RU2632459C2 - Устройство для микроструктурированной прививки белков на подложке - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области микроструктурированной прививки белков на подложке и способу микроструктурированной прививки белков, использующему такое устройство. Устройство содержит подложку, пленку, содержащую полиэтиленгликоль и расположенную на подложке, матрицу для распространения света в соответствии с первым структурированным рисунком и для замены первого структурированного рисунка вторым структурированным рисунком, источник света для освещения матрицы, оптическую систему для формирования на пленке первого микроструктурированного изображения первого структурированного рисунка, первый резервуар для вмещения первого водного раствора, содержащего первое средство прививки и первый белок, второй резервуар для вмещения второго водного раствора, содержащего второе средство прививки и второй белок, и микрожидкостный контур для содержания первого водного раствора, содержащий отверстие для приведения в контакт первого водного раствора с пленкой у отверстия. При этом микрожидкостный контур выполнен с возможностью заполнения первым водным раствором для приведения в контакт первого водного раствора и пленки, причем первое микроструктурированное изображение первого структурированного рисунка формируется на пленке посредством источника света для фотопечати первого белка на пленке, и микрожидкостный контур выполнен с возможностью замены первого водного раствора вторым водным раствором для приведения в контакт второго водного раствора и пленки, причем первый структурированный рисунок заменяется вторым рисунком для фотопечати второго белка на пленке. Изобретение обеспечивает быструю и качественную печать нескольких белков на одной и той же подложке. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится в целом к области прививки белков на подложке в соответствии с разными рисунками и разными концентрациями или к печати белков, причем печать получают путем фотохимической прививки. Изобретение относится, в частности, к области фотохимической прививки множества, то есть, по меньшей мере двух, белков на подложке, автоматизированным способом или способом, который может быть автоматизирован.

Белок в контексте настоящей заявки является биологической макромолекулой, состоящей из большого числа аминокислотных цепей, соединенных между собой пептидными связями. Белок объединяет большое число аминокислот, в отличие от пептидов или олигопептидов, которые содержат их в незначительном числе. Белки обеспечивают функции живых клеток.

Размещение на подложке напечатанных пленок или поверхностных слоев белков в различных концентрациях и конфигурациях или по различным рисункам важно в исследованиях живых клеток in vitro, вне живого организма, так как это позволяет воссоздавать такое сложное окружение белков, какое желательно, делая все менее нужными опыты in vivo, в частности, на животных.

Так, согласно уровню техники желательно иметь средства печати белков, которые были бы универсальными или способными создавать на подложке любой рисунок или шаблон (pattern), исходя из растворов белков, или ДНК, или биологических молекул с заданной концентрацией, например, содержащихся в сосудах.

Желательно также, чтобы в промышленном масштабе можно было напечатать множество белков так же просто, как один белок.

ОПИСАНИЕ УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Решения, предусматриваемые в известном уровне техники для фотохимической печати одного или нескольких белков на одной и той же подложке, имеют существенные ограничения, которые препятствуют их промышленному применению.

Фотохимическая печать состоит в химической прививке или фиксации молекул на поверхности, избирательно в освещаемых зонах поверхности, путем фотоиндуцированной адгезии.

Так, одно средство фотохимической печати или прививки согласно уровню техники состоит обычно из подложки, оптического устройства для освещения подложки, жидкостного устройства, чтобы доставлять к поверхности подложки жидкость, содержащую в водном растворе биологическую молекулу, такую как белок, олигопептид или ДНК, чтобы привить ее на подложке, и молекулу, липкую при наличии освещения, или фотоадгезивный молекулярный клей, молекулу, которую можно либо осадить в виде слоя на подложку, либо которая присутствует растворенной в жидкости вместе с белком.

Когда адгезионная молекула находится в твердом слое, осажденном на подложке, способ фотохимической прививки называется в настоящей заявке "пленочной прививкой".

Когда адгезионная молекула находится в жидкости в контакте с подложкой, способ фотохимической прививки называется в настоящей заявке "прививкой из раствора".

Что касается пленочной прививки, которая представляет собой первый метод прививки в известном уровне техники, при ней используется подложка, обработанная твердой пленкой, жестко закрепленной на подложке, являющейся фотоадгезионной для "маленьких" молекул, которые требуется напечатать, и покрывающей всю площадь подложки между этой подложкой и раствором маленьких молекул. Рассматриваемые здесь маленькие молекулы являются, в частности, нуклеотидами, чтобы получить синтез ДНК, или пептидами, чтобы получить синтез олигопептидов. Пленочная прививка ограничена маленькими молекулами, размерами меньше размеров белка, в том смысле, что эти молекулы не должны обладать способностью неспецифической прививки на подложке на масштабе желательного времени использования образа, напечатанного на подложке. Способность к неспецифической прививке наблюдается при увеличении размера нанесенной фотопечатью молекулы, эта способность характеризуется, в частности, проникновением молекулы в подложку за пределами напечатанных образов, за период времени, делающий эту подложку не пригодной для практического применения из-за экранирования напечатанного образа.

Обычное средство освещения для пленочной прививки состоит, как известно, из матрицы микрозеркал с числовым управлением, способной реализовать любой рисунок путем переориентации каждого из микрозеркал, из которых она состоит, причем матрица служит объективом, который формирует микроструктурированное изображение любого рисунка на поверхности фотоадгезионного слоя в контакте с раствором, содержащим маленькие молекулы.

Хотя печать множества маленьких молекул способом пленочной прививки и возможна, но она требует перед каждой новой печатью нанесения защитных слоев для уже осажденных молекул, что затрудняет промышленное применение этого первого метода.

Однако, поскольку белки как раз обладают способностью к неспецифической прививке, оказалось, что способы пленочной прививки согласно уровню техники не годятся для печати и одного, и тем более для печати нескольких белков.

Что касается прививки из раствора, представляющей собой второй метод прививки в известном уровне техники, в этом методе используется подложка, обработанная слоем, антиадгезионным для белка, и фотоадгезивный клей, как для фотоадгезивного слоя, так и для белка, причем фотоадгезивный клей присутствует в водном растворе, содержащем белок, и раствор приводят в контакт с подложкой и облучают. Наличие средства, предназначенного для предотвращения неспецифической прививки на подложке, в виде слоя, антиадгезионного для белков, делает этот второй метод подходящим для печати одного белка.

Однако прививка из раствора использует фотолитографическую маску без какой-либо фокусирующей оптики и поэтому требует пленки раствора белка и фото-адгизивного клея, который, располагаясь между маской и антиадгезионным слоем, был бы как можно более тонким, обычно несколько микрон. Так, используют одну каплю раствора, сдавленного между маской и плоской подложкой, являющихся неподвижными относительно друг друга. Эта оптомеханическая структура делает проблематичной распространение этого второго метода на печать нескольких белков по меньшей мере по двум причинам.

Во-первых, сложно представить себе возможность автоматизации изменения белка в пленке посредством микрожидкостных насосов, изменяя раствор. Действительно, с уменьшением толщины пленки или слоя жидкости увеличивается потеря напора, но толщина должна быть минимальной, чтобы максимально повысить оптические характеристики, типичная толщина составляет 5 микрон, причем для этого параметра желательной считается точность 1 микрон. Поскольку относительные колебания плоскостности подложки и маски неизбежны, оказалось сложным представить себе для этого второго метода конструкции микрожидкостного устройства, подходящего для автоматического изменения раствора и, стало быть, белка.

Во-вторых, требуется использовать столько масок, сколько белков нужно напечатать. Это предполагает наличие средства ориентации или позиционирования масок на подложке не только в плоскости этой подложки, но также в отношении параллельности подложки и маски, что влияет на оптические качества напечатанного образа. Из этого следует необходимость трехмерного позиционирования каждой маски относительно подложки. Кроме того, для учета относительных изменений плоскостности маски и подложки априори необходимо использовать такие маски и подложку, у которых отклонения от плоскостности были бы очень незначительными, или необходимо пересчитывать параметры каждой маски для каждой подложки, что немыслимо для промышленных условий.

Следовательно, по этим двум причинам и второй метод согласно уровню техники сложно применять для промышленной печати более одного белка на подложке.

Таким образом, печать нескольких белков последовательно, или друг за другом, на подложке автоматизированным промышленным способом остается сложной проблемой в данной области, и идея быстрой системы печати нескольких белков на одной и той же подложке при качестве, совместимом с воссозданием микростуктурированных рисунков или представляющим детали с разрешением порядка микрометра, или микрона, по-видимому, не могла считаться возможной в уровне техники, предшествующем изобретению.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В этом контексте изобретение относится к устройству для микроструктурированной прививки нескольких белков на подложке, которое содержит подложку, пленку, матрицу, источник света, оптическую систему, первый резервуар, предназначенный для вмещения первого водного раствора, второй резервуар, предназначенный для вмещения второго водного раствора, и микрожидкостный контур, причем пленка расположена на подложке, источник выполнен с возможностью освещения матрицы светом, матрица выполнена с возможностью распространять свет в соответствии с первым структурированным рисунком, матрица содержит оптические средства для замены первого структурированного рисунка вторым структурированным рисунком, оптическая система выполнена с возможностью сформировать, на пленке, первое микроструктурированное изображение первого рисунка, контур выполнен с возможностью содержания первого водного раствора, контур имеет отверстие, выполненное с возможностью приводить в контакт первый раствор с пленкой на уровне отверстия, контур содержит микрожидкостное устройство для замены первого раствора вторым раствором, и пленка содержит полиэтиленгликоль на своей поверхности.

В вариантах вышеуказанного устройства:

- указанная матрица является матрицей микрозеркал, распространяющей указанный свет путем отражения,

- указанная оптическая система является объективом микроскопа,

- указанный источник является лазером, излучающим на длине УФ волны,

- указанная длина УФ волны равна 365 нм.

Изобретение относится также к способу микроструктурированной прививки белков на подложке, использующему указанное выше устройство и включающему следующие этапы:

- наполняют первый резервуар первым водным раствором, содержащим бензофенон и первый белок,

- наполняют указанный микрожидкостный контур указанным первым водным раствором, чтобы привести в контакт первый раствор и указанную пленку на уровне указанного отверстия, и

- формируют на пленке с помощью указанного света указанное первое микроструктурированное изображение указанного первого структурированного рисунка, чтобы произвести фотопечать указанного первого белка на пленке.

В одном варианте вышеуказанного способа указанный первый белок является флуоресцентным.

Изобретение относится также к вышеуказанному способу, включающему следующие этапы:

- наполняют второй резервуар вторым водным раствором, содержащим бензофенон и второй белок,

- заменяют указанный первый водный раствор указанным вторым водным раствором, чтобы привести в контакт второй раствор и указанную пленку на уровне указанного отверстия, и

- заменяют указанный первый структурированный рисунок указанным вторым структурированным рисунком для осуществления фотопечати указанного второго белка на пленке.

В одном варианте вышеуказанного способа указанный второй белок является флуоресцентным.

СПИСОК ФИГУР

Изобретение описывается с обращением к фиг. 1, позиции приведены в скобках.

Фиг. 1 показывает первый вариант изобретения в случае системы, способной осуществить печать двух разных белков на одной и той же подложке с помощью рисунков, задаваемых матрицей микрозеркал. Лазер (9), испускающий ультрафиолетовое излучение, располагают с этой целью так, чтобы он освещал матрицу микрозеркал (10). Объектив (11), замещающий оптическую систему, отображает матрицу (10) на прозрачную подложку (7), изнутри этой подложки на первую поверхность подложки. Снаружи подложки в контакте с этой первой поверхностью находится микроканал (6), являющийся частью контура циркуляции жидкости, содержащего, последовательно с первым входом микроканала, микронасос (5), первый резервуар (1), способный питать микронасос, когда электрически управляемый первый микроклапан (3) открыт непоказанным компьютером, второй резервуар (2), способный питать микронасос, когда второй электрически управляемый микроклапан (4) открыт компьютером, микроканал контура содержит также выход, который ведет в сливной или дренажный резервуар (8).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ОДНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом варианте изобретения первый белок содержится в первом резервуаре (1), а второй белок содержится во втором резервуаре (2).

Первый белок является зеленым фибриногеном, известным под названием Fibrinogen-Alexa Fluor 488, а второй белок является красным фибриногеном, известным под названием Fibrinogen Alexa Fluor 546. Вместо указанных фибриногенов можно также выбрать фибронектин для одного из двух белков или для обоих. Согласно изобретению, можно также использовать следующие белки: фибриноген, фибронектин, ламинин, коллаген и витронектин. Для изобретения предпочтительны флуоресцентные белки, как, в частности, зеленый фибриноген и красный фибриноген, в целях визуализации отпечатков, реализованных на подложке.

Первый белок растворен в первой жидкости или в первом водном или буферном растворе, содержащемся в первом резервуаре, причем первый раствор содержит также воду и первое средство прививки, которое представляет собой бензофенон или, как он называется по-английски, benzoylbenzyltriammonium chloride (хлорид бензоилбензилтриметиламмония), в растворимой в воде форме этого продукта.

Второй белок растворен во второй жидкости, или втором водном или буферном растворе, содержащемся во втором резервуаре, причем второй раствор также содержит воду и второе средство прививки, которое также является указанным бензофеноном.

Во всех вариантах изобретения может применяться раствор, использующий не воду, а другую жидкость, но не вызывающую денатурацию белков.

Первый резервуар соединен с первым микроклапаном (3), а второй резервуар соединен со вторым микроклапаном (4). Первый микроклапан и второй микроклапан соединены с микронасосом (5). Микронасос соединен с первым концом микроканала (6), находящемся выше стеклянной подложки (7), которая обработана на своей первой поверхности тонким слоем, толщиной порядка 2 нм, состоящим из полиэтиленгликоля (ПЭГ). Подложка образует крышку для микроканала, имеющего отверстие на уровне подложки, чтобы жидкость, проходящая через микроканал, находилась в контакте с первой поверхностью подложки или, более точно, с тонкой пленкой ПЭГ, или же с обработанной подложкой.

Микроканал открыт со второго конца и позволяет проходящей через него жидкости вытекать в сливной резервуар (8). При необходимости, если нет опасений загрязнения резервуара, можно предусмотреть систему возврата жидкости, выходящей из микроканала, в резервуар, откуда берется эта жидкость.

Микронасос, подходящий для изобретения, может быть, например, нереверсивным микронасосом с постоянным расходом.

Микроклапан, подходящий для изобретения, может быть, в частности, обратным клапаном, обычно блокируемым жидкостью и открывающийся электрическим управлением. Для изобретения подходит любой другой гидравлический блок, позволяющий переключение или объединение резервуаров в одном контуре, соединенным с микронасосом.

Во всей настоящей заявке приставка "микро" для терминов в области жидкостный техники не ограничивает размеры объектов микронным размером, она означает лишь, что жидкостные элементы, подходящие для образования контура или системы циркуляции жидкости, имеют как можно меньшие размеры, чтобы предотвратить напрасный расход первого раствора и второго раствора, когда они приводятся в контакт с подложкой жидкостными компонентами указанного контура, а затем выводятся в сливной резервуар. Если печатная поверхность или поверхность печати на подложке ограничена, например, квадратом размерами 1см на 1см, глубина микроканала или протяженность микроканала от первой поверхности наружу этой первой поверхности, может составлять 200 микрон, чтобы получить объем раствора выше поверхности печати 20 микролитров. Таким образом, обновление можно ограничить малыми количествами раствора и белка, благодаря микрожидкостному характеру некоторых устройств по изобретению, что выгодно для промышленного применения.

Во всей настоящей заявке выражение "печать на подложке" рассматривается как синоним "печати на пленке", когда пленка является результатом обработки поверхности подложки и имеет толщину меньше, чем толщина подложки. Именно этот случай соответствует пленке и подложке в настоящем изобретении.

В настоящей заявке подложка образована из стекла, или ITO (оксид индия и олова), или из любого другого прозрачного материала, если через нее должен проходить свет, чтобы получить печать. Равным образом, пленка является прозрачной, если через нее должен проходить свет, чтобы получить печать. В случае, когда подложка будет по своей природе антиадгезионной для белков, то, не отклоняясь от принципов изобретения, пленка будет пониматься тогда как поверхностный слой подложки, на которую производится прививка.

Расчет характеристик подходящей для изобретения жидкостный или микрожидкостный системы может быть без особого труда осуществлен специалистом среднего уровня в области микрожидкостных систем с учетом предшествующих указаний. Таким образом, изобретение включает в себя микрожидкостный контур, расположенный между пленкой и первым и вторым резервуаром с водным раствором, содержащим первый и второй белок, соответственно. В обобщении изобретения на уровне его жидкостного контура, микрожидкостная схема будет содержать средства для приведения в контакт выхода контура с совокупностью водных растворов, каждый из которых содержит особый белок и бензофенон, в зависимости, например, от автоматического управления, осуществляемого компьютером согласно программируемому выбору. В настоящем варианте гидравлической конструкции, соответствующей уплотнителю каналов с двумя входами, по одному на резервуар, и с одним выходом на уровне микроканала, в уплотнитель можно добавлять резервуары и входы известными в гидравлике средствами, чтобы увеличить число растворов белков, которые могут заполнять микроканал. Таким образом, изобретение в этом первом варианте представлено как иллюстрация структуры с двумя белками, но оно не ограничивается особо этим числом.

Кроме того, в этом первом варианте изобретения в устройство включен источник (9) ультрафиолетового излучения, представляющий собой ультрафиолетовый лазер, излучающий на длине волны 365 нм, возможно импульсный, чтобы способствовать высокой оптической мощности, который облучает плоскую матрицу (10) микрозеркал с цифровым управлением от непоказанного компьютера. Эта матрица позволяет получить объект, каждый пиксель которого может управляться индивидуально, чтобы образовать целевой рисунок любой сложности, имеющий число независимых точек, равное числу микрозеркал матрицы. Каждое микрозеркало можно уподобить черному или светлому элементу изображения, причем матрица образует рисунок в своей плоскости, то есть двумерный рисунок. Эта матрица отображается объективом (11), оптимизированным на ультрафиолет и образующий изображение матрицы на первой поверхности подложки в среде подложки. Оптическая система или объектив может быть инвертированным микроскопом, то есть объективом микроскопа, в котором направление света изменено на противоположное, чтобы преобразовать структурированную матрицу в соответствии с рисунком с разрешением порядка десяти микрон в микроструктурированное изображение с разрешением, или резкостью, порядка микрона путем увеличения от менее 1 до порядка 1/10.

Подложку предпочтительно размещать таким образом, чтобы через нее сначала проходил свет, испущенный лазером, прежде чем на ее первой поверхности не будет сформировано изображение. Другими словами, если подложка имеет первую толщину между второй поверхностью и первой поверхностью, ультрафиолетовое излучение контактирует сначала со второй поверхностью, а затем с первой поверхностью в направлении распространения света. Эта конфигурация обозначается в заявке выражением "подложка освещается изнутри, в отличие от ситуации, когда свет встречает первую и вторую поверхность в указанном порядке, что обозначается выражением "подложка освещается снаружи". Освещение подложки изнутри позволяет избавиться от оптических дефектов раствора, поэтому этот вариант осуществления предпочтителен для изобретения.

Компоненты: подложка, свет, бензофенон, ПЭГ и белок выбирают следующим образом: для заданного белка ПЭГ выбирают в качестве пленки, не адгезионной по отношению к белку, но адгезионной к подложке, бензофенон выбирают в качестве клея, адгезионного к белку и пленке при освещении светом. Можно также определить другие материалы, позволяющие применять изобретение для других белков.

Устройство фотопечати в соответствии с первым структурированным рисунком, первого белка на обработанной подложке, получают в таком случае способом, включающим следующие этапы:

- наполнить микрожидкостный контур первым водным раствором, содержащим первый белок, до вступления в контакт первого раствора и пленки ПЭГ на уровне отверстия микроканала, накрытого пленкой РЭГ, нанесенной на подложку,

- сформировать на пленке с помощью указанного света первое микроструктурированное изображение, уменьшенное объективом микроскопа, первого структурированного рисунка для фотопечати первого белка на пленке.

Таким образом, изобретение занимает первую конфигурацию по отношению к печати посредством первого резервуара. Сложный печатный рисунок двух белков на подложке можно легко осуществить, исходя из этой первой конфигурации, заменяя первый раствор вторым раствором и заменяя первый рисунок, отображенный, или отраженный, или распространенный, или переданный матрицей, вторым рисунком.

Таким образом, чтобы получить первую конфигурацию, достаточно открыть первый микроклапан, закрыть второй микроклапан и задействовать микронасос, чтобы получить первый белок на уровне пленки. Также, чтобы получить первый микроструктурированный образ на пленке, достаточно включить источник света и выбрать первый рисунок на матрице.

Следует отметить, что в этом первом варианте матрица микрозеркал содержит оптические средства для замены первого структурированного рисунка вторым, отличным от первого, структурированным рисунком.

Следует отметить также, что в этом первом варианте микрожидкостный контур, определенный как средство снабжения раствором зоны, состоящей из пленки, антиадгезионной для белков, содержит микрожидкостные устройства для замены первого раствора вторым раствором на уровне пленки.

В таком случае просто заменить первый водный раствор вторым водным раствором на уровне пленки и заменить первый структурированный рисунок вторым структурированным рисунком на матрице, причем посредством этого второго рисунка на пленке затем формируется второе микроструктурированное изображение.

Таким образом, из этого следует вторая конфигурация изобретения в этом первом варианте, согласно которому второй белок наносится на пленку фотопечатью в соответствии с образом второго рисунка.

Можно также заменить первый раствор множеством водных растворов белков и фотоактивируемых молекул (сульфо-SANPAH или сульфосукцинимидил 6-((4-азидо-2-нитрофенил)амино)гексаноат, моногидрат натриевой соли антрахинон-2-сульфоновой кислоты, бензофенон-4-малеимид, бензофенон-4-изоцианат, 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойная кислота, сукцинимидиловый эфир) и заменить первый структурированный рисунок в матрице микрозеркал множеством рисунков, объединенных для желаемого отображения одного белка из раствора совокупности белков, чтобы получить микроструктурированное изображение на пленке ПЭГ. Таким образом, изобретение подходит для облегченной печати множества белков на подложке в соответствии с произвольно выбранными рисунками и, таким образом, для произвольно сложной печати.

Можно также добавить третий этап промывки, добавляя третий резервуар, наполненный буферным раствором, соединяя его с третьим микроклапаном автоматического управления, того же типа, что и первый и второй микроклапаны, и соединяя выход этого третьего клапана с микронасосом. Буферный промывочный раствор может представлять собой, в частности, дистиллированную воду, или физиологический раствор, или другой раствор для промывки белков (ионные или неионные ПАВы: Tween 20, Triton X100).

Таким образом, изобретение представляет особый интерес для применения для быстрой и универсальной печати нескольких белков на подложке, исходя из нескольких резервуаров, с высокой и длительной химической контрастностью, то есть без неспецифической прививки. Химическую контрастность удобно определить для настоящей заявки как разницу концентрации одного и того же белка в двух разных местах, деленную на сумму концентраций указанного белка в этих двух местах.

Следует отметить также, что изобретение подходит также для промышленного применения, так как во всех его конфигурациях управление может предпочтительно осуществлять компьютером, который отдает автоматические команды, известные в уроне техники, на каждый элемент изобретения: источник света, матрица микрозеркал, жидкостный контур (микронасос, микроклапаны).

Использование для печати двух белков по изобретению достигается, например, двумя конфигурациями.

В первой конфигурации использования первый резервуар (1) соединен через открытый первый микроклапан (3) с микронасосом (5) и микроканалом (6), при этом второй микроклапан (4) закрыт, чтобы не допустить смешения в микрожидкостном контуре жидкостей, содержащихся в первом и втором резервуарах. Первая жидкость содержащая первый белок, вытекает, таким образом, из первого резервуара в микроканал, а затем выходит в сливной резервуар (8). В этой первой конфигурации первый рисунок рисуется на матрице микрозеркал (10) с помощью непоказанного компьютера, и отображение этого первого рисунка или первого оптического образа формируется на первой поверхности подложки. Первый резервуар содержит первую жидкость, содержащую первый белок и первое средство прививки из раствора первого белка на первую поверхность при облучении ультрафиолетом. Изображение первого оптического образа передается в виде первого химического образа первого белка первым средством прививки с такой же пространственной протяженностью, что и первый оптический образ, совместимый с ним.

Во второй конфигурации применения второй резервуар (2) соединен с открытым вторым микроклапаном (4), с микронасосом (5) и микроканалом (6), при этом первый микроклапан (5) закрыт, чтобы не допустить смешения жидкостей, содержащихся в первом и втором резервуарах. Вторая жидкость, содержащая второй белок, вытекает из второго резервуара в микроканал, а затем выходит в сливной резервуар (8). В этой второй конфигурации второй рисунок рисуется на матрице микрозеркал (10) непоказанным компьютером, и отображение этого второго рисунка или второго оптического образа формируется на первой поверхности подложки. Второй резервуар содержит вторую жидкость, содержащую второй белок и второе средство прививки из раствора второго белка на первую поверхность при облучении ультрафиолетом. Изображение второго оптического образа передается в виде второго химического образа второго белка вторым средством прививки с такой же пространственной протяженностью, что и второй оптический образ, идеально совместимый с ним, причем подложка оставалась неподвижной на протяжении всего периода использования, что является существенным преимуществом для печати множества белков, при которой операции, осуществляемые на втором белке, можно без труда воспроизвести на каждом белке, оставшемся для печати.

В другой области применения изобретение может служить для получения градиента концентрации одного и того же белка, в частности, изменяя время освещения обработанной поверхности подложки или используя то же время, но выбирая резервуары, содержащие один и тот же белок в разных концентрациях.

Посредством изобретения были получены, в частности, градиенты зеленого фибриногена (Alexa 488), красного фибриногена (Alexa 546) и желтого фибриногена (Alexa 532), проецируя изображение сетки при разных временах освещения.

Что касается изобретения в целом, и для других вариантов или приложений применимы следующие рассуждения:

- Для изобретения может подойти не только матрица микрозеркал, но и любая другая матрица, которая распространяет свет в соответствии с рисунком, сделанным оптически контрастным. Для изобретения годится жидкокристаллический модулятор, работающий на пропускании, а не на отражении или поглощении света.

- Для изобретения подходит любое средство создания рисунка и получения из него изображения на пленке. Для изобретения подходит также система, основанная на пропускании света от источника, создающая контрастированный рисунок, или светящийся рисунок путем пропускания света, причем рисунок воспринимается объективом и отображается объективом на первую поверхность подложки. Функционирование матрицы микрозеркал в отраженном свете в сочетании с объективом инвертированного микроскопа, согласно первому варианту осуществления изобретения, является одним примером устройства освещения или пространственного модулятора света источника в рамках изобретения.

Во всех своих вариантах изобретение обладает практическими преимуществами для печати нескольких белков:

- Оптическая и размерная стабильность системы, причем не требуется никакого демонтажа, что позволяет ограничить неспецифическую прививку белков, что необходимо для применения, благодаря использованию ПЭГ в качестве печатной пленки и бензофенона в растворе.

- Адаптация к произвольному числу резервуаров и множественности белков путем простого увеличения числа микроклапанов и использования логической схемы открытия этих микроклапанов, согласно которой одновременно открыт всего один микроклапан, а другие закрыты. Таким образом, благодаря изобретению можно напечатать произвольное число белков на подложке без снижения контраста по сравнению с печатью одного белка и без потерь времени, с учетом возможности располагать средством прививки каждого белка из раствора с каждым белком, причем это средство прививки адаптировано к подложке. Управление логической схемой можно обеспечить, в частности, компьютером, чтобы наилучшим образом автоматизировать систему печати согласно изобретению.

- Возможное функционирование без контура промывки. Действительно, из описания первого варианта изобретения явствует, что течение раствора на пленке способствует промывке первой поверхности, когда она является активной без освещения. Эта промывка применяется к промывке первой жидкости второй жидкостью при переходе от первой ко второй конфигурации первого варианта. При этом переходе, то есть при изменении жидкости, находящейся в контакте с первой поверхностью, или в переходной фазе, в контакте с первой поверхностью находится смесь жидкостей, в таком случае может быть желательным прервать освещение, чтобы избежать фиксации или печати смеси белков. Освещение можно восстановить, когда будет сочтено, что с первой поверхностью контактирует только чистая жидкость, с точностью, требуемой для печати, то есть когда может быть достигнут искомая химическая контрастность для единственного белка на первой поверхности. Специалист может легко определить момент прерывания освещения согласно критерию контрастности, полученному для каждого напечатанного белка.

Изобретение подходит для промышленного применения в области печати белков на подложке.

Нижеследующие рассуждения также распространяются на изобретение.

В рамках настоящей заявки подразумевается, что указанная микрожидкостная система может содержать контур, позволяющий поддерживать подложку в вакууме. Это дает возможность легко извлечь обработанную подложку путем снятия вакуума по окончания печати.

При этом подразумевается, что идеям изобретения соответствует, для всех его устройств, что указанная микрожидкостная схема содержит контур промывки, соединенный с буферным раствором, такой как физиологический раствор или другой раствор, совместимый с белком, подлежащим печати, и устройства промывки указанной пленки от растворов белков, которые нужно напечатать. В этом случае печатную пленку можно промывать in-situ, что позволяет не перемещать подложку относительно печатаемых отображений рисунков при замене раствора подлежащего печати белка и позволяет сохранить высокую точность относительной печати между образами разных белков или разными образами одного и того же белка.

При этом подразумевается также, что при применении устройства согласно изобретению, содержащего контур промывки, соединенный с буферным раствором и указанными промывочными устройствами, этап, состоящий в замене указанного первого водного раствора указанным вторым водным раствором, чтобы привести в контакт второй раствор и указанную пленку на уровне указанного отверстия, мог бы включать следующие подэтапы:

- заменить указанный первый водный раствор указанным буферным раствором с помощью промывочного устройства и

- заменить буферный раствор вторым водным раствором, чтобы привести в контакт второй раствор и указанную пленку на уровне указанного отверстия.

При этом подразумевается, что в устройстве согласно изобретению, содержащем указанный промывочный контур, соединенный с буферным раствором и указанным промывочным устройством, и средства печати совокупности N рисунков в биективном наложении с совокупностью N белков, один практический пример способа применения устройства может включать следующий этап:

- для каждого белка i, где i меняется от 1 до N, осуществить следующие подэтапы:

открыть микроклапан i, контролирующий резервуар i, содержащий фотоактивируемый водный раствор, в направлении водного раствора, содержащего по меньшей мере одну фотоактиивируемую молекулу, причем водный раствор содержит также белок i, чтобы позволить привести в контакт указанную пленку с водным раствором белка i,

напечатать образ рисунка i путем освещения пленки с помощью источника, в частности, ультрафиолетового (УФ), позволяющего печатать белок на пленке,

прекратить облучение источником,

закрыть микроклапан i, и

открыть буферный микроклапан, управляющий буферным резервуаром, содержащим буферный раствор, чтобы отмыть пленку от водного раствора белка i промывочным устройством.

При этом подразумевается, что изобретение относится также к устройству для микроструктурированной прививки нескольких белков на подложку, которое содержит подложку, пленку, матрицу, источник света, оптическую систему, первый водный раствор, второй водный раствор и микрожидкостный контур, причем пленка находится на подложке, источник освещает матрицу светом, матрица распространяет свет в соответствии с первым структурированным рисунком, матрица содержит оптические средства для замены первого структурированного рисунка вторым структурированным рисунком, оптическая система формирует на пленке первое микроструктурированное изображение первого рисунка, контур содержит первый водный раствор, контур имеет отверстие для первого раствора, первый раствор находится в контакте с пленкой на уровне отверстия, контур содержит микрожидкостные средства для замены первого раствора вторым раствором, пленка содержит полиэтиленгликоль на своей поверхности, первый раствор содержит бензофенон и первый белок, а второй раствор содержит бензофенон и второй белок, причем в указанном устройстве микрожидкостные средства для замены первого раствора вторым раствором содержат устройство промывки пленки буферным раствором, совместимым с первым и вторым белком, причем указанное промывочное устройство способно отмыть пленку от водного раствора первого белка.

Claims (27)

1. Устройство для микроструктурированной прививки нескольких белков на подложке, содержащее

подложку (7),

пленку, содержащую полиэтиленгликоль и расположенную на подложке,

матрицу для распространения света в соответствии с первым структурированным рисунком и для замены первого структурированного рисунка вторым структурированным рисунком,

источник света (9) для освещения матрицы,

оптическую систему для формирования на пленке первого микроструктурированного изображения первого структурированного рисунка,

первый резервуар (1) для вмещения первого водного раствора, содержащего первое средство прививки и первый белок,

второй резервуар (2) для вмещения второго водного раствора, содержащего второе средство прививки и второй белок, и

микрожидкостный контур для содержания первого водного раствора, содержащий отверстие для приведения в контакт первого водного раствора с пленкой у отверстия,

при этом:

микрожидкостный контур выполнен с возможностью заполнения первым водным раствором для приведения в контакт первого водного раствора и пленки, причем первое микроструктурированное изображение первого структурированного рисунка формируется на пленке посредством источника света для фотопечати первого белка на пленке, и

микрожидкостный контур выполнен с возможностью замены первого водного раствора вторым водным раствором для приведения в контакт второго водного раствора и пленки, причем первый структурированный рисунок заменяется вторым рисунком для фотопечати второго белка на пленке.

2. Устройство по п. 1, в котором указанная матрица является матрицей (10) микрозеркал, распространяющей свет путем отражения.

3. Устройство по п. 1, в котором указанная оптическая система является объективом (11) микроскопа.

4. Устройство по п. 2, в котором указанная оптическая система является объективом (11) микроскопа.

5. Устройство по любому из пп. 1-4, в котором указанный источник света является лазером, излучающим на длине УФ волны.

6. Устройство по п. 5, в котором указанная длина УФ волны равна 365 нм.

7. Способ микроструктурированной прививки белков на подложке, использующий устройство по п. 1 и включающий следующие этапы:

- наполняют первый резервуар первым водным раствором, содержащим бензофенон и первый белок,

- наполняют указанный микрожидкостный контур указанным первым водным раствором, чтобы привести в контакт первый раствор и указанную пленку у указанного отверстия, и

- формируют на пленке с помощью указанного света указанное первое микроструктурированное изображение указанного первого структурированного рисунка, чтобы произвести фотопечать указанного первого белка на пленке.

8. Способ по п. 7, причем указанный первый белок является флуоресцентным.

9. Способ по любому из пп. 7 и 8, включающий следующие этапы:

- наполняют второй резервуар вторым водным раствором, содержащим бензофенон и второй белок,

- заменяют указанный первый водный раствор указанным вторым водным раствором, чтобы привести в контакт второй раствор и указанную пленку у указанного отверстия, и

- заменяют указанный первый структурированный рисунок указанным вторым структурированным рисунком для осуществления фотопечати указанного второго белка на пленке.

10. Способ по п. 9, причем указанный второй белок является флуоресцентным.

Images