RU2639382C1 - Method for estimation of bone marrow aspiration quality during monitoring of minimum residual disease in case of multiple myeloma - Google Patents
Method for estimation of bone marrow aspiration quality during monitoring of minimum residual disease in case of multiple myeloma Download PDFInfo
- Publication number
- RU2639382C1 RU2639382C1 RU2016151185A RU2016151185A RU2639382C1 RU 2639382 C1 RU2639382 C1 RU 2639382C1 RU 2016151185 A RU2016151185 A RU 2016151185A RU 2016151185 A RU2016151185 A RU 2016151185A RU 2639382 C1 RU2639382 C1 RU 2639382C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- bone marrow
- expression
- sample
- labeled
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и онкогематологии, и может быть использовано для контроля качества исследуемого образца костного мозга (КМ) при мониторинге минимальной резидуальной болезни (МРБ) при множественной миеломе (ММ) методом проточной цитофлуориметрии аспирата КМ.The invention relates to medicine, namely to immunology and oncohematology, and can be used to control the quality of the studied bone marrow (CM) sample while monitoring the minimal residual disease (MRI) in multiple myeloma (MM) by flow cytofluorimetry of the CM aspirate.
Для оценки ответа на проводимую противоопухолевую терапию в ряде онкогематологических заболеваний выполняется исследование на наличие минимальной резидуальной болезни. МРБ - это состояние, связанное с наличием остаточных опухолевых клеток, не выявляющихся морфологическим методом, но обнаруживающихся более чувствительными методами: многоцветной проточной цитофлуориметрией (МПЦ), полимеразной цепной реакцией, секвенированием. Данные методы позволяют установить наличие остаточных опухолевых клеток с чувствительностью до 10-5-10-6. Актуальным является мониторинг МРБ при множественной миеломе - заболевании, связанном с клональной пролиферацией плазматических клеток (ПК) в костном мозге (реже в экстрамедуллярных очагах) и секрецией моноклональных иммуноглобулинов.To assess the response to ongoing antitumor therapy in a number of hematologic diseases, a study is conducted for the presence of minimal residual disease. MRB is a condition associated with the presence of residual tumor cells that are not detected by the morphological method, but detected by more sensitive methods: multicolor flow cytofluorimetry (MPC), polymerase chain reaction, sequencing. These methods allow us to establish the presence of residual tumor cells with a sensitivity of up to 10 -5 -10 -6 . Monitoring of MPB in multiple myeloma, a disease associated with clonal proliferation of plasma cells (PCs) in the bone marrow (less often in extramedullary foci) and the secretion of monoclonal immunoglobulins, is relevant.
На сегодняшний день известны иммунологические методы лабораторной диагностики - иммунофиксация и иммунофенотипирование, позволяющие получать данные, необходимые для верификации диагноза ММ и оценки клинико-иммунологической ремиссии. Согласно рекомендациям Международной группы по мониторингу ММ иммунофиксация принята в качестве обязательного метода для верификации ремиссии и отсутствия МРБ (Зуева Е.Е., Русанова Е.Б. и др. Множественная миелома: современные направления иммунологического мониторинга. «Эффективная фармакотерапия. Онкология, Гематология и Радиология», 2011, №4; Менделеева Л.П., Вотякова О.М и др. Национальные клинические рекомендации по диагностике и лечению множественной миеломы. «Гематология и трансфузиология». 2016. Т. 61. №1S (2). С. 1-24).Today, immunological methods of laboratory diagnostics are known - immunofixation and immunophenotyping, which allow obtaining the data necessary for verification of the diagnosis of MM and assessment of clinical and immunological remission. According to the recommendations of the International MM Monitoring Group, immunofixation was adopted as a mandatory method for verification of remission and absence of MRI (Zueva E.E., Rusanova E.B. et al. Multiple myeloma: modern directions of immunological monitoring. “Effective pharmacotherapy. Oncology, Hematology and Radiology ", 2011, No. 4; Mendeleeva L.P., Votyakova O.M. et al. National clinical guidelines for the diagnosis and treatment of multiple myeloma." Hematology and transfusiology ". 2016. T. 61. No. 1S (2). C . 1-24).
В мировых рекомендациях также представлены панели моноклональных антител (мАТ), необходимые для мониторинга МРБ при ММ с помощью МПЦ. При этом используют 6 и более цветов. А в качестве панели используют моноклональные антитела для мониторинга МРБ при ММ методом проточной цитофлуориметрии: CD38, CD138, CD19, CD45, CD20, CD27, CD28, CD56, CD81, CD117, CD200 [Stetler-Stevenson М. et al. Consensus guidelines for myeloma minimal residual disease sample staining and data acquisition // Cytometry Part B: Clinical Cytometry. - 2016. - T. 90. - №.1. - C. 26-30].The global recommendations also provide panels of monoclonal antibodies (mAbs), which are necessary for monitoring MRI in MM using MPC. In this case, 6 or more colors are used. And as a panel, monoclonal antibodies are used to monitor MRI in MM by flow cytometry: CD38, CD138, CD19, CD45, CD20, CD27, CD28, CD56, CD81, CD117, CD200 [Stetler-Stevenson M. et al. Consensus guidelines for myeloma minimal residual disease sample staining and data acquisition // Cytometry Part B: Clinical Cytometry. - 2016. - T. 90. - No. 1. - C. 26-30].
Антитела к антигенам дифференцировки CD38 и CD138 используются для четкой идентификации популяции плазматических клеток, а остальные антигены применяются для дифференциации аномальных и нормальных ПК по аберрантной экспрессии.Antibodies to differentiation antigens CD38 and CD138 are used to clearly identify the population of plasma cells, and the remaining antigens are used to differentiate abnormal and normal PCs by aberrant expression.
Материалом для проведения мониторинга МРБ при ММ является образец аспирата КМ. При осуществлении забора образца в связи со спецификой процедуры возможно значительное разведение КМ периферической кровью. ПК при ММ персистируют в КМ, и при значительном разведении образца кровью возможно получение ложноотрицательных результатов.The material for monitoring BMD in MM is a sample of KM aspirate. When sampling in connection with the specifics of the procedure, significant dilution of CM with peripheral blood is possible. PCs with MM persist in CM, and with significant dilution of the blood sample, false negative results are possible.
Известен способ оценки качества аспирата костного мозга в процессе проведения мониторинга МРБ при множественной миеломе, для предотвращения получения ложноотрицательных результатов с целью констатации наличия значительной примеси периферической крови в КМ. Для решения данной задачи определяют количество зрелых (CD13+/CD16+) гранулоцитов, которые характерны для периферической крови. При этом для определения количества зрелых гранулоцитов необходимо дополнительно осуществлять окрашивание клеток моноклональными антителами к CD13 и CD16 и антителами, позволяющими дифференцировать гранулоциты от остальных клеток, например, комбинация CD45 и CD33. При обнаружении в исследуемом образце более 30% зрелых гранулоцитов делают вывод о том, что образец КМ имеет значительную примесь периферической крови и количественные данные о наличии МРБ не могут быть получены [Loken М.R. et al. Normalization of bone marrow aspirates for hemodilution in flow cytometric analyses // Cytometry Part B: Clinical Cytometry. - 2009. - T. 76. - №.1. - C. 27-36]. Использование данного метода оценки качества образца сказывается на общей стоимости анализа, так как увеличивается количество используемых мАТ к антигенам, которые нужно исследовать, что, в свою очередь, приводит к значительному увеличению и времени исследования. Данный источник информации рассмотрен нами в качестве ближайшего аналога.There is a method of evaluating the quality of bone marrow aspirate during monitoring of RBM in multiple myeloma, to prevent false-negative results in order to ascertain the presence of a significant impurity of peripheral blood in CM. To solve this problem, determine the number of mature (CD13 + / CD16 +) granulocytes that are characteristic of peripheral blood. Moreover, to determine the number of mature granulocytes, it is necessary to additionally stain cells with monoclonal antibodies to CD13 and CD16 and antibodies that can differentiate granulocytes from other cells, for example, a combination of CD45 and CD33. If more than 30% of mature granulocytes are detected in the test sample, it is concluded that the CM sample has a significant admixture of peripheral blood and quantitative data on the presence of MBP cannot be obtained [Loken M.R. et al. Normalization of bone marrow aspirates for hemodilution in flow cytometric analyzes // Cytometry Part B: Clinical Cytometry. - 2009. - T. 76. - No. 1. - C. 27-36]. The use of this method of assessing the quality of a sample affects the total cost of the analysis, since the number of mAbs used for antigens increases, which need to be investigated, which, in turn, leads to a significant increase in research time. This source of information is considered by us as the closest analogue.
Технический результат заявленного технического решения заключается в упрощении способа за счет исключения использования в процессе анализа дополнительных моноклональных антител, что ведет к экономии материальных средств и уменьшению времени проводимого исследования при высокой точности оценки.The technical result of the claimed technical solution is to simplify the method by eliminating the use of additional monoclonal antibodies in the analysis process, which leads to savings in material resources and a decrease in the time of the study with high accuracy of the assessment.
Технический результат достигается тем, что оценку качества аспирата костного мозга в процессе проведения мониторинга минимальной резидуальной болезни при множественной миеломе проводят путем его исследования на наличие популяции клеток многоцветной проточной цитофлуориметрией, причем вначале проводят лизис аспирата костного мозга и после центрифугирования оценивают клеточность полученной суспензии на наличие ядросодержащих клеток и до 3×106 ядросодержащих клеток образца из полученного осадка окрашивают моноклональными антителами, инкубируют и анализируют образец, при этом полученный осадок окрашивают с использованием шестицветной панели моноклональных антител: CD38, меченого флуоресцеин изотиоцианатом, CD138, меченого фикоэритрином, CD45, меченого аллофикоцианином-Су7, CD19, меченого перидинин-хлорофиллом-Су5.5, CD56, меченого фикоэретрином-Су7, CD27, меченого аллофикоцианином, а после инкубации производят цитометрический анализ, выделяют всю популяцию плазматических клеток на основе экспрессии маркеров CD38, CD138 и CD45 и оценивают уровни экспрессии на плазматических клетках маркеров CD19, CD56, CD45 и CD27 и при наличии на плазматических клетках двух или более признаков их аномальности, в частности отсутствие экспрессии CD19, отсутствие экспрессии CD45, отсутствие экспрессии CD27 или наличие экспрессии CD56, плазматическую клетку считают резидуальной и при выявлении таких клеток в исследуемом образце его анализируют на наличие В-клеточных предшественников по маркерам CD45 и CD38, и при их количестве менее 0,33% от всей популяции ядросодержащих клеток суспензии костного мозга оценивают качество аспирата костного мозга как неудовлетворительное, то есть образец чрезмерно разведен периферической кровью, и во избежание ложноотрицательного результата на наличие минимальной резидуальной болезни при множественной миеломе рекомендуют повторное проведение пункции костного мозга, а при наличии 0,33% и более В-клеточных предшественников оценивают качество образца костного мозга как удовлетворительное и указывают долю найденных резидуальных плазматических клеток от всех ядросодержащих клеток.The technical result is achieved by assessing the quality of bone marrow aspirate during monitoring of minimal residual disease in multiple myeloma by examining it for the presence of a population of cells with multicolor flow cytofluorimetry, and first, bone marrow aspirate is lysed and, after centrifugation, the cellularity of the resulting suspension is evaluated for the presence of nucleated cells and 3 × 10 June nucleated cells from a sample obtained precipitate stained with monoclonal antibodies and the sample is incubated and analyzed, and the resulting precipitate is stained using a six-color panel of monoclonal antibodies: CD38 labeled with fluorescein isothiocyanate, CD138 labeled with phycoerythrin, CD45 labeled with allophycocyanin-Su7, CD19 labeled with peridinin-chlorophyll-Cy5.5, labeled with phycoerethrin-Su7, CD27 labeled with allophycocyanin, and after incubation, a cytometric analysis is performed, the entire population of plasma cells is isolated based on the expression of CD38, CD138 and CD45 markers and expression levels on plasma cells m arcs CD19, CD56, CD45 and CD27 and in the presence of two or more signs of abnormality on plasma cells, in particular the absence of CD19 expression, the absence of CD45 expression, the absence of CD27 expression or the presence of CD56 expression, the plasma cell is considered residual even when such cells are detected in the studied the sample is analyzed for the presence of B-cell precursors by the markers CD45 and CD38, and when their number is less than 0.33% of the entire population of nucleated cells of a bone marrow suspension, the quality of bone marrow aspirate is assessed as unsatisfactory satisfactory, that is, the sample is excessively diluted with peripheral blood, and in order to avoid a false negative result for the presence of minimal residual disease in multiple myeloma, repeated bone marrow puncture is recommended, and in the presence of 0.33% or more B-cell precursors, the quality of the bone marrow sample is assessed as satisfactory and indicate the proportion of residual plasma cells found from all nucleated cells.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Плазматические клетки при ММ характеризуются аберрантным иммунофенотипом, что и легло в основу поиска данных клеток с помощью МПЦ. Задача заявляемого изобретения состоит в создании нового и точного способа оценки качества исследуемого образца КМ при осуществлении мониторинга МРБ при ММ. Для этого аспират костного мозга больного ММ в количестве 0,5 мл помещают в пробирку и вносят 4,5 мл разведенного лизирующего раствора PharmLyse (Becton Dickinson, США), после чего проводят инкубацию в течение 15 минут при комнатной температуре. Далее осуществляют центрифугирование в течение 3 мин 30 секунд, при ускорении 400 g, из пробирки удаляют супернатант и вносят 2 мл раствора CellWash (Becton Dickinson, США). Далее вновь проводят центрифугирование в течение 3 мин 30 секунд, при ускорении 400 g, из пробирки удаляют супернатант и оценивают клеточность полученной суспензии на наличие ядросодержащих клеток. Количество ядросодержащих клеток оценивалось по параметрам прямого и бокового светорассеяния. Около 3×106 ядросодержащих клеток образца из полученного осадка окрашивают моноклональными антителами. При этом используют шестицветную панель моноклональных антител: 1 мкл CD38, меченого флуоресцеин изотиоцианатом (FITC), 1 мкл CD138, меченого фикоэритрином (РЕ), 1 мкл CD45, меченого аллофикоцианином-Cy7 (АРС-Cy7), 1 мкл CD19, меченого перидинин-хлорофиллом-Cy5.5 (PerCP-Cy5.5), 1 мкл CD56, меченого фикоэретрином-Cy7 (PE-Cy7), 1 мкл CD27, меченого аллофикоцианином (АРС). Инкубируют 15 минут в темноте при комнатной температуре, добавляют 2 мл буферного раствора CellWash, далее центрифугируют в течение 3 мин 30 секунд, при ускорении 400 g, удаляют супернатант, добавляют 500 мкл буферного раствора CellWash и анализируют на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США). Цитометрический анализ на проточном цитофлуориметре проводят незамедлительно. При этом выделяют всю популяцию плазматических клеток на основе экспрессии маркеров CD38, CD138 и CD45. Выявление одновременной экспрессии CD38, CD138 и CD45 позволяет уверенно отделить ПК от других лейкоцитов. Для последующего анализа создают логическое ограничение (гейт), объединяющее CD138+-клетки с определенными характеристиками светорассеяния. Позитивная экспрессия CD38 служит подтверждением принадлежности исследуемой популяции к ПК.Plasma cells with MM are characterized by an aberrant immunophenotype, which formed the basis for the search for these cells using MPC. The task of the invention is to create a new and accurate method for assessing the quality of the investigated sample KM when monitoring MRB with MM. For this, a bone marrow aspirate of a patient with MM in the amount of 0.5 ml is placed in a test tube and 4.5 ml of diluted PharmLyse lysis solution (Becton Dickinson, USA) is added, followed by incubation for 15 minutes at room temperature. Next, centrifugation is carried out for 3 minutes 30 seconds, at an acceleration of 400 g, the supernatant is removed from the tube and 2 ml of CellWash solution is added (Becton Dickinson, USA). Then, centrifugation is again carried out for 3 minutes 30 seconds, at an acceleration of 400 g, the supernatant is removed from the tube and the cellularity of the resulting suspension is evaluated for the presence of nucleated cells. The number of nucleated cells was estimated by the parameters of direct and lateral light scattering. About 3 × 10 6 nucleated cells of the sample from the obtained precipitate are stained with monoclonal antibodies. A six-color panel of monoclonal antibodies is used: 1 μl of CD38 labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), 1 μl of CD138 labeled with phycoerythrin (PE), 1 μl of CD45 labeled with allophycocyanin-Cy7 (APC-Cy7), 1 μl of labeled peridinine chlorophyll-Cy5.5 (PerCP-Cy5.5), 1 μl of phycoerethrin-Cy7-labeled CD7 (PE-Cy7), 1 μl of allophycocyanin-labeled CD27 (APC). Incubated for 15 minutes in the dark at room temperature, add 2 ml of CellWash buffer solution, then centrifuge for 3 minutes 30 seconds, accelerate 400 g, remove the supernatant, add 500 μl of CellWash buffer solution and analyze using a BD FACSCanto II flow cytometer (Becton Dickinson , USA). Cytometric analysis on a flow cytometer is carried out immediately. In this case, the entire population of plasma cells is isolated based on the expression of the markers CD38, CD138 and CD45. Detection of the simultaneous expression of CD38, CD138 and CD45 allows you to confidently separate PC from other white blood cells. For the subsequent analysis, a logical restriction (gate) is created, combining CD138 + cells with specific light scattering characteristics. Positive expression of CD38 confirms the belonging of the studied population to PC.
Затем оценивают уровни экспрессии на плазматических клетках маркеров CD19, CD56, CD45 и CD27 и при наличии на плазматических клетках двух или более признаков их аномальности, в частности отсутствие экспрессии CD19, отсутствие экспрессии CD45, отсутствие экспрессии CD27 или наличие экспрессии CD56, плазматическую клетку считают резидуальной и при выявлении таких клеток проводят анализ на наличие В-клеточных предшественников по маркерам CD45 и CD38. Анализ на наличие В-клеточных предшественников также проводят на проточном цитофлуориметре по параметрам прямого и бокового светорассеяния и распределения интенсивности флуоресценции по каналу APC-Cy7 (CD45), в зависимости от интенсивности флуоресценции по каналу FITC (CD38). При наличии В-клеточных предшественников, имеющих среднюю экспрессию CD38 и низкую экспрессию CD45, менее 0,33% от всей популяции ядросодержащих клеток суспензии костного мозга, оценивают качество аспирата костного мозга как неудовлетворительное, то есть образец чрезмерно разведен периферической кровью и во избежание ложноотрицательного результата анализа МРБ при ММ рекомендуют повторное проведение пункции КМ, а при наличии 0,33% и более В-клеточных предшественников определяют качество аспирата костного мозга как удовлетворительное и указывают долю найденных резидуальных ПК от всех ядросодержащих клеток.Then, the expression levels on plasma cells of the markers CD19, CD56, CD45 and CD27 are evaluated, and if there are two or more signs of abnormality on the plasma cells, in particular, the absence of CD19 expression, the absence of CD45 expression, the absence of CD27 expression or the presence of CD56 expression, the plasma cell is considered residual and when such cells are detected, an analysis is made for the presence of B-cell precursors by the markers CD45 and CD38. Analysis for the presence of B-cell precursors is also carried out on a flow cytometer using direct and lateral light scattering and the distribution of fluorescence intensity through the APC-Cy7 channel (CD45), depending on the fluorescence intensity through the FITC channel (CD38). In the presence of B-cell precursors having an average expression of CD38 and low expression of CD45, less than 0.33% of the whole population of nucleated cells of a bone marrow suspension, the quality of bone marrow aspirate is assessed as unsatisfactory, i.e. the sample is excessively diluted with peripheral blood and in order to avoid a false-negative result MRI analysis for MM recommend repeated CM puncture, and in the presence of 0.33% or more B-cell progenitors, the quality of bone marrow aspirate is determined to be satisfactory and decrees ayut found residual share your PC from all nucleated cells.
Было проведено исследование, как описано выше, аспиратов КМ 24-х здоровых доноров с выделением у них всей популяции ядросодержащих клеток, которые были окрашены моноклональными антителами. Было получено не менее 2×106 ядросодержащих клеток. Затем после выявления всей популяции плазматических клеток на основе экспрессии маркеров CD38, CD138 и CD45 оценивали уровни экспрессии на плазматических клетках маркеров CD19, CD56, CD45 и CD27. При этом ни в одном образце не было обнаружено резидуальных клеток (ПК с аномальным иммунофенотипом). После чего осуществляли определение количества В-клеточных предшественников. На фигуре 1а представлен точечный график распределения интенсивности флуоресценции по каналу PerCP-Cy5.5 (CD19), в зависимости от бокового светорассеяния (SSC-A). На фигуре 1б представлен точечный график распределения интенсивности флуоресценции по каналу АРС-Cy7 (CD45), в зависимости от интенсивности флуоресценции по каналу FITC (CD38). Из гейта "CD19+ cells" выбираются только клетки со средней экспрессией CD38 и имеющие более низкую интенсивность флуоресценции по каналу APC-Cy7 (CD45), нежели зрелые лимфоциты, что соответствует гейту "B-progenitors". На фигуре 1в представлен точечный график распределения интенсивности флуоресценции (ИФ) по каналу РЕ (CD10), в зависимости от бокового светорассеяния (SSC-A). На графике показаны клетки из гейта "В-progenitors", и проиллюстрировано, что они являются положительными по каналу РЕ (CD10).A study was conducted, as described above, of the aspirates of CM 24 healthy donors with the allocation of their entire population of nucleated cells that were stained with monoclonal antibodies. At least 2 × 10 6 nucleated cells were obtained. Then, after revealing the entire population of plasma cells based on the expression of the CD38, CD138, and CD45 markers, expression levels on the plasma cells of the CD19, CD56, CD45, and CD27 markers were evaluated. In this case, no residual cells (PK with an abnormal immunophenotype) were found in any sample. Then carried out the determination of the number of b-cell precursors. Figure 1a shows a scatter plot of the fluorescence intensity distribution over the PerCP-Cy5.5 channel (CD19), depending on lateral light scattering (SSC-A). Figure 1b is a scatter plot of the distribution of fluorescence intensity on the APC-Cy7 channel (CD45), depending on the fluorescence intensity on the FITC channel (CD38). From the CD19 + cells gate, only cells with average CD38 expression and lower APC-Cy7 (CD45) fluorescence intensity are selected than mature lymphocytes, which corresponds to the B-progenitors gate. Figure 1c shows a scatter plot of the distribution of fluorescence intensity (IF) along the PE channel (CD10), depending on lateral light scattering (SSC-A). The graph shows cells from the “B-progenitors” gate, and illustrates that they are positive on the PE channel (CD10).
Из всех ядросодержащих клеток выбираются клетки, имеющие высокую ИФ по каналу PerCP-Cy5.5 (CD 19) и низкий показатель бокового светорассеяния (SSC-A), что соответствует гейту "CD19+ cells". В данном исследовании показано, что в КМ CD19+ клетки (фиг. 1а) со средней ИФ по каналу FITC (CD38) и более низким значением ИФ по каналу APC-Cy7 (CD45) (фиг. 1б), чем зрелые лимфоциты, имеют иммунофенотип CD19+/CD10+ (фиг. 1в), то есть являются В-клеточными предшественниками. Было определено среднее значение доли В-клеточных предшественников от всех ядросодержащих и плазматических клеток 1,13±0,60% (минимум 0,33%, максимум 2,63%, медиана 1,08%). Таким образом, если при исследовании образца КМ при мониторинге МРБ при ММ обнаруживается менее чем 0,33% клеток со средней ИФ по каналу FITC (CD38) и более низким значением ИФ по каналу APC-Cy7 (CD45) от всех ядросодержащих клеток, то образец считается разведенным периферической кровью, и количественное заключение о наличии МРБ не может быть дано, так как возможно получение ложноотрицательного результата.From all nucleated cells, cells are selected that have a high IF through the PerCP-Cy5.5 channel (CD 19) and a low lateral light scattering index (SSC-A), which corresponds to the gate "CD19 + cells". In this study, it was shown that in CM CD19 + cells (Fig. 1a) with an average IF on the FITC channel (CD38) and a lower IF value on the APC-Cy7 channel (CD45) (Fig. 1b) than mature lymphocytes have the immunophenotype CD19 + / CD10 + (Fig. 1B), that is, are B-cell precursors. The mean value of the proportion of B-cell precursors from all nucleated and plasma cells was determined to be 1.13 ± 0.60% (minimum 0.33%, maximum 2.63%, median 1.08%). Thus, if, when examining a CM sample, when monitoring MRI in MM, less than 0.33% of cells with an average IF on the FITC channel (CD38) and a lower IF value on the APC-Cy7 channel (CD45) from all nucleated cells are detected, then the sample it is considered diluted peripheral blood, and a quantitative conclusion on the presence of MBP can not be given, since it is possible to obtain a false negative result.
Было также проведено исследование 314 образцов аспиратов костного мозга больных множественной миеломой, как описано выше. При этом количество В-предшественников менее 0,33% было выявлено в 12 образцах аспиратов костного мозга, что составило 3,8%. В этих случаях были даны заключения о неудовлетворительном качестве образца, то есть разведенном периферической кровью, и было рекомендовано проведение повторной пункции с последующим повторным анализом. В остальных случаях количество В-предшественников было более 0,33%, что указывало на удовлетворительное качество образца костного мозга. В заключение была указана доля найденных резидуальных плазматических клеток от всех ядросодержащих клеток. При проведении исследования каждого образца время, затраченное на его анализ составляло на 30 минут меньше по сравнению со временем исследования в ближайшем аналоге.A study was also conducted of 314 samples of bone marrow aspirates in patients with multiple myeloma, as described above. Moreover, the number of B-precursors of less than 0.33% was detected in 12 samples of bone marrow aspirates, which amounted to 3.8%. In these cases, conclusions were made about the unsatisfactory quality of the sample, that is, diluted with peripheral blood, and a repeated puncture was recommended followed by a second analysis. In other cases, the number of B-precursors was more than 0.33%, which indicated a satisfactory quality of the bone marrow sample. In conclusion, the fraction of residual plasma cells found from all nucleated cells was indicated. When conducting a study of each sample, the time spent on its analysis was 30 minutes less than the time of the study in the closest analogue.
Примеры осуществления способа.Examples of the method.
Пример 1. Больной Б., 56 лет. Диагноз: множественная миелома. Через 3 месяца после проведенной трансплантации аутологичных стволовых клеток крови было проведено исследование образца КМ больного. Вначале проводят лизис аспирата костного мозга и после центрифугирования оценивают клеточность полученной суспензии на наличие ядросодержащих клеток. Было выявлено 2,5×105 ядросодержащих клеток образца из полученного осадка, который окрашивали моноклональными антителами с использованием шестицветной панели: CD38, меченого флуоресцеин изотиоцианатом, CD138, меченого фикоэритрином, CD45, меченого аллофикоцианином-Cy7, CD19, меченого перидинин-хлорофиллом-Cy5.5, CD56, меченого фикоэретрином-Cy7, CD27, меченого аллофикоцианином. После инкубации производили цитометрический анализ и выделяли всю популяцию плазматических клеток на основе экспрессии маркеров CD38, CD138 и CD45. Оценили уровни экспрессии на плазматических клетках маркеров CD19, CD56, CD45 и CD27. Было выявлено два признака аномальности: отсутствие экспрессии CD19 и наличие экспрессии CD56. Обнаружено 20 резидульных клеток. Далее был проведен анализ исследуемого образца на наличие В-клеточных предшественников по маркерам В-клеточных предшественников, имеющих среднюю экспрессию CD38 и низкую экспрессию CD45. Их количество составило 0,20% от всей популяции ядросодержащих клеток суспензии костного мозга. На фигуре 2 приведен точечный график распределения интенсивности флуоресценции по каналу APC-Cy7 (CD45), в зависимости от интенсивности флуоресценции по каналу FITC (CD38). Из гейта "CD19+ cells" выбирали только клетки со средней экспрессией CD38 и имеющие более низкую интенсивность флуоресценции по каналу APC-Cy7 (CD45), нежели зрелые лимфоциты, что соответствует гейту "B-progenitors". Так как рассчитанное количество В-клеточных предшественников менее 0,33% (0,20%), то отмечено неудовлетворительное качество образца, то есть что он разведен периферической кровью, и в заключении не могут быть представлены количественные данные о наличии МРБ. Было рекомендовано провести повторно пункцию костного мозга у данного больного с последующим исследованием пунктата.Example 1. Patient B., 56 years old. Diagnosis: multiple myeloma. 3 months after the transplantation of autologous blood stem cells, a study of a patient’s CM was performed. First, bone marrow aspirate is lysed, and after centrifugation, the cellularity of the resulting suspension is evaluated for the presence of nucleated cells. 2.5 × 10 5 nucleated cells of the sample were detected from the obtained precipitate, which was stained with monoclonal antibodies using a six-color panel: CD38 labeled with fluorescein isothiocyanate, CD138 labeled with phycoerythrin, CD45 labeled with allophycocyanine-Cy7, CD19 labeled with peridinin-chlorophyll Cy5 .5, CD56 labeled with phycoerethrin-Cy7, CD27 labeled with allophycocyanin. After incubation, a cytometric analysis was performed and the entire population of plasma cells was isolated based on the expression of the markers CD38, CD138 and CD45. Plasma expression levels of plasma markers CD19, CD56, CD45, and CD27 were evaluated. Two signs of abnormality were identified: lack of expression of CD19 and the presence of expression of CD56. 20 residual cells were detected. Further, the test sample was analyzed for the presence of B-cell precursors by the markers of B-cell precursors having medium expression of CD38 and low expression of CD45. Their number amounted to 0.20% of the entire population of nucleated cells of the bone marrow suspension. Figure 2 shows a scatter plot of the distribution of fluorescence intensity on the APC-Cy7 channel (CD45), depending on the fluorescence intensity on the FITC channel (CD38). From the CD19 + cells gate, only cells with average CD38 expression and lower APC-Cy7 (CD45) fluorescence intensity were selected than mature lymphocytes, which corresponds to the B-progenitors gate. Since the calculated number of B-cell precursors is less than 0.33% (0.20%), the unsatisfactory quality of the sample is noted, that is, that it is diluted with peripheral blood, and quantitative data on the presence of MPB cannot be presented in conclusion. It was recommended to re-puncture the bone marrow in this patient with a subsequent examination of the punctate.
Пример 2. Больной К., 60 лет. Диагноз: множественная миелома. Через 6 месяцев после проведенной трансплантации аутологичных стволовых клеток крови было проведено исследование образца КМ больного. Вначале проводят лизис аспирата костного мозга и после центрифугирования оценивают клеточность полученной суспензии на наличие ядросодержащих клеток. Было выявлено 1,5×105 ядросодержащих клеток образца из полученного осадка, который затем окрашивали моноклональными антителами с использованием шестицветной панели: CD38, меченого флуоресцеин изотиоцианатом, CD138, меченого фикоэритрином, CD45, меченого аллофикоцианином-Cy7, CD19, меченого перидинин-хлорофиллом-Cy5.5, CD56, меченого фикоэретрином-Cy7, CD27, меченого аллофикоцианином. После инкубации производили цитометрический анализ и выделяли всю популяцию плазматических клеток на основе экспрессии маркеров CD38, CD138 и CD45. Оценивали уровни экспрессии на плазматических клетках маркеров CD19, CD56, CD45 и CD27. Было выявлено два признака аномальности: отсутствие экспрессии CD19, отсутствие экспрессии CD45. Обнаружена 31 резидульная клетка. Далее был проведен анализ исследуемого образца на наличие В-клеточных предшественников по маркерам В-клеточных предшественников, имеющих среднюю экспрессию CD38 и низкую экспрессию CD45. При анализе В-клеточных предшественников обнаружено, что их количество составило 0,41% от всех ядросодержащих клеток. На фигуре 3 приведен точечный график распределения интенсивности флуоресценции по каналу APC-Cy7 (CD45), в зависимости от интенсивности флуоресценции по каналу FITC (CD38). Из гейта "CD19+ cells" выбираются только клетки со средней экспрессией CD38 и имеющие более низкую интенсивность флуоресценции по каналу APC-Cy7 (CD45), нежели зрелые лимфоциты, что соответствует гейту "B-progenitors". Количество этих клеток составило 0,41% от всех ядросодержащих клеток.Example 2. Patient K., 60 years old. Diagnosis: multiple myeloma. 6 months after the transplantation of autologous blood stem cells, a study of a patient’s CM sample was performed. First, bone marrow aspirate is lysed, and after centrifugation, the cellularity of the resulting suspension is evaluated for the presence of nucleated cells. 1.5 × 10 5 nucleated cells of the sample were detected from the obtained precipitate, which was then stained with monoclonal antibodies using a six-color panel: CD38, labeled with fluorescein isothiocyanate, CD138, labeled with phycoerythrin, CD45, labeled with allophycocyanin-Cy7, CD19, labeled with peridilin-chlorofilofilin Cy5.5, CD56 labeled with phycoerethrin-Cy7, CD27 labeled with allophycocyanin. After incubation, a cytometric analysis was performed and the entire population of plasma cells was isolated based on the expression of the markers CD38, CD138 and CD45. Plasma expression levels of the CD19, CD56, CD45, and CD27 markers on plasma cells were evaluated. Two signs of abnormality were identified: lack of expression of CD19, lack of expression of CD45. 31 residual cells were detected. Further, the test sample was analyzed for the presence of B-cell precursors by the markers of B-cell precursors having medium expression of CD38 and low expression of CD45. When analyzing B-cell precursors, it was found that their number was 0.41% of all nucleated cells. Figure 3 shows a scatter plot of the distribution of fluorescence intensity on the APC-Cy7 channel (CD45), depending on the fluorescence intensity on the FITC channel (CD38). From the CD19 + cells gate, only cells with average CD38 expression and lower APC-Cy7 (CD45) fluorescence intensity are selected than mature lymphocytes, which corresponds to the B-progenitors gate. The number of these cells was 0.41% of all nucleated cells.
Так как рассчитанное количество В-клеточных предшественников более 0,33% (0,41%), то определяют качество аспирата костного мозга как удовлетворительное, и в заключении было указано на наличие резидуальной болезни в количестве 0,021% ПК от всех ядросодержащих клеток.Since the calculated number of B-cell precursors is more than 0.33% (0.41%), the quality of bone marrow aspirate is determined to be satisfactory, and in conclusion, the presence of residual disease in the amount of 0.021% PC from all nucleated cells was indicated.
Таким образом, заявленный способ оценки качества аспирата костного мозга в процессе проведения мониторинга минимальной резидуальной болезни при множественной миеломе позволяет оценивать качество образца без применения дополнительных моноклональных антител для определения В-клеточных предшественников, что ведет к экономии материальных средств и уменьшению времени проводимого исследования, которое сокращается на 30 минут. При этом точность оценки сохраняется на прежнем уровне.Thus, the claimed method for assessing the quality of bone marrow aspirate during monitoring of minimal residual disease in multiple myeloma allows to evaluate the quality of the sample without the use of additional monoclonal antibodies to determine B-cell precursors, which leads to savings in material resources and reduce the time of the study, which is reduced for 30 minutes. Moreover, the accuracy of the assessment remains at the same level.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016151185A RU2639382C1 (en) | 2016-12-26 | 2016-12-26 | Method for estimation of bone marrow aspiration quality during monitoring of minimum residual disease in case of multiple myeloma |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016151185A RU2639382C1 (en) | 2016-12-26 | 2016-12-26 | Method for estimation of bone marrow aspiration quality during monitoring of minimum residual disease in case of multiple myeloma |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2639382C1 true RU2639382C1 (en) | 2017-12-21 |
Family
ID=63857261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016151185A RU2639382C1 (en) | 2016-12-26 | 2016-12-26 | Method for estimation of bone marrow aspiration quality during monitoring of minimum residual disease in case of multiple myeloma |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2639382C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112698037A (en) * | 2021-03-25 | 2021-04-23 | 北京积水潭医院 | Antibody composition for detecting treatment effect of multiple myeloma as well as kit and application thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110207627A1 (en) * | 2008-08-13 | 2011-08-25 | George Mason University | Ex vivo therapeutics screening of living bone marrow cells for multiple myeloma |
| RU2580648C1 (en) * | 2015-03-20 | 2016-04-10 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" (НИИФКИ) | Method for predicting disease-free survival in patients with multiple myeloma after autologous hematopoietic stem cell transplantation |
-
2016
- 2016-12-26 RU RU2016151185A patent/RU2639382C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110207627A1 (en) * | 2008-08-13 | 2011-08-25 | George Mason University | Ex vivo therapeutics screening of living bone marrow cells for multiple myeloma |
| RU2580648C1 (en) * | 2015-03-20 | 2016-04-10 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" (НИИФКИ) | Method for predicting disease-free survival in patients with multiple myeloma after autologous hematopoietic stem cell transplantation |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LOKEN М.R. et al. Normalization of bone marrow aspirates for hemodilution in flow cytometric analyses // Cytometry Part B: Clinical Cytometry, 2009, 76:1б, рр.27-36. * |
| ПОПОВ А.М. и др. Острые лейкозы: различия иммунофенотипа бластных клеток и их неопухолевых аналогов в костном мозге // Клиническая онкогематология, 2016; 9(3), стр.302-313. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112698037A (en) * | 2021-03-25 | 2021-04-23 | 北京积水潭医院 | Antibody composition for detecting treatment effect of multiple myeloma as well as kit and application thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Della Porta et al. | Multicenter validation of a reproducible flow cytometric score for the diagnosis of low-grade myelodysplastic syndromes: results of a European LeukemiaNET study | |
| Al-Mawali et al. | Incidence, sensitivity, and specificity of leukemia-associated phenotypes in acute myeloid leukemia using specific five-color multiparameter flow cytometry | |
| Rawstron et al. | Improving efficiency and sensitivity: European Research Initiative in CLL (ERIC) update on the international harmonised approach for flow cytometric residual disease monitoring in CLL | |
| Illingworth et al. | ICCS/ESCCA consensus guidelines to detect GPI‐deficient cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and related disorders part 3–data analysis, reporting and case studies | |
| Lamchiagdhase et al. | Urine sediment examination: a comparison between the manual method and the iQ200 automated urine microscopy analyzer | |
| Naume et al. | Detection of isolated tumor cells in peripheral blood and in BM: evaluation of a new enrichment method | |
| Delgado et al. | A simple flow-cytometry method to evaluate peripheral blood contamination of bone marrow aspirates | |
| van de Geijn et al. | Leukoflow: multiparameter extended white blood cell differentiation for routine analysis by flow cytometry | |
| JP2017207516A (en) | Malignancy detection method and kit of peripheral circulating tumor cell unit | |
| Seghezzi et al. | Preliminary evaluation of UF-5000 Body Fluid Mode for automated cerebrospinal fluid cell counting | |
| Reis-Alves et al. | Improving the differential diagnosis between myelodysplastic syndromes and reactive peripheral cytopenias by multiparametric flow cytometry: the role of B-cell precursors | |
| Rico et al. | Flow-cytometry-based protocols for human blood/marrow immunophenotyping with minimal sample perturbation | |
| Bento et al. | Performance of eight‐color dry antibody reagent in the detection of minimal residual disease in chronic lymphocytic leukemia samples | |
| Palacio et al. | Flow cytometry in the bone marrow evaluation of follicular and diffuse large B-cell lymphomas | |
| RU2639382C1 (en) | Method for estimation of bone marrow aspiration quality during monitoring of minimum residual disease in case of multiple myeloma | |
| Xu et al. | Diagnostic application and clinical significance of FCM progress scoring system based on immunophenotyping in CD34+ blasts in myelodysplastic syndromes | |
| El-Sayed et al. | Flow cytometric immunophenotyping (FCI) of lymphoma: correlation with histopathology and immunohistochemistry | |
| Statuto et al. | Cytofluorimetric and immunohistochemical comparison for detecting bone marrow infiltration in non-Hodgkin lymphomas: a study of 354 patients | |
| US20200041513A1 (en) | Residual disease detection in multiple myeloma | |
| US11486878B2 (en) | Compositions and methods for identifying cancer cells | |
| CN109752548B (en) | Combined reagent and system for evaluating prognosis of chronic lymphocytic leukemia | |
| Tkaczuk et al. | The significance of circulating epithelial cells in Breast Cancer patients by a novel negative selection method | |
| Porwit | Is there a role for flow cytometry in the evaluation of patients with myelodysplastic syndromes? | |
| Ajise et al. | Clinical utility of morphology, immunohistochemistry, flow cytometry, and FISH analysis in monitoring of plasma cell neoplasms in the bone marrow | |
| Yang et al. | Diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria in peripheral blood and bone marrow with six-color flow cytometry |