RU2636464C2 - Способ получения и использования тканеинженерных конструкций на основе прогениторных клеток для лечения заболеваний сердца - Google Patents
Способ получения и использования тканеинженерных конструкций на основе прогениторных клеток для лечения заболеваний сердца Download PDFInfo
- Publication number
- RU2636464C2 RU2636464C2 RU2015150091A RU2015150091A RU2636464C2 RU 2636464 C2 RU2636464 C2 RU 2636464C2 RU 2015150091 A RU2015150091 A RU 2015150091A RU 2015150091 A RU2015150091 A RU 2015150091A RU 2636464 C2 RU2636464 C2 RU 2636464C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microtissue
- heart
- solution
- cells
- culture
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 127
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims abstract description 13
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 208000018672 Dilatation Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 60
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 24
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 16
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims description 13
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 claims description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 8
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 6
- 229940082569 selenite Drugs 0.000 claims description 6
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L selenite(2-) Chemical compound [O-][Se]([O-])=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 6
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 5
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 5
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 4
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 claims description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 claims description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 3
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 claims description 3
- 210000005241 right ventricle Anatomy 0.000 claims description 3
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 22
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- -1 magnesium cations Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 35
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 30
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 22
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 19
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 19
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 14
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 13
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 13
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 12
- 101100013973 Mus musculus Gata4 gene Proteins 0.000 description 10
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 10
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 8
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 7
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 6
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 5
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 5
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 5
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 description 4
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 description 4
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 4
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 4
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 3
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 3
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 3
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 3
- 101150114527 Nkx2-5 gene Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 101100460507 Xenopus laevis nkx-2.5 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 2
- 206010002329 Aneurysm Diseases 0.000 description 2
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 2
- 239000012594 Earle’s Balanced Salt Solution Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000002253 embryonic cardiomyocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009762 endothelial cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 208000002854 epidermolysis bullosa simplex superficialis Diseases 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000003976 gap junction Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 2
- 239000002103 nanocoating Substances 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 230000014306 paracrine signaling Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- RCEBHKDQZCVBTC-UHFFFAOYSA-N 2-acetamidothiophene-3-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)NC=1SC=CC=1C(O)=O RCEBHKDQZCVBTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 1
- 206010007513 Cardiac aneurysm Diseases 0.000 description 1
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 description 1
- 206010007572 Cardiac hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 102000010970 Connexin Human genes 0.000 description 1
- 108050001175 Connexin Proteins 0.000 description 1
- 208000001778 Coronary Occlusion Diseases 0.000 description 1
- 206010011086 Coronary artery occlusion Diseases 0.000 description 1
- 206010011091 Coronary artery thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010011703 Cyanosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 102000018715 GATA4 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010052320 GATA4 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100024392 Insulin gene enhancer protein ISL-1 Human genes 0.000 description 1
- 206010048858 Ischaemic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010013709 Leukocyte Common Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000017095 Leukocyte Common Antigens Human genes 0.000 description 1
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000009344 Penetrating Wounds Diseases 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001625 cardiomyogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000023715 cellular developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009693 chronic damage Effects 0.000 description 1
- 210000002358 circulating endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000037020 contractile activity Effects 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 208000002528 coronary thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 101150003286 gata4 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 108010090448 insulin gene enhancer binding protein Isl-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003601 intercostal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000004683 skeletal myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 210000001562 sternum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000378 teratogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003390 teratogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области клеточной и тканевой инженерии, конкретно к созданию тканеинженерных конструкций на основе прогениторных клеток миокарда и лечению заболеваний сердца. Способ включает высаживание на культуральные чашки прогениторных клеток сердца из расчета 100000-1000000 клеток на смплощади поверхности, культивирование до формирования микроткани при температуре 34-37°C в течение 12-240 часов в среде роста, открепление микроткани сердца от поверхности культуральной чашки, которое осуществляют посредством обработки микроткани сначала раствором, обеспечивающим удаление двухвалентных катионов кальция и магния при температуре раствора 18-37°C, затем нейтральным раствором при температуре 2-4°C с последующим механическим снятием микроткани с поверхности культуральной чашки. Полученную микроткань используют преимущественно для лечения заболеваний сердца, связанных с повреждением стенки левого и/или правого желудочков сердца при инфаркте миокарда, посредством трансплантации микроткани на зону повреждения в период фазы ранней дилатации стенки левого желудочка или в течение первых двух недель после инфаркта миокарда, после чего осуществляют послойное ушивание раны. Изобретение позволяет по упрощенной технологии получать микроткань сердца высокого качества за счет сохраненной архитектоники и межклеточных взаимодействий. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной и тканевой инженерии, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для создания тканеинженерных конструкций (ТИК) (или микроткани сердца) на основе прогениторных клеток миокарда, лечения заболеваний сердца, моделирования патологических состояний, а также изучения механизмов межклеточных взаимодействий и регенерации миокарда.
Уровень техники
Репаративная регенерация является широко распространенным механизмом восстановления органов и тканей в организме человека и животных. Однако в ряде случаев, например, при обширных повреждениях (инфаркт миокарда и др.), хронических заболеваниях, старении, естественных компенсаторных реакций оказывается недостаточно, что ведет к нарушению функции и прогрессированию заболеваний. В последние годы появились убедительные данные о том, что тканевая инженерия может стать основой для восстановления и замещения поврежденных органов и тканей. Задачей тканевой инженерии является конструирование и выращивание вне организма человека тканевых эквивалентов, состоящих из собственных или донорских клеток и биосовместимой «натуральной» и/или синтетической матрицы, комбинация которых воспроизводит трехмерную структуру ткани. Возможности тканевой инженерии существенно расширяются за счет применения стволовых/прогениторных клеток организма, присутствующих во многих органах и участвующих в обновлении дифференцированных тканеспецифичных клеток.
Из уровня техники известно, что для задач тканевой инженерии могут быть использованы стволовые/прогениторные клетки, получаемые из костного мозга (гематопоэтические и мезенхимальные стромальные стволовые клетки, мультипотентных взрослых прогениторных клеток (МАРС клетки) и клетки SP-популяции, циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток (из периферической крови или костного мозга) и скелетных миобластов [Carvalho Е, Verma Р, Hourigan К, Banerjee R. Myocardial infarction: stem cell transplantation for cardiac regeneration. Regen Med. 2015 V. 7. - P. 13-26; Stoltz JF, de Isla N, Li YP, Bensoussan D, Zhang L, Huselstein C, Chen Y, Decot V, Magdalou J, Li N, Reppel L, He Y. Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century. Stem Cells Int. 2015]. Однако в результате проведенных экспериментальных и клинических исследований не было показано достаточно высокой эффективности клеточной терапии сердечной недостаточности, и, что самое главное, не была подтверждена возможность замещения утраченного миокарда за счет дифференцировки трансплантированных клеток (Lipinski MJ, Biondi-Zoccai GG, Abbate A, Khianey R, Sheiban I, Bartunek J, Vanderheyden M, Kim HS, Kang HJ, Strauer BE, Vetrovec GW. Impact of intracoronary cell therapy on left ventricular function in the setting of acute myocardial infarction: a collaborative systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. J Am Coll Cardiol. 2007 Oct 30; 50(18):1761-7; Rubart M, Field LJ. Stem cell differentiation: cardiac repair. Cells Tissues Organs. 2008; 188(1-2):202-11). Эффекты, наблюдаемые при трансплантации стволовых клеток, были обусловлены, в основном, их паракринной активностью, подавляющей апоптоз кардиомиоцитов и стимулирующей ангиогенез и активность собственных резидентных клеток сердца (Pavo N, Charwat S, Nyolczas N, Jakab A, Murlasits Z, Bergler-Klein J, Nikfardjam M, Benedek I, Benedek T, Pavo IJ, Gersh BJ, Huber K, Maurer G, 
M. Cell therapy for human ischemic heart diseases: critical review and summary of the clinical experiences. J Mol Cell Cardiol. 2014 Oct; 75:12-24). Более перспективным в настоящий момент представляется использование резидентных прогениторных клеток сердца (ПКС). ПКС локализуются в зрелом миокарде и участвуют в процессах поддержания клеточного гомеостаза взрослого органа путем замены стареющих/гибнущих клеток миокарда, а также восстанавливают клетки сердца после острых (инфаркт миокарда) и хронических повреждений (ИБС, кардиомиопатии) (Bearzi С, Rota М, Hosoda Т, Tillmanns J, Nascimbene A, De Angelis A, Yasuzawa-Amano S, Trofimova I, Siggins RW, Lecapitaine N, Cascapera S, Beltrami AP, D’Alessandro DA, Zias E, Quaini F, Urbanek K, Michler RE, Bolli R, Kajstura J, Leri A, Anversa P. Human cardiac stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2007 Aug 28; 104(35):14068-73; De Angelis Al, Piegari E, Cappetta D, Marino L, Filippelli A, Berrino L, Ferreira-Martins J, Zheng H, Hosoda T, Rota M.Urbanek K, Kajstura J, Leri A, Rossi F, Anversa P. Anthracycline cardiomyopathy is mediated by depletion of the cardiac stem cell pool and is rescued by restoration of progenitor cell function. Circulation. 2010 Jan 19; 121(2):276-92.). Перспективность использования ПКС для лечения пациентов с заболеваниями сердца подтверждается результатами проведенных клинических исследований SCIPIO (Bolli R, Chugh AR, D’Amario D, Loughran JH, Stoddard MF, Ikram S, Beache GM, Wagner SG, Leri A, Hosoda T, Sanada F, Elmore JB, Goichberg P, Cappetta D, Solankhi NK, Fahsah I, Rokosh DG, Slaughter MS, Kajstura J, Anversa P. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.Lancet. 2011 Nov 26; 378(9806): 1847-57) и CADUCEUS (Makkar RR1, Smith RR, Cheng K, Malliaras K, Thomson LE, Berman D, Czer LS, 
L, Mendizabal A, Johnston PV, Russell SD, Schuleri KH, Lardo AC,Gerstenblith G, E. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 2012 Mar 10; 379(9819):895-904). Несмотря на видимые преимущества ПКС перед другими типами клеток, применяемых для кардиомиопластики (Koninckx R, 
A, Windmolders S, Carlotti F, Mees U, Steels P, Rummens JL, Hendrikx M, Hensen K. Mesenchymal stem cells or cardiac progenitors for cardiac repair? A comparative study. Cell Mol Life Sci. 2011 Jun; 68(12):2141-56), возможность их широкого применения остается ограниченной. Существующие способы доставки клеточного материала в миокард (интрокоронарное или интрамиокардиальное введение) далеки от совершенства. Они не позволяют избежать повреждения клеток и обеспечить хорошую выживаемость клеточного материала после трансплантации. Альтернативой этим методам может служить использование тканеинженерных конструкций микроткани сердца (ТИК), созданной на основе низкодифференцированных стволовых клеток или клеток преддифференцированных в специфические сердечные клетки. ТИК представляет собой одно-/многослойные клеточные структуры, состоящие из клеток одного или нескольких видов и наработанного ими внеклеточного матрикса или искусственного матрикса. Эпикардиальная трансплантация стволовых клеток в составе ТИК является более эффективным и безопасным методом в сравнении с прямым введением клеток в миокард с помощью инъекций. ТИК снимают ограничения, связанные с объемом для инъекций, что позволяет проводить доставку большего количества клеток. Преимуществами использования стволовых клеток в виде ТИК является сохранение клеточных рецепторов, что обеспечивает более эффективную адгезию клеточных имплантов к поврежденному миокарду. Кроме того, способ создания ТИК дает возможность формировать in vitro многослойные клеточные конструкции с сохраненной архитектоникой и межклеточными взаимодействиями, что должно повлиять на возможность интеграции в поврежденный миокард. ТИК, в составе которой присутствуют резидентные ПКС, создают платформу для формирования новых кардиомиоцитов, которые будут интегрированы в поврежденный миокард левого желудочка, что позволит восстановить его стенку и предотвратить дальнейшее ремоделирование и развитие сердечной недостаточности. Образование межклеточных контактов новообразованных клеток с клетками реципиента будет способствовать развитию синхронных сокращений, что, возможно, будет вносить вклад в сократительную способность левого желудочка. Нельзя также исключить возможность образования новых клеток сосудов из c-kit+VEGFR+ПКС и/или прорастание существующих сосудов в ТИК с образования полноценной функциональной единицы сердца. Определенную роль в этом процессе могут выполнять ростовые факторы и цитокины, секретируемые стволовыми клетками сердца в норме и в условиях гипоксии.
Из уровня техники известен способ получения микроткани сердца путем культивирования эмбриональных кардиомиоцитов цыпленка в 96-луночных U-образных культуральных чашках (Garzoni LR, Adesse D, Soares MJ, Rossi MI, Borojevic R, de Meirelles Mde N. Fibrosis and hypertrophy induced by Trypanosoma cruzi in a three-dimensional cardiomyocyte-culture system. J Infect Dis. 2008 Mar 15; 197(6):906-Культивирование U-образных чашках способствует формированию сфероидов, состоящих из кардиомиоцитов. Полученные сфероиды инфицировали трипаносомой крузи (Tripanosoma Cruzi) для стимуляции продукции белков внеклеточного матрикса и индукции гипертрофии кардиомиоцитов. Сформированную МТС предложено использовать для изучения фармакологических препаратов, препятствующих развитию фиброза и гипертрофии миокарда.
Из уровня техники известны другие способы получения микроткани путем увеличения степени межклеточных взаимодействий и формирования объемных клеточных агрегатов. Для этой цели использованы культивирование на специальных вращающихся шейкерах (S.B. Watzka, et al. Selection of viable cardiomyocytes for cell transplantation using three-dimensional tissue culture Transplantation, 70 (2000), pp. 1310-1317; Kelm, J.M. et al. Design of artificial myocardial microtissues. Tissue Eng 83 (2003), pp. 173-180; K.S. Furukawa, et al. Formation of human fibroblast aggregates (spheroids) by rotational culture Cell Transplant., 10 (2001), pp. 441-445), в гипоадгезионных условиях (S. Kale, et al. Three-dimensional cellular development is essential for ex vivo formation of human bone Nat. Biotechnol., 18 (2000), pp. 954-958), с центрифугированием клеток при 500 g (А. Muraglia, et al. Formation of a chondro-osseous rudiment in micromass cultures of human bone-marrow stromal cells J. Cell Sci., 116 (2003), pp. 2949-2955), культивирование на пористых мембранах (S.B. Watzka, et al. Selection of viable cardiomyocytes for cell transplantation using three-dimensional tissue culture Transplantation, 70 (2000), pp. 1310-1317), культивирование в условиях естественной гравитации по типу «висячей капли» (Rismani Yazdi S et al. Adding the ‘heart’ to hanging drop networks for microphysiological multi-tissue experiments. Lab Chip.2015 Nov 7; 15(21):4138-47). Существенным недостатком описанных решений является использование эмбриональных или ранних постнатальных клеток сердца для получения микроткани из зрелых кардиомиоцитов, что не может быть использовано для человека по этическим соображениям. Кроме того, способы формирования клеточных агрегатов основаны на грубом механическом воздействии на клетки, что может оказывать существенное влияние на их выживаемость и сроки культивирования.
Из уровня техники известен способ формирования микроткани сердца путем культивирования в биореакторе (Miklas JW et al. Bioreactor for modulation of cardiac microtissue phenotype by combined static stretch and electrical stimulation. Biofabrication. 2014 Jun; 6(2):024113). В основе изобретение лежит использование неонатальных кардиомиоцитов крысы, культивированных в коллагеновом геле при постоянной электрической и механической стимуляции в условиях биореактора. Существенным ограничением данного метода является применение неонатальных клеток сердца, коллагенового геля и необходимость приобретения дорогостоящего биореактора с соответствующими модулями, что существенно ограничивает применение данной модели в медицине.
Наиболее близким к заявляемому решению является способ получения микроткани сердца (WO 2013151755), в основе которого лежит использование культуральных чашек с наноструктурированной поверхностью, имеющей параллельные борозды и выступы. Наноструктурированная поверхность чашек способствует созданию особых анизотропных условий, позволяющих моделировать микроокружение в ткани взрослого сердца. В соответствии с изобретением низкодифференцированные клетки-предшественники кардиомиоцитов, полученные из эмбриональных или индуцированных стволовых клеток ,предлагается высаживать на культуральные чашки с наноструктурированным покрытием для формирования микроткани сердца. Культивирование в данных условиях способствует формированию слоя клеток (клеточной накладки), экспрессирующих транскрипционные факторы и белки зрелых кардиомиоцитов, взаимодействующих между собой через щелевые коннексинсодержащие контакты. Клетки в составе клеточной накладки формируют электромеханическое сопряжение и способны передавать волну возбуждения при соответствующей стимуляции.
Однако данный способ имеет ряд недостатков в сравнении с заявляемым решением.
1) В изобретении предложено использовать клетки-предшественники, полученные из эмбриональных (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), применение которых сопряжено с этическими проблемами и возможной иммунологической несовместимостью их дифференцированного потомства, что существенно ограничивает их практическое применение.
2) При использовании низкодифференцированных предшественников кардиомиоцитов из ЭСК и иПСК возникает необходимость в тестировании их тератогенных и онкогенных свойств при каждом использовании.
3) При использовании низкодифференцированных предшественников кардиомиоцитов из ЭСК и иПСК возникает необходимость в подборе условий и осуществлении контроля уровня специфической дифференцировки при каждом использовании.
4) При использовании низкодифференцированных предшественников кардиомиоцитов из ЭСК и иПСК возникает необходимость в подборе маркеров и условий для проведения селекции строго определенной популяции клеток из гетерогенной культуры.
5) Для получения микроткани сердца требуются специальное оборудование и разработка технологии наноструктурирования поверхности культуральных чашек.
6) Высокая стоимость чашек с наноструктурированной поверхностью.
7) Сложность в стандартизации процедур наноструктурирования поверхности и подготовки исходного клеточного материала (вариабельность в свойствах клонов ЭСК и иПСК).
8) Использование коммерческих чашек с наноструктурированным покрытием существенно ограничивает возможность получения тканеинженерной конструкции большой площади в сравнении с площадью культуральной чашки.
9) Необходимость в постоянном контроле процесса дифференцировки клеток на чашках с наноструктурированной поверхностью.
10) Длительность получения микроткани сердца (способ включает следующие этапы: получение индуцированных плюрипотентных клеток-характеристика клеток-отбор предшественников кардиомиоцитов-характеристика клеток - культивирование на чашках с наноструктурированной поверхностью - характеристика клеток).
Раскрытие изобретения
Задачей данного изобретения является создание усовершенствованного способа получения тканеинженерных конструкций (микроткани сердца) на основе прогениторных клеток миокарда. Полученная заявляемым способом микроткань сердца при ее трансплантации повышает эффективность лечения заболеваний сердца по сравнению с использованием тканеинженерных конструкций, полученных известными способами. Получаемые микроткани сердца также могут быть использованы для моделирования патологических состояний, изучения механизмов межклеточных взаимодействий и регенерации миокарда.
Поставленная задача решается тем, что способ получения микроткани сердца на основе прогениторных клеток сердца включает получение культуры прогениторных клеток сердца с последующим их высаживанием на культуральные чашки из расчета 100000-1000000 клеток на см2 площади поверхности и культивированием до формирования микроткани при температуре 34-37°C в течение 12-240 часов в среде роста, с последующим откреплением микроткани сердца от поверхности культуральной чашки, которое осуществляют посредством обработки микроткани сначала раствором, обеспечивающим удаление двухвалентных катионов кальция и магния при температуре буферного раствора +18 - +37°C, затем нейтральным раствором при температуре +2 - +4°C с последующим механическим снятием микроткани с поверхности культуральной чашки.
В способе могут быть использованы культуральные чашки диаметром 10-100 мм без покрытия или с покрытием из коллагена, и/или фибронектина, и/или ламинина, и/или желатина, и/или фибрина в количестве 0,1-1000 мкг/см2.
В качестве среды роста предпочтительно используют среду, содержащую 0,5-10% ФБС, 1-100 нг/мл bFGF, 1-100 нг/мл EGF, 2% В27, 1-5х инсулин-трансферрин селенита, например среду DMEM F12, или IMDM, или F12, или RPMI, или MEM, или DMEM, или Myelocult. Среда роста может дополнительно содержать 0,01-3% пенициллина-стрептомицина, и/или 0,01-1 мМ 2-меркаптоэтанола, и/или 0,1-5 мМ Л-глутамина.
Перед откреплением микроткани сердца от поверхности культуральной чашки ее, как правило, промывают раствором для удаления следовых количеств среды роста при температуре буферного раствора +18 - +37°C. Для этого может быть использован раствор Хэнкса, или раствор Эрла, или раствор Дульбекко.
В качестве раствора, обеспечивающего удаление двухвалентных катионов кальция и магния, может быть использован раствор Версена, при этом промывку раствором осуществляют в 1-10 этапов.
В качестве нейтрального (или «холодного») раствора используют раствор Хэнкса без Са++Mg++, или раствор Эрла, или раствор Дульбекко.
В одном из вариантов осуществления для механического снятия с поверхности культуральной чашки микроткань одним неотрывным движением обводят по периметру культуральной чашки для отсоединения ее краев от бортов чашки, затем движениями, направленными от периферии микроткани к центру, добиваются отслойки микроткани от чашки, после отсоединения 80-90% микроткани от поверхности культуральной чашки аккуратными постукивающими движениями по дну чашки добиваются его флотации в фосфатно-солевом буфере. Для механического снятия микроткани культуральную чашку помещают на лед.
Сущность заявленного способа лечения заболеваний сердца, связанных с повреждением стенки левого и/или правого желудочков сердца при инфаркте миокарда, заключается в том, что в период фазы ранней дилатации стенки левого желудочка или в течение первых двух недель после инфаркта миокарда осуществляют трансплантацию микроткани, полученной по представленному выше способу, при этом имикроткань на зону повреждения наносят поверхностью, которая при культивировании размещалась на культуральной чашке, после чего осуществляют послойное ушивание раны. Ушивание раны, как правило, осуществляют через 5-40 минут после нанесения микроткани на зону повереждения, при этом микротканью сердца покрывают не менее 10-100% зоны повреждения.
Техническим результатом изобретения является получение in vitro ТИК (микроткани сердца или имплантата) высокого качества за счет сохраненной архитектоники и межклеточных взаимодействий при упрощении технологии получения. Технический результат достигается совокупностью существенных признаков, включающих используемый состав исходных клеток; условия формирования микроткани, при которых клетки не погибают в процессе взаимодействия между собой, при этом изменяют свой секреторный профиль, начиная больше синтезировать внеклеточного матрикса, что исключает необходимость внесения в состав получаемого продукта синтетического матрикса (который должен после трансплантации не вызывать иммунного ответа (быть биоразлагаемым)), а также при которых клетки вступают в дифференцировку в направлении кардиомиоцитов и клеток сосудов; а также признаков, характеризующих условия открепления сформированной на чашке Петри микроткани, при которых минимизируется риск разрушения матрикса и межклеточных взаимодействий в процессе снятия ТИК с поверхности культуральной чашки, что приводит к увеличению выживаемости клеток в составе имплантата in vitro и in vivo, активацию кардио- и эндотелиальной дифференцировки ПКС в составе конструкции, более эффективную адгезию микроткани к поврежденному миокарду, высокую степень интеграции имплантата в ткань миокарда с формированием графта, содержащего сосуды и кардиомиоциты.
В заявляемом изобретении матрикс, формируемый в процессе осуществления способа, является продуктом, вырабатываемым самими клетками, который обеспечивает, в т.ч. выживаемость клеток. Существенным условием формирования качественной ТИК является плотность посадки культуры прогениторных клеток сердца на поверхность культуральной чашки - от 100000 до 1000000 клеток на см2. При меньших значениях плотности не будет формироваться целостная конструкция трансплантата, позволяющая переносить ее с одной чашки на другую без повреждения архитектоники и межклеточных взаимодействий, при больших значения плотности посадки клетки ухудшаются параметры получаемой микроткани (клетки не способны взаимодействовать с поверхностью, распластываться и синтезировать достаточное количество белков внеклеточного матрикса, кроме того, возникает недостаток факторов для роста клеток из сред культивирования) в связи с тем, что продукты распада одних клеток начинают подавлять жизнеспособность других клеток.
Кроме того, заявляемое изобретение характеризуется следующими преимуществами:
- использование прогениторных клеток сердца в качестве основы для создания микроткани сердца, которые наряду с паракринным действием способны к мультипотентной дифференцировки в кардиомиоциты и клетки сосудов;
- возможность получения микроткани сердца без использования чашек с наноструктурированной поверхностью, соответствующего оборудования для его нанесения или готовых коммерческих чашек с покрытием специфическими полимерами;
- возможность получения микроткани сердца произвольной площади без учета ограничений, связанных с размером коммерчески доступных наноструктурированных чашек или чашек с полимерным покрытием;
- высокая скорость открепления микроткани сердца от поверхности культуральной чашки с сохранением жизнеспособности клеток и целостности наработанного внеклеточного матрикса;
- возможность получения васкуляризированной микроткани сердца за счет ангиогенной дифференцировки составляющих клеток;
- возможность повышения интеграционной способности и электромеханического сопряжения конструкции с тканью миокарда за счет формирования кардиомиоцитоподобных клеток;
- возможность формирования «функциональной единицы» сердца из спецализированных клеток сердца, как модели для фармакологических исследований и/или изучения механизмов межклеточных взаимодействий и регенерации миокарда.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 представлены основные этапы получения с-kit + ПКС крысы. А - эксплант на поверхности культуральной чашки (3 день) культивирования; Б - образование монослоя фибробластоподобных клеток вокруг экспланта на 7 день культивирования; В - появления округлых клеток вокруг экспланта на 12 день культивирования; Г - c-kit + клетки через 24 часа после иммуномагнитной селекции; Д - c-kit + клетки через 72 часа после иммуномагнитной селекции; Е - культура c-kit + клеток через 10 дней культивирования.
На фигуре 2 представлена сформированная ТИК (микроткань сердца) на основе с-kit + ПКС. А - частичное открепление накладки от поверхности культуральной чашки после кратковременной обработки раствором Версена и механического открепления краев; Б - клеточная накладка после открепления от поверхности культуральной чашки; В - структура клеточной накладки при 10х увеличении.
На фигуре 3 представлены срезы микроткани сердца. А - окрашивание гемотоксилин-эозином; Б - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к коннексину 43 и актину. Коннексин 43 отмечен стрелками; В - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к Ki-67 и актину. Пролиферирующие клетки отмечены стрелками; Г - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к каспазе 3 и актину; Д - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к Gata 4. Клетки, вступившие в дифференцировку, отмечены стрелками.
На фигуре 4 представлена ТИК (микроткань сердца) на основе ПКС после трансплантации на ишемизированный миокард крысы.
На фигуре 5 представлена васкуляризация ТИК (микроткани сердца) на 14 день после трансплантации. А - иммунофлуоресцентное окрашивание ткани миокарда крысы антителами к маркеру эндотелия сосудов CD31. Сформированные сосуды отмечены стрелками. Б - иммунофлуоресцентное окрашивание ткани миокарда крысы антителами к маркеру гладкомышечных клеток сосудов гладкомышечному актину. Сформированные сосуды отмечены стрелками. Трансплантированные клетки в составе накладки помечены Cell Tracker CM-DIL.
На фигуре 6 представлены признаки кардиомиоцитарной дифференцировки ПКС в составе ТИК (микроткани сердца) на 14 день после трансплантации. А - иммунофлуоресцентное окрашивание ткани миокарда крысы антителами к маркеру клеток-предшественников кардиомиоцитов Nkx 2,5. Клетки, вступившие в дифференцировку, отмечены стрелками. Б - иммунофлуоресцентное окрашивание ткани миокарда крысы антителами к маркеру зрелых кардиомиоцитов - тяжелые цепи миозина β. Новообразованные кардиомиоциты отмечены стрелками. Трансплантированные клетки в составе накладки помечены Cell Tracker CM-DIL.
Осуществление изобретения
В рамках настоящего изобретения под тканеинженерной конструкцией (микротканью сердца) понимается одно-/многослойные клеточные структуры, которые также в литературе встречаются как тканевые эквиваленты, клеточные конструкции, клеточные имплантаты, клеточные «заплатки».
Основой для создания микроткани сердца выступают прогениторные клетки сердца (ПКС). Термином ПКС обозначается популяция клеток миокарда, которые способны к самообновлению и дифференцировке в функционирующие клетки сердца. Кроме того, ПКС способны секретировать ростовые факторы и цитокины, которые обеспечивает выживаемость клеток, препятствуют развитию гипертрофии кардиомиоцитов и фиброза в зоне повреждения. Для получения культуры ПКС необходимо выполнение 2 этапов: получение первичной клеточной суспензии и проведение селекции строго определенной популяции клеток. Суспензия клеток может быть получена из образцов миокарда человека и животных с помощью одного или комбинации методов, например ферментативной диссоциации ткани, методом эксплантной культуры, ретроградной перфузией сердца по Лангендорфу. Следующим этапом получения ПКС является проведение иммуномагнитной селекции/клеточного сортинга с антителами к специфическим маркерам, например: c-kit (CD117) и/или sca-1/sca-1like и/или Islet-1 и/или SSEA-4 или культивирование в виде клеточных агрегатов (клетки кардиосфер). Для последующей посадки на культуральные чашки для формирования микроткани сердца ПКС могут быть взяты 1-10 пассажей. В одном из вариантов осуществления изобретения культура ПКС может быть получена по технологии, подробно представленной в материалах патента на изобретение № RU 2505602 «Способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего из образцов миокарда».
Для получения ТИК (микроткани сердца) ПКС высаживают на культуральные чашки °°°Петри диаметром 10-100 мм из расчета 100000-1000000 кл/см2 площади поверхности без покрытия. Культивирование клеток проводят при температуре 34-37°C в атмосфере 5% CO2 в течение 12-240 часов в среде, содержащей 0,5-10% ФБС, 1-100 нг/мл bFGF, 1-100 нг/мл EGF, 2% В27, 1-5х инсулин-трансферрин селенита. Наиболее предпочтительным является культивирование ПКС в течение 72-240 часов (в зависимости от требуемой толщины тканеинженерной конструкции) в среде DMEM F12 («Invitrogen», США), содержащей 10% ФБС, 1-100 нг/мл bFGF, 1-100 нг/мл EGF, 2% В27, 1-5х инсулин-трансферрин селенита или IMDM, F12, RPMI, MEM, DMEM, Myelocult. При этом среда дополнительно может содержать 0,01-3 об.% пенициллина-стрептомицина и/или 0,01-1 мМ 2-меркаптоэтанола и/или 0,1-5 мМ Л-глутамина. Культивирование ПКС в состоянии высокой плотности в специальной среде способствует формированию межклеточных взаимодействий, активации продукции белков внеклеточного матрикса и индукции кардиомиоцитарной и эндотелиальной дифференцировки клеток. Таким образом происходит формирование 3D многослойной клеточной конструкции (микроткани сердца), состоящей из белков синтезированного внеклеточного матрикса и клеток преддифференцированных в карди- и эндотелиальном направлениях.
После окончания процесса культивирования полученную ТИК (микроткань сердца) промывают в 2-10 этапов теплым раствором Хэнкса (HBSS) без Са++ Mg++ (температура буферного раствора +18 - +37C) для удаления следовых количеств среды культивирования и сыворотки. В качестве раствора для обработки ТИК может быть также использован теплый раствор Эрла (EBSS) или раствор Дульбекко (dPBS). Промывку ТИК проводят путем нанесения теплого раствора Хэнкса (0,1-0,5 мл/см2) струйно на бортик культуральной чашки (для предотвращения смещения клеток), инкубации длительностью 5-300 секунд и удаления раствора с помощью насоса.
Для открепления поверхности культуральной чашки микроткань промывают в 1-10 этапов теплым раствором Версена (температура буферного раствора +18 - +37°C) для удаления двухвалетных катионов кальция и магния, способствующих началу процесса открепления микроткани сердца от поверхности культуральной чашки. Промывку ТИК проводят путем нанесения теплого раствора Версена (0,1-0,5 мл/см2) струйно на бортик культуральной чашки (для предотвращения смещения клеток), инкубации длительностью 5-300 секунд и удаления раствора с помощью насоса. После этого в культуральную чашку добавляют холодный раствор Хэнкса без Са++ Mg++ (температура буферного раствора +2 - +4°C), что приводит к изменению формы клеток (в составе тканеинженерной конструкции) за счет реорганизации их актинового цитоскелета и адгезивных контактов при холодовом воздействии (используют 1-10 этапов обработки раствором, время инкубации с раствором 5-300 секунд) В качестве раствора для обработки ТИК может быть также использован холодный раствор Эрла (EBSS) или раствор Дульбекко (dPBS). Холодный раствор Хэнкса (0,1-0,5 мл/см2) наносят струйно на бортик культуральной чашки (для предотвращения смещения клеток). Далее, культуральную чашку помещают на лед и проводят механическое снятие с помощью шпателя или стандартного пластикового наконечника для пипетки. Для этого ТИК одним неотрывным движением обводят по периметру культуральной чашки (для отсоединения его краев от бортов чашки). Затем короткими по 1-10 мм движениями, направленными от периферии конструкта к центру, добиваются его отслойки от чашки. После того как 80-90% ТИК отсоединено от поверхности культуральной чашки аккуратными постукивающими движениями по дну чашки (1-1000 раз) добиваются его флотации в растворе Хэнкса. Перенос клеточной накладки в другую культуральную чашку или область трансплантации проводят с использованием синтетической мембраны или пинцета. Следует обратить внимание, что предложенный способ получения тканеинженерных конструкций не требует ферментативной обработки пластов клеток или использования специальных чашек с термочувствительным покрытием, что обеспечивает простоту, легкость и низкую стоимость получения готового имплантата. Кроме того, предложенный способ обеспечивает лучшие показатели выживаемости клеток, сохранение внеклеточного матрикса и целостности ТИК в сравнении с использованием ферментативного метода открепления. Таким образом, за счет использования щадящего способа открепления микроткани от поверхности культуральной чашки (без применения ферментов) сохраняются адгезивные контакты на поверхности клеток тканеинженерных конструкций, что позволяет обеспечить более качественное «прилипание» конструкции к ткани миокарда и более быструю миграцию клеток микроткани в ткань миокарда.
ТИК (микроткань сердца) может быть использована для лечения заболеваний сердца, связанных с повреждением стенки левого и/или правого желудочков сердца при инфаркте миокарда (ИМ), возникшем вследствие тромбоза коронарной артерии. ТИК следует трансплантировать в период фазы ранней дилатации стенки левого желудочка (в течение первых 48 часов) или в течение первых 2 недель после ИМ. Известно, что на 2-3 сутки в зону инфаркта происходит миграция лейкоцитов, что приводит к лизису некротических миоцитов сердечной стенки. В результате разрушения коллагена и миоцитов прочность стенки миокарда к этому времени значительно снижается, что может привести к формированию аневризмы или разрыву сердца. Повышение прочности стенки ЛЖ за счет использования ТИК (микроткани сердца) является одной из основных задач данного изобретения. Клетки ТИК после трансплантации формируют очаги неокардиогенеза, а новообразованные сосуды образуют единую сеть коллатерального кровоснабжения. ПКС способны секретировать ростовые факторы и цитокины, которые обеспечивает выживаемость клеток, препятствуют развитию гипертрофии кардиомиоцитов и фиброза в зоне повреждения. Паракринное действие клеток в составе ТИК будет способствовать сохранению гибернирующего миокарда в периинфарктной зоне, что является обязательным условием для предотвращения развития истинной аневризмы левого желудочка в период позднего ремоделирования (2-8 недель после ИМ). ТИК (микроткань) сердца наносят на зону некроза и/или периинфарктную зону с помощью синтетической гипоадгезионной мембраны при строгом соблюдении ориентации конструкции (поверхность ТИК раннее прикрепленная на чашке должна быть «контактной» при размещении на миокарде). После размещения ТИК на эпикардиальной поверхности миокарда ее расправляют с помощью игольчатого пинцета. ТИК наносят для обеспечения покрытия не менее 10-100% зоны повреждения. Послойное ушивание раны проводят не ранее 5-40 минут после нанесения ТИК (для обеспечения адгезии клеточной конструкции).
Полученная микроткань может быть использована также при проникающих ранениях сердца (после ушивания раны), после хирургического иссечения аневризмы сердца, а также при хронической сердечной недостаточности и кардиомиопатиях.
Изобретение поясняется следующими примерами конкретного осуществления.
Пример 1. Получение прогениторных клеток сердца крысы.
Для реализации изобретения были использованы образцы миокарда от самцов крыс линии Вистар массой 250-300 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. При проведении экспериментов руководствовались рекомендациями о гуманном отношении к лабораторным животным, изложенными в Приказе МЗ СССР за №755 от 12 августа 1977 г. Ткань миокарда была измельчена ножницами до размера кусочков 2-3 мм3, затем промыта раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ) 3 раза. Далее проведена обработка ткани раствором ферментов (0,1% коллагеназы A («Roche diagnostics)), США) и 0,2% трипсина («Invitrogen», США) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ)) при 37°C в течение 15 минут при постоянном покачивании на шейкере. После инкубации к раствору ферментов с кусочками ткани добавлен тройной объем среды IMDM, содержащей 10%» фетальной сыворотки теленка (ФБС) («Hyclone», США) и проведено центрифугирование 10 мин со скоростью 1000 оборотов/мин (200 g). Затем кусочки ткани миокарда были промыты 3 раза раствором ФСБ и помещены на пластиковые культуральные чашки, предварительно покрытые фибронектином, в среду культивирования (IMDM («Invitrogen», США), содержащей 10% ФБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мML-глутамина) (фиг. 1А). Каждые три дня проводилась частичная замена среды (1/2 объема). Экспланты культивировали до момента появления прозрачных округлых клеток, находящихся на слое фибробластов (Фиг. 1Б, В). С помощью среды для открепления клеток Accutase («IСТ», США) клетки «снимали» с чашек, фильтровали через нейлоновые мембраны («BD Pharmingen», США) с размером пор 40 микрон и далее использовали для иммуномагнитной селекции. В качестве маркера для получения СКС был использован с-kit (рецептор фактора стволовых клеток (SCF)), который характеризует популяцию резидентных клеток сердца с высоким регенеративным потенциалом (Beltramietal., 2003). Для иммуномагнитной селекции с-kit клеток использованы поликлональные антитела к антигену CD45 («Аbcam», США), с-kit крысы («SantaCruz», США) и вторичные антитела к Fc-фрагменту кроличьих IgG («Dynal», США), конъюгированные с магнитными бусинами. Сортинг клеток проводился в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя наборов для иммуномагнитной селекции («Dynal», США). Полученные c-kit + клетки культивировали в среде DMEM F12 («Invitrogen», США), содержащей 10% ФБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 20 нг/мл bFGF, 20 нг/мл EGF, 10 нг/мл LIF, 2% В27, 1х инсулин-трансферрин селенита (Фиг. 1Г, Д, Е).
Пример 2. Получение ТИК (микроткани сердца).
C-kit+ клетки 3-го пассажа высаживали на культуральные чашки без покрытия площадью 3,8 см2 из расчета 300000 кл/см2 площади поверхности. Далее клетки культивировали в течение 96 часов в среде DMEM F12 («Invitrogen», США), содержащей 10%) ФБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 20 нг/мл bFGF, 20 нг/мл EGF, 2% В27, 1х инсулин-трансферрин селенита, при температуре 37°C. Далее выполнили 2 промывки теплым раствором Хэнкса (HBSS) без Са++ Mg++ (температура раствора +37°C) для удаления следовых количеств среды культивирования и сыворотки. Промывку ТИК проводили путем нанесения теплого раствора Хэнкса (0,2 мл/см2) струйно на бортик культуральной чашки (для предотвращения смещения клеток), затем инкубировали в растворе 30 секунд и удаляли раствор с помощью насоса. Для открепления клеточных накладок с поверхности культуральной чашки проводили 2 промывки теплым раствором Версена (температура раствора +37°C) для удаления двухвалетных катионов кальция и магния. Промывку ТИК проводили путем нанесения теплого раствора Версена (0,2 мл/см2) струйно на бортик культуральной чашки (для предотвращения смещения клеток), затем инкубировали 30 секунд и удаляли раствор с помощью насоса. После этого в культуральную чашку добавляли струйно холодный раствор Хэнкса без Са++ Mg++ (температура раствора +4C; 0,2 мл/см2). Далее, культуральную чашку помещали на лед и проводили механическое снятие ТИК с помощью шпателя или стандартного пластикового наконечника для пипетки. Для этого ТИК одним неотрывным движением обводили по периметру культуральной чашки (для отсоединения его краев от бортов чашки). Затем короткими по 2 мм движениями, направленными от периферии конструкта к центру, добивались его отслойки от чашки. После того как 90% ТИК было отсоединено от поверхности культуральной чашки аккуратными постукивающими движениями по дну чашки (11 раз) добивались его флотации в растворе Хэнкса (Фиг. 2) Перенос клеточной накладки на область трансплантации проводили с использованием синтетической гипоадгезионной мембраны и пинцета.
Пример 3. Характеристика ТИК (микроткани сердца) методом иммунофлуоресцентного окрашивания
Криосрезы ТИК (7 мкм) промывали в фосфатно-солевом буфере и фиксировали 4% формалином в течение 15 минут. Для снижения неспецифического связывания антител с клетками препараты инкубировали в блокирующем растворе (1% бычьего сывороточного альбумина/10% сыворотки донора вторых антител/фосфатно-солевой буфер) в течение 30 минут. После удаления излишка блокирующего раствора клетки инкубировали в течение 60 мин с первичными антителами (в концентрациях рекомендованных изготовителем) в растворе (1% бычий сывороточный альбумин/фосфатно-солевой буфер). Использовали первичные антитела против Ki67 («Abcam», США), коннексина 43 («Sigma», США), каспазы 3 («Cell signalling)), США), Gata 4 («SantaCruz», США), срезы отмывали от излишков антител 3 раза в фосфатно-солевом буфере, затем инкубировали клетки в течение 60 минут с вторичными антителами Alexa Fluor («Invitrogen», США), меченными FITC в стандартном разведении 1:2000 в растворе (1% бычьего сывороточного альбумина/фосфатно-солевой буфер). Срезы отмывали от излишков антител в в фосфатно-солевом буфере 3 раза. Ядра клеток докрашивали DAPI. После отмывки в фосфатно-солевом буфере срезы клеточных агрегатов заключали в Aquapolymount («Polysciencesinc», США). Полученные таким образом препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М («Zeiss», Германия). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRC («Zeiss», Германия) и обработки изображения в программах Axiovision 3.1 («Zeiss», Германия) и AdobePhotoShop («AdobeSystems», США).
Анализ полученных ТИК (микроткани сердца) с помощью гистологического и иммунофлуоресцентного окрашивания срезов показали, что они состоят из нескольких слоев клеток (Фиг. 3), взаимодействующих между собой при помощи коннексин -43 содержащих щелевых контактов. Около 10-12% процентов клеток в составе ТИК экспрессировали маркер пролиферации Ki-67. Пролиферация клеток накладок в совокупности с отсутствием маркеров апоптоза (каспаза 3) указывают, что данные условия культивирования поддерживают жизнеспособность клеток. Культивирование с-kit+ клеток в составе ТИК на культуральных чашках без фибронектина и в отсутствии факторов, способствующих сохранению низкодифференцированного состояния стволовых/прогениторных клеток, вызывало повышение экспрессии транскрипционного фактора Gata 4, который не экспрессировался в культуре c-kit+ клеток после иммуномагнитной селекции. Появление экспрессии Gata 4 указывает на индукцию кардиомиогенной дифференцировики в c-kit + клетках при культивировании в составе 3D культуры клеточной накладки. Gata 4 является наиболее ранним кардиоспецифичным транскрипционным фактором, который определяет формирование миокарда в период эмбрионального развития (Holtzinger A, Evans Т. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 2005 Sep; 132(17):4005-14). Маркер Gata 4+ характеризует мультипотентные c-kit+ прогениторные клетки миокарда, которые способны образовывать не только кардиомиоцитарные клетки-предшественниками, но и клетки сосудов (Bearzi С, Leri A, Lo Monaco F, Rota M, Gonzalez A, Hosoda T, Pepe M, Qanud K, Ojaimi C, Bardelli S, D’Amario D, D’Alessandro DA, Michler RE, Dimmeler S, Zeiher AM, Urbanek K, Hintze TH, Kajstura J, Anversa P. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Sep 15; 106(37): 15885-90). Было показано, что помимо дифференцировки c-kit + Gata 4+ прогениторные клетки сердца участвуют в регенерации миокарда путем паракринной секреции биологически активных факторов, привлекающих другие стволовые клетки и подавляющие апоптоз кардиомиоцитов (Kawaguchi N, Smith AJ, Waring CD, Hasan MK, Miyamoto S, Matsuoka R, Ellison GM. c-kitpos GATA-4 high rat cardiac stem cells foster adult cardiomyocyte survival through IGF-1 paracrine signalling. PLoS One. 2010 Dec 13; 5(12):e14297). Co-культивирование c-kit+Gata 4 + клеток со взрослыми кардиомиоцитами крысы повышало выживаемость кардиомиоцитов in vitro и стимулировало их сократительную активность. Эти эффекты были связаны с секрецией IGF-1 c-kit+Gata 4 + клетками, который активировал IGF-1R/Akt сигнальный каскад кардиомиоцитов и подавлял их апоптоз (Kawaguchi N, Smith AJ, Waring CD, Hasan MK, Miyamoto S, Matsuoka R, Ellison GM. c-kitpos GATA-4 high rat cardiac stem cells foster adult cardiomyocyte survival through IGF-1 paracrine signalling.PLoS One. 2010 Dec 13; 5(12):e14297).
Пример 3. Трансплантация ТИК (микроткани сердца) на модели инфаркта миокарда у крысы
В эксперименте использованы крысы линии Вистар массой 250-300 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. При проведении экспериментов руководствовались рекомендациями о гуманном отношении к лабораторным животным, изложенными в Приказе МЗ СССР за №755 от 12 августа 1977 г. Моделирование инфаркта миокарда проведено в соответствии с подходом, опубликованном ранее (TraktuevDO, Tsokolaeva ZI, Shevelev AA, Talitskiy KA, Stepanova VV, Johnstone BH, Rahmat-Zade TM, Kapustin AN, Tkachuk VA, March KL, Parfyonova YV. Urokinase gene transfer augments angiogenesis in ischemic skeletal and myocardial muscle. Mol Ther. 2007 Nov; 15(11): 1939-46). Животных интубировали через трахеотомическое отверстие и подключали к аппарату искусственной вентиляции легких (ИВЛ). Вентиляцию легких осуществляли комнатным воздухом с частотой дыхания 60-65 уд/мин с помощью аппарата ИВЛ. Левостороннюю торакотомию проводили в пятом межреберье на 2-3 мм кнаружи от грудины. В образовавшееся отверстие «вывихивали» сердце. Лигатуру накладывали на левую переднюю нисходящую коронарную артерию на 2-3 мм ниже предсердия и возвращали сердце обратно в грудную полость. Коронарную окклюзию верифицировали по появлению эпикардиального цианоза. Перед проведением трансплантации клетки в составе ТИК были помечены красным флуоресцентным красителем CellTracker CM DIL (Invitrogen). Через 10 минут после перевязки левой передней нисходящей коронарной артерии клеточную накладку помещали на эпикардиальную поверхность миокарда (поверхность ТИК ранее прикрепленная к чашке была «контактной» при размещении на миокарде) и расправляли с помощью пинцета (Фиг. 4). Послойное ушивание хирургической раны проводили через 20 минут после трансплантации ТИК.
Пример 4. Оценка васкуляризации и кардиомиоцитарной дифференцировки ПКС в составе тканеинженерной конструкции после трансплантации
На 14 день после трансплантации тканеинженерных конструкций животных умерщвляли. Сердца животных извлекали из грудной полости и готовили криосрезы. Криосрезы клеточных накладок (7 мкм) промывали в фосфатно-солевом буфере и фиксировали 4% формалином в течение 15 минут. Для снижения неспецифического связывания антител с клетками препараты инкубировали в блокирующем растворе (1% бычьего сывороточного альбумина/10% сыворотки донора вторых антител/фосфатно-солевой буфер) в течение 30 минут. После удаления излишка блокирующего раствора клетки инкубировали в течение 60 мин с первичными антителами (в концентрациях рекомендованных изготовителем) в растворе (1% бычий сывороточный альбумин/фосфатно-солевой буфер). Использовали первичные антитела против CD31 («BD Pharmingen», США), α-гладкомышечного актина («Sigma», США), Nkx 2,5 («Abcam», США), МНС («SantaCruz», США), срезы отмывали от излишков антител 3 раза в фосфатно-солевом буфере, затем инкубировали клетки в течение 60 минут с вторичными антителами Alexa Fluor («Invitrogen», США), меченными FITC в стандартном разведении 1:2000 в растворе (1% бычьего сывороточного альбумина/фосфатно-солевой буфер). Срезы отмывали от излишков антител в фосфатно-солевом буфере 3 раза. Ядра клеток докрашивали DAPI. После отмывки в фосфатно-солевом буфере срезы клеточных агрегатов заключали в Aquapolymount («Polysciencesinc», США). Полученные таким образом препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М («Zeiss», Германия). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRC («Zeiss», Германия) и обработки изображения в программах Axiovision 3.1 («Zeiss», Германия) и AdobePhotoShop («AdobeSystems», США).
При оценке влияния трансплантации ТИК (микроткани сердца) на ремоделирование левого желудочка, одним из показателей которого является толщина стенки в области инфаркта, было обнаружено, что трансплантация имплантата из ПКС позволяет почти вдвое увеличить этот показатель, что является важнейшим фактором, уменьшающим постинфарктное ремоделирование левого желудочка и развитие сердечной недостаточности. Причем ТИК (микроткань сердца) не только интегрировалась с подлежащей тканью стенки левого желудочка, но и хорошо васкуляризировалась: содержала большое количество артериальных и венозных кровеносных сосудов разного диаметра (Фиг. 5). Часть клеток ТИК, меченных Cell Tracker CM-DIL, экспрессировали маркеры клеток-предшственников кардиомиоцитов - Nkx 2,5 и зрелых кардиомиоцитов - тяжелые цепи миозина β (Фиг. 6), что указывает на дифференцировку ПКС в составе имплантата в кардиомиоцитарном направлении.
Claims (15)
1. Способ получения микроткани сердца на основе прогениторных клеток сердца, включающий высаживание на культуральные чашки прогениторных клеток сердца из расчета 100000-1000000 клеток на см2 площади поверхности и культивирование их до формирования микроткани при температуре 34-37°C в течение 12-240 часов в среде роста с последующим откреплением микроткани сердца от поверхности культуральной чашки, которое осуществляют посредством обработки микроткани сначала раствором, обеспечивающим удаление двухвалентных катионов кальция и магния при температуре раствора 18-37°C, затем нейтральным раствором при температуре 2-4°C с последующим механическим снятием микроткани с поверхности культуральной чашки.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют культуральные чашки с покрытием из коллагена, и/или фибронектина, и/или ламинина, и/или желатина, и/или фибрина в количестве 0,1-1000 мкг/см2.
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют культуральные чашки диаметром 10-100 мм.
4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве среды роста используют среду, содержащую 0,5-10% ФБС, 1-100 нг/мл bFGF, 1-100 нг/мл EGF, 2% В27, 1-5х инсулин-трансферрин селенита.
5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что в качестве среды роста используют среду DMEM F12, или IMDM, или F12, или RPMI, или MEM, или DMEM, или Myelocult.
6. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что среда роста дополнительно содержит 100 ед/мл пенициллина-стрептомицина и/или 2 мМ Л-глутамина.
7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что перед откреплением микроткани сердца от поверхности культуральной чашки ее промывают раствором для удаления следовых количеств среды роста при температуре буферного раствора +18-+37°C.
8. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что для промывки используют раствор Хэнкса, или раствор Эрла, или раствор Дульбекко.
9. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве раствора, обеспечивающего удаление двухвалентных катионов кальция и магния, используют раствор Версена, при этом промывку раствором осуществляют в 1-10 этапов.
10. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве нейтрального раствора используют раствор Хэнкса без Ca++ Mg++, или раствор Эрла, или раствор Дульбекко.
11. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что для механического снятия микроткани культуральную чашку помещают на лед.
12. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что для механического снятия с поверхности культуральной чашки микроткань одним неотрывным движением обводят по периметру культуральной чашки для отсоединения ее краев от бортов чашки, затем движениями, направленными от периферии микроткани к центру, добиваются отслойки микроткани от чашки, после отсоединения 80-90% микроткани от поверхности культуральной чашки аккуратными постукивающими движениями по дну чашки добиваются его флотации в фосфатно-солевом буфере.
13. Способ лечения заболеваний сердца, связанных с повреждением стенки левого и/или правого желудочков сердца при инфаркте миокарда, включающий получение микроткани сердца способом по п. 1 и трансплантацию полученной ткани в период фазы ранней дилатации стенки левого желудочка или в течение первых двух недель после инфаркта миокарда, при этом микроткань на зону повреждения наносят поверхностью, которая при культивировании размещалась на культуральной чашке, после чего осуществляют послойное ушивание раны.
14. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что ушивание раны осуществляют через 5-40 минут после нанесения микроткани на зону повреждения.
15. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что микротканью сердца покрывают не менее 10-100% зоны повреждения.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015150091A RU2636464C2 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Способ получения и использования тканеинженерных конструкций на основе прогениторных клеток для лечения заболеваний сердца |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015150091A RU2636464C2 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Способ получения и использования тканеинженерных конструкций на основе прогениторных клеток для лечения заболеваний сердца |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015150091A RU2015150091A (ru) | 2017-05-26 |
| RU2636464C2 true RU2636464C2 (ru) | 2017-11-23 |
Family
ID=58873985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015150091A RU2636464C2 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Способ получения и использования тканеинженерных конструкций на основе прогениторных клеток для лечения заболеваний сердца |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2636464C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2747087C1 (ru) * | 2020-08-31 | 2021-04-26 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Способ производства биокомпозитных сфероидов для восстановления костной ткани |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1421341A1 (ru) * | 1985-06-26 | 1988-09-07 | Сочинский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии | Способ лечени ишемической болезни сердца |
| WO2008054819A2 (en) * | 2006-11-02 | 2008-05-08 | The General Hospital Corporation | Cardiovascular stem cells, methods for stem cell isolation, and uses thereof |
| WO2013151755A1 (en) * | 2012-04-04 | 2013-10-10 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Systems and method for engineering muscle tissue |
| RU2542964C1 (ru) * | 2013-08-22 | 2015-02-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения прогениторных клеток миокарда |
-
2015
- 2015-11-23 RU RU2015150091A patent/RU2636464C2/ru active IP Right Revival
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1421341A1 (ru) * | 1985-06-26 | 1988-09-07 | Сочинский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии | Способ лечени ишемической болезни сердца |
| WO2008054819A2 (en) * | 2006-11-02 | 2008-05-08 | The General Hospital Corporation | Cardiovascular stem cells, methods for stem cell isolation, and uses thereof |
| WO2013151755A1 (en) * | 2012-04-04 | 2013-10-10 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Systems and method for engineering muscle tissue |
| RU2542964C1 (ru) * | 2013-08-22 | 2015-02-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения прогениторных клеток миокарда |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Garzoni LR et al. "Fibrosis and hypertrophy induced by Trypanosoma cruzi in a three-dimensional cardiomyocyte-culture system", J Infect Diss. 2008; 197(6): 906-915. Miklas JW et al. "Bioreactor for modulation of cardiac microtissue phenotype by combined static stretch and electrical stimulation", Biofabrication. 2014; 6(2):024113. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2747087C1 (ru) * | 2020-08-31 | 2021-04-26 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Способ производства биокомпозитных сфероидов для восстановления костной ткани |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015150091A (ru) | 2017-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2793046C (en) | Method for the isolation and expansion of cardiac stem cells from biopsy | |
| Leor et al. | Bioengineered cardiac grafts | |
| Duan et al. | Hybrid gel composed of native heart matrix and collagen induces cardiac differentiation of human embryonic stem cells without supplemental growth factors | |
| Jing et al. | Stem cells for heart cell therapies | |
| Hasan et al. | Engineered biomaterials to enhance stem cell‐based cardiac tissue engineering and therapy | |
| EP2274419B1 (en) | Methods for producing hair microfollicles and de novo papillae and their use for in vitro tests and in vivo implantations | |
| US9867854B2 (en) | Therapeutic method using cardiac tissue-derived pluripotent stem cells | |
| Buikema et al. | Concise review: engineering myocardial tissue: the convergence of stem cells biology and tissue engineering technology | |
| Ye et al. | Strategies for tissue engineering cardiac constructs to affect functional repair following myocardial infarction | |
| Dergilev et al. | Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs | |
| Forte et al. | Human cardiac progenitor cell grafts as unrestricted source of supernumerary cardiac cells in healthy murine hearts | |
| Wang et al. | Recent progress in induced pluripotent stem cell-derived 3D cultures for cardiac regeneration | |
| JP2017538411A (ja) | 組織適用におけるｌｇｒ４、ｌｇｒ５およびｌｇｒ６発現上皮幹細胞を用いた最小限分極機能性細胞微細凝集塊単位の開発および使用のための方法 | |
| Munderere et al. | The progress of stem cell therapy in myocardial-infarcted heart regeneration: cell sheet technology | |
| Zimmermann | Remuscularizing failing hearts with tissue engineered myocardium | |
| RU2636464C2 (ru) | Способ получения и использования тканеинженерных конструкций на основе прогениторных клеток для лечения заболеваний сердца | |
| CN102822331A (zh) | 提高人干细胞活性的方法 | |
| US10149865B2 (en) | Method for preparing a biological tissue construct and use of autologous cells obtained specifically | |
| US20080241111A1 (en) | Pluripotent Stem Cell Derived from Cardiac Tissue | |
| US20230087578A1 (en) | Device and methods for engineering 3d complex tissues | |
| Dai et al. | Tissue engineering approaches to heart repair | |
| JP2023542154A (ja) | 心臓分化を受けているヒト細胞を含む細胞微小区画、当該微小区画から得られた組織、及びそれらの使用 | |
| Ma et al. | Myocardial patch formation by three-dimensional 3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate cultured with mouse embryonic stem cells | |
| Odedra et al. | Cardiac tissue engineering | |
| Prakash et al. | Stem cell bioengineering and tissue engineering microenvironment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181124 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20191210 |