RU2625018C2 - Method for colorectal cancer diagnosis/screening based on simultaneous quantification of protein nature tumour markers, glycans antibodies, g, a and m immunoglobulins in human blood on biological microchip - Google Patents

Method for colorectal cancer diagnosis/screening based on simultaneous quantification of protein nature tumour markers, glycans antibodies, g, a and m immunoglobulins in human blood on biological microchip Download PDF

Info

Publication number
RU2625018C2
RU2625018C2 RU2015153853A RU2015153853A RU2625018C2 RU 2625018 C2 RU2625018 C2 RU 2625018C2 RU 2015153853 A RU2015153853 A RU 2015153853A RU 2015153853 A RU2015153853 A RU 2015153853A RU 2625018 C2 RU2625018 C2 RU 2625018C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibodies
glycans
immunoglobulins
immobilized
protein
Prior art date
Application number
RU2015153853A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2015153853A (en
Inventor
Вероника Игоревна Бутвиловская
Софья Борисовна Поплетаева
Владимир Романович Чечеткин
Алла Юрьевна Рубина
Елена Николаевна Савватеева
Мария Вадимовна Цыбульская
Сергей Александрович Волошин
Алексей Александрович Тихонов
Original Assignee
Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) filed Critical Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран)
Priority to RU2015153853A priority Critical patent/RU2625018C2/en
Publication of RU2015153853A publication Critical patent/RU2015153853A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2625018C2 publication Critical patent/RU2625018C2/en

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: method involves the simultaneous quantification of protein nature tumour markers, glycan antibodies, G, A and M immunoglobulins in human blood on a biological microchip. For this purpose, the biochip contains hydrogel elements with immobilized antibodies to protein oncomarkers, hydrogel elements with immobilized glycans, hydrogel elements with immobilized antibodies against human immunoglobulins of G, A, M classes. The change in the level of the analyzed markers in comparison with the level in the serum of healthy donors indicates colorectal cancer. The group of inventions also refers to a biological microchip, which is an array of three-dimensional hydrogel elements.
EFFECT: application of this invention allows colorectal cancer diagnosis, screening, simultaneous quantification of protein markers, antibodies to glycans, G, A and M immunoglobulins in human blood on a biological microchip that allows successive reactions of various types.
8 cl, 5 ex, 5 tbl, 7 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

(Technical Field)(Technical Field)

Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности, к аналитической биохимии и иммунохимическому анализу и касается способа диагностики колоректального рака, основанного на одновременном количественном определении концентрации онкомаркеров белковой природы, уровней антител к онкоассоциированным гликанам, уровней иммуноглобулинов G, А, M в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе. Биологический микрочип на основе гидрогелей содержит иммобилизованные антитела к белковым онкомаркерам, иммобилизованные гликаны (в том числе онкоассоциированные), иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов человека G, А, М. Предлагаемое изобретение может найти применение в аналитической биохимии, иммунологии и медицине, в частности при диагностике колоректального рака.The invention relates to biochemistry and medicine, in particular, to analytical biochemistry and immunochemical analysis, and relates to a method for the diagnosis of colorectal cancer based on the simultaneous quantitative determination of the concentration of tumor markers of protein nature, levels of antibodies to cancer-associated glycans, levels of immunoglobulins G, A, M in human serum on a biological microchip. A biological microchip based on hydrogels contains immobilized antibodies to protein oncomarkers, immobilized glycans (including oncological associated ones), immobilized antibodies against human immunoglobulins G, A, M. The present invention can find application in analytical biochemistry, immunology and medicine, in particular in the diagnosis of colorectal cancer.

Уровень техникиState of the art

(Background Art)(Background art)

Колоректальный рак (КРР) стоит на третьем месте по распространенности среди населения индустриальных стран (Claudia Allemani, Hannah К Weir, Helena Carreira, Rhea Harewood, Devon Spika, Xiao-Si Wang, Finían Bannon, Jane V Ahn, Christopher J Johnson, Audrey Bonaventure, Rafael Marcos-Gragera, Charles Stiller, Guiñar Azevedo e Silva, Wan-Qing Chen, Olufemi J Ogun MPC, Group* and the CW. Global surveillance of cancer survival 1995-2009: analysis of individual data for 25 676 887 patients from 279 population-based registries in 67 countries (CONCORD-2). Lancet 2014;(November 26). doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(14)62038-9). Статистика развитых стран мира свидетельствует о неуклонном росте впервые выявленных случаев рака толстой и прямой кишки по сравнению со злокачественными опухолями любой другой локализации, кроме рака легкого. Смертность от КРР также очень высока, например, в США 10% всех онкологических смертей приходится на КРР, для Японии эта цифра 13%.Colorectal cancer (CRC) ranks third in terms of prevalence among the population of industrial countries (Claudia Allemani, Hannah K Weir, Helena Carreira, Rhea Harewood, Devon Spika, Xiao-Si Wang, Finían Bannon, Jane V Ahn, Christopher J Johnson, Audrey Bonaventure , Rafael Marcos-Gragera, Charles Stiller, Guiñar Azevedo e Silva, Wan-Qing Chen, Olufemi J Ogun MPC, Group * and the CW. Global surveillance of cancer survival 1995-2009: analysis of individual data for 25 676 887 patients from 279 population-based registries in 67 countries (CONCORD-2). Lancet 2014; (November 26). doi: http: //dx.doi.org/10.1016/S0140-6736 (14) 62038-9). Statistics from developed countries of the world indicate a steady growth of newly diagnosed cases of colon and rectal cancer compared with malignant tumors of any other localization except lung cancer. Mortality from CRC is also very high, for example, in the United States 10% of all cancer deaths occur in CRC, for Japan this figure is 13%.

Россия относится к странам с высоким уровнем заболеваемости КРР и смертности от него. В 2010 г. в нашей стране зарегистрировано более 58 тыс.новых случаев КРР; в структуре онкологической заболеваемости в 2008 г. рак ободочной кишки находился на 4-м месте (6,5% случаев), рак прямой кишки - на 5-м месте (4,9%). Соответственно увеличивается и смертность. Так, в структуре общей смертности доля рака толстой кишки в 2008 г. составила 7,0% (3-е место), а доля рака прямой кишки - 5,8% (4-е место) (Чиссов В.И. и др. Злокачественные новообразования в России в 2010 году: заболеваемость и смертность // ФГБУ МНИОИ им П.А. Грецена. - 2012; 1: 17-136). Главными факторами риска для развития КРР являются генетическая предрасположенность, воспалительные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона, язвенный колит, дивертикулит.На ранних этапах, КРР развивается с минимальными клиническими симптомами. В то же время, считается, что смертность от КРР можно снизить с помощью ранней диагностики.Russia is one of the countries with a high incidence of mortality and cancer mortality. In 2010, more than 58 thousand new cases of CRC were registered in our country; in the structure of oncological morbidity in 2008, colon cancer was in 4th place (6.5% of cases), colorectal cancer was in 5th place (4.9%). Accordingly, mortality is increasing. Thus, in 2008, the share of colon cancer in the structure of total mortality was 7.0% (3rd place), and the share of colon cancer - 5.8% (4th place) (Chissov V.I. et al. Malignant neoplasms in Russia in 2010: morbidity and mortality // Federal State Budgetary Scientific Research Institute named after P. Gretsen. - 2012; 1: 17-136). The main risk factors for the development of CRC are genetic predisposition, inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease, ulcerative colitis, diverticulitis. In the early stages, CRC develops with minimal clinical symptoms. At the same time, it is believed that mortality from CRC can be reduced through early diagnosis.

Аденомы считаются наиболее важным предшественником спорадического КРР. Однако было доказано, что у 50% людей с течением жизни будет развиваться колоректальная аденома, но только у 6% она трансформируется в КРР (Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer Statistics, 2012. CA Cancer J Clin 2012;62:10-29). Зубчатые полипы (т.е. зубчатые аденомы и большие гиперпластические полипы) все чаще признаются источником вероятных предраковых поражений. По оценкам 20% - 30% КРР возникают из зубчатых полипов, а не из аденом (Noffsinger АЕ. Serrated polyps and colorectal cancer: new pathway to malignancy. Annu. Rev. Pathol. 2009; 4:343-364).Adenomas are considered the most important precursor to sporadic CRC. However, it has been proven that 50% of people will develop colorectal adenoma over time, but only 6% will transform into CRC (Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer Statistics, 2012. CA Cancer J Clin 2012; 62: 10 -29). Jagged polyps (i.e., jagged adenomas and large hyperplastic polyps) are increasingly recognized as the source of probable precancerous lesions. An estimated 20% - 30% CRC arises from dentate polyps and not from adenomas (Noffsinger AE. Serrated polyps and colorectal cancer: new pathway to malignancy. Annu. Rev. Pathol. 2009; 4: 343-364).

Зубчатые полипы, как правило, расположены с правой стороны, более распространены среди пожилых людей, и менее заметны эндоскопически, чем аденомы (Groff RJ, Nash R, Ahnen DJ. Significance of serrated polyps of the colon. Curr. Gastroenterol. Rep.2008; 10(5):490-498.). Они растут быстрее, чем аденомы и могут прогрессировать быстрее в КРР (Noffsinger А.Е. Serrated polyps and colorectal cancer: new pathway to malignancy. Annu. Rev. Pathol. 2009; 4:343-364). Развитие зубчатых полипов связывают с BRAF мутациями, которые редко присутствуют при аденомах. До сих пор нет единого критерия, который должен быть использован для идентификации высокого риска развития КРР из зубчатого полипа, кроме, пожалуй, одного критерия - размер полипа свыше 1 см.Jagged polyps are usually located on the right side, more common among older people, and less endoscopic than adenomas (Groff RJ, Nash R, Ahnen DJ. Significance of serrated polyps of the colon. Curr. Gastroenterol. Rep. 2008; 10 (5): 490-498.). They grow faster than adenomas and can progress faster in CRC (Noffsinger, A.E. Serrated polyps and colorectal cancer: new pathway to malignancy. Annu. Rev. Pathol. 2009; 4: 343-364). The development of dentate polyps is associated with BRAF mutations, which are rarely present in adenomas. Until now, there is no single criterion that should be used to identify a high risk of developing CRC from a dentate polyp, except, perhaps, for one criterion - the size of the polyp is more than 1 cm.

Сегодня для обнаружения колоректального рака применяют следующие инвазивные методы - колоноскопию, гибкую сигмоидоскопию, ирригоскопию с двойным контрастированием, компьютерно - томографическую колонографию («виртуальную колоноскопию»).Today, the following invasive methods are used to detect colorectal cancer - colonoscopy, flexible sigmoidoscopy, double-contrast irrigoscopy, computed tomographic colonography ("virtual colonoscopy").

Гибкая сигмоидоскопия позволяет обследовать внутреннюю поверхность толстой кишки на расстоянии 60 см от анального отверстия. С помощью этого метода можно выявить колоректальные полипы и опухоли. Однако очевидным недостатком этого метода является возможность обследования только левой части толстой кишки, а правая ее часть остается необследованной. В то время как специфичность гибкой сигмоидоскопии очень высока (98-100%), чувствительность в отношении выявления КРР низка от 35% до 70% из-за наличия большого количества правосторонних аденом.Flexible sigmoidoscopy allows you to examine the inner surface of the colon at a distance of 60 cm from the anus. Using this method, colorectal polyps and tumors can be detected. However, the obvious drawback of this method is the possibility of examining only the left part of the colon, and its right part remains unexplored. While the specificity of flexible sigmoidoscopy is very high (98-100%), sensitivity for detecting CRC is low from 35% to 70% due to the presence of a large number of right-sided adenomas.

Колоноскопия позволяет выявить и удалить полипы, провести биопсию опухоли, расположенной в толстой кишке. Специфичность и чувствительность выявления полипов и КРР высоки. Пока нет перспективных рандомизированных исследований, в которых бы оценивалось влияние колоноскопии на заболеваемость и уровень смертности. Однако, по данным математического моделирования отдаленные результаты полиэктомии (United States National Polyp Study) показывают почти 90% снижение случаев заболеваемости КРР и смертельных исходов от него (Regula J., Rupinski M., Kraszewska Ε., Polkowski Μ. and other. Colonoscopy in colorectal cancer screening for detection of advanced neoplasia. N. Engl. J. Med. 2006; 355: 1863-1872).Colonoscopy allows you to identify and remove polyps, to conduct a biopsy of a tumor located in the colon. The specificity and sensitivity of detecting polyps and CRC are high. There are no promising randomized trials evaluating the impact of colonoscopy on morbidity and mortality. However, according to mathematical modeling, the long-term results of a polyectomy (United States National Polyp Study) show an almost 90% reduction in the incidence of deaths and deaths from it (Regula J., Rupinski M., Kraszewska Ε., Polkowski Μ. And other. Colonoscopy in colorectal cancer screening for detection of advanced neoplasia. N. Engl. J. Med. 2006; 355: 1863-1872).

Колоноскопия является «золотым стандартом» выявления КРР, все пациенты с положительным результатом других скрининговых исследований должны быть в последующем направлены на колоноскопию.Colonoscopy is the "gold standard" for detecting CRC, all patients with a positive result of other screening studies should be subsequently referred for colonoscopy.

Ирригоскопия с двойным контрастированием (ИДК) позволяет исследовать всю толстую кишку, ее чувствительность и специфичность ниже диагностических показателей, получаемых при проведении колоноскопии. Даже при наличии больших полипов и опухолей ИДК обладает существенно более низкой чувствительностью (48%), чем колоноскопия. Кроме того, ИДК дает больше, чем колоноскопия, ложно - положительных результатов (артефакты, определяемые как полипы) (Winawer S.J., Stewart Е.Т., Zauber A.G., Bond J.H., and other. A comparison of colonoscopy and double- contrast barium enema for surveillance after polypectomy. National Polyp Study Work Group.N. Engl. J. Med. 2000; 342: 1766-1772). Пациентам, у которых при ИДК была выявлена патология, в последующем необходимо провести колоноскопию. Несмотря на эти недостатки ИДК широко распространена и тот факт, что с ее помощью можно выявить до 50% больших полипов, обуславливает ее применение при отсутствии возможности проведения более точных исследований.Double-contrast irrigoscopy (DCI) allows you to examine the entire colon, its sensitivity and specificity below the diagnostic parameters obtained during colonoscopy. Even in the presence of large polyps and tumors, IDK has a significantly lower sensitivity (48%) than colonoscopy. In addition, IDK gives more than coloscopy false positive results (artifacts defined as polyps) (Winawer SJ, Stewart E.T., Zauber AG, Bond JH, and other. A comparison of colonoscopy and double-contrast barium enema for surveillance after polypectomy. National Polyp Study Work Group. N. Engl. J. Med. 2000; 342: 1766-1772). Patients who have been diagnosed with IDK have a pathology followed by a colonoscopy. Despite these shortcomings, IDK is widespread and the fact that with its help it is possible to identify up to 50% of large polyps, determines its use in the absence of the possibility of more accurate studies.

Компьютерно-томографическая колонография (КТК). Послойной спиральное компьютерно-томографическое сканирование брюшной полости и таза с последующей цифровой обработкой и анализом изображений может создать как дву -, так и трехмерную реконструкцию просвета толстой кишки («виртуальная колоноскопия»). Проведение этого исследования требует инсуфляции воздуха для раздувания кишки до возможного объема, который может перенести пациент.Мета - анализ исследований, в которых КТК использовали для выявления колоректальных полипов и рака, показал высокую чувствительность (93%) и высокую специфичность (97%) при наличии полипов размером в 10 мм или более. Однако, при комбинации полипов больших и средних размеров (свыше 6 мм) чувствительность метода снижалась до 86% и специфичность также до 86%. При исследовании полипов разных размеров разброс показателей чувствительности (от 45% до 97%) и специфичности (от 26% до 97%) становился слишком большим. Серьезным препятствием использования КТК для раннего определения КРР является то, что полипы размерами 6 мм-9 мм и плоские образования в кишке могут быть пропущены (Kim D.H., Pickhardt P.J., Taylor A.J., Leung W.K. and other. CT colonography versus colonoscopy for the detection of advanced neoplasia. The New England journal of medicine. 2007; 357: 1403-1412). Большим недостатком КТК является и то, что для его повторного проведения пациента необходимо подвергнуть повторному воздействию ионизирующего излучения.Computed tomographic colonography (CPC). A layered spiral computed tomographic scan of the abdominal cavity and pelvis, followed by digital processing and image analysis, can create both two- and three-dimensional reconstruction of the lumen of the colon (“virtual colonoscopy”). This study requires insufflation of air to inflate the intestine to the extent that the patient can tolerate. Meta - analysis of studies in which CPC was used to detect colorectal polyps and cancer showed high sensitivity (93%) and high specificity (97%) in the presence of polyps 10 mm or more in size. However, with a combination of polyps of large and medium sizes (over 6 mm), the sensitivity of the method decreased to 86% and specificity also to 86%. In the study of polyps of different sizes, the scatter of sensitivity indicators (from 45% to 97%) and specificity (from 26% to 97%) became too large. A major obstacle to using CPC for early detection of CRC is that polyps of 6 mm-9 mm and flat lesions in the intestine can be skipped (Kim DH, Pickhardt PJ, Taylor AJ, Leung WK and other. CT colonography versus colonoscopy for the detection of advanced neoplasia. The New England journal of medicine. 2007; 357: 1403-1412). The big disadvantage of CPC is that for its repeated conducting the patient must be re-exposed to ionizing radiation.

Вышеописанные инвазивные методы не подходят для ранней диагностики КРР, т.к. ни одно из перечисленных выше исследований не может охватить полной картины развития и распространения КРР.The invasive methods described above are not suitable for the early diagnosis of CRC, as None of the above studies can capture the full picture of the development and spread of CRC.

Для молекулярной диагностики КРР необходимо контролировать высвобождение опухолевых маркеров на различных стадиях роста опухоли и в различных биологических средах (Ahlquist DA, Harrington JJ, Burgart LJ, Roche PC. Morphometry analysis of the "mucocellular layer" overlying colorectal cancer and normal mucosa: relevance to exfoliation and stool screening. Hum. Pathol. 2000; 31(1):51-57).For molecular diagnosis of CRC, it is necessary to control the release of tumor markers at various stages of tumor growth and in various biological media (Ahlquist DA, Harrington JJ, Burgart LJ, Roche PC. Morphometry analysis of the "mucocellular layer" overlying colorectal cancer and normal mucosa: relevance to exfoliation and stool screening. Hum. Pathol. 2000; 31 (1): 51-57).

К широко распространенным неинвазивным методам определения КРР, используемым в клинике, относятся анализ кала на скрытую кровь, иммунохимическое определение гемоглобина в стуле пациента, определение ДНК маркеров в стуле пациента, определение белковых онкомаркеров в сыворотке крови пациента.The widespread non-invasive methods for determining CRC used in the clinic include stool analysis for occult blood, immunochemical determination of hemoglobin in the patient’s stool, determination of DNA markers in the patient’s stool, determination of protein tumor markers in the patient’s blood serum.

Анализ кала на скрытую кровь основан на определении гемоглобина в стуле пациента (Allison JE, Sakoda LC, Levin TR et al. Screening for colorectal neoplasms with new fecal occult blood tests: update on performance characteristics. J Natl Cancer Inst 2007; 99:1462-1470). Наиболее распространенными являются тесты Hemoccult II (Smith Kline Diagnostics) и Hemoccult II Sensa (Smith Kline Diagnostics). При наличии крови в кале гваяковый тест показывает синее окрашивание. Изменение цвета связано в пероксидазо-подобной активностью гемоглобина в стуле. Для гваякового теста характерна большая доля ложноположительных реакций, низкая специфичность выявления КРР. Ложно-позитивные сигналы могут возникать из-за нарушения диеты при подготовке к анализу, например употребление красного мяса, растительных пероксидаз (некоторые фрукты и овощи), употребление высоких доз витамина С.Наличие геморроя и ангиодисплазий, также могут вызывать ложные положительные результаты. Современные рекомендации по Hemoccult тестированию включают в себя пищевые ограничения (Ransohoff D.F., Lang С.А., Part I: Suggested technique for fecal occult blood testing and interpretation in colorectal cancer screening. Ann Intern Med 1997 126:808).Fecal occult blood analysis is based on the determination of hemoglobin in the patient’s stool (Allison JE, Sakoda LC, Levin TR et al. Screening for colorectal neoplasms with new fecal occult blood tests: update on performance characteristics. J Natl Cancer Inst 2007; 99: 1462- 1470). The most common tests are Hemoccult II (Smith Kline Diagnostics) and Hemoccult II Sensa (Smith Kline Diagnostics). If there is blood in the stool, the guaiac test shows a blue color. The color change is related to the peroxidase-like activity of hemoglobin in the stool. The guaiac test is characterized by a large proportion of false-positive reactions, low specificity for detecting CRC. False positive signals can occur due to a diet violation in preparation for analysis, for example, eating red meat, plant peroxidases (some fruits and vegetables), eating high doses of vitamin C. The presence of hemorrhoids and angiodysplasias can also cause false positive results. Current recommendations for Hemoccult testing include nutritional restrictions (Ransohoff D.F., Lang S.A., Part I: Suggested technique for fecal occult blood testing and interpretation in colorectal cancer screening. Ann Intern Med 1997 126: 808).

Из-за низкого уровня диагностической чувствительности, этот тест не позволял выявлять ранние стадии рака (Heresbach D, Manfredi S, D'Halluin Ρ Ν, Bretagne JF, Branger В. Review in depth and meta-analysis of controlled trials on colorectal cancer screening by fecal occult blood test. Eur J Gastroenterol Hepatol 2006; 18(4):427-433).Due to its low diagnostic sensitivity, this test did not detect the early stages of cancer (Heresbach D, Manfredi S, D'Halluin Ρ Ν, Bretagne JF, Branger B. Review in depth and meta-analysis of controlled trials on colorectal cancer screening by fecal occult blood test. Eur J Gastroenterol Hepatol 2006; 18 (4): 427-433).

В основе иммунохимического выявления гемоглобина в стуле пациента лежит взаимодействие гемоглобина со специфическими антителами, с последующей регистрацией сигнала иммунохимическим методом (ИФА). Эти тесты не реагируют с нечеловеческим гемоглобином или пероксидазами растений, что позволяет не соблюдать диетические ограничения (Cole SR, Young GP. Effect of dietary restriction on participation in fecal occult blood test screening for colorectal cancer. Med J Aust 2001; 175(4):195-198). Примерами таких тестов являются HemeSelect (SmithKline Diagnostics, США) и InSure (Enterix Inc., США).The immunochemical detection of hemoglobin in the patient’s stool is based on the interaction of hemoglobin with specific antibodies, followed by signal registration by the immunochemical method (ELISA). These tests do not react with non-human hemoglobin or plant peroxidases, which allows dietary restrictions not to be observed (Cole SR, Young GP. Effect of dietary restriction on participation in fecal occult blood test screening for colorectal cancer. Med J Aust 2001; 175 (4): 195-198). Examples of such tests are HemeSelect (SmithKline Diagnostics, USA) and InSure (Enterix Inc., USA).

Количественное определение гемоглобина в стуле пациента лежит в основе теста FOB Gold (Sentinel Diagnostics, Италия). Тест FOB Gold позволяет точно определить количественное содержание гемоглобина в стуле без предварительного соблюдения пациентами строгой диеты. Метод основан на реакции агглютинации антиген-антитело между гемоглобином человека и анти-гемоглобин-антителом на латексных частицах. Агглютинация измеряется по абсорбции при 570 нм, увеличение единиц абсорбции пропорционально количеству гемоглобина человека в образце. Данный тест является полностью автоматическим. Специальная пробирка для сбора образцов разработана как контейнер для сбора стула и помещается прямо в биохимический анализатор. К недостаткам метода относится низкая чувствительность выявления КРР.The quantitative determination of hemoglobin in the patient’s stool is the basis of the FOB Gold test (Sentinel Diagnostics, Italy). The FOB Gold test allows you to accurately determine the quantitative content of hemoglobin in the stool without first observing a strict diet by patients. The method is based on the antigen-antibody agglutination reaction between human hemoglobin and anti-hemoglobin antibody on latex particles. Agglutination is measured by absorption at 570 nm, the increase in absorption units is proportional to the amount of human hemoglobin in the sample. This test is fully automatic. A special sample collection tube is designed as a container for collecting stools and fits directly into a biochemical analyzer. The disadvantages of the method include the low sensitivity to detect CRC.

Метод обнаружения ДНК маркеров в стуле пациента стремительно развивается с начала 2000 г. (Ahlquist DA. Colorectal cancer screening by detection of altered human DNA in stool: Feasibility of a multitarget assay panel. Gastroenterology 2000; 119(5):1219-1227). Целесообразность тестирования стула на наличие ДНК для выявления КРР была впервые продемонстрирована, когда в 1992 г. впервые была обнаружена связь КРР и единственного маркера - мутантного гена KRAS (Sidransky D, Tokino Τ, Hamilton SR, et al. Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors. Science 1992; 256(5053): 102-105). ДНК-тест позволяет обнаруживать до 52% инвазивных опухолей КРР по сравнению с 13%, обнаруживаемыми с помощью обычного гваякового теста (Р=0,003), с сопоставимым уровнем специфичности. В другом исследовании (Ahlquist DA, Sargent DJ, Loprinzi CL, et al. Stool DNA and occult blood testing for screen detection of colorectal neoplasia. Ann. Intern. Med. 2008; 149(7):441-450), одновременное использование трех маркеров ДНК позволило выявить 46% случаев аденом, в то время как гваяковый тест обнаружил только 10% (Р<0,001), причем специфичность ДНК теста была на 17% выше.A method for detecting DNA markers in a patient’s stool has been rapidly developing since the beginning of 2000 (Ahlquist DA. Colorectal cancer screening by detection of altered human DNA in stool: Feasibility of a multitarget assay panel. Gastroenterology 2000; 119 (5): 1219-1227). The feasibility of testing stool for DNA to detect CRC was first demonstrated when, in 1992, the relationship between CRC and the only marker, the mutant gene KRAS (Sidransky D, Tokino Τ, Hamilton SR, et al. Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors. Science 1992; 256 (5053): 102-105). The DNA test allows up to 52% of invasive CRC tumors to be detected, compared with 13% detected using a conventional guaiac test (P = 0.003), with a comparable level of specificity. In another study (Ahlquist DA, Sargent DJ, Loprinzi CL, et al. Stool DNA and occult blood testing for screen detection of colorectal neoplasia. Ann. Intern. Med. 2008; 149 (7): 441-450), the simultaneous use of three DNA markers revealed 46% of cases of adenomas, while the guaiac test found only 10% (P <0.001), and the specificity of the DNA test was 17% higher.

Тем не менее, тест ДНК имеет более низкий уровень чувствительности по сравнению с анализом кала на скрытую кровь (Ahlquist DA, Sargent DJ, Loprinzi CL, et al. Stool DNA and occult blood testing for screen detection of colorectal neoplasia. Ann. Intern. Med. 2008; 149(7):441-450.).However, the DNA test has a lower level of sensitivity compared to occult blood feces (Ahlquist DA, Sargent DJ, Loprinzi CL, et al. Stool DNA and occult blood testing for screen detection of colorectal neoplasia. Ann. Intern. Med. . 2008; 149 (7): 441-450.).

Несмотря на большое разнообразие молекулярных подходов к скринингу колоректального рака, описанных выше, в настоящее время все еще существует необходимость в методе, обладающим высоким диагностическим потенциалом для повышения эффективности скрининга/диагностики КРР и предоставляющим персоналу возможность работать с сывороткой крови пациента.Despite the wide variety of molecular approaches to colorectal cancer screening described above, there is still a need for a method with high diagnostic potential to increase the efficiency of screening / diagnosis of CRC and allowing staff to work with the patient's blood serum.

В клинической практике для диагностики КРР принято определять концентрацию двух белковых онкомаркеров: карциноэмбрионального антигена (РЭА) и карбогидратного антигена СА 19-9 в сыворотке крови пациента методом ИФА (Gold Ρ, Freedman SO. Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system. J. Exp.Med. 1965; 122(3):467-481. Locker GY, Hamilton S, Harris J, et al. ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumor markers in gastrointestinal cancer. J. Clin. Oncol. 2006; 24(33):5313-5327), однако чувствительность метода не высока. Традиционно концентрации онкомаркеров в сыворотке крови пациентов определяют методом твердофазного иммуноанализа ИФА. Наиболее распространенные коммерческие тест-системы, основанные на твердофазном ИФА (Fujirebio Diagnostics - CanAg, Швеция, NovaTec, Германия, Abazyme, Needham, США, Biosourse Diagnostics, Бельгия, Alpha Diagnostic Intl., Texas, США; Вектор-Бест, Иммунотех, Амеркард и Хема-Медика, Москва, Россия, Алкор-Био, Санкт-Петербург, Россия), позволяют определять содержание только одного маркера в образце.In clinical practice, for the diagnosis of CRC, it is customary to determine the concentration of two protein tumor markers: carcinoembryonic antigen (CEA) and carbohydrate antigen CA 19-9 in the patient's blood serum by ELISA (Gold Ρ, Freedman SO. Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system. J. Exp .Med. 1965; 122 (3): 467-481. Locker GY, Hamilton S, Harris J, et al. ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumor markers in gastrointestinal cancer. J. Clin. Oncol. 2006; 24 (33): 5313-5327), however, the sensitivity of the method is not high. Traditionally, the concentration of tumor markers in the blood serum of patients is determined by the method of solid-phase immunoassay of ELISA. The most common commercial test systems based on solid-phase ELISA (Fujirebio Diagnostics - CanAg, Sweden, NovaTec, Germany, Abazyme, Needham, USA, Biosourse Diagnostics, Belgium, Alpha Diagnostic Intl., Texas, USA; Vector-Best, Immunotech, Amercard and Hema-Medica, Moscow, Russia, Alkor-Bio, St. Petersburg, Russia), allow to determine the content of only one marker in the sample.

Основными направлениями дальнейшего развития и совершенствования методов in vitro диагностики КРР являются их миниатюризация, повышение чувствительностии и возможность проведения одновременного многопараметрического анализа. Множество компании выпускают автоматические анализаторы, которые могут одновременно определеять несколько белковых онкомаркеров в сыворотке крови пациента. Концентрации онкомаркеров автоматически количественно рассчитываются по калибровочным кривым, полученным в ходе проведения иммуноанализа исследуемых растворов и контрольных образцов. Многопараметрическое тестирование образца в данной системе достигается путем одновременного проведения большого количества индивидуальных анализов на каждый онкомаркер.The main directions of further development and improvement of in vitro methods for the diagnosis of CRC are their miniaturization, increased sensitivity and the possibility of simultaneous multi-parameter analysis. Many companies produce automatic analyzers that can simultaneously detect several protein tumor markers in the patient's blood serum. Concentrations of tumor markers are automatically quantitatively calculated by calibration curves obtained during immunoassay of the studied solutions and control samples. Multiparameter testing of a sample in this system is achieved by simultaneously conducting a large number of individual analyzes for each tumor marker.

Например, для определения содержания нескольких онкомаркеров используются автоматические анализаторы, например, фирмы Awareness Technology Inc., США, действующие на основе принципа ИФА, и представляющие собой открытую систему для любых методик и реактивов. Анализатор ChemWell использует стандартные микропланшеты для всех типов реакций и способен проводить несколько параллельных исследований, в том числе иммуноферментный анализ опухолевых маркеров: АФП, РЭА, ПСА, СА125, СА15-3, СА19-9, СА242, ферритина, ХГЧ, НСЕ, тканевого полипептидного антигена, бета 2-микроглобулина в 4-х лунках. Полностью автоматизированный микропланшетный ИФА-анализатор Stat Fax 3200 обеспечивает построение калибровочных кривых, процедуру обсчета результатов, вычитание фона и др., позволяет проводить до 12-и параллельных тестов одновременно. Иммунохемилюминесцентный стриповый анализатор Lumi Stat - CLIA используют для определения 11-и опухолевых маркеров РЭА, ПСАобщ, ПСАсвоб, CAI25, АФП, простатической кислой фосфатазы, CAI 9-9, CAI 5-3, NMP22 (ядерные матриксные белки), бета-2-микроглобулина, цитокератина 18. Прибор Biomerieux mini VIDAS, Франция, представляет собой мультипараметрический автоматический иммуноанализатор, основанный на технологии энзим-связанного иммунофлюоресцентного анализа и предназначен для выполнения "одиночных" тестов. Определение аналитов происходит с высокой чувствительностью (превышающей на несколько порядков чувствительность ИФА), что позволяет значительно снизить время проведения анализа (до 30 мин.). Приборы этого класса представляют собой механическое соединение нескольких анализов, но не одновременный многопараметрический анализ нескольких аналитов в одном образце.For example, to determine the content of several tumor markers, automatic analyzers are used, for example, Awareness Technology Inc., USA, operating on the basis of the ELISA principle and representing an open system for any methods and reagents. The ChemWell analyzer uses standard microplates for all types of reactions and is capable of conducting several parallel studies, including enzyme-linked immunosorbent assay of tumor markers: AFP, CEA, PSA, CA125, CA15-3, CA19-9, CA242, ferritin, hCG, NSE, tissue polypeptide antigen, beta 2-microglobulin in 4 wells. The fully automated microplate ELISA analyzer Stat Fax 3200 provides the construction of calibration curves, the procedure for calculating the results, subtracting the background, etc., allows up to 12 parallel tests simultaneously. The Lumi Stat immunochemiluminescent strip analyzer - CLIA is used to determine 11 tumor markers of CEA, PSAobs, PSAsobvod, CAI25, AFP, prostatic acid phosphatase, CAI 9-9, CAI 5-3, NMP22 (nuclear matrix proteins), beta-2- microglobulin, cytokeratin 18. Biomerieux mini VIDAS, France, is a multi-parameter automatic immunoassay based on enzyme-linked immunofluorescence assay technology and designed to perform “single” tests. The determination of analytes occurs with high sensitivity (exceeding the sensitivity of ELISA by several orders of magnitude), which can significantly reduce the analysis time (up to 30 minutes). Instruments of this class represent a mechanical combination of several analyzes, but not a simultaneous multi-parameter analysis of several analytes in one sample.

Описано одновременное определение нескольких белковых онкомаркеров с помощью полностью автоматизированных систем Elecsys компании Roche Diagnostics, США/Швейцария, Luminex, США/Нидерланды, и AxSYM компании Abbott, США. Система Elecsys использует принцип гетерогенного иммунохимического анализа на основе электрохемилюминесцентной диагностики - аналитические полоски или микроколонки для аффинной хроматографии. Анализатор Luminex (США) основан на принципе проточной флуориметрии микросфер с иммобилизованными на поверхности лигандами (с использованием различных типов взаимодействия: комплементарное взаимодействие нуклеиновые кислот и оснований, взаимодействие лиганд-рецептор, образование иммунокомплексов, ферментативные реакции), что позволяет проводить одновременный анализ до 100 различных аналитов. Автоматизированные системы AxSYM основаны на иммуноферментном анализе на микрочастицах и/или флюоресцентном поляризационном иммуноферментном анализе. Они обеспечивают быстрое время получения результата (8-30 мин) и высокую производительность (от 80 до 120 тестов в час). Недостатком анализаторов Roche Diagnostics, Luminex и Abbott является то, что они представляют собой «закрытые» системы, состоящие из прибора-анализатора и набора реагентов к нему (используются пробирки, микроколонки, полоски и прочие реагенты только данной фирмы, предназначенные для данной системы или данного конкретного прибора), а также их высокая стоимость (от нескольких десятков до сотен тысяч долларов США), высокие требования к квалификации персонала, что не позволяет их внедрить в широкую клиническую практику. К недостаткам всех анализаторов относится большой объем сыворотки крови, забираемой на анализ (свыше 100 мкл на один онкомаркер).The simultaneous determination of several protein tumor markers using fully automated Elecsys systems from Roche Diagnostics, USA / Switzerland, Luminex, USA / Netherlands, and AxSYM from Abbott, USA, is described. The Elecsys system uses the principle of heterogeneous immunochemical analysis based on electrochemiluminescent diagnostics - analytical strips or microcolumns for affinity chromatography. The Luminex analyzer (USA) is based on the principle of flow fluorimetry of microspheres with ligands immobilized on the surface (using various types of interaction: complementary interaction of nucleic acids and bases, ligand-receptor interaction, formation of immunocomplexes, enzymatic reactions), which allows simultaneous analysis of up to 100 different analytes. AxSYM automated systems are based on enzyme-linked immunosorbent assay on microparticles and / or fluorescence polarization enzyme-linked immunosorbent assay. They provide quick time to obtain the result (8-30 minutes) and high performance (from 80 to 120 tests per hour). The disadvantage of Roche Diagnostics, Luminex and Abbott analyzers is that they are "closed" systems consisting of an analyzer and a set of reagents for it (tubes, microcolumns, strips and other reagents of only this company are used, designed for this system or this specific device), as well as their high cost (from several tens to hundreds of thousands of US dollars), high requirements for staff qualifications, which does not allow them to be introduced into wide clinical practice. The disadvantages of all analyzers include a large amount of blood serum taken for analysis (over 100 μl per tumor marker).

Диагностика онкозаболеваний по наличию в сыворотке крови человека антител к онкоассоциированным гликанам - перспективная область онкодиагностики, активно развивается с 2010 г. Антитела к онкоассоциированным гликанам (AGA) оказались перспективными маркерами ряда заболеваний, например, рак яичников (Jacob, Francis et al. 2012. "Serum Antiglycan Antibody Detection of Nonmucinous Ovarian Cancers by Using a Printed Glycan Array." International Journal of Cancer 130(1): 138-46).Diagnosis of oncological diseases by the presence of antibodies to cancer-associated glycans in human blood serum is a promising area of cancer diagnostics, has been actively developing since 2010. Antibodies to cancer-associated glycans (AGA) have proven to be promising markers of a number of diseases, for example, ovarian cancer (Jacob, Francis et al. 2012. " Serum Antiglycan Antibody Detection of Nonmucinous Ovarian Cancers by Using a Printed Glycan Array. "International Journal of Cancer 130 (1): 138-46).

Учитывая тот факт, что большинство белковых маркеров не являются специфичными по отношению к локализации и типу опухоли, необходимо их объединить в группы в конкретных сочетаниях - так называемые диагностические и прогностические сигнатуры (комбинации белковых онкомаркеров и антител к гликанам), способные решить проблему специфичности, ранней и более точной диагностики КРР.Given the fact that most protein markers are not specific for the location and type of tumor, it is necessary to combine them into groups in specific combinations - the so-called diagnostic and prognostic signatures (combinations of protein tumor markers and antibodies to glycans) that can solve the problem of specificity, early and more accurate diagnosis of CRC.

Поиск и отбор специфичных антител к гликановым структурам при КРР имеет высокую клиническую значимость и открывает новые возможности диагностического сопровождения процесса онкотерапии, определяет стратегию и тактику лечения, ход и возможный исход болезни. Это связано с тем, что антитела к гликанам обнаруживаются в сыворотке крови на ранних стадиях рака (Chapman С, Murray A, Chakrabarti J, et al. Autoantibodies in breast cancer: Their use as an aid to early diagnosis. Ann. Oncol. 2007;18(5):868-873. Chapman CJ, Murray A, McElveen JE, et al. Autoantibodies in lung cancer: possibilities for early detection and subsequent cure. Thorax. 2008; 63(3):228-233).Search and selection of specific antibodies to glycan structures in CRC is of high clinical importance and opens up new possibilities for the diagnostic support of the oncotherapy process, determines the treatment strategy and tactics, the course and possible outcome of the disease. This is because antibodies to glycans are found in the blood serum in the early stages of cancer (Chapman C, Murray A, Chakrabarti J, et al. Autoantibodies in breast cancer: Their use as an aid to early diagnosis. Ann. Oncol. 2007; 18 (5): 868-873. Chapman CJ, Murray A, McElveen JE, et al. Autoantibodies in lung cancer: possibilities for early detection and subsequent cure. Thorax. 2008; 63 (3): 228-233).

В настоящее время для проведения масштабных исследований связывания антител AGA с гликанами наиболее часто используется твердофазный иммуноанализ на плашке (Shilova NV, Galanina ОЕ, Pochechueva TV, et al. High molecular weight neoglycoconjugates for solid phase assays. Glycoconj. J. 2005; 22:43-51).Currently, solid-state plate immunoassays (Shilova NV, Galanina OE, Pochechueva TV, et al. High molecular weight neoglycoconjugates for solid phase assays. Glycoconj. J. 2005; 22:43 -51).

Как и в случае анализа белковых онкомаркеров, для определения антител AGA существует потребность в быстром и автоматическом анализе сыворотки крови пациента. Например, компания SCIEX (США) выпустила автоматический анализатор определения антител AGA с использованием магнитных частиц. К недостаткам этого метода относится возможность определения только AGA к N- гликанам.As in the case of the analysis of protein tumor markers, for the determination of AGA antibodies there is a need for a quick and automatic analysis of the patient's blood serum. For example, SCIEX (USA) has released an automatic analyzer for the determination of AGA antibodies using magnetic particles. The disadvantages of this method include the possibility of determining only AGA for N-glycans.

В настоящее время задача проведения многопараметрического анализа при минимальном объеме тестируемого образца решается при использовании биологических микрочипов - массивов элементов, содержащих иммобилизованные биологические зонды (ДНК, белки, олигосахариды, олигонуклеотиды и т.д.). Создание биочипов позволило осуществить перенос макроварианта иммунохимического анализа в формат микрочипа и проводить одновременный количественный анализ биологического образца для определения концентраций нескольких анализируемых веществ, что заменяет несколько индивидуальных иммунохимических тестов. Использование технологии микрочипов для проведения лабораторных исследований позволяет миниатюризовать и упростить процедуру анализа, в частности, для анализа белковых онкомаркеров и антител к онкоассоциированным гликанам в сыворотке крови, по сравнению с другими in vitro тестами. Разработка микрочипов для диагностики/скрининга КРР тесно связана с развитием технологии биочипов, позволяющих проводить мультиплексное исследование аналита как на наличие белковых онкомаркеров, так и на наличие антител к гликанам.Currently, the task of conducting multi-parameter analysis with a minimum volume of the test sample is solved using biological microarrays - arrays of elements containing immobilized biological probes (DNA, proteins, oligosaccharides, oligonucleotides, etc.). The creation of biochips allowed the transfer of the macro variant of immunochemical analysis into the microchip format and the simultaneous quantitative analysis of a biological sample to determine the concentrations of several analytes, which replaces several individual immunochemical tests. The use of microarray technology for laboratory research allows us to miniaturize and simplify the analysis procedure, in particular, for the analysis of protein tumor markers and antibodies to onco-associated glycans in blood serum, in comparison with other in vitro tests. The development of microarrays for the diagnosis / screening of CRC is closely related to the development of biochip technology that allows for the multiplex study of the analyte for the presence of protein tumor markers and for the presence of antibodies to glycans.

Иммунохимический принцип лежит в основе мультиплексного анализа анти-гликановых антител на биочипах, ячейки которых содержат иммобилизованные гликаны. Активность в данной области резко возросла благодаря развитию методологии, которая позволяет наносить на микрочип (размером 25х 75 мм) несколько сот различных гликанов (Blixt, Ola et al. 2004. "Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(49):17033-38. Jacob, Francis et al. 2012. "Serum Antiglycan Antibody Detection of Nonmucinous Ovarian Cancers by Using a Printed Glycan Array." International Journal of Cancer 130(1):138-46. Pochechueva, Tatiana, Francis Jacob, Andre Fedier, and Viola Heinzelmann-Schwarz. 2012. "Tumor-Associated Glycans and Their Role in Gynecological Cancers: Accelerating Translational Research by Novel High-Throughput Approaches." Metabolites 2(4):913-39. Galanina, О.E., M. Mecklenburg, N.E. Nifantiev, G. V Pazynina, and Ν. V Bovin. 2003. "GlycoChip: Multiarray for the Study of Carbohydrate-Binding Proteins." Lab on a chip 3(4):260-65).The immunochemical principle underlies the multiplex analysis of anti-glycan antibodies on biochips, the cells of which contain immobilized glycans. Activity in this area has increased dramatically thanks to the development of a methodology that allows several hundred different glycans to be applied to a microchip (25x75 mm in size) (Blixt, Ola et al. 2004. "Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101 (49): 17033-38. Jacob, Francis et al. 2012. "Serum Antiglycan Antibody Detection of Nonmucinous Ovarian Cancers by Using a Printed Glycan Array." International Journal of Cancer 130 (1): 138-46. Pochechueva, Tatiana, Francis Jacob, Andre Fedier, and Viola Heinzelmann-Schwarz. 2012. "Tumor-Associated Glycans and Their Role in Gynecological Cancers: Accelerating Translational Research by Novel High-Throughput Approaches." Metabolites 2 (4): 913-39. Galanina, O.E., M. Mecklenburg, NE Nifantiev, G . V Pazynina, and Ν. V Bovin. 2003. "GlycoChip: Multiarray for the Study of Carbohydrate-Binding Proteins." Lab on a chip 3 (4): 260-65).

В большинстве работ, посвященных анализу антигликановых антител, иммунохимическое определение антител проводят в сыворотках здоровых доноров, микрочипы являются двумерными, т.е. иммобилизованные гликаны находятся на поверхности носителя (стекла, пластика); при этом гликаны могут быть либо адсорбированы, либо ковалентно связаны с подложкой. Для иммобилизации гликанов используется два основных метода: химическая иммобилизация на твердой поверхности и иммобилизация гликана через спейсер (линкер). В настоящее время существует несколько платформ, которые используют для печати гликановых микрочипов.In the majority of works devoted to the analysis of antiglycan antibodies, the immunochemical determination of antibodies is carried out in the sera of healthy donors, microchips are two-dimensional, i.e. immobilized glycans are on the surface of the carrier (glass, plastic); wherein the glycans can be either adsorbed or covalently bonded to the substrate. Two basic methods are used to immobilize glycans: chemical immobilization on a solid surface and immobilization of glycan through a spacer (linker). Currently, there are several platforms that are used for printing glycan microchips.

Косорциум функциональной гликомики (www. functionalglycomic.org), например, использует NHS-активированные стеклянные слайды для печати гликанов, содержащих аминогруппу. Другие научные группы используют эпоксиактивированные слайды (Роhl NL. Fluorous tags catching on microarrays. Angew Chem Int Ed Engl. 2008; 47:3868-3870.), фторидные слайды (Ko KS, Jaipuri FA, Pohl NL. Fluorous-based carbohydrate microarrays. J Am Chem Soc. 2005;127:13162-13163; Feizi T, Chai W. Oligosaccharide microarrays to decipher the glyco code. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004; 5:582-588.), слайды, покрытые нитроцеллюлозой (Feizi Τ, Fazio F, Chai W, et al. Carbohydrate microarrays - a new set of technologies at the frontiers of glycomics. Curr Opin Struct Biol. 2003;13:637-645; Fukui S, Feizi T, Galustian C, et al. Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of carbohydrate-protein interactions. Nat Biotechnol. 2002;20:1011-1017; Padler-Karavani V, Song X, Yu H, et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 2012; 287:22593-22608.). Причем, для разных условий определения AGA требуются разные платформы для иммобилизации гликанов. Биочипы напечатанные на разных платформах из одинаковых библиотек гликанов часто показывают разные сигналы для гликан связывающих белков, разную специфичность и чувствительность проводимого анализа (Liu Y, Childs RA, Palma AS, et al. Neoglycolipid-based oligosaccharide microarray system: preparation of NGLs and their noncovalent immobilization on nitrocellulose-coated glass slides for microarray analyses. Methods Mol Biol. 2012; 808:117-136.), прямое сравнение сигналов от двух разных платформ часто вводит в заблуждение. Для печати гликанов на нитроцеллюлозной (Edwards HD, Nagappayya SK, Pohl NLB. Probing the limitations of the fluorous content for tag-mediated microarray formation. Chem Commun. 2012; 48:510-512.) и фторидной платформах (Blixt, О., Head, S., Mondala, T., Scanlan, С., Huflejt, M.E., Alvarez, R., Bryan, M.C., Fazio, F., Calarese, D., Stevens, J., Razi, N., Stevens, D.J., Skehel, J.J., van Die, I.,Burton, D.R., Wilson, I.A., Cummings, R., Bovin, N.,Wong, C.H., and Paulson, J.C. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101:17033-17038.) необходима липидная компонента, чтобы гликан мог связываться с GBPs. К преимуществам гликочипов на нитроцеллюлозной мембране можно отнести трехмерное расположение иммобилизованного гликана, но это утверждение спорно, т.к. необходимо следить за влажностью камеры, где хранится гликочип. Пересыхание микрочипа ведет к ложным результатам последующего иммуноанализа GBPs.The Functional Glycomics Cosortium (www. Functionalglycomic.org), for example, uses NHS-activated glass slides to print glycans containing an amino group. Other research groups use epoxy-activated slides (Pohl NL. Fluorous tags catching on microarrays. Angew Chem Int Ed Engl. 2008; 47: 3868-3870.), Fluoride slides (Ko KS, Jaipuri FA, Pohl NL. Fluorous-based carbohydrate microarrays. J Am Chem Soc. 2005; 127: 13162-13163; Feizi T, Chai W. Oligosaccharide microarrays to decipher the glyco code. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004; 5: 582-588.), Slides coated with nitrocellulose (Feizi Τ , Fazio F, Chai W, et al. Carbohydrate microarrays - a new set of technologies at the frontiers of glycomics. Curr Opin Struct Biol. 2003; 13: 637-645; Fukui S, Feizi T, Galustian C, et al. Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of carbohydrate-protein interactions. Nat Biotechnol. 2002; 20: 1011-1017; Padler-Karavani V, Song X, Yu H, et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two nov el sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 2012; 287: 22593-22608.). Moreover, for different conditions for determining AGA, different platforms for immobilizing glycans are required. Biochips printed on different platforms from the same glycan libraries often show different signals for glycan binding proteins, different specificity and sensitivity of the analysis (Liu Y, Childs RA, Palma AS, et al. Neoglycolipid-based oligosaccharide microarray system: preparation of NGLs and their noncovalent immobilization on nitrocellulose-coated glass slides for microarray analyses. Methods Mol Biol. 2012; 808: 117-136.), direct comparison of signals from two different platforms is often misleading. For printing glycans on nitrocellulose (Edwards HD, Nagappayya SK, Pohl NLB. Probing the limitations of the fluorous content for tag-mediated microarray formation. Chem Commun. 2012; 48: 510-512.) And fluoride platforms (Blixt, O., Head, S., Mondala, T., Scanlan, C., Huflejt, ME, Alvarez, R., Bryan, MC, Fazio, F., Calarese, D., Stevens, J., Razi, N., Stevens, DJ, Skehel, JJ, van Die, I., Burton, DR, Wilson, IA, Cummings, R., Bovin, N., Wong, CH, and Paulson, JC Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins . Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101: 17033-17038.) A lipid component is required so that glycan can bind to GBPs. The advantages of glycochips on a nitrocellulose membrane include the three-dimensional arrangement of immobilized glycan, but this statement is debatable, because it is necessary to monitor the humidity of the chamber where the glycochip is stored. Drying of the microchip leads to false results of subsequent immunoassay of GBPs.

В международной патентной заявке Vuskovic M., M. Huflejt (US 2014/0087957 A1) описан способ диагностики и мониторинга нескольких десятков онкологических заболеваний по изменению уровня антигликановых антител nAbs к более чем 500 гликановым структурам в различных биологических жидкостях человека, причем гликаны с любыми спейсерными группами могут быть иммобилизованы на плашке, биочипах или магнитных частицах. Определение уровня антител к гликанам в сыворотке крови проводят методом твердофазного иммуноанализа. В этой патентной заявке не описаны случаи выявления КРР, к недостаткам также относится отсутствие одновременного количественного определения содержания белковых онкомаркеров, уровней иммуноглобулинов G, А, M и антител к гликанам в сыворотке крови пациента.International patent application Vuskovic M., M. Huflejt (US 2014/0087957 A1) describes a method for diagnosing and monitoring dozens of oncological diseases by changing the level of anti-glycan antibodies nAbs to more than 500 glycan structures in various human biological fluids, and glycans with any spacer groups can be immobilized on a die, biochips or magnetic particles. Determination of the level of antibodies to glycans in blood serum is carried out by the method of solid-phase immunoassay. Cases of detecting CRC are not described in this patent application; the disadvantages also include the lack of a simultaneous quantitative determination of the content of protein tumor markers, levels of immunoglobulins G, A, M and antibodies to glycans in the patient's blood serum.

В международном патенте Blixt О., Head S. (US 2007/0059769 A1) описан биологический микрочип с иммобилизованными гликанами для одновременного анализа антител nAbs к более чем 1000 гликановым структурам и способы иммуноанализа, в которых биочип используется. Описанный в патенте биочип нельзя использовать для количественного анализа антител к гликанам, одновременного проведения количественного анализа белковых онкомаркеров, уровней иммуноглобулинов G, А, М, т.е. для диагностики КРР.International patent Blixt O., Head S. (US 2007/0059769 A1) describes a biological microchip with immobilized glycans for the simultaneous analysis of nAbs antibodies to more than 1000 glycan structures and immunoassay methods in which the biochip is used. The biochip described in the patent cannot be used for the quantitative analysis of antibodies to glycans, while quantitative analysis of protein tumor markers, levels of immunoglobulins G, A, M, i.e. for the diagnosis of CRC.

К недостаткам двумерных чипов относятся денатурация биологических образцов на поверхности носителя и на границе раздела фаз, приводящая к потере функциональной активности биологических образцов, недостаточная концентрация активных гликанов в ячейках микрочипа и, вследствие этого, невысокая чувствительность анализа. Более того, к недостаткам технологии двумерных гликочипов следует отнести невозможность одновременной иммобилизации гликанов и белков на одной подложке.The disadvantages of two-dimensional chips include denaturation of biological samples on the surface of the carrier and at the interface, leading to a loss in the functional activity of biological samples, insufficient concentration of active glycans in the cells of the microchip, and, as a result, low analysis sensitivity. Moreover, the disadvantages of the technology of two-dimensional glycochips include the impossibility of simultaneously immobilizing glycans and proteins on the same substrate.

Коммерческие биочиповые тест-систем для определения антигликановых антител на рынке не представлены.Commercial biochip test systems for determining antiglycan antibodies are not on the market.

Альтернативой двумерным чипам для определения белковых онкомаркеров и антител к гликанам являются микрочипы на основе гидрогелей.An alternative to two-dimensional chips for determining protein tumor markers and antibodies to glycans are hydrogel-based microchips.

Технология разрабатывается в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и основана на одновременном формировании гидрогелевых ячеек с иммобилизацией молекулярных зондов. При этом молекулярные зонды равномерно распределены по всему объему ячейки. За счет развитой поверхности гидрогеля молекулярные зонды иммобилизованы с достаточной плотностью иммобилизации, однако, на значительном удалении друг от друга для нивелирования стерических эффектов. Структура геля предотвращает контакт соединений с гидрофобной подложкой, и обеспечивает нативное водное окружение биологических молекул. Очевидно, что подобный метод иммобилизации замечательно подходит для работы с молекулярными зондами белковой и гликановой природы и по своим характеристикам выгодно отличается от классических методов планарной иммобилизации (Rubina, a Yu et al. Hydrogel-Based Protein Microchips: Manufacturing, Properties, and Applications. BioTechniques. 2003; 34(5):1008-1014; Dyukova V.I., Dementieva E.I., Zubtsov D.A., Galanina O.E., Bovin N.V., Rubina A.Y. Hydrogel glycan microarrays. Anal. Biochem. 2005;347 (1): 94-105).The technology is being developed at the Institute of Molecular Biology named after V.A. Engelhardt RAS (IMB RAS) and is based on the simultaneous formation of hydrogel cells with the immobilization of molecular probes. In this case, the molecular probes are uniformly distributed throughout the cell volume. Due to the developed surface of the hydrogel, molecular probes are immobilized with a sufficient immobilization density, however, at a considerable distance from each other to level steric effects. The gel structure prevents contact of the compounds with the hydrophobic substrate, and provides a native aqueous environment of biological molecules. Obviously, this method of immobilization is great for working with molecular probes of protein and glycan nature and in its characteristics compares favorably with the classical methods of planar immobilization (Rubina, a Yu et al. Hydrogel-Based Protein Microchips: Manufacturing, Properties, and Applications. BioTechniques . 2003; 34 (5): 1008-1014; Dyukova VI, Dementieva EI, Zubtsov DA, Galanina OE, Bovin NV, Rubina AY Hydrogel glycan microarrays. Anal. Biochem. 2005; 347 (1): 94-105).

После завершения процедуры полимеризации молекулярные зонды с достаточной эффективностью ковалентно закреплены в гелевой сетке и распределены по ней равномерно (Зубцова Ж.И., Цыбульская М.В., Савватеева Е.Н., Бутвиловская В.И. и др. Анализ девяти серологических онкомаркеров на гидрогелевом Биочипе. Биоорганическая Химия. 2013; 39(6):693-704).After completion of the polymerization procedure, the molecular probes with sufficient efficiency are covalently fixed in the gel network and distributed evenly on it (Zubtsova Zh.I., Tsybulskaya MV, Savvateeva EN, Butvilovskaya VI, etc. Analysis of nine serological tumor markers on a hydrogel biochip. Bioorganic Chemistry. 2013; 39 (6): 693-704).

Недостатки способов диагностики колоректального рака, а так же недостатки микрочипов для анализа белковых онкомаркеров и антигликановых антител, известные из уровня техники, преодолены настоящим изобретением, обеспечивающим способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе.The disadvantages of the methods for diagnosing colorectal cancer, as well as the disadvantages of microarrays for the analysis of protein oncomarkers and antiglycan antibodies, known from the prior art, are overcome by the present invention, which provides a method for the diagnosis of colorectal cancer, based on the simultaneous quantitative determination of tumor markers of protein nature, antibodies to glycans, immunoglobulins G, A and M in human blood on a biological microchip.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

(Disclosure of Invention)(Disclosure of Invention)

Первым аспектом изобретения является способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, содержащем гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами к белковым онкомаркерам, гидрогелевые элементы с иммобилизованными гликанами, гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М, где изменение уровня анализируемых маркеров по сравнению с уровнем маркеров в сыворотке крови здоровых доноров, свидетельствует о колоректальном раке.The first aspect of the invention is a method for the diagnosis of colorectal cancer, based on the simultaneous quantitative determination of tumor markers of protein nature, antibodies to glycans, immunoglobulins G, A and M in human blood on a biological microchip containing hydrogel elements with immobilized antibodies to protein oncomarkers, hydrogel elements with immobilized glycans hydrogel elements with immobilized antibodies against human immunoglobulins of classes G, A, M, where the change in the level of analyzed m rkerov compared to the level of the markers in the serum of healthy donors suggests colorectal cancer.

В одном из воплощений способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, осуществляется в формате сэндвич-иммуноанализа и включает проведение нескольких стадий:In one of the embodiments, a method for the diagnosis of colorectal cancer, based on the simultaneous quantitative determination of tumor markers of protein nature, antibodies to glycans, immunoglobulins G, A and M in human blood on a biological microchip, is carried out in the format of a sandwich immunoassay and includes several stages:

а) инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу соединения, для образования иммунных комплексов с иммобилизованными на микрочипе лигандами;a) incubation of the biological microchip in the reaction medium, including a sample containing compounds to be analyzed, for the formation of immune complexes with ligands immobilized on the microchip;

б) детекцию образовавшегося комплекса;b) detection of the resulting complex;

в) количественное определение анализируемого соединения.c) quantification of the analyte.

В случае сэндвич-иммуноанализа белковых онкомаркеров биологический микрочип содержит иммобилизованные антитела, каждое из которых специфически взаимодействует с тем или иным определяемым аналитом, реакционная среда на стадии а) содержит анализируемое соединение, на данной стадии происходит образование специфического комплекса антиген - иммобилизованное антитело. При необходимости эту стадию проводят в условиях перемешивания, что значительно ускоряет проведение иммуноанализа.In the case of sandwich immunoassay of protein tumor markers, the biological microchip contains immobilized antibodies, each of which specifically interacts with one or another analyte being determined, the reaction medium in stage a) contains the analyte, and at this stage a specific complex of antigen - immobilized antibody is formed. If necessary, this stage is carried out under stirring conditions, which greatly accelerates the immunoassay.

После образования комплекса на стадии б) микрочип проявляют мечеными антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого соединения. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа.After complex formation in step b), the microchip is developed with labeled antibodies specific for another epitope of the analyte. The higher the concentration of the analyte in the sample, the higher the signal recorded from the corresponding gel cells of the microchip.

В случае сэндвич-иммуноанализа антител к гликанам, биологический микрочип содержит иммобилизованные гликаны против анализируемого соединения, реакционная среда на стадии а) содержит анализируемое соединение, и происходит образование специфического комплекса антитело - иммобилизованный гликан. После образования комплекса микрочип проявляют мечеными антивидовыми антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого антитела. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа.In the case of a sandwich immunoassay of antibodies to glycans, the biological microchip contains immobilized glycans against the analyte, the reaction medium in step a) contains the analyte, and a specific antibody-immobilized glycan complex forms. After complex formation, the microchip is developed with labeled antispecies antibodies specific for another epitope of the analyzed antibody. The higher the concentration of the analyte in the sample, the higher the signal recorded from the corresponding gel cells of the microchip.

Для количественного определения анализируемых соединений на стадии в) стадии а)-б) проводят со стандартными (эталонными) образцами, содержащими известные концентрации анализируемого соединения и строят калибровочную зависимость регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого соединения (калибровочную кривую), по которой определяют содержание анализируемого соединения в образце.For the quantitative determination of the analyzed compounds in stage c), stages a) -b) are carried out with standard (reference) samples containing known concentrations of the analyzed compound and the calibration dependence of the recorded signal on the concentration of the analyzed compound is constructed (calibration curve), which determines the content of the analyzed compound in sample.

Детекцию результатов иммуноанализа осуществляют флуориметрически. Антитела и другие соединения, используемые для детекции, могут содержать флуоресцентные метки, биотин или являться конъюгатами с белками или другими соединениями, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хеми- или биолюминесценции).The detection of immunoassay results is carried out fluorimetrically. Antibodies and other compounds used for detection may contain fluorescent labels, biotin, or conjugates to proteins or other compounds capable of participating in reactions leading to light emission (chemiluminescence or bioluminescence).

Чувствительность предлагаемого множественного параллельного иммуноанализа соединений на биологическом микрочипе не уступает чувствительности стандартного варианта иммуноанализа, например, в формате микротитровального планшета (Таблица 1)·The sensitivity of the proposed multiple parallel immunoassay of compounds on a biological microchip is not inferior to the sensitivity of the standard variant of immunoassay, for example, in the format of a microtiter tablet (Table 1)

Таким образом, способ, предлагаемый в настоящем изобретении, позволяет проводить диагностику колоректального рака, основанную на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, содержащем гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами к белковым онкомаркерам, гидрогелевые элементы с иммобилизованными гликанами, гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М, где изменение концентрации анализируемых маркеров по сравнению с контрольным образцом, полученным от здорового человека, свидетельствует о колоректальном раке.Thus, the method proposed in the present invention allows the diagnosis of colorectal cancer, based on the simultaneous quantitative determination of tumor markers of protein nature, antibodies to glycans, immunoglobulins G, A and M in human blood on a biological microchip containing hydrogel elements with immobilized antibodies to protein tumor markers, hydrogel elements with immobilized glycans, hydrogel elements with immobilized antibodies against human immunoglobulins of classes G, A, M, g de change in the concentration of the analyzed markers in comparison with the control sample obtained from a healthy person indicates colorectal cancer.

Вторым аспектом изобретения является биологический микрочип для диагностики колоректального рака. Биологический микрочип представляет собой массив трехмерных гидрогелевых элементов, расположенных на подложке из стекла, пластика металла. Трехмерные гидрогелевые элементы микрочипа ковалентно закреплены на поверхности подложки и отделены друг от друга гидрофобной поверхностью подложки, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизовано индивидуальное соединение. В каждом гелевом элементе содержится иммобилизованный лиганд белковой или небелковой природы, который при инкубации микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу соединения, образует специфический иммунный комплекс типа «антиген-антитело». На этой стадии происходит разделение анализируемых соединений из смеси по их способности к специфическому связыванию с иммобилизованными лигандами, что позволяет проводить одновременный, параллельный анализ нескольких объектов на одном микрочипе.A second aspect of the invention is a biological microchip for the diagnosis of colorectal cancer. The biological microchip is an array of three-dimensional hydrogel elements located on a substrate of glass, metal plastic. Three-dimensional hydrogel elements of the microchip are covalently attached to the surface of the substrate and are separated from each other by the hydrophobic surface of the substrate, and an individual compound is immobilized in each individual cell. Each gel element contains an immobilized ligand of a protein or non-protein nature, which, when the microchip is incubated in a reaction medium including a sample containing compounds to be analyzed, forms a specific antigen-antibody immune complex. At this stage, the analyzed compounds are separated from the mixture by their ability to specifically bind to immobilized ligands, which allows simultaneous, parallel analysis of several objects on the same microchip.

Трехмерные гелевые элементы обладают значительно большей емкостью по сравнению с элементами двумерных микрочипов, что увеличивает чувствительность анализа. Гидрофильное окружение иммобилизованных в структуре гидрогеля лигандов стабилизирует их структуру, что позволяет им полностью сохранять свою биологическую активность.Three-dimensional gel elements have a significantly higher capacity compared to elements of two-dimensional microarrays, which increases the sensitivity of the analysis. The hydrophilic environment of the ligands immobilized in the hydrogel structure stabilizes their structure, which allows them to fully maintain their biological activity.

Лиганды, иммобилизованные в гидрогелевых ячейках биологического микрочипа, выбирают из группы, включающей антитела любого типа и антигены различной природы.Ligands immobilized in the hydrogel cells of a biological microchip are selected from the group consisting of antibodies of any type and antigens of various nature.

В качестве исследуемых объектов для количественного иммунологического анализа колоректального рака согласно изобретению предпочтительно предлагаются:The following are preferably proposed as test subjects for the quantitative immunological analysis of colorectal cancer according to the invention:

- опухолеассоциированные антигены (РЭА, СА 19-9, СА 125, SCCA1 (SPB 3), SCCA2 (SPB 4), ПСА общ., ПСА своб., ХГЧ, АФП, СА 242), являющиеся маркерами онкозаболеваний;- tumor associated antigens (CEA, CA 19-9, CA 125, SCCA1 (SPB 3), SCCA2 (SPB 4), PSA total., PSA free., hCG, AFP, CA 242), which are markers of cancer;

- иммуноглобулины человека классов G, А, М;- human immunoglobulins of classes G, A, M;

- антитела к различным гликанам (SiaTn, TF, Tn, LeC, LeY, SiaLeA, Manβ1-4GlcNAc, Galal-4Galβ1-4GlcNAcβ).- antibodies to various glycans (SiaT n , TF, T n , Le C , Le Y , SiaLe A , Manβ1-4GlcNAc, Galal-4Galβ1-4GlcNAcβ).

Для иммуноанализа опухолеассоциированных антигенов - маркеров колоректального рака в качестве иммобилизованных лигандов используют антитела к указанным опухолеассоциированным антигенам и/или сами опухолеассоциированные антигены. Для иммунологического определения иммуноглобулинов человека классов G, А, М, например, при определении иммунного статуса организма, в качестве иммобилизованных лигандов биологического микрочипа используют антитела против иммуноглобулинов G, А, М, человека и/или иммуноглобулины G, А, М, человека. Для иммуноанализа антител к различным гликанам, иммобилизованными лигандами биологического микрочипа являются гликаны.For immunoassay of tumor-associated antigens - markers of colorectal cancer, antibodies to the indicated tumor-associated antigens and / or tumor-associated antigens themselves are used as immobilized ligands. For immunological determination of human immunoglobulins of classes G, A, M, for example, when determining the immune status of an organism, antibodies against immunoglobulins G, A, M, human and / or immunoglobulins G, A, M, human are used as immobilized ligands of a biological microchip. For immunoassay of antibodies to various glycans, glycans are immobilized ligands of a biological microchip.

Биологический микрочип допускает одновременное и параллельное проведение иммунохимических реакций таких, как одновременное взаимодействие иммобилизованного антитела с белковым онкомаркером, присутствующим в сыворотке крови, взаимодействие иммобилизованного гликана с антителом, присутствующим в том же образце сыворотки крови, одновременное взаимодействие иммобилизованного антитела к иммуноглобулину человека, например, класса G с иммуноглобулином данного класса, находящимся в том же образце сыворотки крови.A biological microchip allows simultaneous and parallel immunochemical reactions, such as the simultaneous interaction of an immobilized antibody with a protein tumor marker present in blood serum, the interaction of immobilized glycan with an antibody present in the same blood serum, the simultaneous interaction of an immobilized antibody to a human immunoglobulin, for example, class G with an immunoglobulin of this class located in the same serum sample.

В другом воплощении предусмотрено последовательное проведение иммунохимических реакций, например, иммобилизованного антитела с белковым онкомаркером, присутствующим в сыворотке крови на одном кластере биочипа и взаимодействие иммобилизованного гликана с антителом, присутствующим в сыворотке крови, одновременно с взаимодействием иммобилизованного антитела к иммуноглобулину человека, например, класса G с иммуноглобулином, находящимся в же образце сыворотки крови.In another embodiment, sequential immunochemical reactions are provided, for example, an immobilized antibody with a protein oncomarker present in the blood serum on one biochip cluster and the interaction of the immobilized glycan with an antibody present in the blood serum, simultaneously with the interaction of the immobilized antibody to human immunoglobulin, for example, class G with immunoglobulin in the same serum sample.

Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры и примеры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.Further, the invention will be disclosed in more detail with reference to the figures and examples, which are given solely for the purpose of illustrating and explaining the essence of the claimed invention, but which are not intended to limit the scope of claims.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов классов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, содержащем гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами к белковым онкомаркерам, гидрогелевые элементы с иммобилизованными гликанами, гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М, где изменение уровня анализируемых маркеров по сравнению с уровнем маркеров в сыворотке крови здоровых доноров, свидетельствует о колоректальном раке.The present invention provides a method for the diagnosis of colorectal cancer based on the simultaneous quantitative determination of protein markers of oncology, antibodies to glycans, class G, A and M immunoglobulins in human blood on a biological microchip containing hydrogel elements with immobilized antibodies to protein tumor markers, hydrogel elements with immobilized glycans , hydrogel elements with immobilized antibodies against human immunoglobulins of classes G, A, M, where the level change is analyzed markers compared with the level of markers in the blood serum of healthy donors indicates colorectal cancer.

Способ диагностики/скрининга колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении концентрации онкомаркеров белковой природы, уровней антител к гликанам, уровней иммуноглобулинов G, А, M в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе, заключается в проведении иммуноанализа сыворотки крови человека на биологическом микрочипе, и предусматривает:A method for the diagnosis / screening of colorectal cancer, based on the simultaneous quantitative determination of the concentration of tumor markers of protein nature, levels of antibodies to glycans, levels of immunoglobulins G, A, M in human blood serum on a biological microchip, consists in conducting immunoassay of human blood serum on a biological microchip, and provides :

а) взаимодействие образца сыворотки крови человека с ячейками биочипа в условиях, обеспечивающих образование специфических иммунных комплексов - соединений, иммобилизованных в гидрогелевых ячейках микрочипа, с соединениями, содержащимися в анализируемом образце;a) the interaction of a sample of human blood serum with biochip cells under conditions providing for the formation of specific immune complexes — compounds immobilized in hydrogel cells of the microchip with compounds contained in the analyzed sample;

б) детекцию образовавшихся иммунных комплексов;b) detection of the formed immune complexes;

в) определение уровней белковых онкомаркеров, антител к гликанам и иммуноглобулинов человека класса G, А, М.c) determination of the levels of protein tumor markers, antibodies to glycans and human immunoglobulins of class G, A, M.

г) диагностирование колоректального рака путем сравнения концентрации белковых онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А, M в анализируемом образце с соответствующими уровнями маркеров в сыворотке крови здоровых доноров.d) the diagnosis of colorectal cancer by comparing the concentration of protein tumor markers, antibodies to glycans, immunoglobulins G, A, M in the analyzed sample with the corresponding levels of markers in the blood serum of healthy donors.

В качестве реакционной среды, обеспечивающей образование специфических иммунных комплексов, выбирают растворы, которые обычно используются при проведении иммуноанализов различного типа, например, фосфатный буфер, трис-HCl и др. Для уменьшения неспецифических взаимодействий в реакционную среду добавляют поливиниловый спирт, сахарозу, бычий сывороточный альбумин, белки сухого молока и другие соединения, хорошо известные специалистам в данной области.As the reaction medium providing the formation of specific immune complexes, choose solutions that are usually used in various types of immunoassays, for example, phosphate buffer, Tris-HCl, etc. To reduce nonspecific interactions, polyvinyl alcohol, sucrose, and bovine serum albumin are added to the reaction medium , milk powder proteins and other compounds well known to those skilled in the art.

Общая процедура проведения иммуноанализа с использованием биологических микрочипов описана в примере 1.The general procedure for immunoassay using biological microarrays is described in example 1.

Детекцию образовавшихся иммунных комплексов предпочтительно осуществляют флуориметрическим методом. В качестве проявляющих антител используют конъюгаты антител против белковых онкомаркеров, конъюгаты антивидовых антител и конъюгаты антител против иммуноглобулинов человека классов G, А, M с флуоресцентными красителями (Пример 2) или конъюгаты антител против белковых онкомаркеров, конъюгаты антивидовых антител и конъюгаты антител против иммуноглобулинов человека классов G, А, M с биотином и флуоресцентно-меченный авидин (стрептавидин) (Примеры 3, 5). В качестве флуоресцентных красителей используют, например, цианиновый 3 (Су3), цианиновый 5 (Су5), флуоресцеин, Texas Red, но не ограничиваясь ими. Флуоресцентные изображения микрочипов после проведения анализа показаны, например, на Фиг. 2А, Фиг. 2В, Фиг. 2С, Фиг. 2Б. Регистрацию флуоресцентных сигналов с ячеек микрочипа проводят с помощью флуоресцентных микроскопов (Пример 1, Пример 4) или сканирующих микроскопов различных типов (Пример 2), позволяющих регистрировать сигнал с используемой флуоресцентной метки.The detection of the formed immune complexes is preferably carried out by the fluorimetric method. Antibody conjugates of antibodies against protein oncomarkers, conjugates of antispecies antibodies and conjugates of antibodies against human immunoglobulins of classes G, A, M with fluorescent dyes (Example 2) or conjugates of antibodies against protein oncomarkers, conjugates of antivirus antibodies and conjugates of antibodies against human immunoglobulins are used as developing antibodies. G, A, M with biotin and fluorescently-labeled avidin (streptavidin) (Examples 3, 5). As fluorescent dyes use, for example, cyanine 3 (Cy3), cyanine 5 (Cy5), fluorescein, Texas Red, but not limited to. Fluorescence images of microarrays after analysis are shown, for example, in FIG. 2A, FIG. 2B, FIG. 2C, FIG. 2B. The registration of fluorescence signals from the cells of the microchip is carried out using fluorescence microscopes (Example 1, Example 4) or scanning microscopes of various types (Example 2), allowing to record the signal from the used fluorescent label.

В качестве образцов для анализа используются разбавленная или неразбавленная сыворотка крови человека, разбавленная или неразбавленная плазма крови человека.As samples for analysis, diluted or undiluted human blood serum, diluted or undiluted human blood plasma are used.

При определении уровней различных иммуноглобулинов способом настоящего изобретения проводят стадии а) и б) с известными концентрациями анализируемых соединений и строят калибровочные зависимости «сигнал от соответствующих элементов микрочипа - концентрация анализируемого соединения», по которым определяют уровни анализируемых соединений (Фиг. 3А, Фиг. 3В).When determining the levels of various immunoglobulins by the method of the present invention, steps a) and b) are carried out with known concentrations of the analyzed compounds and the calibration dependencies “signal from the corresponding elements of the microchip — concentration of the analyzed compound” are constructed, which determine the levels of the analyzed compounds (Fig. 3A, Fig. 3B )

При определении концентрации белковых онкомаркеров способом настоящего изобретения проводят стадии а) и б) с известными концентрациями анализируемых соединений и строят калибровочные зависимости «сигнал от соответствующих элементов микрочипа - концентрация анализируемого соединения», по которым определяют уровни анализируемых соединений (Фиг. 4А, Фиг. 4В).When determining the concentration of protein tumor markers by the method of the present invention, steps a) and b) are carried out with known concentrations of the analyzed compounds and the calibration dependencies “signal from the corresponding elements of the microchip — concentration of the analyzed compound” are constructed, which determine the levels of the analyzed compounds (Fig. 4A, Fig. 4B )

Ниже описан способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M с использованием биологических микрочипов, являющихся предпочтительными воплощениями настоящего изобретения.The following describes a method for the diagnosis of colorectal cancer, based on the simultaneous quantitative determination of tumor markers of protein nature, antibodies to glycans, immunoglobulins G, A and M using biological microarrays, which are preferred embodiments of the present invention.

Биологический микрочип, содержащий элементы с иммобилизованными антителами против онкомаркеров белковой природы, гликанами, антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А и М.A biological microchip containing elements with immobilized antibodies against tumor markers of protein nature, glycans, antibodies against human immunoglobulins of classes G, A and M.

Стадия а) При взаимодействии микрочипа с образцом сыворотки крови человека в элементах с иммобилизованными гликанами одновременно происходит образование иммунных комплексов с иммуноглобулинами G, А, М, специфичными к данным гликанам. В это же время, при взаимодействии микрочипа с образцом сыворотки крови человека в элементах с иммобилизованными антителами против белковых онкомаркеров одновременно происходит образование иммунных комплексов с онкомаркерами, из образца сыворотки крови человека специфичными к данным антителам. В это же время, при взаимодействии микрочипа с образцом сыворотки крови человека в элементах с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, M одновременно происходит образование иммунных комплексов с иммуноглобулинами G, А, M из образца сыворотки крови, специфичными к данным антителам.Stage a) When the microchip interacts with a sample of human blood serum in elements with immobilized glycans, the formation of immune complexes with immunoglobulins G, A, M specific to these glycans occurs simultaneously. At the same time, when a microchip interacts with a sample of human blood serum in elements with immobilized antibodies against protein tumor markers, the formation of immune complexes with tumor markers simultaneously occurs from a human blood sample specific to these antibodies. At the same time, when a microchip interacts with a sample of human blood serum in elements with immobilized antibodies against human immunoglobulins of classes G, A, M, the formation of immune complexes with immunoglobulins G, A, M from a blood serum sample specific to these antibodies occurs.

Стадия б) При обработке (проявлении) конъюгатами антител с флуоресцентным красителем против каждого из онкомаркеров регистрируют сигналы от элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против определяемого онкомаркера и эти сигналы флуоресценции используют далее на стадии в) для определения концентрации онкомаркера.Stage b) When processing (developing) conjugates of antibodies with a fluorescent dye against each of the tumor markers, signals from microchip elements containing immobilized antibodies against the determined tumor marker are recorded and these fluorescence signals are used further in step c) to determine the concentration of the tumor marker.

При обработке (проявлении) конъюгатами меченых антител против иммуноглобулинов G, А, M по сигналу с данного элемента микрочипа (с иммобилизованными антителами к иммуноглобулинам G, А, М) определяют уровень иммуноглобулинов G, А, М.When processing (developing) conjugates of labeled antibodies against immunoglobulins G, A, M, the signal from this microchip element (with immobilized antibodies to immunoglobulins G, A, M) determines the level of immunoglobulins G, A, M.

При обработке (проявлении) конъюгатами меченых антител против иммуноглобулинов G, А, M по сигналу с данного элемента микрочипа (с иммобилизованными гликанами) определяют уровень антител к гликанам.When processing (developing) conjugates of labeled antibodies against immunoglobulins G, A, M by the signal from this element of the microchip (with immobilized glycans), the level of antibodies to glycans is determined.

Для одновременного определения уровней онкомаркеров, антител к гликанам и иммуноглобулинов G, А, M проявляющий раствор может включать смесь антител против онкомаркеров, иммуноглобулинов G, А, М, которые являются конъюгатами с флуоресцентными красителями, излучающими свет в разных областях спектра, например, конъюгатами с Су3 и Су5. Одновременное определение онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А, M возможно также при последовательной обработке микрочипа растворами, содержащими сначала одни меченые антитела, а затем другие меченые антитела, и в этом варианте проявляющие антитела могут содержать как различные, так и одинаковые флуоресцентные метки.To simultaneously determine the levels of tumor markers, antibodies to glycans and immunoglobulins G, A, M, the developing solution may include a mixture of antibodies against tumor markers, immunoglobulins G, A, M, which are conjugates with fluorescent dyes that emit light in different spectral regions, for example, conjugates with Su3 and Su5. The simultaneous determination of tumor markers, antibodies to glycans, immunoglobulins G, A, M is also possible by sequentially processing the microchip with solutions containing first labeled antibodies and then other labeled antibodies, and in this embodiment, the developing antibodies may contain different or the same fluorescent labels .

Стадия в) Для построения калибровочных зависимостей биологический микрочип инкубируют с растворами, содержащими известные концентрации онкомаркеров, и строят зависимости «сигнал от соответствующих элементов микрочипа - концентрация анализируемого соединения», по которым с использованием сигналов флуоресценции, полученных на Стадии б) определяют уровни анализируемых онкомаркеров.Stage c) To build the calibration dependences, the biological microchip is incubated with solutions containing known concentrations of tumor markers, and the dependences “signal from the corresponding elements of the microchip — concentration of the analyte” are built, which determine the levels of the analyzed tumor markers using fluorescence signals obtained in Stage b).

Для построения калибровочных зависимостей биологический микрочип инкубируют с растворами, содержащими известные концентрации иммуноглобулинов G, А, M и строят зависимости «сигнал от соответствующих элементов микрочипа - концентрация анализируемого соединения», по которым по которым с использованием сигналов флуоресценции, полученных на Стадии б) определяют концентрацию анализируемых иммуноглобулинов G, А, M и уровни антител к гликанам.To build the calibration dependences, the biological microchip is incubated with solutions containing known concentrations of immunoglobulins G, A, M and the dependences “signal from the corresponding elements of the microchip — concentration of the analyte” are constructed, according to which the concentration is determined using fluorescence signals obtained in Stage b) analyzed immunoglobulins G, A, M and levels of antibodies to glycans.

Стадия г) Диагностику колоректального рака (Пример 3) осуществляют методом ROC-анализа, путем сравнения концентрации белковых онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А, M (Фиг. 6А, 6В) в анализируемом образце с соответствующими уровнями маркеров в сыворотке крови здоровых доноров (Фиг. 5А, 5В).Stage g) Diagnosis of colorectal cancer (Example 3) is carried out by ROC analysis, by comparing the concentration of protein tumor markers, antibodies to glycans, immunoglobulins G, A, M (Fig. 6A, 6B) in the analyzed sample with the corresponding levels of markers in healthy blood serum donors (Fig. 5A, 5B).

Результаты определения диагностической эффективности способа выявления колоректального рака, основанного на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, содержащем гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами к белковым онкомаркерам, гидрогелевые элементы с иммобилизованными гликанами, гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, M представлены в Таблице 2.The results of determining the diagnostic effectiveness of a method for detecting colorectal cancer based on the simultaneous quantitative determination of tumor markers of protein nature, antibodies to glycans, immunoglobulins G, A and M in human blood on a biological microchip containing hydrogel elements with immobilized antibodies to protein oncomarkers, hydrogel elements with immobilized glycans , hydrogel elements with immobilized antibodies against human immunoglobulins of classes G, A, M are presented in Table e 2.

Настоящее изобретение обеспечивает биологический микрочип для диагностики колоректального рака. Микрочип представляет собой массив трехмерных гидрогелевых элементов в форме микрокапель заданного объема, расположенных на подложке из стекла, пластика или металла. Количество и объем элементов массива определяется количеством анализируемых белковых онкомаркеров, гликанов, иммуноглобулинов и аппаратурой, используемой при получении микрочипов (например, размером пина робота, наносящего капли раствора на подложку) и способом регистрации сигналов (флуоресцентный микроскоп, биочип-анализатор, сканер и др.). Биологические микрочипы для иммунологического анализа соединений изготавливают методом полимеризационной иммобилизации по запатентованной технологии (А.Д. Мирзабеков, А.Ю. Рубина, С.В. Паньков, Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления, Патент РФ №2216547 (Б.И.П.М. №32, 20.11.2003). International Application PCT/RU 01/004204, WO 03/033539), которая позволяет получать микрочипы, содержащие иммобилизованные белки, гликаны и другие соединения. Связывание лиганда с гидрогелевой матрицей возможно как напрямую при его иммобилизации в процессе формирования геля, так и опосредованно. В качестве примеров опосредованного связывания лиганда с гидрогелевой матрицей может служить иммобилизация через образование специфических комплексов типа авидин (стрептавидин) - биотин, например, образование связи между иммобилизованным на гидрогелевой матрице авидином и биотинилированным антителом, или иммобилизация через образование специфических комплексов типа металл - хелатор, например, образование связи между иммобилизованной на гидрогелевой матрице нитрилотриуксусной кислотой со связанным с ней координационными связями атомом никеля и рекомбинантным белком, содержащим полигистидиновый фрагмент, и др.The present invention provides a biological microchip for the diagnosis of colorectal cancer. A microchip is an array of three-dimensional hydrogel elements in the form of microdroplets of a given volume located on a substrate of glass, plastic or metal. The number and volume of array elements is determined by the number of analyzed protein tumor markers, glycans, immunoglobulins and the equipment used to obtain microchips (for example, the size of a robot pin, applying droplets of a solution to a substrate) and the method of recording signals (fluorescence microscope, biochip analyzer, scanner, etc. ) Biological microchips for immunological analysis of compounds are made by polymerization immobilization using a patented technology (A.D. Mirzabekov, A.Yu. Rubin, S.V. Pankov, Method for polymerization immobilization of biological macromolecules and composition for its implementation, RF Patent No. 2216547 (B. I.P.M. No. 32, 11/20/2003). International Application PCT / RU 01/004204, WO 03/033539), which allows to obtain microchips containing immobilized proteins, glycans and other compounds. The binding of the ligand to the hydrogel matrix is possible both directly during its immobilization in the process of gel formation, and indirectly. As examples of indirect binding of a ligand to a hydrogel matrix, immobilization through the formation of specific complexes of the avidin type (streptavidin) - biotin can serve as, for example, the formation of a bond between avidin immobilized on a hydrogel matrix and a biotinylated antibody, or immobilization through the formation of specific metal-chelator complexes, for example , the formation of a bond between nitrilotriacetic acid immobilized on a hydrogel matrix with coordination bonds a nickel volume and recombinant protein containing a polyhistidine fragment, etc.

В качестве лигандов, иммобилизованных в гелевых ячейках, могут выступать соединения белковой и небелковой природы, такие как моноклональные антитела, поликлональные антитела, рекомбинантные антитела, различные типы мини антител, в том числе Fab-фрагменты и одноцепочечные антитела (scFv и другие), иммуноглобулины любого типа (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE), антигены различной природы (белки, гликопротеины, полисахариды и др.), низкомолекулярные вещества. Тип используемых при анализе лигандов определяется рядом факторов, например, аффинностью антител по отношению к данному антигену, стабильностью, возможностью иммобилизации антител и введения в них метки (флуоресцентной метки, ферментной метки путем получения конъюгатов и др.), а также способом проведения анализа (прямой, конкурентный, сэндвич-анализ и др.).Ligands immobilized in gel cells may include compounds of protein and non-protein nature, such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant antibodies, various types of mini antibodies, including Fab fragments and single chain antibodies (scFv and others), immunoglobulins of any type (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE), antigens of various nature (proteins, glycoproteins, polysaccharides, etc.), low molecular weight substances. The type of ligands used in the analysis is determined by a number of factors, for example, the affinity of antibodies to a given antigen, stability, the possibility of immobilization of antibodies and the introduction of a label (fluorescent label, enzyme label by obtaining conjugates, etc.), as well as the method of analysis (direct , competitive, sandwich analysis, etc.).

Биологический микрочип допускает последовательное проведение реакций различного типа. Например, первой реакцией может быть взаимодействие антигена с антителом с образованием двойного комплекса антиген-антитело или тройного комплекса антитело-антиген-антитело для антигенов белковой природы (иммунологическая реакция). Затем, если антитело или антиген содержит ферментную метку, проводится ферментативная реакция, например, окисление люминола перекисью водорода в присутствии усилителей, катализируемое пероксидазой хрена, в результате которой происходит излучение света (хемилюминесценция). В случае, если антитело или антиген является конъюгатом с биотином, после проведения иммунологической реакции можно проводить связывание с конъюгатом стрептавидина с флуоресцентным красителем непосредственно на микрочипе.A biological microchip allows sequential reactions of various types. For example, the first reaction can be the interaction of an antigen with an antibody to form a double antigen-antibody complex or an antibody-antigen-antibody triple complex for protein antigens (immunological reaction). Then, if the antibody or antigen contains an enzyme label, an enzymatic reaction is carried out, for example, the oxidation of luminol with hydrogen peroxide in the presence of amplifiers, catalyzed by horseradish peroxidase, which results in the emission of light (chemiluminescence). If the antibody or antigen is a conjugate with biotin, after the immunological reaction, it is possible to bind to the conjugate of streptavidin with a fluorescent dye directly on the microchip.

В качестве анализируемых объектов для способа диагностики колоректального рака, основанного на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов классов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе по изобретению предпочтительно предлагаются:As the analyzed objects for a method for the diagnosis of colorectal cancer based on the simultaneous quantitative determination of tumor markers of protein nature, antibodies to glycans, immunoglobulins of classes G, A and M in human blood on a biological microchip according to the invention, it is preferably proposed:

опухолеассоциированные антигены, являющиеся маркерами онкологических заболеваний, в том числе колоректального рака, например:tumor-associated antigens that are markers of cancer, including colorectal cancer, for example:

- альфа-фетопротеин (АФП) - маркер рака печени; простата-специфический антиген (PSA), общий и свободный - маркер рака простаты; раковоэмбриональный антиген (РЭА) - маркер рака желудочно-кишечного тракта; раковый антиген 125 (СА 125) - маркер рака яичника, тела матки; раковый антиген 19-9 (СА 19-9) - маркер рака поджелудочной железы; антиген плоскоклеточной карциномы SCCA 1 (SPB 3)- маркер плоскоклеточного рака шейки матки, рака головы и шеи; антиген плоскоклеточной карциномы SCCA 2 (SPB 4)- маркер плоскоклеточного рака шейки матки, рака головы и шеи; хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) - маркер рака; раковый антиген СА 242- маркер рака кишечника;- alpha-fetoprotein (AFP) - a marker of liver cancer; prostate-specific antigen (PSA), general and free, is a marker of prostate cancer; cancer embryonic antigen (CEA) - a marker of gastrointestinal cancer; cancer antigen 125 (CA 125) - a marker of cancer of the ovary, uterine body; cancer antigen 19-9 (CA 19-9) - a marker for pancreatic cancer; SCCA 1 squamous cell carcinoma antigen (SPB 3) - a marker of squamous cervical cancer, head and neck cancer; SCCA 2 squamous cell carcinoma antigen (SPB 4) - a marker for squamous cell carcinoma of the cervix uteri, head and neck cancer; human chorionic gonadotropin (hCG) is a marker of cancer; CA 242 cancer antigen, a marker of bowel cancer;

- иммуноглобулины человека классов G, А, М;- human immunoglobulins of classes G, A, M;

- антитела против гликанов (SiaTn, TF, Tn, LeC, LeY, SiaLeA, Manβ1-4GlcNAc);- antibodies against glycans (SiaT n , TF, T n , Le C , Le Y , SiaLe A , Manβ1-4GlcNAc);

Биочип для диагностики колоректального рака может содержать как один кластер, содержащий иммобилизованные антитела к белковым онкомаркерам, гликаны, антитела к иммуноглобулинам человека классов G, А, M для одновременного проведения иммунологической реакции (Пример 3), так и два. Наличие двух кластеров позволяет проводить независимые параллельные иммунологические реакции на одном биочипе (Пример 4, Пример 5).The biochip for the diagnosis of colorectal cancer can contain either one cluster containing immobilized antibodies to protein tumor markers, glycans, antibodies to human immunoglobulins of classes G, A, M for simultaneous immunological reactions (Example 3), and two. The presence of two clusters allows for independent parallel immunological reactions on a single biochip (Example 4, Example 5).

Иммуноанализ опухолеассоциированных белковых онкомаркеров проводят с использованием биологических микрочипов (Фиг. 1А, 1В), содержащих иммобилизованные антитела против указанных опухолеассоциированных антигенов. При иммунологическом определении иммуноглобулинов человека классов G, А, M в качестве иммобилизованных лигандов биологического микрочипа используют антитела против иммуноглобулинов человека G, А, M (Фиг. 1А, 1В). Для иммуноанализа антител против различных гликанов иммобилизованными лигандами биологического микрочипа являются гликаны (Фиг. 1А, 1В).Immunoassay of tumor-associated protein tumor markers is carried out using biological microarrays (Fig. 1A, 1B) containing immobilized antibodies against these tumor-associated antigens. In the immunological determination of human immunoglobulins of classes G, A, M, antibodies against human immunoglobulins G, A, M are used as immobilized ligands of the biological microchip (Fig. 1A, 1B). For immunoassay of antibodies against various glycans, the immobilized ligands of the biological microchip are glycans (Fig. 1A, 1B).

Общая процедура проведения иммуноанализа с использованием биологических микрочипов описана в примере 1. Для одновременного иммуноанализа опухолеассоциированных белковых онкомаркеров, в качестве иммобилизованных лигандов биологического микрочипа использовали антитела к указанным опухолеассоциированным белковым онкомаркерам (примеры 4).The general procedure for the immunoassay using biological microarrays is described in Example 1. For the simultaneous immunoassay of tumor-associated protein tumor markers, antibodies to these tumor-associated protein tumor markers were used as immobilized ligands of the biological microchip (examples 4).

В примере 5 описан биологический микрочип для одновременного иммуноанализа уровней антител к гликанам и иммуноглобулинов человека классов G, А, M в образце сыворотки крови с использованием гликанов и антител против иммуноглобулинов G, А, M в качестве иммобилизованных лигандов. Результаты тестирования иммуноглобулинов G, А, M в исследуемых группах пациентов приведены на Фиг. 6А и Фиг. 6В. Результаты определения диагностической эффективности отдельных антител к гликанам приведены на Фиг. 7 и Таблице 3.Example 5 describes a biological microchip for simultaneous immunoassay of levels of antibodies to glycans and human immunoglobulins of classes G, A, M in a blood serum sample using glycans and antibodies against immunoglobulins G, A, M as immobilized ligands. The results of testing immunoglobulins G, A, M in the studied groups of patients are shown in FIG. 6A and FIG. 6B. The results of determining the diagnostic efficacy of individual antibodies to glycans are shown in FIG. 7 and Table 3.

Приводимые ниже примеры предназначены не для ограничения притязаний, а исключительно для иллюстрации отдельных воплощений настоящего изобретения.The following examples are not intended to limit claims, but solely to illustrate individual embodiments of the present invention.

Пример 1. Иммуноанализ молекулярных маркеров колоректального рака с использованием гидрогелевых микрочиповExample 1. Immunoassay of molecular markers of colorectal cancer using hydrogel microarrays

Для иммуноанализа использовали микрочипы, структура которых показана на Фиг 1А, Фиг 1В, содержащие элементы с иммобилизованными антителами против белковых онкомаркеров, антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М, гликанами. Для уменьшения неспецифических взаимодействий во всех вариантах анализа микрочипы предварительно инкубировали в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1% поливинилового спирта (ПВС-50) или в том же буфере, содержащем 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 4% сахарозы ("блокировочный буфер"), 40 мин. при комнатной температуре. Перед проведением анализа растворы антигена (образца) при необходимости разбавляли 0,01 M фосфатным буфером, рН7,2, содержащим 0,15 M NaCl, 0,15% ПВС-50 и 0,15% поливинилпирролидона 360.For immunoassay, microarrays were used, the structure of which is shown in Fig. 1A, Fig. 1B, containing elements with immobilized antibodies against protein tumor markers, antibodies against human immunoglobulins of classes G, A, M, glycans. To reduce nonspecific interactions in all analysis variants, microarrays were preincubated in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 1% polyvinyl alcohol (PVA-50), or in the same buffer containing 3% bovine serum albumin (BSA) and 4% sucrose (“blocking buffer”), 40 min. at room temperature. Before analysis, the antigen (sample) solutions were, if necessary, diluted with 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.15% PVA-50 and 0.15% polyvinylpyrrolidone 360.

Для сэндвич иммуноанализа, на биочипы наносили 100 мкл раствора антигена. В случае анализа белковых онкомаркеров использовали неразбавленную сыворотку крови, инкубацию проводили при 37°С в течение 20 ч. Для определения антител к гликанам сыворотку крови разбавляли 1/5 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,2, содержащим 0,15 M NaCl, 0,15% ПВС-50 и 0,15% поливинилпирролидона 360, инкубацию проводили в течение 2 часов при 37°С.После кратковременной (20 мин.) отмывки в 0,01 M фосфатном буфере, рН7,2, 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, микрочипы проявляли конъюгатами проявляющих антител с биотином (или флуоресцентно-меченными антителами), специфичными к другому эпитопу антигена (60 мин, при 37°С). После отмывки (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, 20 мин, комн. температура) инкубировали с раствором стрептавидина с флуоресцентным красителем (15 мин., 37°С, 0,05 мг/мл) измеряли интенсивность флуоресцентных сигналов. После отмывки (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, 15 30 мин, комн. температура) приступали к регистрации флуоресцентных сигналов. Антитела, стрептавидин и антигены белковой природы, меченные флуоресцентными метками (например, Су 5) получали по известным методикам (например, описанным в G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996).For a sandwich immunoassay, 100 μl of antigen solution was applied to biochips. In the case of analysis of protein tumor markers, undiluted blood serum was used, incubation was carried out at 37 ° C for 20 hours. To determine antibodies to glycans, blood serum was diluted with 1/5 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl , 0.15% PVA-50 and 0.15% polyvinylpyrrolidone 360, incubation was carried out for 2 hours at 37 ° C. After a short (20 min.) Washing in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, microarrays were shown by conjugates of developing antibodies with biotin (or fluorescently-labeled antibodies) specific for another epitope antigen (60 minutes at 37 ° C). After washing (0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, 20 min, room temperature), they were incubated with a streptavidin solution with a fluorescent dye (15 min., 37 ° C, 0.05 mg / ml), the intensity of the fluorescent signals was measured. After washing (0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, 15-30 min, room temperature), registration of fluorescent signals was started. Antibodies, streptavidin, and protein-derived antigens labeled with fluorescent labels (e.g., Su 5) were prepared according to known methods (e.g., described in G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996).

Для измерения флуоресцентных сигналов использовали флуоресцентный микроскоп разработанный в лаборатории биочипов ИМБ РАН (V. Barsky, A. Perov, S. Tokalov, A. Chudinov, Ε. Kreindlin, A. Sharonov, Ε. Kotova, A. Mirzabekov, Fluorescence data analysis on gel-based biochips, J. Biomol. Screening, 2002, 7, 247-257). Микроскоп снабженный CCD камерой и компьютерными программами для визуализации изображения и обработки полученных данных (ИМБ РАН). Микроскоп позволяет одновременно анализировать данные со всех элементов микрочипа и получать двумерное и трехмерное изображения флуоресцентного сигнала с гелевых элементов. Так же возможно использование флуоресцентных сканеров, (например, сканера Genepix 4200 А (Molecular Devices, США)). Величины флуоресцентных сигналов рассчитывали с помощью программного обеспечения Genepix Pro 6.0 (Molecular Devices, США). Для интерпретации результатов использовали интенсивность флуоресценции F635 median, полученную в программе Genepix Pro 6.0.Fluorescence signals were measured using a fluorescence microscope developed in the biochip laboratory of the IMB RAS (V. Barsky, A. Perov, S. Tokalov, A. Chudinov, Ε. Kreindlin, A. Sharonov, Ε. Kotova, A. Mirzabekov, Fluorescence data analysis on gel-based biochips, J. Biomol. Screening, 2002, 7, 247-257). A microscope equipped with a CCD camera and computer programs for image visualization and processing of obtained data (IMB RAS). The microscope allows you to simultaneously analyze data from all elements of the microchip and to obtain two-dimensional and three-dimensional images of the fluorescent signal from the gel elements. It is also possible to use fluorescent scanners (for example, a Genepix 4200 A scanner (Molecular Devices, USA)). The values of fluorescence signals were calculated using the software Genepix Pro 6.0 (Molecular Devices, USA). To interpret the results, the F635 median fluorescence intensity obtained in the program Genepix Pro 6.0 was used.

Для всех вариантов анализа строили график зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации антигена в растворе. Наименьшую определяемую концентрацию антигена рассчитывали как концентрацию, соответствующую интенсивности сигнала, в 3 раза превышающего разброс фонового сигнала.For all analysis options, a plot was made of the dependence of the fluorescence intensity on the concentration of antigen in solution. The smallest detectable antigen concentration was calculated as the concentration corresponding to the signal intensity, 3 times the spread of the background signal.

Пример 2. Количественный иммуноанализ антител к гликанам с использованием гидрогелевых микрочиповExample 2. Quantitative immunoassay of antibodies to glycans using hydrogel microarrays

Для одновременного определения уровней антител к гликанам и общих иммуноглобулинов класса G, А, M в образце сыворотки крови человека использовали микрочипы, структура которых показана на Фиг 1А, Фиг 1Б. Перед проведением анализа для уменьшения неспецифических взаимодействий микрочипы инкубировали в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1% поливинилового спирта («блокировочный раствор»), 40 мин. при комн. температуре.To simultaneously determine the levels of antibodies to glycans and total class G, A, M immunoglobulins in a human serum sample, microchips were used, the structure of which is shown in Fig. 1A, Fig. 1B. Before analysis, to reduce nonspecific interactions, the microarrays were incubated in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 1% polyvinyl alcohol (“blocking solution”), 40 min. at room temperature.

Микрочипы инкубировали с исследуемым образцом (сывороткой крови) или с калибровочными пробами, содержащими известные концентрации иммуноглобулинов человека классов G, А, М, в течение 2 ч при 37°С.После отмывки в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1% Tween 20 (20 мин., комнатная температура) микрочипы обрабатывали раствором мышиных антител против человеческих иммуноглобулинов G, А, M с флуоресцентным красителем Су5 (Pierce, USA) (1 ч., 37°С).Microchips were incubated with the test sample (blood serum) or with calibration samples containing known concentrations of human immunoglobulins of classes G, A, M, for 2 hours at 37 ° C. After washing in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 1% Tween 20 (20 min, room temperature), the microchips were treated with a solution of mouse antibodies against human immunoglobulins G, A, M with fluorescent dye Cy5 (Pierce, USA) (1 h, 37 ° C) .

После завершения инкубации и отмывки в (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, 15 30 мин, комн. температура) от неспецифически связавшихся компонентов регистрировали флуоресцентные сигналы. Для измерения флуоресцентных сигналов использовали микрочиповый сканер Genepix 4200 А (Molecular Devices, США) с программным обеспечением. Флуоресцентное изображение микрочйпа после взаимодействия с сывороткой крови пациента с КРР представлено на Фиг.2 В.After incubation and washing were completed, fluorescent signals were recorded in (0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, 15-30 min, room temperature) from non-specifically bound components. A Genepix 4200 A microarray scanner (Molecular Devices, USA) with software was used to measure fluorescent signals. The fluorescence image of the microchip after interaction with the blood serum of a patient with CRC is presented in Figure 2 B.

Для повышения достоверности получаемых данных все иммобилизованные гликаны и антитела в составе микрочипа представлены в четырех одинаковых гелевых элементах, и интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал от четырех одинаковых гелевых элементов.To increase the reliability of the data obtained, all immobilized glycans and antibodies in the microchip are presented in four identical gel elements, and the fluorescence intensity was calculated as the median signal from four identical gel elements.

Строили калибровочную зависимость «интенсивность флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих антитела против иммуноглобулинов G, А, M - концентрация иммуноглобулина G в калибровочной пробе (Фиг. 3 В), по которой определяли уровни гликан- специфических и общих иммуноглобулинов G, А, M в исследуемом образце.A calibration dependence was built: “the intensity of the fluorescent signal of the elements of the microchip containing antibodies against immunoglobulins G, A, M is the concentration of immunoglobulin G in the calibration sample (Fig. 3 B), which determined the levels of glycan-specific and total immunoglobulins G, A, M in the studied sample.

Наименьшую определяемую концентрацию антигена рассчитывали как концентрацию, соответствующую интенсивности сигнала, в 3 раза превышающего разброс фонового сигнала.The smallest detectable antigen concentration was calculated as the concentration corresponding to the signal intensity, 3 times the spread of the background signal.

Пример 3. Диагностика колоректального рака, основанная на одновременном определении концентрации белковых онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов классов G, А, M в образце сыворотки крови на биологическом микрочипе.Example 3. Diagnosis of colorectal cancer based on the simultaneous determination of the concentration of protein oncomarkers, antibodies to glycans, immunoglobulins of classes G, A, M in a blood serum sample on a biological microchip.

3.1. Постановка анализа3.1. Statement of analysis

Для одновременного определения концентрации белковых онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов классов G, А, M в образце сыворотки крови человека использовали микрочипы, структура которых показана на Фиг 1А. Перед проведением анализа для уменьшения неспецифических взаимодействий микрочипы инкубировали в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1% поливинилового спирта («блокировочный раствор»), 40 мин. при комн. температуре.To simultaneously determine the concentration of protein tumor markers, antibodies to glycans, immunoglobulins of classes G, A, M in a human serum sample, microarrays were used, the structure of which is shown in Fig. 1A. Before analysis, to reduce nonspecific interactions, the microarrays were incubated in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 1% polyvinyl alcohol (“blocking solution”), 40 min. at room temperature.

Микрочипы инкубировали с исследуемым образцом (сывороткой крови) или с калибровочными пробами, содержащими известные концентрации белковых онкомаркеров, иммуноглобулинов человека класса G в течение 20 часов при 37°С.После отмывки в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1% Tween 20 (20 мин., комнатная температура) микрочипы обрабатывали смесью конъюгатов антител против всех онкомаркеров с биотином, конъюгатом антител против иммуноглобулинов человека классов G, А, M с биотином (1 ч., 37°С). После отмывки в 0,01 M фосфатном буфере, рН7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1% Tween 20 (20 мин. при комнатной температуре) микрочипы обрабатывали раствором стрептавидина с флуоресцентным красителем Су5 (Pierce, USA) (15 мин., 37°С). После завершения инкубации и отмывки в (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, 15 30 мин, комн. температура) от неспецифически связавшихся компонентов регистрировали флуоресцентные сигналы.Microchips were incubated with the test sample (blood serum) or with calibration samples containing known concentrations of protein tumor markers, human G class immunoglobulins for 20 hours at 37 ° C. After washing in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0 , 15 M NaCl, 1% Tween 20 (20 min, room temperature) the microchips were treated with a mixture of conjugates of antibodies against all tumor markers with biotin, a conjugate of antibodies against human immunoglobulins of classes G, A, M with biotin (1 h, 37 ° C) . After washing in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 1% Tween 20 (20 min at room temperature), the microchips were treated with a solution of streptavidin with fluorescent dye Cy5 (Pierce, USA) (15 min. , 37 ° C). After incubation and washing were completed, fluorescent signals were recorded in (0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, 15-30 min, room temperature) from non-specifically bound components.

3.2. Обработка данных3.2. Data processing

Для измерения флуоресцентных сигналов использовали флуоресцентный микроскоп, снабженный CCD-камерой и программным обеспечением для визуализации изображения и обработки полученных данных, разработанный в ИМБ РАН (V. Barsky, А. Perov, S. Tokalov, A. Chudinov, Ε. Kreindlin, Α. Sharonov, Ε. Kotova, A. Mirzabekov, Fluorescence data analysis on gel-based biochips, J. Biomol. Screening, 2002, 7, 247-257) или микрочиповый сканер GenePix 4200A (США). Флуоресцентное изображение микрочипа после анализа сыворотки крови больного КРР представлено на Фиг. 2А, здорового донора - на Фиг. 2С.Fluorescence signals were measured using a fluorescence microscope equipped with a CCD camera and software for image visualization and data processing, developed at the IMB RAS (V. Barsky, A. Perov, S. Tokalov, A. Chudinov, Ε. Kreindlin, Α. Sharonov, Kotova, A. Mirzabekov, Fluorescence data analysis on gel-based biochips, J. Biomol. Screening, 2002, 7, 247-257) or a GenePix 4200A microchip scanner (USA). The fluorescence image of the microchip after analysis of the blood serum of a patient with CRC is shown in FIG. 2A, healthy donor - in FIG. 2C.

Для повышения достоверности получаемых данных все иммобилизованные зонды в составе микрочипа представлены в четырех одинаковых гелевых элементах, и интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал от четырех одинаковых гелевых элементов.To increase the reliability of the data obtained, all immobilized probes in the microchip are presented in four identical gel elements, and the fluorescence intensity was calculated as the median signal from four identical gel elements.

В качестве положительного контроля работоспособности диагностического инструмента выступают ячейки с иммобилизованным иммуноглобулином G.Cells with immobilized immunoglobulin G act as a positive control of the health of the diagnostic tool.

Строили калибровочную зависимость «интенсивность флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих антитела против белкового онкомаркера - концентрация белкового онкомаркера в калибровочной пробе (Фиг. 4), по которой определяли концентрацию белкового онкомаркера в исследуемом образце. Результаты определения представлены в Таблице 4.The calibration dependence “intensity of the fluorescent signal of microarray elements containing antibodies against the protein tumor marker — the concentration of the protein tumor marker in the calibration sample (Fig. 4) was constructed, which was used to determine the concentration of the protein tumor marker in the test sample. The determination results are presented in Table 4.

3.3. Анализ диагностической эффективности сигнатур для диагностики колоректального рака при помощи статистической обработки данных и ROC- анализа.3.3. Analysis of the diagnostic effectiveness of signatures for the diagnosis of colorectal cancer using statistical data processing and ROC analysis.

Статистическая обработка данных анализов (концентрации онкомаркеров, флуоресцентные сигналы от иммобилизованных гликанов и антител к иммуноглобулинам человека классов G, А, М, полученные после проведения иммуноанализа на чипах конструкции Фиг. 1А, 1В проводилась с помощью программ MedCalc Version 15.4. Сравнительный анализ диагностической эффективности разных факторов при мультиплексном анализе на чипах проводился с помощью многопараметрического логрегрессионного анализа (Hosmer DW, Lemeshow S. Applied logistic regression. Wiley Series in probability and statistics, 3rd ed. New York:Wiley-Interscience, 2013. 528 p) и ROC-кривых (Receive Operating Characteristic curve analysis) (Bradley AP. The use of the area under the ROC curve in the evaluation of machine learning algorithms. Pattern Recognition 1997; 30:1145-59; Vuskovic MI, Xu H, Bovin NV, et al. Processing and analysis of serum antibody binding signals from Printed Glycan Arrays for diagnostic and prognostic applications. Int J Bioinform Res Appl 2011; 7:402-26). Чем больше площадь под ROC-кривой, тем выше диагностическая эффективность данного фактора. Метод определения диагноза считается превосходным, если площадь под ROC-кривой AUC=0.9-1.0; очень хорошим при AUC=0.8-0.9; хорошим при AUC=0.7-0.8; удовлетворительным при AUC=0.6-0.7; и неудовлетворительным при AUC=0.5-0.6. Случайное предсказание соответствует AUC=0.5. Также для оценки диагностической эффективности разрабатываемого метода определения колоректального рака (CRC) были использованы число верно предсказанных положительных диагнозов (TP, %) и доля верно классифицированных диагнозов (точность, %).Statistical processing of analysis data (concentration of tumor markers, fluorescence signals from immobilized glycans and antibodies to human immunoglobulins of classes G, A, M, obtained after immunoassay on chips of the design of Fig. 1A, 1B was carried out using MedCalc Version 15.4 programs. A comparative analysis of the diagnostic effectiveness of different factors for multiplex analysis on chips was performed using multi-parameter log-regression analysis (Hosmer DW, Lemeshow S. Applied logistic regression. Wiley Series in probability and statistics, 3rd ed. New York: Wiley-Interscienc e, 2013.528 p) and ROC curves (Receive Operating Characteristic curve analysis) (Bradley AP. The use of the area under the ROC curve in the evaluation of machine learning algorithms. Pattern Recognition 1997; 30: 1145-59; Vuskovic MI, Xu H, Bovin NV, et al. Processing and analysis of serum antibody binding signals from Printed Glycan Arrays for diagnostic and prognostic applications. Int J Bioinform Res Appl 2011; 7: 402-26). The larger the area under the ROC curve, the higher the diagnostic effectiveness of this factor. The method for determining the diagnosis is considered excellent if the area under the ROC curve AUC = 0.9-1.0; very good at AUC = 0.8-0.9; good at AUC = 0.7-0.8; satisfactory at AUC = 0.6-0.7; and unsatisfactory at AUC = 0.5-0.6. Random prediction corresponds to AUC = 0.5. The number of correctly predicted positive diagnoses (TP,%) and the share of correctly classified diagnoses (accuracy,%) were also used to assess the diagnostic effectiveness of the developed method for determining colorectal cancer (CRC).

Рассматривали следующие модели: модель "Oncology" (CRC=1, IBD=0, HD=0); "Disease" (CRC=1, IBD=1, HD=0); и "CRC/IBD" (CRC=1, IBD=0). Модель "Oncology" позволяет выделить случаи CRC; "Disease" позволяет отличить больных пациентов от здоровых; модель "CRC/IBD" отличает случаи CRC от воспалительных заболеваний кишечника.The following models were considered: the Oncology model (CRC = 1, IBD = 0, HD = 0); "Disease" (CRC = 1, IBD = 1, HD = 0); and "CRC / IBD" (CRC = 1, IBD = 0). The Oncology Model allows you to highlight cases of CRC; "Disease" allows you to distinguish sick patients from healthy ones; the CRC / IBD model distinguishes cases of CRC from inflammatory bowel disease.

Доли истинно положительных и ложно положительных примеров рассчитывали по формулам (1) и (2).The fractions of truly positive and false positive examples were calculated using formulas (1) and (2).

Доля истинно положительных примеров TPR (True Positives Rate):Percentage of truly positive examples of TPR (True Positives Rate):

Figure 00000001
Figure 00000001

Доля ложно положительных примеров FPR (False Positives Rate):False positive examples FPR (False Positives Rate):

Figure 00000002
Figure 00000002

где TP (True Positives) - верно классифицированные положительные диагнозы;where TP (True Positives) - correctly classified positive diagnoses;

TN (True Negatives) - верно классифицированные отрицательные диагнозы;TN (True Negatives) - correctly classified negative diagnoses;

FN (False Negatives) - положительные примеры, ложно классифицированные какFN (False Negatives) - positive examples falsely classified as

отрицательные (заболевание ошибочно не обнаруживается);negative (the disease is not erroneously detected);

FP (False Positives) - отрицательные примеры, ложно классифицированные как положительные (ложное обнаружение болезни).FP (False Positives) - negative examples that are falsely classified as positive (false detection of the disease).

Чувствительность и специфичность бинарной модели ROC анализа рассчитывали по формулам (3) и (4).The sensitivity and specificity of the binary ROC analysis model was calculated using formulas (3) and (4).

Чувствительность модели (Sensitivity) - это доля истинно положительных случаев:The sensitivity of the model (Sensitivity) is the proportion of truly positive cases:

Figure 00000003
Figure 00000003

Специфичность модели (Specificity) - доля истинно отрицательных случаев, которые были правильно идентифицированы моделью:Specificity of the model (Specificity) - the proportion of truly negative cases that were correctly identified by the model:

Figure 00000004
Figure 00000004

Чувствительность и специфичность бинарной модели определения заболевания стремится к 100% (площадь под ROC-кривой стремится к 1), если количество детектируемых моделью ложноотрицательных или ложноположительных диагнозов заболевания стремится к нулю.The sensitivity and specificity of the binary model for determining the disease tends to 100% (the area under the ROC curve tends to 1) if the number of false-negative or false-positive diagnoses of the disease detected by the model tends to zero.

В программе MedCalc Version 11.4.2.0 проводили расчет AUC для сигнатур (Фиг. 7, Фиг. 6В., Фиг. 5).In the MedCalc Version 11.4.2.0 program, AUC was calculated for the signatures (Fig. 7, Fig. 6B., Fig. 5).

Результаты диагностической эффективности сигнатур для выявления колоректального рака в сыворотках крови пациентов из трех когорт приведены в Таблице 2.The results of the diagnostic efficacy of signatures for the detection of colorectal cancer in the blood serum of patients from three cohorts are shown in Table 2.

Пример 4. Одновременный анализ нескольких белковых онкомаркеров на одном микрочипеExample 4. Simultaneous analysis of several protein tumor markers on one microchip

Были изготовлены микрочипы с иммобилизованными антителами ко всем исследуемым маркерам РЭА, СА 19-9, СА 125, SPB 3, SPB 4, ПСА общ., ПСА св., ХГЧ, АФП, СА 242, (Фиг. 1А, 1В). Для анализа белковых онкомаркеров использовали неразбавленную сыворотку крови, инкубацию проводили при 37оС в течение 20 ч. После кратковременной (20 мин.) отмывки в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 М NaCl, 0,1% Твин-20, микрочипы проявляли конъюгатами проявляющих антител с биотином (или флуоресцентно-меченными антителами), специфичными к другому эпитопу антигена (60 мин, при 37°С). После отмывки (0,01 М фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl, 0,1% Твин-20, 20 мин, комн. температура) инкубировали с раствором стрептавидина с флуоресцентным красителем (15 мин., 37°С, 0,05 мг/мл). После отмывки (0,01 М фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl, 0,1% Твин-20, 15 30 мин, комн. температура) приступали к регистрации флуоресцентных сигналов.Microchips with immobilized antibodies were made to all studied markers CEA, CA 19-9, CA 125, SPB 3, SPB 4, PSA total., PSA St., hCG, AFP, CA 242, (Fig. 1A, 1B). For analysis of protein tumor markers, undiluted blood serum was used, incubation was performed at 37 ° C for 20 hours. After short-term (20 min.) Washing in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween -20, the microarrays showed conjugates of developing antibodies with biotin (or fluorescently-labeled antibodies) specific for another epitope of the antigen (60 min, at 37 ° C). After washing (0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, 20 min, room temperature), they were incubated with a streptavidin solution with a fluorescent dye (15 min., 37 ° C, 0.05 mg / ml). After washing (0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, 15-30 min, room temperature), registration of fluorescent signals was started.

Как видно из Фиг. 2В, в случае анализа образца больного колоректальным раком, яркие сигналы наблюдались в гелевых ячейках, содержащих специфические антитела (РЭА, СА 19-9, СА242). Пределы обнаружения онкомаркеров в случае их параллельного анализа оказались такие же, как и при определении каждого маркера в отдельности (Таблица 5).As can be seen from FIG. 2B, in the case of analysis of a sample of a patient with colorectal cancer, bright signals were observed in gel cells containing specific antibodies (CEA, CA 19-9, CA242). The detection limits of tumor markers in the case of their parallel analysis were the same as in the determination of each marker separately (Table 5).

Пример 5. Одновременное определение уровней антител к гликанам и иммуноглобулинов человека классов G, А, M в образце сыворотки кровиExample 5. Simultaneous determination of levels of antibodies to glycans and human immunoglobulins of classes G, A, M in a blood serum sample

Использовали микрочипы, структура которых показана на ФИГ. 1В. Перед проведением анализа микрочипы обрабатывали блокировочным раствором, как описано в Примере 1.Used microchips, the structure of which is shown in FIG. 1B. Before analysis, the microchips were treated with a blocking solution, as described in Example 1.

Микрочипы инкубировали с исследуемым образцом сыворотки крови или с калибровочными пробами, содержащими известные концентрации иммуноглобулина G, в течение 2 ч при 37°С; после отмывки (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, 20 мин, комн. температура) микрочипы инкубировали с конъюгатом биотинилированных поликлональных антител против иммуноглобулинов G, A, M (1 ч, 37°С). Инкубировали с раствором стрептавидина с флуоресцентным красителем (15 мин., 37°С, 0,05 мг/мл). После отмывки (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, 15 30 мин, комн. температура) приступали к регистрации флуоресцентных сигналов, как описано в Примере 1. Флуоресцентное изображение микрочипа после анализа сыворотки крови здорового донора представлено на Фиг. 2D.Microchips were incubated with a test serum sample or with calibration samples containing known concentrations of immunoglobulin G for 2 hours at 37 ° C; after washing (0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, 20 min, room temperature), the microarrays were incubated with a conjugate of biotinylated polyclonal antibodies against immunoglobulins G, A, M (1 h, 37 ° C). Incubated with a streptavidin solution with a fluorescent dye (15 min., 37 ° C, 0.05 mg / ml). After washing (0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, 15-30 min, room temperature), registration of fluorescent signals was started, as described in Example 1. The fluorescence image of the microchip after analysis of the blood serum of a healthy donor is shown in FIG. 2D.

Строили калибровочную зависимость интенсивность флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих антитела против иммуноглобулинов G, А, M - концентрация иммуноглобулина G в калибровочной пробе (Фиг. 3В), по которой определяли уровни специфических и общих иммуноглобулинов G в исследуемом образце сыворотки крови.A calibration dependence was constructed, the fluorescence signal intensity of the microchip elements containing antibodies against immunoglobulins G, A, M - the concentration of immunoglobulin G in the calibration sample (Fig. 3B), which determined the levels of specific and total immunoglobulins G in the test blood serum.

Краткое описание фигурBrief Description of the Figures

Brief Description of Drawings)Brief Description of Drawings)

Фиг. 1A и Фиг. 1B демонстрируют вид гидрогелевого биологического микрочипа для одновременного количественного определения онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе. Каждое иммобилизованное соединение представлено в четырех одинаковых элементах.FIG. 1A and FIG. 1B show the appearance of a hydrogel biological microchip for the simultaneous quantitative determination of protein markers of oncology, antibodies to glycans, immunoglobulins G, A and M in human blood on a biological microchip. Each immobilized compound is represented in four identical elements.

Фиг. 1А демонстрирует вид однокластерного гидрогелевого биологического микрочипа.FIG. 1A shows a view of a single cluster hydrogel biological microchip.

Фиг. 1В демонстрирует вид двухкластерного гидрогелевого биологического микрочипа.FIG. 1B shows a view of a two-cluster hydrogel biological microchip.

Схема микрочипа для диагностики колоректального рака. Массив гидрогелевых элементов содержит элементы с иммобилизованными гликанами, антителами к белковым онкомаркерам и элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М.Microchip scheme for the diagnosis of colorectal cancer. The array of hydrogel elements contains elements with immobilized glycans, antibodies to protein tumor markers and elements with immobilized antibodies against human immunoglobulins of classes G, A, M.

Молекулярные зонды:Molecular Probes:

Антитела к белковым онкомаркерам: 1) Элементы с иммобилизованными антителами против АФП, 2) элементы с иммобилизованными антителами против ХГЧ, 3) элементы с иммобилизованными антителами против РЭА, 4) элементы с иммобилизованными антителами против СА 19-9, 5) элементы с иммобилизованными антителами против СА 125, 6) элементы с иммобилизованными антителами против ПСА, 7) элементы с иммобилизованными антителами против SPB3, 8) элементы с иммобилизованными антителами против SPB4, 9) элементы с иммобилизованными антителами против СА 242;Antibodies to protein tumor markers: 1) Elements with immobilized antibodies against AFP, 2) Elements with immobilized antibodies against hCG, 3) Elements with immobilized antibodies against CEA, 4) Elements with immobilized antibodies against CA 19-9, 5) Elements with immobilized antibodies against CA 125, 6) elements with immobilized antibodies against PSA, 7) elements with immobilized antibodies against SPB3, 8) elements with immobilized antibodies against SPB4, 9) elements with immobilized antibodies against CA 242;

Гликаны: 10) Tn; 11)SiaTn; 12) SiaLeA; 13) LeC; 14) LeY; 15) TF; 16) Manβ1-4GlcNAc;Glycans: 10) T n ; 11) SiaT n ; 12) SiaLe A ; 13) Le C ; 14) Le Y ; 15) TF; 16) Manβ1-4GlcNAc;

17) элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов G, А, М,17) elements with immobilized antibodies against immunoglobulins G, A, M,

18) элементы с иммобилизованным иммуноглобулином человека класса G,18) elements with immobilized human immunoglobulin class G,

19) элементы, не содержащие биоматериала.19) elements that do not contain biomaterial.

Фиг. 2А, Фиг. 2В, Фиг. 2С, Фиг. 2D представляют флуоресцентные изображения биологических микрочипов после проведения анализа сывороток крови пациентов с диагнозом КРР и здорового донора. В сыворотках крови определяли уровни белковых онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А, М. Микрочипы инкубировали с образцом сыворотки крови и проявляли смесью биотинилированных антител против белковых онкомаркеров, биотинилированными антителами против иммуноглобулинов G, А, M с последующей проявкой стрептавидином, меченным флуоресцентным красителем Су5.FIG. 2A, FIG. 2B, FIG. 2C, FIG. 2D represent fluorescence images of biological microarrays after analysis of the blood sera of patients diagnosed with CRC and a healthy donor. Serum levels of protein tumor markers, antibodies to glycans, immunoglobulins G, A, M were determined. Microarrays were incubated with a blood serum sample and developed with a mixture of biotinylated antibodies against protein tumor markers, biotinylated antibodies against immunoglobulins G, A, M followed by development of streptavidin labeled with fluorescent dye Su5.

Фиг. 2А. Изображение однокластерного микрочипа, структура которого показана на Фиг. 1 А, после анализа сыворотки пациента с диагнозом колоректальный рак.FIG. 2A. An image of a single cluster microchip whose structure is shown in FIG. 1 A, after analysis of the serum of a patient diagnosed with colorectal cancer.

Фиг. 2В. Изображение однокластерного микрочипа, структура которого показана на Фиг. 1 В, после анализа сыворотки пациента с диагнозом колоректальный рак.FIG. 2B. An image of a single cluster microchip whose structure is shown in FIG. 1 B, after analysis of the serum of a patient diagnosed with colorectal cancer.

Фиг. 2С. Изображение двухкластерного микрочипа, структура которого показана на Фиг. 1А, после анализа сыворотки здорового пациента.FIG. 2C. An image of a two-cluster microchip, the structure of which is shown in FIG. 1A, after analysis of the serum of a healthy patient.

Фиг. 2D. Изображение двухкластерного микрочипа, структура которого показана на Фиг. 1 В, после анализа сыворотки здорового пациента.FIG. 2D. An image of a two-cluster microchip, the structure of which is shown in FIG. 1 V, after serum analysis of a healthy patient.

Фиг. 3А, Фиг. 3В представляют графики зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала, полученные от элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов классов G, А, M от концентрации иммуноглобулинов G, А, M в растворе. Каждая точка калибровочной зависимости - среднее значение измерений на десяти микрочипах. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений. Калибровочные зависимости строились с использованием кусочно-линейной интерполяции.FIG. 3A, FIG. 3B are graphs of the dependence of the intensity of the fluorescent signal obtained from microarray elements containing immobilized antibodies against immunoglobulins of classes G, A, M on the concentration of immunoglobulins G, A, M in solution. Each point of the calibration dependence is the average value of measurements on ten microchips. The vertical segments show the standard deviations. Gauge dependencies were constructed using piecewise linear interpolation.

Фиг. 3А представляет график зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов классов G, А, M от концентрации иммуноглобулинов G, А, M в разведениях сыворотки крови пациента с известным содержанием иммуноглобулина G.FIG. 3A is a graph of the dependence of the fluorescence signal intensity of microarray elements containing immobilized antibodies against class G, A, M immunoglobulins on the concentration of immunoglobulins G, A, M in dilutions of the patient's blood serum with known immunoglobulin G.

Фиг. 3Б представляет график зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов классов G, А, M от концентрации иммуноглобулина G в растворе.FIG. 3B is a graph of the intensity of the fluorescent signal of microarray elements containing immobilized antibodies against immunoglobulins of classes G, A, M on the concentration of immunoglobulin G in solution.

Фиг. 4А, Фиг. 4В представляют графики зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против белковых онкомаркеров РЭА и СА 19-9 от концентрации РЭА и СА 19-9 в растворе. Каждая точка калибровочной зависимости - среднее значение измерений на десяти микрочипах. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений. Калибровочные зависимости строились с использованием кусочно-линейной интерполяции.FIG. 4A, FIG. 4B are graphs of the dependence of the intensity of the fluorescent signal of the elements of the microchip containing immobilized antibodies against protein tumor markers CEA and CA 19-9 on the concentration of CEA and CA 19-9 in solution. Each point of the calibration dependence is the average value of measurements on ten microchips. The vertical segments show the standard deviations. Gauge dependencies were constructed using piecewise linear interpolation.

Фиг. 4А представляет график зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против белкового онкомаркера РЭА от концентрации РЭА в растворе.FIG. 4A is a graph of the intensity of the fluorescent signal of microarray elements containing immobilized antibodies against the CEA protein tumor marker on the concentration of CEA in solution.

Фиг. 4В представляет график зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против белкового онкомаркера СА 19-9 от концентрации СА 19-9 в растворе.FIG. 4B is a graph of the intensity of the fluorescent signal of microarray elements containing immobilized antibodies against the protein oncomarker CA 19-9 on the concentration of CA 19-9 in solution.

Фиг. 5А и Фиг. 5В. демонстрируют результаты статистического анализа (ROC-анализ) диагностической эффективности выявления КРР при одновременном определении молекулярных сигнатур в сыворотке крови. Сигнатура, состоящая из 4х антител к гликанам: Tn, TF, SiaLeA и Manβ1- 4GlcNAc; Сигнатура, состоящая из 6 онкомаркеров: РЭА, СА 19-9, АФП, ХГЧ, СА 125, СА 15-3.FIG. 5A and FIG. 5B. demonstrate the results of a statistical analysis (ROC analysis) of the diagnostic efficiency of detecting CRC while determining molecular signatures in blood serum. Signature consisting of 4 antibodies to glycans: Tn, TF, SiaLeA and Manβ1-4GlcNAc; The signature, consisting of 6 tumor markers: CEA, CA 19-9, AFP, hCG, CA 125, CA 15-3.

Фиг. 5А. демонстрируют результаты статистического анализа (ROC- анализ) диагностической эффективности выявления КРР при одновременном определении шести онкомакеров в сыворотке крови по сравнению с диагностической эффективностью выявления КРР при одновременном определении концентраций РЭА и С А19-9 в сыворотке крови пациентов с диагнозами КРР (33 шт.), воспалительные заболевания кишечника (27 шт.) и здоровых доноров (69 шт.) (для выявления КРР использовали модель "Oncology" (CRC=1, IBD=0, HD=0)). Построение ROC- кривых, статистическая обработка данных анализов проводилась с помощью программ MedCalc Version 11.4.2.0.FIG. 5A. demonstrate the results of a statistical analysis (ROC analysis) of the diagnostic efficacy of detecting CRC with the simultaneous determination of six tumor markers in blood serum compared with the diagnostic effectiveness of detecting CRC with the simultaneous determination of CEA and C19-9 concentrations in the blood serum of patients diagnosed with CRC (33 pcs.) , inflammatory diseases of the intestine (27 pcs.) and healthy donors (69 pcs.) (the Oncology model was used to detect CRC (CRC = 1, IBD = 0, HD = 0)). Construction of ROC-curves, statistical processing of analysis data was carried out using the MedCalc Version 11.4.2.0 software.

Фиг. 5В. Демонстрирует зависимость диагностической эффективности выявления КРР (площадь под ROC- кривой (AUC)) от состава диагностических сигнатур. Сигнатура, состоящая из 4х антител к гликанам: Tn, TF, SiaLeA и Manβ1- 4GlcNAc; Сигнатура, состоящая из 6 онкомаркеров: РЭА, СА 19-9, АФП, ХГЧ, СА 125, СА 15-3.FIG. 5B. Demonstrates the dependence of the diagnostic efficiency of detecting CRC (the area under the ROC-curve (AUC)) on the composition of the diagnostic signatures. Signature consisting of 4 antibodies to glycans: Tn, TF, SiaLeA and Manβ1-4GlcNAc; The signature, consisting of 6 tumor markers: CEA, CA 19-9, AFP, hCG, CA 125, CA 15-3.

Фиг. 6А и Фиг. 6В демонстрируют результаты измерения содержания иммуноглобулинов G, А, M в исследуемых группах пациентов с диагнозами колоректальный рак (CRC), здоровых доноров (HD), с диагнозом воспалительные заболевания кишечника (IBD).FIG. 6A and FIG. 6B show the results of measuring the content of immunoglobulins G, A, M in the studied groups of patients diagnosed with colorectal cancer (CRC), healthy donors (HD), with a diagnosis of inflammatory bowel disease (IBD).

Фиг. 6А представляет Box-and-wiskers диаграмму («ящик с усами») полученных результатов по выявлению уровней иммуноглобулинов G, А, M в сыворотках крови пациентов с диагнозом КРР (CRC), воспалительными заболеваниями кишечника (IBD) и здоровых доноров (HD). Приведено распределение флуоресцентных сигналов, полученных на микрочипах от ячеек, содержащих иммобилизованные антитела к иммуноглобулинам (IgG, IgA, IgM) человека, для трех групп пациентов. Границами ящика служат 25-й и 75-й процентили соответственно, линия в середине ящика - медиана (50-й процентиль). Концы усов - края статистически значимой выборки.FIG. 6A presents a Box-and-wiskers chart (“mustache box”) of the results of the determination of the levels of immunoglobulins G, A, M in the blood serum of patients diagnosed with CRC, inflammatory bowel disease (IBD) and healthy donors (HD). The distribution of fluorescent signals obtained on microarrays from cells containing immobilized antibodies to human immunoglobulins (IgG, IgA, IgM) for three groups of patients is shown. The boundaries of the box are the 25th and 75th percentiles, respectively, the line in the middle of the box is the median (50th percentile). The ends of the whiskers are the edges of a statistically significant sample.

Фиг. 6В демонстрируют результаты ROC-анализа выявления уровня общих иммуноглобулинов G, А, M в сыворотках крови пациентов с диагнозами КРР, воспалительные заболевания кишечника, здоровых доноров в следующих моделях:FIG. 6B show the results of a ROC analysis to identify the level of total immunoglobulins G, A, M in the blood serum of patients diagnosed with CRC, inflammatory bowel disease, and healthy donors in the following models:

А - модель "Oncology" (CRC=1, IBD=0, HD=0), модель позволяет выявить только колоректальный рак;A - “Oncology” model (CRC = 1, IBD = 0, HD = 0), the model allows only colorectal cancer to be detected;

В - модель «Disease» (CRC=1, IBD=1, HD=0), модель позволяет выявить только здоровых доноров.B - “Disease” model (CRC = 1, IBD = 1, HD = 0), the model allows only healthy donors to be identified.

Исследование проводили в трех когортах пациентов: пациенты с диагнозами КРР (33 шт.), воспалительными заболеваниями кишечника (27 шт.), здоровые доноров (69 шт.) (Построение ROC-кривых, статистическая обработка данных анализов проводилась с помощью программ MedCalc Version 15.4).The study was carried out in three cohorts of patients: patients diagnosed with CRC (33 pcs.), Inflammatory bowel diseases (27 pcs.), Healthy donors (69 pcs.) (Construction of ROC-curves, statistical analysis of the analysis data was carried out using MedCalc Version 15.4 programs )

Фиг. 7 демонстрирует результаты статистического анализа (ROC- анализ) диагностической эффективности антител к гликанам для выявления КРР. Изучение проводили в сыворотках крови пациентов с диагнозом КРР (33 сыворотки), воспалительными заболевания кишечника (27 сывороток) и здоровых доноров (69 сывороток) (для выявления КРР использовали модель "Oncology" (CRC=1, IBD=0, HD=0)). Построение ROC-кривых, статистическая обработка данных анализов проводилась с помощью программ MedCalc Version 15.4.FIG. 7 shows the results of a statistical analysis (ROC analysis) of the diagnostic efficacy of antibodies to glycans for detecting CRC. The study was carried out in the blood serum of patients diagnosed with CRC (33 sera), inflammatory bowel disease (27 sera) and healthy donors (69 sera) (the Oncology model was used to detect CRC (CRC = 1, IBD = 0, HD = 0) ) Construction of ROC-curves, statistical processing of analysis data was carried out using the MedCalc Version 15.4 software.

Figure 00000005
Figure 00000005

Figure 00000006
Figure 00000006

Figure 00000007
Figure 00000007

Figure 00000008
Figure 00000008

Figure 00000009
Figure 00000009

Figure 00000010
Figure 00000010

Figure 00000011
Figure 00000011

Figure 00000012
Figure 00000012

Figure 00000013
Figure 00000013

Figure 00000014
Figure 00000014

Claims (15)

1. Способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов классов G, А и М в крови человека на биологическом микрочипе, содержащем гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами к белковым онкомаркерам, гидрогелевые элементы с иммобилизованными гликанами, гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М, где изменение уровня анализируемых маркеров по сравнению с уровнем маркеров в сыворотке крови здоровых доноров, свидетельствует о колоректальном раке.1. A method for the diagnosis of colorectal cancer, based on the simultaneous quantitative determination of tumor markers of protein nature, antibodies to glycans, class G, A and M immunoglobulins in human blood on a biological microchip containing hydrogel elements with immobilized antibodies to protein oncomarkers, hydrogel elements with immobilized glycans, hydrogel elements with immobilized antibodies against human immunoglobulins of classes G, A, M, where the change in the level of the analyzed markers compared to the level eat markers in the blood serum of healthy donors, indicates colorectal cancer. 2. Способ по п. 1, включающий2. The method according to p. 1, including а) взаимодействие образца сыворотки крови человека с ячейками биочипа в условиях, обеспечивающих образование специфических иммунных комплексов - соединений, иммобилизованных в гидрогелевых ячейках микрочипа, с соединениями, содержащимися в анализируемом образце;a) the interaction of a sample of human blood serum with biochip cells under conditions providing for the formation of specific immune complexes — compounds immobilized in hydrogel cells of the microchip with compounds contained in the analyzed sample; б) детекцию образовавшихся иммунных комплексов;b) detection of the formed immune complexes; в) определение концентраций белковых онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и М;c) determination of the concentration of protein tumor markers, antibodies to glycans, immunoglobulins G, A and M; г) диагностирование колоректального рака путем сравнения уровней белковых онкомаркеров, антител к гликанам и иммуноглобулинов классов G, А, М в анализируемом образце с соответствующими уровнями маркеров в сыворотке крови здоровых доноров.d) the diagnosis of colorectal cancer by comparing the levels of protein tumor markers, antibodies to glycans and immunoglobulins of classes G, A, M in the analyzed sample with the corresponding levels of markers in the blood serum of healthy donors. 3. Способ по п. 2, в котором стадию а) проводят с известными концентрациями белковых онкомаркеров, иммуноглобулинов G, А, М и строят калибровочную зависимость сигналов от ячеек биологического микрочипа от концентрации соединений, которую используют для определения концентрации белковых онкомаркеров, иммуноглобулинов G, А, М, концентрации антител к гликанам в анализируемом образце.3. The method according to p. 2, in which stage a) is carried out with known concentrations of protein tumor markers, immunoglobulins G, A, M, and a calibration dependence of the signals on the cells of the biological microchip is built on the concentration of compounds that is used to determine the concentration of protein tumor markers, immunoglobulins G, A, M, the concentration of antibodies to glycans in the analyzed sample. 4. Способ по п. 2, в котором детекцию образовавшихся иммунных комплексов на стадии (б) проводят флуориметрически.4. The method according to p. 2, in which the detection of the formed immune complexes in stage (b) is carried out fluorimetrically. 5. Способ по п. 1, в котором в качестве белковых онкомаркеров используются РЭА, СА 19-9, СА 125, SCCA1 (SPB 3), SCCA2 (SPB 4), ПСА общ., ПСА своб., ХГЧ, АФП, СА 242.5. The method according to p. 1, in which CEA, CA 19-9, CA 125, SCCA1 (SPB 3), SCCA2 (SPB 4), PSA total., PSA free, hCG, AFP, CA are used as protein tumor markers 242. 6. Способ по п. 1, в котором в качестве антител к гликанам используются антитела к SiaTn, TF, Tn, LeC, LeY, SiaLeA, Manβ1-4GlcNAc.6. The method according to claim 1, wherein antibodies to SiaTn, TF, Tn, LeC, LeY, SiaLeA, Manβ1-4GlcNAc are used as antibodies to glycans. 7. Биологический микрочип для диагностики колоректального рака, представляющий собой массив трехмерных гидрогелевых элементов, характеризующийся тем, что он включает:7. A biological microchip for the diagnosis of colorectal cancer, which is an array of three-dimensional hydrogel elements, characterized in that it includes: - элементы, содержащие иммобилизованные антитела к онкомаркерам белковой природы,- elements containing immobilized antibodies to tumor markers of protein nature, - элементы, содержащие иммобилизованные гликаны, способные при развитии колоректального рака вызывать у человека иммунные реакции с участием иммуноглобулинов классов G, А и М,- elements containing immobilized glycans capable of inducing immune reactions in humans with the participation of immunoglobulins of classes G, A and M during the development of colorectal cancer - элементы, содержащие иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов человека классов G, А и М.- elements containing immobilized antibodies against human immunoglobulins of classes G, A and M. 8. Биологический микрочип п. 7, в котором каждый элемент массива с иммобилизованными гликанами содержит антитела к спейсерированным гликанам, и/или неогликоконъюгату, и/или гликану, выделенному из природных источников.8. The biological microchip of claim 7, wherein each element of the array with immobilized glycans contains antibodies to spacer glycans and / or a neoglycoconjugate and / or glycan isolated from natural sources.
RU2015153853A 2015-12-16 2015-12-16 Method for colorectal cancer diagnosis/screening based on simultaneous quantification of protein nature tumour markers, glycans antibodies, g, a and m immunoglobulins in human blood on biological microchip RU2625018C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015153853A RU2625018C2 (en) 2015-12-16 2015-12-16 Method for colorectal cancer diagnosis/screening based on simultaneous quantification of protein nature tumour markers, glycans antibodies, g, a and m immunoglobulins in human blood on biological microchip

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015153853A RU2625018C2 (en) 2015-12-16 2015-12-16 Method for colorectal cancer diagnosis/screening based on simultaneous quantification of protein nature tumour markers, glycans antibodies, g, a and m immunoglobulins in human blood on biological microchip

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015153853A RU2015153853A (en) 2017-06-19
RU2625018C2 true RU2625018C2 (en) 2017-07-11

Family

ID=59068196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015153853A RU2625018C2 (en) 2015-12-16 2015-12-16 Method for colorectal cancer diagnosis/screening based on simultaneous quantification of protein nature tumour markers, glycans antibodies, g, a and m immunoglobulins in human blood on biological microchip

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2625018C2 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2702009C1 (en) * 2019-04-08 2019-10-03 Федеральное государственное научное учреждение "Научно-исследовательский институт морфологии человека" Method for differential diagnosis of serration of colon
RU2798058C2 (en) * 2021-05-20 2023-06-14 Общество с ограниченной ответственностью "Биотех Югра" Screening method of colorectal cancer diagnosing

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005083440A2 (en) * 2004-02-19 2005-09-09 Yale University Identification of cancer protein biomarkers using proteomic techniques
RU2363955C2 (en) * 2004-12-28 2009-08-10 Учреждение Российской Академии Наук Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Ран (Имб Ран) Biological microchip for multiple parallel immunological analysis of compounds and methods of immunoassay thereof
RU137188U1 (en) * 2013-01-31 2014-02-10 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО НижГМА МЗ России) BIOCHIP FOR DIAGNOSTICS IN THE FIELD OF MEDICINE
US20140087957A1 (en) * 2012-09-25 2014-03-27 Marko Vuskovic Methods, assays and kits for cancer diagnosis and screening utilizing glycan-binding and glycan epitopes
RU2568242C2 (en) * 2012-04-24 2015-11-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им В.А. Энгельгарда Российской академии наук (ИМБ РАН) Method of treatment of blood sample at immunological analysis of allergen-specific and total immunoglobulins e

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005083440A2 (en) * 2004-02-19 2005-09-09 Yale University Identification of cancer protein biomarkers using proteomic techniques
RU2363955C2 (en) * 2004-12-28 2009-08-10 Учреждение Российской Академии Наук Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Ран (Имб Ран) Biological microchip for multiple parallel immunological analysis of compounds and methods of immunoassay thereof
RU2568242C2 (en) * 2012-04-24 2015-11-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им В.А. Энгельгарда Российской академии наук (ИМБ РАН) Method of treatment of blood sample at immunological analysis of allergen-specific and total immunoglobulins e
US20140087957A1 (en) * 2012-09-25 2014-03-27 Marko Vuskovic Methods, assays and kits for cancer diagnosis and screening utilizing glycan-binding and glycan epitopes
RU137188U1 (en) * 2013-01-31 2014-02-10 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО НижГМА МЗ России) BIOCHIP FOR DIAGNOSTICS IN THE FIELD OF MEDICINE

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SIDRANSKY D. et al. Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors // Science, 1992; 256(5053): 102-105. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2702009C1 (en) * 2019-04-08 2019-10-03 Федеральное государственное научное учреждение "Научно-исследовательский институт морфологии человека" Method for differential diagnosis of serration of colon
RU2798058C2 (en) * 2021-05-20 2023-06-14 Общество с ограниченной ответственностью "Биотех Югра" Screening method of colorectal cancer diagnosing

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015153853A (en) 2017-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kingsmore Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays
JP6161542B2 (en) Methods, arrays and uses thereof
CN103149369B (en) A kind of protein-chip and kit thereof detecting esophageal squamous cell carcinoma mark
WO2022083673A1 (en) Biomarker for esophageal cancer, and use thereof
Butvilovskaya et al. Multiplex determination of serological signatures in the sera of colorectal cancer patients using hydrogel biochips
US20210132070A1 (en) Serological biomarkers for early diagnosis of lung cancer
JP2012514184A (en) Methods for multi-analyte detection and quantification
CN105917230A (en) Method, array and use thereof for determining pancreatic cancer
CN101680896A (en) Method, array and use thereof
Li et al. A multiplexed bead assay for profiling glycosylation patterns on serum protein biomarkers of pancreatic cancer
CA3101968A1 (en) Apparatus and method for absolute quantification of biomarkers for solid tumor diagnosis
JP2018535433A (en) Biomarkers for the detection of breast cancer in women with dense breast
JP2020515826A (en) Antibody assay
Xia et al. The glycan array platform as a tool to identify carbohydrate antigens
CN203275415U (en) Protein chip for detecting esophageal squamous carcinoma marker and kit thereof
CN104380112B (en) Maternal biomarkers for gestational diabetes
Song et al. Simultaneous multianalysis for tumor markers by antibody fragments microarray system
RU2625018C2 (en) Method for colorectal cancer diagnosis/screening based on simultaneous quantification of protein nature tumour markers, glycans antibodies, g, a and m immunoglobulins in human blood on biological microchip
Heegaard et al. Circulating antinuclear antibodies in patients with pelvic masses are associated with malignancy and decreased survival
WO2020069661A1 (en) Serological biomarkers for early diagnosis of lung cancer
RU2599890C2 (en) Multi-parameter diagnostic test system intended for detecting and monitoring therapy of breast cancer and ovarian cancer, and analysis procedure using said method
US20080020475A1 (en) Methods and kits for the diagnosis of hypothyroidism
Gannot et al. Layered peptide arrays: high-throughput antibody screening of clinical samples
Haab et al. Using antibody arrays to measure protein abundance and glycosylation: considerations for optimal performance
US20150004633A1 (en) Assays and methods for the diagnosis of ovarian cancer

Legal Events

Date Code Title Description
QB4A Licence on use of patent

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20181101

Effective date: 20181101