2016132105 A RU 2016132105A RU 2639498 C1 RU2639498 C1 RU 2639498C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bdags
- dermatitidis
- dna
- fluorescence
- irritant
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
- C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D493/10—Spiro-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано для выявления ДНК возбудителя бластомикоза Blastomyces dermatitidis в биологическом материале и объектах окружающей среды специалистами учреждений как практического здравоохранения, Роспотребнадзора, так и в научных исследованиях.The invention relates to the field of biotechnology, molecular biology and can be used to detect DNA of the causative agent of blastomycosis Blastomyces dermatitidis in biological material and environmental objects by specialists of institutions of both practical public health, Rospotrebnadzor, and in scientific research.
Бластомикоз относится к особо опасным заболеваниям, этиологическим агентом которого является диморфный гриб Blastomyces dermatitidis. Заболевание характеризуется образованием гранулем и гнойных абсцессов в легких, коже, подкожной клетчатке, а при диссеминации - во многих внутренних органах. Специфические симптомы отсутствуют. Острую форму бластомикоза клинически трудно дифференцировать от бактериальной пневмонии, хронической формы туберкулеза или рака легких. Существует молниеносная форма заболевания с развитием ОРДС (острый респираторный дистресс-синдром). Причем в таком виде заболевание заканчивается в большинстве случаев летально [Dworkin M.S., Duckro A.N., Proia L. et al. The epidemiology of blastomycosis in Illinois and factors associated with death // Clin. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 41. - P. 107-111]. Бластомикоз относится к категории «респираторных», т.е. основной путь инфицирования - аэрогенный при вдыхании спор мицелия гриба из окружающей среды.Blastomycosis is a particularly dangerous disease, the etiological agent of which is the dimorphic fungus Blastomyces dermatitidis. The disease is characterized by the formation of granulomas and purulent abscesses in the lungs, skin, subcutaneous tissue, and during dissemination - in many internal organs. No specific symptoms. It is clinically difficult to differentiate an acute form of blastomycosis from bacterial pneumonia, a chronic form of tuberculosis or lung cancer. There is a fulminant form of the disease with the development of ARDS (acute respiratory distress syndrome). Moreover, in this form, the disease ends in most cases lethally [Dworkin M.S., Duckro A.N., Proia L. et al. The epidemiology of blastomycosis in Illinois and factors associated with death // Clin. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 41. - P. 107-111]. Blastomycosis belongs to the category of “respiratory”, i.e. the main route of infection is aerogenic by inhalation of spores of the mycelium of the fungus from the environment.
В настоящее время бластомикоз регистрируют в районе южных и восточных штатов США. В Африке бластомикоз известен в 18 странах, однако большинство случаев заболевания регистрируют в южной части материка, особенно в Южно-Африканской республике и Зимбабве. Известны случаи завоза бластомикоза в некоторые страны Европы (Италия, Франция, Венгрия, Польша).Currently, blastomycosis is recorded in the region of the southern and eastern states of the United States. In Africa, blastomycosis is known in 18 countries, but most cases are reported in the southern part of the mainland, especially in the Republic of South Africa and Zimbabwe. Cases of import of blastomycosis to some European countries are known (Italy, France, Hungary, Poland).
Необходимость исследований, направленных на обнаружение штаммов В. dermatitidis, связана с ростом уровня миграции населения, туристической и деловой активности между странами Африки, Северной и Южной Америки и Российской Федерацией, а также с сохранением угрозы возникновения чрезвычайных ситуаций, обусловленных возможностью террористических актов с использованием этого возбудителя.The need for research aimed at the detection of strains of B. dermatitidis is associated with an increase in the level of population migration, tourism and business activity between the countries of Africa, the Americas and the Russian Federation, as well as with the continued threat of emergencies caused by the possibility of terrorist attacks using this pathogen.
Установление этиологической роли возбудителя при глубоких микозах является непростой задачей, обусловленной определенными ограничениями стандартных методов их диагностики. Так, при микроскопическом исследовании клинического материала возможно предположить природу заболевания, но не определить вид возбудителя. Выделение чистой культуры В. dermatitidis с последующим подтверждением конверсии мицелиальной формы в дрожжевую может занять несколько недель.Establishing the etiological role of the pathogen in deep mycoses is not an easy task, due to certain limitations of standard methods for their diagnosis. So, with a microscopic examination of clinical material, it is possible to assume the nature of the disease, but not to determine the type of pathogen. Isolation of a pure culture of B. dermatitidis followed by confirmation of the conversion of the mycelial form to yeast may take several weeks.
Метод полимеразной цепной реакции обладает высокой специфичностью и чувствительностью и является прямым методом выявления ДНК возбудителя бластомикоза, позволяющим быстро идентифицировать культуру гриба в пробах различного происхождения.The polymerase chain reaction method has high specificity and sensitivity and is a direct method for detecting the DNA of the blastomycosis pathogen, which allows quick identification of the fungus culture in samples of various origins.
Выбор специфического фрагмента ДНК-мишени и подбор праймеров играет важнейшую роль в проведении реакции, влияя на качество диагностики заболеваний. Использование метода ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с флуоресцентной детекцией позволяет детектировать продукты амплификации в момент проведения реакции. Для этого в одной пробирке совместно с праймерами используют меченые флуоресцентными красителями зонды, что позволяет повысить специфичность анализа и одновременно дает возможность для автоматической регистрации полученных результатов. Отсутствие стадии электрофореза в проведении исследования ведет к уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб и лаборатории продуктами амплификации, позволяет снизить требования, предъявляемые к ГТЦР лаборатории, а также раньше получить результат.The selection of a specific fragment of the target DNA and the selection of primers plays a crucial role in the reaction, affecting the quality of the diagnosis of diseases. Using real-time PCR (PCR-RV) with fluorescence detection allows you to detect amplification products at the time of the reaction. For this purpose, probes labeled with fluorescent dyes are used in one tube together with primers, which makes it possible to increase the specificity of the analysis and at the same time makes it possible to automatically record the results. The absence of an electrophoresis stage in the study reduces the likelihood of contamination of the studied samples and the laboratory with amplification products, reduces the requirements for the GTsR laboratory, and also earlier to get the result.
Известен способ идентификации возбудителя бластомикоза, где разработана мультиплексная ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и гибридизационных зондов с резонансным переносом энергии, комплементарных фрагментам гена гистидинкиназы В. dermatitidis [Babady N.E, Buckwalter S.P., Hall L., Le Febre K.M., Binnicker M.J., Wengenack N.L. Detection of Blastomyces dermatitidis and Histoplasma capsulatum from culture isolates and clinical specimens by use of real-time PCR / J. Clin. Microbiol. - 2011 - Vol. 49, №9. - p. 3204-3208]. Применение такой технологии сопряжено с необходимостью использования двух олигонуклеотидных зондов, меченых разными флуорофорами, что предъявляет высокие требования к выбору пары флуоресцентных красителей, между которыми возможен резонансный перенос энергии, а также повышает стоимость проведения анализа.A known method for identifying the causative agent of blastomycosis, where a real-time multiplex PCR was developed using primers and hybridization probes with resonant energy transfer, complementary to fragments of the histidine kinase gene B. dermatitidis [Babady NE, Buckwalter SP, Hall L., Le Febre KM, Binnicker MJ, Wengenack Nl Detection of Blastomyces dermatitidis and Histoplasma capsulatum from culture isolates and clinical specimens by use of real-time PCR / J. Clin. Microbiol. - 2011 - Vol. 49, No. 9. - p. 3204-3208]. The use of this technology is associated with the need to use two oligonucleotide probes labeled with different fluorophores, which makes high demands on the choice of a pair of fluorescent dyes between which resonance energy transfer is possible, and also increases the cost of analysis.
Наиболее близким аналогом являются специфичные праймеры и зонд по типу TaqMan, сконструированые на основе промоторной области гена BAD1, предложенные K. Sidamonidze с соавторами для идентификации возбудителя бластомикоза методом ПЦР-РВ [Sidamonidze K., Peck М.K., Perez М. et al. Real-Time PCR assay for identification of Blastomyces dermatitidis in culture and in tissue / J. Clin. Microbiol. - 2012. - Vol. 50 (5). - p. 1783-1786. doi:10.1128/JCM.00310-12]. Однако при секвенировании гена BAD-1, ответственного за синтез адгезина клеточной стенки В. dermatitidis, был обнаружен полиморфизм промоторной области, а у штаммов В. dermatitidis, принадлежащих к африканскому типу (серотип 2), BAD1 отсутствует. Вполне возможно, что в этом случае выбор праймеров, нацеленных на промоторную область гена BAD1, вызовет трудности при осуществлении лабораторной диагностики.The closest analogue is specific primers and a TaqMan-type probe, designed on the basis of the BAD1 gene promoter region, proposed by K. Sidamonidze et al for identification of the causative agent of blastomycosis by PCR-PB [Sidamonidze K., Peck M.K., Perez M. et al. . Real-Time PCR assay for identification of Blastomyces dermatitidis in culture and in tissue / J. Clin. Microbiol. - 2012. - Vol. 50 (5). - p. 1783-1786. doi: 10.1128 / JCM.00310-12]. However, during sequencing of the BAD-1 gene, which is responsible for the synthesis of adhesion of the cell wall of B. dermatitidis, a promoter region polymorphism was detected, and there was no BAD1 in B. dermatitidis strains belonging to the African type (serotype 2). It is possible that in this case the choice of primers aimed at the promoter region of the BAD1 gene will cause difficulties in the implementation of laboratory diagnostics.
Целью настоящего изобретения является разработка набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации ДНК возбудителя бластомикоза методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.The aim of the present invention is to develop a set of specific oligonucleotide primers and a fluorescently-labeled probe for identifying DNA of the causative agent of blastomycosis by polymerase chain reaction with hybridization-fluorescence-based results.
Цель достигается созданием набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации ДНК возбудителя бластомикоза Blastomyces dermatitidis методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, содержащего олигонуклеотиды, комплементарные фрагментам гена α-1,3-глюкансинтазы В. dermatitidis, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, и зонда, сконструированного по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего флуоресцентную детекцию, имеющих следующую структуру:The goal is achieved by creating a set of oligonucleotide primers and a fluorescently labeled probe to identify the DNA of the blastomycosis pathogen Blastomyces dermatitidis by polymerase chain reaction with hybridization-fluorescence-based results containing oligonucleotides that are complementary to the fragments of the α-1,3-glumatin direct gene activity of dermatin reverse primers in the amplification reaction, and a probe designed as a "molecular beacon", providing fluorescence detection, having the following stream tour:
где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 490 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм. BHQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 480-580 нм.where FAM is carboxyfluorescein, a fluorescent dye with an absorption wavelength of 490 nm and a fluorescence wavelength of 520 nm. BHQ1 is a fluorescence quencher with a quenching range of 480-580 nm.
Характеристика олигонуклеотидных праймеров, зонда и ДНК мишени для идентификации возбудителя бластомикоза.Characterization of oligonucleotide primers, probe and target DNA for identification of the causative agent of blastomycosis.
Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), для идентификации возбудителя бластомикоза были подобраны праймеры, обозначенные BDags-1F / BDags-2R, комплементарные фрагменту гена α-1,3-глюкансинтазы (alpha-1,3-glucan synthase) и обеспечивающие амплификацию специфического фрагмента размером 178 п.н.Based on the data presented in the GenBank NCBI database (National Center for Biotechnology Information, USA), primers designated BDags-1F / BDags-2R complementary to the α-1,3-glucan synthase gene fragment (alpha-1) were selected to identify the blastomycosis causative agent , 3-glucan synthase) and providing amplification of a specific fragment of 178 bp
Для детекции продуктов ПЦР в режиме реального времени был сконструирован зонд формата «молекулярный маяк», обозначенный BDags-2P, на разных концах которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. Подобная структура зонда обеспечивает максимальный эффект тушения и низкую фоновую флуоресценцию, поскольку молекулы флуорофора и гасителя сближены в пространстве.To detect PCR products in real time, a molecular beacon format probe, designated BDags-2P, was constructed at its different ends with a fluorophore and a fluorescence quencher. Such a probe structure provides the maximum quenching effect and low background fluorescence, since the fluorophore and quencher molecules are brought together in space.
Апробация разработанного набора олигонуклеотидов была осуществлена на наборе штаммов возбудителей особо опасных микозов лаборатории коллекционных штаммов ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. В качестве положительного контроля использовали коллекционный штамм В. dermatitidis 9. Для выделения ДНК использовали обеззараженные суспензии микромицетов в концентрациях от 1×107 м.к./мл до 1×101 кл./мл.Testing of the developed set of oligonucleotides was carried out on a set of strains of pathogens of especially dangerous mycoses of the laboratory of collection strains PKUZ Volgograd Research Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor. A collection strain of B. dermatitidis 9 was used as a positive control. For disinfection of DNA, disinfected suspensions of micromycetes were used in concentrations from 1 × 10 7 MK / ml to 1 × 10 1 cells / ml.
Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с праймерами - BDags-1F / BDags-2R и зондом BDags-2P оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителя бластомикоза, и составила 1×102 кл./мл.The sensitivity of the real-time amplification reaction with fluorescence detection with primers BDags-1F / BDags-2R and the BDags-2P probe was evaluated by studying DNA samples isolated from ten-fold dilutions of pure cultures of the blastomycosis pathogen and amounted to 1 × 10 2 cells / ml .
Примеры конкретного выполненияCase Studies
Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации ДНК возбудителя бластомикоза методом ПЦР в режиме реального времени.Example 1. The method of designing oligonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for identifying DNA of the causative agent of blastomycosis by real-time PCR.
На основе анализа in silico секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителя бластомикоза, присутствующих в базах данных Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/scientific-community/data) и GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), для конструирования прямого BDags-1F и обратного BDags-2R праймеров были выбраны участки, комплементарные фрагментам гена α-1,3-глюкансинтазы (alpha-1,3-glucan synthase) В. dermatitidis, который является одним из факторов вирулентности и кодирует фермент, осуществляющий синтез компонента клеточной стенки гриба (GenBank NCBI, GeneID: 8507939). Расчетная длина предполагаемого ампликона - 178 п.н. (табл. 1).Based on an in silico analysis of the sequenced nucleotide sequences of the blastomycosis pathogen present in the Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/scientific-community/data) and GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information) databases (http: // www .ncbi.nlm.nih.gov), for the construction of direct BDags-1F and reverse BDags-2R primers, regions complementary to fragments of the α-1,3-glucan synthase gene of B. dermatitidis were selected, which is one of the virulence factors and encodes an enzyme that synthesizes a component of the fungal cell wall (GenBank NCBI, GeneID: 8507939). The estimated length of the proposed amplicon is 178 bp. (tab. 1).
При использовании компьютерных программ была проанализирована структура выбранной пары праймеров BDags-1F / BDags-2R (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации.Using computer programs, the structure of the selected pair of BDags-1F / BDags-2R primers (the formation of dimers, hairpins, and other secondary structures) was analyzed and their theoretical suitability for the successful initiation of the amplification reaction was shown.
Для флуоресцентной детекции продуктов ПЦР в режиме реального времени сконструирован олигонуклеотидный зонд BDags-2P размером 24 п.н., который гибридизуется на участке ампликона между прямым и обратным праймерами BDags-1F / BDags-2R. На разных концах зонда расположены флуорофор FAM и гаситель флуоресценции BHQ1. Комплементарные концевые последовательности зонда образуют «шпильку» по принципу «молекулярного маяка». В онлайн-режиме с использованием программы Mfold на интернет-сайте http://mfold.rna.albany.edu оценивали вторичную структуру и термодинамические параметры разработанного зонда.For fluorescence detection of PCR products in real time, a 24 bp BDags-2P oligonucleotide probe was constructed that hybridizes in the amplicon region between the forward and reverse BDags-1F / BDags-2R primers. FAM fluorophore and BHQ1 fluorescence quencher are located at different ends of the probe. The complementary end sequences of the probe form a hairpin according to the principle of a molecular beacon. In the online mode using the Mfold program on the website http://mfold.rna.albany.edu, the secondary structure and thermodynamic parameters of the developed probe were evaluated.
Специфичность разработанных олигонуклеотидов оценивали с использованием компьютерной программы BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между сконструированными праймерами BDags-1F/BDags-2R и зондом BDags-2P и нуклеотидными последовательностями В. dermatitidis и других гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (GenBank, Broad Institute). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.The specificity of the developed oligonucleotides was evaluated using the BLAST computer program on the web server of the National Center for Biotechnological Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) to establish homology between the designed primers BDags-1F / BDags- 2R and a BDags-2P probe and nucleotide sequences of B. dermatitidis and other heterologous microorganisms present in the databases (GenBank, Broad Institute). At the time of the computer analysis, no homology was detected.
Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с использованием разработанных праймеров BDags-1F / BDags-2R и флуоресцентно-меченого зонда BDags-2P для идентификации возбудителя бластомикоза методом ПЦР в режиме реального времени.Example 2. Amplification of specific DNA fragments using the developed primers BDags-1F / BDags-2R and fluorescently labeled probe BDags-2P to identify the causative agent of blastomycosis by real-time PCR.
Инактивацию образцов микромицетов и выделение ДНК проводили согласно требованиям СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».Inactivation of micromycete samples and DNA isolation was carried out according to the requirements of SP 1.3.3118-13 “Safety of work with microorganisms of I-II pathogenicity (danger) groups” and MU 1.3. 2569-09 “Organization of the work of laboratories using nucleic acid amplification methods when working with material containing microorganisms of pathogenicity groups I-IV”.
Обеззараживание исследуемых проб проводили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и последующим прогреванием в течение 40 мин при температуре температуре 56°C и инкубированием при комнатной температуре до 24 ч. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляли с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом [Sandhu G.S. et al., 1995].The test samples were disinfected by adding a solution of sodium merthiolate to a final concentration of 0.1% and subsequent heating for 40 minutes at a temperature of 56 ° C and incubation at room temperature for up to 24 hours. DNA was isolated from pure micromycete cultures using the guanidine thiocyanate-phenolic method DNA reprecipitation with isopropanol [Sandhu GS et al., 1995].
Для проведения ПЦР в режиме реального времени в состав реакционной смеси входили анализируемая ДНК микромицетов, разработанные комплементарным специфичным фрагментам ДНК В. dermatitidis прямой BDags-1F и обратный BDags-2R праймеры, олигонуклеотидный зонд BDags-2P, а также дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор, MgCl2 и фермент Taq-F полимераза (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Амплификацию продолжительностью 45 циклов проводили в объеме 25 мкл. В качестве отрицательного контрольного образца добавляли ТЕ-буфер.For real-time PCR, the reaction mixture included micromycete DNA analyzed, developed with complementary specific fragments of B. dermatitidis DNA direct BDags-1F and reverse BDags-2R primers, BDags-2P oligonucleotide probe, as well as deoxyribonucleoside triphosphates, buffer solution 2 and Taq-F polymerase enzyme (FBUN CRI Epidemiology of Rospotrebnadzor). Amplification of 45 cycles was carried out in a volume of 25 μl. A TE buffer was added as a negative control.
Амплификацию и детекцию продуктов ПЦР осуществляли в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Результаты регистрировали в табличной и графической форме. Если кривая накопления флуоресценции по каналу детекции пересекала пороговую линию на участке характерного экспоненциального роста уровня флуоресценции, на цикле, не превышающем значение порогового цикла реакции (Ct), то результат амплификации ДНК В. dermatitidis считался положительным. При этом значение Ct для исследуемых образцов было не более 33.Amplification and detection of PCR products was carried out in real time on a Rotor-Gene 6000 instrument (Corbett Research, Australia). The results were recorded in tabular and graphical form. If the fluorescence accumulation curve along the detection channel crossed the threshold line at the site of a characteristic exponential increase in the fluorescence level, on a cycle not exceeding the threshold reaction cycle (Ct), the result of amplification of B. dermatitidis DNA was considered positive. In this case, the Ct value for the studied samples was no more than 33.
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанного набора олигонуклеотидных праймеров BDags-1F / BDags-2R и флуоресцентно-меченого зонда BDags-2P для идентификации возбудителя бластомикоза.Example 3. Determination of the sensitivity and specificity of the amplification reaction using the developed set of oligonucleotide primers BDags-1F / BDags-2R and fluorescently labeled probe BDags-2P to identify the causative agent of blastomycosis.
При подготовке проб для ПЦР исследуемые культуры грибов в мицелиальной фазе роста культивировали на агаре Сабуро, содержащем 5% левомицетина, pH 6,8±0,2, и инкубировали при температуре (28±1) 0С в течение 30-45 сут. Дрожжевые формы микромицетов выращивали на среде Френсиса, содержащей 5% цистеина и 5% дефибринированной крови, в течение 7-14 сут при 37°C. Из выросших культур готовили суспензии в 0,9% растворе натрия хлорида, pH 7,2±0.1.When preparing samples for PCR, the studied fungal cultures in the mycelial growth phase were cultured on Saburo agar containing 5% chloramphenicol, pH 6.8 ± 0.2, and incubated at a temperature of (28 ± 1) 0С for 30-45 days. Yeast forms of micromycetes were grown on Francis medium containing 5% cysteine and 5% defibrinated blood for 7-14 days at 37 ° C. From the grown cultures, suspensions were prepared in a 0.9% sodium chloride solution, pH 7.2 ± 0.1.
После обеззараживания и фильтрования суспензий грибов проводили подсчет клеток исходных взвесей в камере Горяева и разводили таким образом, чтобы концентрация возбудителя бластомикоза составляла от 1×107 до 1×101 кл./мл, а для гетерологичных микроорганизмов - 1×107 кл./мл.After disinfection and filtering of fungal suspensions, the cells of the initial suspension were counted in the Goryaev chamber and diluted in such a way that the concentration of the blastomycosis pathogen was from 1 × 10 7 to 1 × 10 1 cells / ml, and for heterologous microorganisms it was 1 × 10 7 cells. / ml
Выделение ДНК, постановку и учет результатов реакции ПЦР в режиме реального времени осуществляли, как описано в примере 2.DNA isolation, statement and accounting of the results of the PCR reaction in real time was carried out as described in example 2.
Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами BDags-1F / BDags-2R и флуоресцентно-меченым зондом BDags-2P оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений взвесей дрожжевых клеток В. dermatitidis. В амплификационную смесь добавляли по 10 мкл ДНК, выделенной из разведений от 1×105 до 1×101 м.к./мл. Анализ результатов показал, что с помощью разработанных праймеров BDags-1F / BDags-2R и флуоресцентно-меченого зонда BDags-2P минимальный порог аналитической чувствительности достигал концентрации 1×102 кл/мл (рис. 1).The sensitivity of the amplification reaction with the developed specific primers BDags-1F / BDags-2R and a fluorescently labeled probe BDags-2P was evaluated by studying DNA samples isolated from ten-fold dilutions of B. dermatitidis yeast cell suspensions. 10 μl of DNA extracted from dilutions from 1 × 10 5 to 1 × 10 1 m.k./ ml was added to the amplification mixture. An analysis of the results showed that, using the developed BDags-1F / BDags-2R primers and the BDags-2P fluorescently labeled probe, the minimum analytical sensitivity threshold reached a concentration of 1 × 10 2 cells / ml (Fig. 1).
Рисунок 1 отображает график нарастания флуоресцентных кривых, полученных при амплификации ДНК штамма В. dermatitidis 9 с праймерами BDags-1F / BDags-2R и флуоресцентно-меченым зондом Bdags-2P (изображены кривые 1 - В. dermatitidis 9 в концентрации 105 кл./мл, 2 - В. dermatitidis 9 в концентрации 104 кл./мл, 3 - В. dermatitidis 9 в концентрации 103 кл./мл, 4 - В. dermatitidis 9 в концентрации 102 мк./мл, кривые ниже уровня пороговой линии - отрицательный контроль и кривые накопления флуоресценции проб В. dermatitidis 9 в концентрации меньше 102 кл./мл).Figure 1 shows a graph of the increase in fluorescence curves obtained by amplification of DNA of strain B. dermatitidis 9 with BDags-1F / BDags-2R primers and a fluorescently-labeled probe Bdags-2P (curves 1 - B. dermatitidis 9 are shown at a concentration of 10 5 cells / ml, 2 - B. dermatitidis 9 at a concentration of 10 4 cells / ml, 3 - B. dermatitidis 9 at a concentration of 10 3 cells / ml, 4 - B. dermatitidis 9 at a concentration of 10 2 μl / ml, curves below the level the threshold line is the negative control and fluorescence accumulation curves of B. dermatitidis 9 samples at a concentration of less than 10 2 cells / ml).
Специфичность разработанного набора праймеров BDags-1F / BDags-2R и флуоресцентно-меченого зонда BDags-2P оценена на коллекции из 40 штаммов, из которых 3 штамма В. dermatitidis и 37 штаммов гетерологичных микроорганизмов (9 штаммов Histoplasma capsulatum, 6 штаммов Coccidioides immitis, 2 штамма Coccidioides posadasii 5 штаммов Cryptococcus neoformans, и по 1 штамму Candida parapsilosis BKM Y-58, Candida glabrata BKM Y-1481, Candida kefyr BKM Y-257, Candida guilliermondii BKM Y-41, Rhodotorula mucilaginosa BKM Y-339, Geotrichum fermentans BKM Y-813, Fusarium javanicum (solani) BKM F-134, Absidia hyalospora (syn. Mycocladus hyalospora) BKMF-1435, Aspergillus fumigatus BKM F-753, Rhizopus microsporia var. microsporus BKM F-774, Fusarium culmorum BKM F-1017, Gymnoascus reesii BKM F-1707, Mucor racemosus var. racemosus BKM F-1128, Phialophora verrucosa BKM F-1990, Scopulariopsis brevicaulis BKM F-406). Оценка специфичности ПЦР показала отсутствие перекрестных реакций с близкородственными гетерологичными штаммами, в том числе с ДНК возбудителей особо опасных микозов.The specificity of the developed set of primers BDags-1F / BDags-2R and fluorescently labeled probe BDags-2P was evaluated on a collection of 40 strains, of which 3 strains of B. dermatitidis and 37 strains of heterologous microorganisms (9 strains of Histoplasma capsulatum, 6 strains of Coccidioides immit strain of
Таким образом, разработанный набор праймеров BDags-1F / BDags-2R и флуоресцентно-меченого зонда BDags-2P может быть использован для идентификации возбудителя бластомикоза и позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать ДНК В. dermatitidis в пробах чистых культур, объектах окружающей среды и биологическом материале.Thus, the developed set of primers BDags-1F / BDags-2R and a fluorescently labeled probe BDags-2P can be used to identify the causative agent of blastomycosis and allows B. dermatitidis DNA to be detected in samples of pure cultures, objects of the environment with high sensitivity and specificity. environment and biological material.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016132105A RU2639498C1 (en) | 2016-08-03 | 2016-08-03 | Set of oligonucleotide primers and fluorescence marked probes for identifying of blastomycesis dermatitis irritant |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016132105A RU2639498C1 (en) | 2016-08-03 | 2016-08-03 | Set of oligonucleotide primers and fluorescence marked probes for identifying of blastomycesis dermatitis irritant |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2639498C1 true RU2639498C1 (en) | 2017-12-21 |
Family
ID=63857507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016132105A RU2639498C1 (en) | 2016-08-03 | 2016-08-03 | Set of oligonucleotide primers and fluorescence marked probes for identifying of blastomycesis dermatitis irritant |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2639498C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2723160C1 (en) * | 2019-08-15 | 2020-06-09 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method of detecting and determining dna with a given sequence using giant raman scattering spectroscopy |
-
2016
- 2016-08-03 RU RU2016132105A patent/RU2639498C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| BABADY N et al., Detection of Blastomyces dermatitidis and Histoplasma capsulatum from culture isolates and clinical specimens by use of real-time PCR, Journal of clinical microbiology, 2011. * |
| JOHANSSON MK et al., Intramolecular dimers: a new strategy to fluorescence quenching in dual-labeled oligonucleotide probes, Journal of the American Chemical Society, 2002. * |
| KVACH MV et al. 5 (6)-Carboxyfluorescein revisited: new protecting group, separation of isomers, and their spectral properties on oligonucleotides, Bioconjugate chemistry, 2007. * |
| RYAZANTSEV D et al. Design of molecular beacons: 3′ couple quenchers improve fluorogenic properties of a probe in real-time PCR assay, Analyst, 2014. * |
| SIDAMONIDZE K et al., Real-time PCR assay for identification of Blastomyces dermatitidis in culture and in tissue, Journal of clinical microbiology, 2012. * |
| АНТОНОВ В.А. и др. Использование ПЦР для ускоренной идентификации возбудителей особо опасных микозов. Проблемы медицинской микологии, 2005. * |
| МАРКИН А.М. и др. Разработка диагностического набора для индикации возбудителя бластомикоза с помощью ПЦР в режиме реального времени. Проблемы медицинской микологии, 2015. * |
| МАРКИН А.М. и др. Разработка диагностического набора для индикации возбудителя бластомикоза с помощью ПЦР в режиме реального времени. Проблемы медицинской микологии, 2015. RYAZANTSEV D et al. Design of molecular beacons: 3′ couple quenchers improve fluorogenic properties of a probe in real-time PCR assay, Analyst, 2014. SIDAMONIDZE K et al., Real-time PCR assay for identification of Blastomyces dermatitidis in culture and in tissue, Journal of clinical microbiology, 2012. BABADY N et al., Detection of Blastomyces dermatitidis and Histoplasma capsulatum from culture isolates and clinical specimens by use of real-time PCR, Journal of clinical microbiology, 2011. АНТОНОВ В.А. и др. Использование ПЦР для ускоренной идентификации возбудителей особо опасных микозов. Проблемы медицинской микологии, 2005. KVACH MV et al. 5 (6)-Carboxyfluorescein revisited: new protecting group, separation of isomers, and their spectral properties on oligonucleotides, Bioconjugate chemistry, 2007. JOHANSSON MK * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2723160C1 (en) * | 2019-08-15 | 2020-06-09 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method of detecting and determining dna with a given sequence using giant raman scattering spectroscopy |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200149119A1 (en) | Assays for fungal infection | |
| Vollmer et al. | Evaluation of novel broad-range real-time PCR assay for rapid detection of human pathogenic fungi in various clinical specimens | |
| Bialek et al. | Detection of Cryptococcus neoformans DNA in tissue samples by nested and real-time PCR assays | |
| CN108588250B (en) | LAMP primer for detecting watermelon bacterial fruit blotch and detection method thereof | |
| US20090226895A1 (en) | Method of detecting vibrio parahaemolyticus via real-time PCR-hybridization | |
| CN102242197B (en) | LAMP (loop-mediated isothermal amplification) kit and special primers thereof for detecting NDM-1 (new Delhi metallo-beta-lactamase 1) gene | |
| Khlif et al. | Evaluation of nested and real-time PCR assays in the diagnosis of candidaemia | |
| CN101113473A (en) | Method for detecting food-derived pathogenic vibrio bacteria by composite fluorescence PCR technique | |
| CN110093432B (en) | sRNA marker for distinguishing mycobacterium tuberculosis from BCG vaccine and application thereof | |
| CN111607658A (en) | Primer probe system, kit and detection method for human fungal infection detection | |
| US20110151458A1 (en) | Methods and reagents for the detection of salmonella spp | |
| CN103667271B (en) | The primer of detection by quantitative Candida albicans bacterium and probe and application thereof | |
| CN1724686B (en) | Target sequence used for detecting mycoplasma pnoumoniae and reagent box | |
| CN110656192B (en) | Loop-mediated isothermal amplification primer group for detecting neisseria meningitidis and detection method | |
| RU2639498C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and fluorescence marked probes for identifying of blastomycesis dermatitis irritant | |
| CN102634605B (en) | Method for detecting egg drop syndrome viruses and kit for method | |
| WO2017077999A1 (en) | Method for detecting tuberculosis complex-derived dna | |
| CN103882140A (en) | Rapid diagnosis kit for mycobacterium tuberculosis | |
| IE20060925A1 (en) | Nucleic acids probes for detection of yeast and fungal species | |
| RU2551208C1 (en) | SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENTLY LABELLED PROBE FOR IDENTIFICATION OF Burkholderia mallei AND ITS DIFFERENTIATION FROM Burkholderia pseudomallei | |
| Pornprasert et al. | Development of TaqMan real‐time polymerase chain reaction for the detection and identification of Penicillium marneffei | |
| Loeffler et al. | Development and evaluation of the nuclisens basic kit NASBA for the detection of RNA from Candida species frequently resistant to antifungal drugs | |
| JP6267436B2 (en) | Methods for detecting and identifying zygomycosis-causing bacteria | |
| CN114807416A (en) | RPA-LFS detection primer probe combination of candida tropicalis and application thereof | |
| US20050065330A1 (en) | Identification of Histoplasma capsulatum using a PCR assay |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180804 |