RU2635993C1 - Композиция убихинола для парентерального введения и способ её получения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, в частности к композиции убихинола для инъекционного введения и способу ее получения. Композиция убихинола предназначена для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы и включает лекарственное вещество (убихинол), поверхностно-активные вещества, антиоксиданты (прямые и косвенные) и растворители, разрешенные для парентерального введения. Предложенная композиция и способ позволяет получать стабильный при хранении раствор убихинола, пригодный для инъекционного введения. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 24 пр.

Description

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и медицине и описывает композицию и способ получения убихинола для инъекционного введения, включающую лекарственное вещество (убихинол), поверхностно-активные вещества, антиоксиданты (прямые и косвенные) и растворители, разрешенные для парентерального введения, и предназначенную для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, особенно в острой фазе. Предложенная композиция позволяет получать стабильный при хранении раствор убихинола, пригодный для инъекционного введения.

Коэнзим Q10 (Q10) относится к группе жирорастворимых бензохинолов, участвует в выработке энергии во всех клетках организма. Коэнзим Q10 является коферментом системы тканевого дыхания митохондрий, участвует в процессах биологического окисления и производства АТФ, как переносчик электронов, сопрягающий процессы электронного транспорта и окислительного фосфорилирования. Это единственный жирорастворимый антиоксидант, способный синтезироваться в организме человека и животных, а также постоянно регенерировать из окисленной формы с помощью ферментных систем. Отношение восстановленной формы - убихинола к окисленной форме - убихонону рассматривается как один из важных показателей состояния антиоксидантной системы, этот коэффициент у здоровых людей составляет 3,7±1,3% [Ключников C.O., Гнетнева Е.С. Убихинон (Коэнзим 10): теория и клиническая практика // Педиатрия. 2008. Т 87. №3. 103-110]. Непосредственное (прямое) антиоксидантное действие коэнзима Q10 заключается в улавливании свободных радикалов и связано главным образом с восстановленной формой кофермента [Siemieniuk Е., Skrzydlewska Е. Coenzyme Q10: its biosynthesis and biological signifi cance in animal organisms and in humans // Postepy Hig. Med. Dosw. (online), 2005. 59. 150-159; Медведев O.C. Замедление процессов старения: в фокусе коэнзим Q10 // Трудный пациент. 2012. №4. Т. 10. 50-58]. Клинически и экспериментально установлено, что уровень коэнзима-Q10 в тканях резко снижен при сердечно-сосудистых заболеваниях [Molyneux S.L., Florkowsky С.М., George P.M. et al. Coenzyme Q10: an independent predictor of mortality in chronic heart failure // J. Am. Coll. Cardiol. 2008. 52(18). 1435-1441; Медведев O.C., Каленикова Е.И., Городецкая E.A. др. Коэнзим Q10 в кардиологической практике - теоретические основы и результаты клинических исследовании // Рус. Мед. Журн. 2009. 18. С. 1177-1181]. Для окисленной формы коэнзима Q10 доказаны противоишемические, кардиопротективные и антигипертензивные свойства [Kumar A., Kaur Н., Devi P. et al. Role of coenzyme Q10 (CoQ10) cardiac disease, hypertension and Meniere-like syndrome // Pharmacol. Ther. 2009. 124. 259-268; Ivanov A., Gorodetskaya E., Kalenikova E. et al. Single intravenous injection of CoQ10 reduces infarct size in a rat model of ischemia and reperfusion injury // World Journal of Cardiovascular Diseases. 2013. 3. 1-7; Ivanov A., Tokareva O., Gorodetskaya E. et al. Cardioprotection with Intravenous Injection of Coenzyme Q10 is limited by Time of Administration after Onset of Myocardial Infarction in Rats // J. Clin. Exp. Cardiolog. 2014, 5(4)]. Показана эффективность применения коэнзима Q10 в комплексной терапии сердечной недостаточности [Mortensen S.A. Overview of coenzyme Q10 as adjunctive therapy in chronic heart failure. Rationale, design and end-points of «Q-symbio» - a multinational trial // Biofactors. 2003. №18. P. 79-89.], атеросклероза [Панкин В.З., Капелько В.И., Руге Э.К. и др. Коэнзим Q10: физиологическая функция и перспективы использования в комплексной терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы. Пособие для врачей. - М.: Медпрактика-М. 2008. С. 22.], кардиомиопатии [Langsjoen Р.Н., Langsjoen A., Willis R., Folkers K. Treatment of hypertrophic cardiomyopathy with coenzyme Q10 // Molecular Aspects of Medicine. 1997. №18. P. 145-151]. Клинические испытания показали, что применение восстановленной формы коэнзима Q10 повышает его уровень в крови в несколько раз более эффективно, чем использование его окисленной формы [Yamashita S., Yamamoto Y. Simultaneous detection of ubiquinol and ubiquinone in human plasma as a marker of oxidative stress // Analytical biochemistry. 1997. T. 250. №. 1. C. 66-73]. Учитывая, что заболевания сердечно-сосудистой системы, особенно в острой фазе, требуют быстрого достижения терапевтического эффекта, актуально создание препаратов восстановленного коэнзима Q10 для инъекционного введения.

Существует композиция для инъекционного введения, содержащая 6-декапренил-2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинон (убихинон, окисленная форма коэнзима Q10), способ получения которой заключается в том, что определенные количества неионогенного поверхностно-активного вещества и антиоксиданта смешивают, нагревают их до 40-120°C, растворяют в полученном растворе необходимые количества 6-декапренил-2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинона и полученную смесь при интенсивном перемешивании приливают в предварительно нагретый до 30-100°C изотонический раствор с последующей стерилизацией полученной композиции. Предлагаемое изобретение позволяет получать водно-масляные эмульсии, содержащие 6-декапренил-2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинон, для инъекционного введения в организм [Патент RU 2359665, опубликовано 27.06.2009]. Недостатком данного изобретения является использование коэнзима Q10 в окисленной форме, а не в восстановленной форме, способ получения композиции предполагает использование высоких температур, что нежелательно при работе с легкоокисляющимися субстанциями, кроме того готовая форма представляет собой эмульсию, которая имеет свойство расслаиваться и прогоркать.

Существует наноэмульсионная композиция, подходящая для различных путей введения, в том числе внутривенного, содержащая от 5 до 20% коэнзима Q10, от 1 до 5% этанола, от 1 до 5% лецитина, от 20 до 30% каприк/каприлик триглицерида или растительного масла, от 10 до 20% глицерина, от 1 до 15% сорастворителей. Состав наноэмульсии в соответствии с изобретением может улучшить стабильность и биодоступность коэнзима Q10 [Патент US 8372395, опубликовано 12.02.2013]. Недостатком данной композиции является использование коэнзима Q10 в окисленной форме, а также использование значительного количества вспомогательных веществ для создания стабильной наноэмульсии.

Известен способ получения биологически активной порошковой субстанции в форме достаточно стабильных молекулярных комплексов включения восстановленного коэнзима Q10 в бета-циклодекстрине с размерами частиц до 70-100 мкм, обладающую в 10 раз меньшей способностью к окислению по сравнению со свободным восстановленным коэнзимом Q₁₀ и легко переходящую в водном растворе в солюбилизированную форму с размерами частиц 200-700 нм. Эти молекулярные комплексы способны к солюбилизации в воде и являются более стабильными (защищены от окисления) по сравнению с нерастворимым в воде и быстро окисляющимся свободным восстановленным коэнзимом Q₁₀ [Патент RU 2509760, опубликовано 20.03.2014]. Недостатком этого способа является получение комплекса включения убихинола с достаточно большим размером частиц, которые невозможно использовать для внутривенного введения. Кроме того известно, что частицы с размерами более 300 нм недостаточно эффективно проникают в клетки, что снижает терапевтическую эффективность композиции.

Известен состав, подходящий для парентерального применения гидрофобных активных агентов, таких как коэнзим Q10. Описан способ его получения и метод лечения онкологических заболеваний. Для этого гидрофобный активный агент диспергируют с образованием коллоидной дисперсии наночастиц с добавлением по крайней мере одного из стабилизатора дисперсии и опсонизирующего вещества. Способ получения включает диспергирование гидрофобного активного агента путем гомогенизации под высоким давлением при температуре 65°C на водяной бане с использованием микрофлюидизатора. Коллоидная нанодисперсия имеет средний размер частиц менее 200 нм [Заявка на патент US 20110229554, опубликовано 22.09.2011]. Недостатком этого способа является использование коэнзима Q10 в окисленной, а не восстановленной форме, что снижает терапевтическую эффективность средства. Кроме того в данном способе описано использование высокотехнологичного оборудования для получения нанодисперсии.

Известен способ получения липосомального раствора восстановленной формы коэнзима Q10, включающий коэнзим Q10 в восстановленной форме, соевый лецитин и поверхностно-активные вещества, Раствор предназначен для использования при различных путях введения, включая инъекционный [Патент EP 1386905, опубликовано 26.09.2012]. Недостатком данного изобретения является сложности получения липосом, связанные с их производством, а также нестабильность при длительном хранении, т.к. липосомальные суспензии представляют собой термодинамически нестабильные коллоидные системы. Еще одним недостатком липосомальных композиций является то, что попадая в системный кровоток, липосомы могут поглощаться макрофагами, что не позволяет достичь специфического эффекта липосомальной лекарственной формы.

Известна липосомальная композиция 6-декапренил-2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинона для трансдермального, перорального и инъекционного введения, содержащая дополнительно поверхностно-активные вещества [Заявка на патент WO 9835660, опубликовано 20.08.1998]. Недостатком композиции является использование коэнзима Q10 в окисленной форме, что снижает биологическую эффективность предложенного средства.

Известна стабильная и нетоксичная композиция коэнзима Q10, пригодная для внутривенного введения, обеспечивающая клинически эффективные уровни действующего вещества в крови. Композиция представляет собой эмульсию, в которой коэнзим Q10 растворен в масляной фазе - растительном масле (кукурузное, арахисовое, сафлоровое, оливковое или соевое масло). Недостатком композиции является использование коэнзима Q10 в окисленной форме, что снижает биологическую эффективность предложенного средства [Заявка на патент US 4824669, опубликовано 25.04.1989].

Таким образом, большинство из вышеперечисленных инъекционных лекарственных форм коэнзима Q10, содержат в качестве биологически активной субстанции окисленную форму - убихинон. Это, по-видимому, связано с тем, что убихинол представляет собой крайне реакционноспособное гидрофобное соединение, склонное к быстрому окислению при контакте с кислородом воздуха, что создает определенные трудности при разработке препаратов на его основе. Однако такой подход ведет к снижению терапевтического действия предлагаемых препаратов, т.к. именно с восстановленной формой коэнзима Q10 связано его антиоксидантное действие. Кроме того предложенные лекарственные формы представляют собой в основном эмульсии и липосомальные суспензии, которые имеют ряд недостатков, таких как невысокая стабильность при хранении, необходимость использования при производстве высокотехнологичного оборудования, а также, в ряде случаев, данные системы имеют достаточно большой размер частиц не позволяющий использовать композиции для внутривенного введения.

Наиболее близкой к предложенному решению является композиция для парентерального применения 6-декапренил-2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинона для инъекций, содержащая 0,2-15% 6-декапренил-2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинона, 0,2-40% солюбилизирующего агента и 45-99,6% воды. Композиция обладает высокой биодоступностью, быстротой действия и точностью дозирования [Патент RU 2433820, опубликовано 20.11.2011]. Недостатком этого изобретения является использование коэнзима Q10 в окисленной, а не в восстановленной форме, кроме того композиция предполагает использование достаточно большого количества солюбилизирующего агента, что может быть неприемлемо для композиций вводимых внутривенно.

Задачей настоящего изобретения является создание стабильной композиции инъекционной восстановленной формы коэнзима Q10 - убихинола для инъекций, подходящей как для внутримышечного, так и для внутривенного введения.

Поставленная задача решена созданием композиции убихинола для инъекций с содержанием действующего вещества 0,1-1%, в состав которого входит по крайней мере один солюбилизирующий агент, имеющий значение ГЛБ в интервале 10-18, выбранный из группы неионогенных ПАВ, в количестве 1-12% или их смесь, антиоксиданты (прямые и/или косвенные) в количестве 0,05-0,2% и вода для инъекций или изотонические растворы в количестве 98,85-86,8%.

В качестве солюбилизирующих компонентов в предлагаемой композиции могут быть использованы неионогенные ПАВ со значением ГЛБ в интервале 10-18, разрешенные для применения в инъекционных лекарственных формах, такие как коллифор ELP, коллифор HS15, твин-20, твин-80 и их смеси, а также аналогичные по свойствам ПАВ. Неионогенные ПАВ не оказывают раздражающего действия, повышают резорбцию лекарственных препаратов, устойчивы к воздействию кислот, щелочей и солей, хорошо смешиваются с органическими растворителями и совместимы с большинством лекарственных веществ.

В композиции в качестве прямого антиоксиданта использованы гидрофильные антиоксиданты, представляющие собой сильные восстановители, разрешенные для стабилизации инъекционных растворов (кислота аскорбиновая, натрия сульфит, натрия метабисульфит и др.). В качестве косвенного антиоксиданта использованы комплексообразователи, разрешенные для стабилизации инъекционных растворов (этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль, тетацин, унитиол и др.).

Препарат убихинола дополнительно может содержать водорастворимые сорастворители (спирт этиловый, низкомолекулярный поливинилпирролидон, 1,2-пропиленгликоль, низкомолекулярные полиэтиленгликоли, глицерин и др.), регуляторы pH и осмотического давления (неорганические соли, растворы кислот и др.).

Раствор убихинола согласно настоящему изобретению получают следующим образом: убихинол (0,1-1%) смешивают с солюбилизаторами и прямыми антиоксидантами при температуре 50-60°C, к полученной смеси частями добавляют воду для инъекций или изотонические растворы с растворенными в них косвенными антиоксидантами. pH полученных растворов лежит в диапазоне от 3 до 8, что допустимо для лекарственных форм, предназначенных для внутривенного, внутримышечного и подкожного введения.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1 представляет ингибирование образования свободнорадикальных интермедиатов: 1 - контроль (реакционная среда без добавок); 2 - в присутствии 12,5 мкМ убихинола; 3 - в присутствии 5 мкМ α-токоферола.

Фиг. 2 - Влияние убихинола на генерирование свободного радикала (семихинона) спиновой ловушки TIRON в условиях ферментативной генерации супероксида (система ксантин-ксантиноксидаза). На панелях А и Б первый спектр сверху регистрирует максимальный уровень семихинона TIRON без добавки препарата (8 мин инкубации реакционной среды в условиях аэрации). А - Влияние убихинола в концентрации 1 мМ. Б - Влияние убихинола в концентрации 2 мМ.

Фиг. 3 - Влияние различных концентраций убихинола на кинетику окисления дигидрородамина 123 под действием пероксинитрита.

По оси абсцисс - время, с; по оси ординат - изменение концентрации дигидрородамина.

Фиг. 4 - Зависимость времени задержки сигнала ЭПР TIRON от концентрации убихинола в инкубационной смеси. По оси абсцисс - концентрация убихинола, мМ; по оси ординат - задержка времени сигнала, с.

Фиг. 5 - Влияние убихинола на значение амплитуды зубца ST.

По оси абсцисс - время после индукции патологии; по оси ординат - значение амплитуды зубца ST, мкВ.

* Статистические значимое отличие амплитуды ST от контрольной группы через 24 ч после реперфузии миокарда (p<0,05), критерий Тьюки.

Фиг. 6 - Влияние убихинола на площадь поражения миокарда

По оси абсцисс - группа животных; по оси ординат - площадь поражения миокарда, %.

* Статистические значимое отличие от контрольной группы (p<0,05), критерий Тьюки.

В качестве примеров описано создание композиций содержащих в качестве активного компонента восстановленный коэнзим Q10 (убихинол).

ПРИМЕРЫ

Пример 1. В предварительно нагретую до 55°C смесь коллифора ELP (8,0 г) и твина-20 (4,0 г) добавляют кислоту аскорбиновую (0,1 г), затем добавляют убихинол (1,0 г), перемешивают при нагревании до получения прозрачного раствора. В изотоническом растворе натрия хлорида (86,9 мл) растворяют трилон Б (0,05 г), раствор нагревают до 55°C и частями при перемешивании и нагревании добавляют к раствору убихинола в смеси ПАВ. После охлаждения объем раствора доводят до 100 мл изотоническим раствором натрия хлорида. pH полученного раствора 3,3.

Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации (фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм) в токе азота, затем в асептических условиях разливают в ампулы коричневого стекла.

Пример 2. Следовали методике примера 1, но вместо твина-20 использовали твин-80. pH полученного раствора 3,3.

Пример 3. В предварительно нагретую до 55°C смесь коллифора ELP (8,0 г), твина-20 (2,0) и спирта этилового (5 мл) добавляют кислоту аскорбиновую (0,1 г), затем добавляют убихинол (1,0 г), перемешивают при нагревании до получения прозрачного раствора. В воде для инъекций (82 мл) растворяют трилон Б (0,05 г), раствор нагревают до 55°C и частями при перемешивании и нагревании добавляют к раствору убихинола в смеси ПАВ. После охлаждения объем раствора доводят до 100 мл изотоническим раствором натрия хлорида. pH полученного раствора 3,2.

Пример 4. Следовали методике примера 3, но вместо коллифора ELP использовали коллифор HS15. pH полученного раствора 3,4.

Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации (фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм) в токе азота, затем в асептических условиях разливают в ампулы коричневого стекла.

Пример 5. Следовали методике примера 1, но вместо изотонического раствора натрия хлорида использовали воду для инъекций с растворенными в ней натрия хлоридом (0,602%), калия хлоридом (0,037%), кальция хлоридом (0,0294%), натрия лактатом (0,6276%) с добавлением хлористоводородной кислоты до pH 5,5-6,3 (раствор Хартмана). pH полученного раствора 4,2.

Пример 6. Следовали методике примера 1, но вместо изотонического раствора натрия хлорида использовали воду для инъекций с растворенными в ней натрия хлоридом (0,86%), калия хлоридом (0,03%), кальция хлоридом (0,033%), (раствор Рингера для инфузий) pH полученного раствора 3,5.

Пример 7. Следовали методике примера 1, но вместо изотонического раствора натрия хлорида использовали воду для инъекций с растворенными в ней натрия хлоридом (0,5%), калия хлоридом (0,1%) и натрия гидрокарбонатом (0,4%) (раствор Трисоль для инфузий). pH полученного раствора 7,3.

Пример 8. Следовали методике примера 1, но вместо изотонического раствора натрия хлорида использовали воду для инъекций с растворенными в ней натрия хлоридом (0,6%), калия хлоридом (0,03%), магния хлоридом (0,012%), натрия фумаратом (1,4%) (раствор Мафусол для инфузий). pH полученного раствора 5,4.

Пример 9. Следовали методике примера 1, но вместо изотонического раствора натрия хлорида использовали воду для инъекций с растворенными в ней повидоном 8000 (6,0%), натрия хлоридом (0,55%), калия хлоридом (0,042%), магния хлоридом (0,0005%), кальция хлоридом (0,05%), натрия гидрокарбонатом (0,023%) (раствор Красгемодез для инфузий). pH полученного раствора 4,0.

Пример 10. Оценка стабильности растворов

Оценивали стабильность растворов, приготовленных по методикам, описанным в примерах 1-9.

Стабильность оценивали визуально, а также контролировали количественное содержание действующего вещества, примесей в образцах, цветность растворов при хранении в естественных условиях (20°C) в течение 12 месяцев. Внешний вид, количество действующих веществ и примесей, цветность растворов в процессе хранения не изменились.

Пример 11. Фармакокинетические свойства при однократном внутривенном введении.

Изучение фармакокинетики средства, приготовленного по примеру 1, проводили на взрослых крысах-самцах Wistar при его однократном внутривенном введении в трех дозах - 5, 10 и 20 мг/кг. Для каждой дозы было использовано по 6 животных, отбор крови проводили через 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48 ч. Количественный анализ коэнзима Q₁₀ в плазме проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием. Установлено, что кинетические кривые «ln концентрация-время» имеют биэкспоненциальный характер. Первая короткая фаза, по-видимому, соответствует распределению препарата в сильно васкуляризированные органы, вторая фаза связана главным образом с процессом накопления и депонирования препарата в печени. Площадь под фармакокинетической кривой (AUC_{0→48 ч}) статистически значимо увеличивается с увеличением дозы убихинола. Время полувыведения препарата для трех доз составляло 8-9 часов, общий клиренс, отражающий объем ткани, освобождающийся от фармакологического средства в единицу времени с увеличением дозы снижается (таблица 1). Проверку гипотезы линейности проводили, анализируя кривые «концентрация-время», нормированные относительно дозы, полученные результаты свидетельствуют о нелинейности фармакокинетики препарата в изучаемом диапазоне доз.

Пример 12. Изучение антиоксидантного действия на модели перекисного окисления липидов (ПОЛ) в липосомах. Антиоксидантное действие средства, приготовленного по примеру 1, исследовали на модели перекисного окисления липидов (ПОЛ) в липосомах из яичного фосфатидилхолина. Для инициации ПОЛ использовали азоинициатор 2,2'-азобис(2-метилпропионитрил). Для регистрации люминол-зависимой хемилюминесценции в ходе перекисного окисления липосом использовали отечественный люминометр Lum-5773 (люминол-зависимая хемилюминесценция отражает кинетику образования свободнорадикальных интермедиатов при перекисном окислении липидов). Снижение уровня свободнорадикальных интермедиатов ПОЛ под действием средства наблюдали в широком диапазоне концентраций от 2,5 до 500 мкМ. Зависимость ингибирования ПОЛ от концентрации носит нелинейный характер, максимальный антиоксидантный эффект наблюдается при концентрации убихинола равной 12,5 мкМ, люминол-зависимая хемилюминесценция при данной концентрации убихинола составляла только 16.8±3.6% от контроля, близкий уровень ингибирования ПОЛ наблюдался под действием 5 мкМ α-токоферола (Фиг. 1). При более высоких концентрациях антиоксидантное действие убихинола снижалось.

Пример 13. Изучение взаимодействия убихинола с супероксидными радикалами, образующимися в системе ксантин-ксантиноксидаза методом ЭПР-спектроскопии.

Регистрацию спектров ЭПР проводили на малогабаритном автоматизированном спектрометре ESR 70-03 XD/2 УП «КБСТ» БГУ (Беларусь) при комнатной температуре. Во время регистрации спектров ЭПР суспензия реакционная смесь (80 мкл) находилась в газопроницаемом капилляре PTFE 22 фирмы «Zeus Industrial Products, Inc.» (США). Через кварцевую трубку, в которой находился капилляр, продувалась газовая смесь постоянного состава, что позволяло контролировать парциальное давление кислорода в реакционной смеси. В качестве спиновой ловушки супероксидного анион-радикала использовали TIRON (4,5-диоксибензол-1,3-дисульфонат). В состав среды для ферментативной генерации супероксида входили: 1 мМ TIRON, ксантиноксидаза (0,6 ед/мл) и 4 мМ ксантина.

При концентрации убихинола в реакционной среде 1 мМ сигнал ЭПР семихинона возникает через 4 мин инкубации и далее постепенно возрастает, при этом оставаясь существенно ниже, чем в контроле. В концентрации 2 мМ убихинол практически полностью ингибирует супероксид-зависимую генерацию свободного радикала TIRON в течение 8 мин инкубации ферментативной системы (Фиг. 2).

Пример 14. Изучение взаимодействия с пероксинитритом

Пероксинитрит (ONOO^-) является сильным окислителем, он способен вызывать повреждения широкого спектра молекул в клетке, в том числе ДНК и белков. Образование пероксинитрита in vivo происходит в результате взаимодействия супероксид-иона и оксида азота.

Изучение взаимодействия средства, приготовленного по примеру 1, с пероксинитритом проводили в реакционной среде, содержащей 0,4 мМ дигидрородамина 123 и 0,4 мМ SIN-1(3-морфолинсиднонимин) в 10 мМ К,Na-фосфатном буфере (pH 7,4). Реакция образования ONOO^- инициировалась добавлением раствора SIN-1 в кювету спектрофотометра. Далее регистрировалось оптическое поглощение при 500 нм (максимум соответствует родамину 123 - продукту окисления дигидрородамина 123). Измерения проводились на спектрофотометре Varian Cary 300Bio (США). Соединения, перехватывающие пероксинитрит, влияют на кинетику образования родамина 123, что позволяет оценивать их антиоксидантные свойства в отношении активных форм азота.

Установлено, что раствор убихинола дозозависимо ингибирует образование родамина 123. В концентрации выше 64 мкМ исследуемый препарат практически полностью ингибирует этот процесс (фиг. 3).

Пример 15. Изучение влияния препарата на функциональное состояние митохондрий.

Дыхание митохондрий (суспензия митохондрий с содержанием белка 40-70 мг/мл была получена гомогенизацией сердец нормотензивных крыс Wistar) изучали после 30 мин преинкубации с различными концентрациями исследуемого препарата: препарат добавляли к 50-60 мкл суспензии митохондрий из расчета 0,05-10 мкг действующего вещества на мг белка митохондрий. При исследовании образования свободных радикалов кислорода различные концентрации препарата вносили в среду инкубации непосредственно перед добавлением митохондрий. Скорость поглощения кислорода измеряли с помощью электрода Кларка и полярографа YSI 53 (Yellow Spring Instruments Inc., США). Регистрацию и анализ спектров ЭПР проводили на малогабаритном автоматизированном спектрометре ESR 70-03 XD/2 УП «КБСТ» БГУ (Беларусь). Концентрацию кислорода непосредственно в реакционной смеси определяли по ширине компонент спектра ЭПР нитроксильного радикала TEMPONE-¹⁵N-D₁₆ (4-оксо-2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-D₁₆-1-оксил-¹⁵N). В качестве спиновой ловушки использовали TIRON (4,5-диоксибензол-1,3-дисульфонат). Абсолютные значения скорости образования супероксидных радикалов вычисляли с помощью супероксид-генерирующей системы ксантин-ксантиноксидаза, кинетические характеристики которой определяли по скорости восстановления цитохрома C супероксидными радикалами. Измерения оптических спектров проводили на спектрофотометре Cary 60 фирмы «Agilent» (Австралия).

Установлено, что инкубация митохондрий с препаратом в концентрации 0.0005-1 мкг действующего вещества/мг белка не приводила к снижению эффективности окислительного фосфорилирования. Достоверное снижение дыхательного контроля происходило лишь при существенном увеличении концентрации препарата: инкубация митохондрий с убихинолом в концентрации 10 мкг/мг вызывала уменьшение дыхательного контроля на 34%.

Результаты по подавлению сигнала ЭПР семихинонов TIRON^- (фиг. 4) показывают, что в условиях опытов с изолированными митохондриями раствор убихинола является эффективным антиоксидантом, успешно конкурирующим со спиновой ловушкой TIRON.

Пример 16. Оценка кардиопротекторного действия in vivo.

Для моделирования ишемии-реперфузии миокарда использовали лигирование левой коронарной артерии на нить с ослаблением лигатуры через 40 минут после начала ишемии. В качестве тест-системы, как наиболее оптимальной биологической модели для изучения патологий сердечно-сосудистой системы, были использованы самцы аутбредных крыс в возрасте 15-17 недель.

В качестве критериев оценки действия препаратов использовали измерение ЭКГ (элевация сегмента ST) через 40 минут и 24 часа и определение биохимических показателей крови через 4 и 24 часа после формирования патологии. Гистохимически оценивали площадь повреждения миокарда.

На фоне моделирования патологии было отмечено наличие площади поражения миокарда (при гистохимическом исследовании), достоверное увеличение биохимических показателей, элевации сегмента ST.

При оценке биохимических показателей крови животных через 4 часа после формирования патологии, достоверное, по сравнению с контролем, снижение уровня КК было выявлено у групп животных, получавших средство по примеру 1 л ЛФ в дозе 1 и 3 мг/кг, Убихинон в дозе 3 мг/кг и Мексидол. Тенденции к снижению уровня КК были выявлены у групп животных, получавших Убихинол ЛФ в дозе 1 и 3 мг/кг, и препарат сравнения Милдронат. Уровень NO у групп животных, получавших Убихинол и его липосомальную форму в дозах 1 и 3 мг/кг, Милдронат и Мексидол был достоверно ниже уровня контрольной группы. Выявленные отличия говорят о наличие у препаратов кардиопротекторного действия.

По результатам оценки данных ЭКГ было отмечено влияние средства по примеру 1 дозах 3 и 9 мг/кг на элевацию ST через 40 минут после формирования ишемии миокарда (фиг. 5).

При проведении гистохимического анализа наименьший процент ишемического повреждения миокарда от общей площади срезов сердца наблюдался у животных после введения средства по примеру 1 в дозе 3 мг/кг (фиг. 6).

Таким образом, средство в виде водного раствора на основе убихинола в дозе 3 мг/кг эффективно для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, особенно в острой фазе.

Пример 17. Следовали методике примера 1, но вместо кислоты аскорбиновой добавляли натрия сульфит (0,15 г). рН полученного раствора 4,5.

Пример 18. Следовали методике примера 1, но вместо кислоты аскорбиновой добавляли натрия метабисульфит (0,075 г). рН полученного раствора 4,4.

Пример 19. Следовали методике примера 3, но вместо трилона Б добавляли тетацин (0,05 г). рН полученного раствора 3,2.

Пример 20. Следовали методике примера 3, но вместо трилона Б добавляли унитиол (0,2 г). рН полученного раствора 3,4.

Пример 21. Следовали методике примера 1, но вместо спирта этилового использовали пропиленгликоль-1,2 (6,5 г). рН полученного раствора 6,4.

Пример 22. Следовали методике примера 2, но вместо спирта этилового использовали полиэтиленгликоль низкомолекулярный (5,0 г). рН полученного раствора 6,3.

Пример 23. Следовали методике примера 3, но вместо спирта этилового использовали глицерин (5,0 г). рН полученного раствора 7,0.

Пример 24. Следовали методике примера 2, но вместо спирта этилового использовали низкомолекулярный поливинилпирролидон (3,0 г). рН полученного раствора 6,4.

Claims (10)

1. Композиция убихинола для инъекций, содержащая 0,1-1% активного компонента, 1-12% солюбилизирующих агентов, 1-7% сорастворителей, 0,05-0,2% антиоксидантов и 97,85-79,80% воды и предназначенная для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы.

2. Композиция по п. 1, для создания которой солюбилизирующий агент выбирают из группы неионогенных поверхностно-активных веществ со значением ГЛБ от 10 до 18 - твин-80, твин 20, коллифор ELP и коллифор HS15 и их смеси.

3. Композиция по п. 1, для создания которой антиоксиданты выбирают из группы прямых гидрофильных антиоксидантов и косвенных антиоксидантов - комплексообразователей.

4. Композиция по п. 1, для создания которой в качестве прямого гидрофильного антиоксиданта выбрана кислота аскорбиновая или натрия сульфит, или натрия метабисульфит.

5. Композиция по п. 1, для создания которой в качестве косвенного антиоксиданта выбрана этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль или тетацин, или унитиол.

6. Композиция по п. 1, в которой в качестве сорастворителя используют спирт этиловый, низкомолекулярный поливинилпирролидон, 1,2-пропиленгликоль, низкомолекулярные полиэтиленгликоли или глицерин.

7. Композиция по п. 1, в которой рН раствора лежит в области 3,0-8,0.

8. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве вспомогательных компонентов используют регуляторы рН и осмотического давления, разрешенные для инъекционных лекарственных форм.

9. Способ получения композиции убихинола по п. 1, отличающийся тем, что убихинол смешивают с солюбилизирующим агентом, сорастворителем и прямыми антиоксидантами при нагревании (температура 50-60°C), затем диспергируют с водой или изотоническими растворами, в которых растворен косвенный антиоксидант.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что водный раствор убихинола согласно изобретению подвергают стерилизующей фильтрации в асептических условиях в токе азота.

Images