RU2624846C1 - Application of 4-(3-ethoxy-4-hydroxybenzyl)-5-oxo-5,6-dihydro-4h-[1,3,4]-thiadiazine-2-(2,4-difluorophenyl)-carboxamide to suppress infection, caused by antibiotic-resistant pseudomonas aeruginosa strains, and method of suppression of this infection - Google Patents
Application of 4-(3-ethoxy-4-hydroxybenzyl)-5-oxo-5,6-dihydro-4h-[1,3,4]-thiadiazine-2-(2,4-difluorophenyl)-carboxamide to suppress infection, caused by antibiotic-resistant pseudomonas aeruginosa strains, and method of suppression of this infection Download PDFInfo
- Publication number
- RU2624846C1 RU2624846C1 RU2016139657A RU2016139657A RU2624846C1 RU 2624846 C1 RU2624846 C1 RU 2624846C1 RU 2016139657 A RU2016139657 A RU 2016139657A RU 2016139657 A RU2016139657 A RU 2016139657A RU 2624846 C1 RU2624846 C1 RU 2624846C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- infection
- strains
- dose
- antibiotic
- pseudomonas aeruginosa
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Область, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa.The invention relates to microbiology and can be used to suppress infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa.
Предшествующий уровеньPrior level
Pseudomonas aeruginosa или синегнойная палочка вызывает до 30%, а в некоторых отделениях до 50% всех внутрибольничных инфекций. Она является причиной внутрибольничных пневмоний, первичных бактериемий, инфекций мочеполовой системы и гнойных хирургических инфекций в высоком проценте случаев, особенно в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) у пациентов с искусственной вентиляцией легких и другими инвазивными процедурами такими, как катетеризация мочевого пузыря или проведение длительной инфузионной терапии. Часто инфекции развиваются молниеносно и сопровождаются высокой летальностью, показатели которой остаются стабильно высокими (34-48%). Такая угрожающая ситуация вызвана чрезвычайно высоким уровнем множественной устойчивости к большинству, а иногда и ко всем антибиотикам у клинических штаммов синегнойной палочки. P. aeruginosa лидирует среди антибиотикорезистентных грамотрицательных бактерий, вызывающих инфекции у госпитализированных больных. Внутрибольничные инфекции, вызванные синегнойной палочкой, практически не поддаются стандартному антибактериальному лечению вследствие множественной устойчивости к антибиотикам клинических штаммов. Кроме того, уже во время лечения развивается резистентность к новым препаратам. Поэтому приходится использовать комбинацию из нескольких антибиотиков, в том числе высокотоксичных. А смертность связана с тем, что бактериемии, вызванные псевдоманадами, развиваются так обвально, что даже не хватает времени поставить антибиотикограмму и подобрать нужный антибиотик. Например, по данным зарубежных исследований при бактериальном сепсисе выживаемость при адекватно назначенной стартовой антибактериальной терапии составляет 52,0%, при неадекватном стартовом назначении антибиотиков - 10,3%, то есть приводит к 5-кратному снижению выживаемости.Pseudomonas aeruginosa or Pseudomonas aeruginosa causes up to 30%, and in some departments up to 50% of all nosocomial infections. It is the cause of nosocomial pneumonia, primary bacteremia, infections of the genitourinary system and purulent surgical infections in a high percentage of cases, especially in resuscitation and intensive care units (ICU) in patients with mechanical ventilation and other invasive procedures such as catheterization of the bladder or long-term infusion therapy. Often infections develop at lightning speed and are accompanied by high mortality, the rates of which remain stably high (34-48%). This threatening situation is caused by an extremely high level of multiple resistance to the majority, and sometimes to all antibiotics, of clinical Pseudomonas aeruginosa strains. P. aeruginosa leads among antibiotic-resistant gram-negative bacteria that cause infections in hospitalized patients. Nosocomial infections caused by Pseudomonas aeruginosa practically do not respond to standard antibacterial treatment due to the multiple antibiotic resistance of clinical strains. In addition, already during treatment, resistance to new drugs develops. Therefore, you have to use a combination of several antibiotics, including highly toxic ones. And mortality is due to the fact that bacteremia caused by pseudomanadas develop so abruptly that there is not even enough time to put an antibioticogram and choose the right antibiotic. For example, according to foreign studies with bacterial sepsis, survival with adequately prescribed starting antibiotic therapy is 52.0%, with inadequate starting antibiotic administration - 10.3%, that is, leads to a 5-fold decrease in survival.
Борьба с внутрибольничными инфекциями требует значительных затрат, связанных с контролем и своевременной диагностикой инфекции, подбором эффективной терапии, необходимостью использования отделений интенсивной терапии, длительностью нахождения в стационаре, тяжелыми вплоть до летальных последствий данных заболеваний. Очевидно, что разработка новых подходов в создании антибактериальных препаратов с иными, чем у антибиотиков, механизмами действия, является чрезвычайно актуальной задачей.The fight against nosocomial infections requires significant costs associated with monitoring and timely diagnosis of infection, the selection of effective therapy, the need to use intensive care units, the length of stay in the hospital, severe up to the fatal consequences of these diseases. It is obvious that the development of new approaches to the creation of antibacterial drugs with mechanisms of action other than antibiotics is an extremely urgent task.
Известно лечение бактериальных инфекций, вызванных Р. aeruginosa, с помощью синтетических антибактериальных препаратов.It is known to treat bacterial infections caused by P. aeruginosa with synthetic antibacterial drugs.
Однако антибиотикорезистентность патогенных микроорганизмов, в том числе множественная, широко распространена и является важнейшим фактором снижения эффективности лечения инфекционных болезней практически во всех регионах мира.However, antibiotic resistance of pathogenic microorganisms, including multiple ones, is widespread and is the most important factor in reducing the effectiveness of treatment of infectious diseases in almost all regions of the world.
По данным исследований, проведенных НИИ антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии и исследовательской группой РОСНЕТ в ОРИТ российских стационаров до 2003 г., частота устойчивости P.aeruginosa к меропенему составила в среднем 3%, к имипенему - 22,9%. Из других бета-лактамных антибиотиков устойчивость к цефтазидиму была 12,2%, к пиперациллину-тазобактаму - 37,7%, к пиперациллину - 56,5%. По данным исследования той же группы в 2008 г. устойчивыми к меропенему были уже 41,4% выделенных штаммов синегнойной палочки, к имипенему - 39,0%, к цефтазидиму - 47,9%, к цефоперазону - 72,6%, к цефоперазону-сульбактаму - 60,7%, к цефепиму - 58,6%, к пиперациллину - 52,9%, к пиперациллину-тазобактаму - 42,4%. Аналогичные результаты были получены в исследованиях в рамках программы «РЕЗОРТ» в ОРИТ 31 ЛПУ РФ в 2002-2004 гг. - доля устойчивых штаммов составляла: к имипенему и меропенему - 39% и 41%; к амикацину - 42%; к цефтазидиму - 48%; к остальным цефалоспоринам - 58-72%. Была выявлена высокая частота встречаемости устойчивости к ципрофлоксацину - 65% и гентамицину - 75%. На основе данных микробиологического мониторинга в ГБУ "Санкт-Петербургский НИИ скорой помощи им И.И. Джанелидзе» с 2009 по 2012 гг. только к колистину не было выявлено устойчивых штаммов синегнойной палочки. Фактически для лечения синегнойных инфекций, вызванных множественноустойчивыми к антибиотикам штаммами, препаратом выбора остается только полимиксин Е (колистин), который редко применяется вследствие токсического воздействия на почки и слизистую кишечника больных.According to research conducted by the Research Institute of Antimicrobial Chemotherapy of the Smolensk State Medical Academy and the ROSNET research group in the ICU of Russian hospitals until 2003, the frequency of resistance of P.aeruginosa to meropenem was on average 3%, to imipenem - 22.9%. Of the other beta-lactam antibiotics, resistance to ceftazidime was 12.2%, to piperacillin-tazobactam - 37.7%, to piperacillin - 56.5%. According to a study of the same group, in 2008, 41.4% of isolated Pseudomonas aeruginosa strains were resistant to meropenem, 39.0% to imipenem, 47.9% to ceftazidime, 72.6% to cefoperazone, and cefoperazone -sulbactam - 60.7%, to cefepime - 58.6%, to piperacillin - 52.9%, to piperacillin-tazobactam - 42.4%. Similar results were obtained in studies in the framework of the RESORT program in ICU 31 of the medical facilities of the Russian Federation in 2002-2004. - the proportion of resistant strains was: to imipenem and meropenem - 39% and 41%; to amikacin - 42%; ceftazidime - 48%; to other cephalosporins - 58-72%. A high incidence of resistance to ciprofloxacin - 65% and gentamicin - 75% was revealed. Based on the data of microbiological monitoring at the State Budgetary Institution St. Petersburg Research Institute of Emergency Medicine named after II Dzhanelidze from 2009 to 2012, resistant strains of Pseudomonas aeruginosa were not detected only against colistin. In fact, for the treatment of Pseudomonas infections caused by multi-resistant antibiotic strains, the drug of choice is only polymyxin E (colistin), which is rarely used due to toxic effects on the kidneys and intestinal mucosa of patients.
В ряде зарубежных аналитических работ описывается современное положение дел в области эффективности лечения различными антибиотиками инфекций, вызванных P.aeruginosa. Например, в работе Somayeh Moazami Goudarzi et al представлены данные, полученные в результате обследования пациентов двух госпиталей в Тегеране (Иран) в 2011 г (1) (S. Moazami Goudarzi and F. Eftekhar, 2015). Было показано, что выявленные клинические штаммы обладали резистентностью к большинству тестируемых (как синтетическим, так и полусинтетическим и природным) антибиотикам таким как тетрациклин (80% устойчивых штаммов), карбенициллин (82%), пиперациллин (72%), азтреонам (76%), тобрамецин (78%), цефепим (77%), меропенем (71%), амикацин (78%), ципрофлоксацин (78%), котримоксазол (94%), имипенем (70%), цефтазидим (20%).A number of foreign analytical works describe the current state of affairs in the field of the effectiveness of treatment with various antibiotic infections caused by P. aeruginosa. For example, Somayeh Moazami Goudarzi et al presented data from a survey of patients at two hospitals in Tehran (Iran) in 2011 (1) (S. Moazami Goudarzi and F. Eftekhar, 2015). It was shown that the identified clinical strains were resistant to most of the tested antibiotics (both synthetic and semi-synthetic and natural) such as tetracycline (80% of resistant strains), carbenicillin (82%), piperacillin (72%), aztreonam (76%) , tobramycin (78%), cefepime (77%), meropenem (71%), amikacin (78%), ciprofloxacin (78%), cotrimoxazole (94%), imipenem (70%), ceftazidime (20%).
Отсутствуют опубликованные данные, оценивающие различие эффективности комбинированной и монотерапии инфекций, вызванных P. aeruginosa. Отсутствуют рандомизированные исследования, а не рандомизированные исследования по этой проблеме единичны и показывают противоречивые результаты. Большинство авторов, в том числе российских, считают комбинированную терапию инфекций, вызванных синегнойной палочкой, предпочтительнее монотерапии. Как правило, рекомендуют назначать различные комбинации цефалоспоринов, фторхинолонов, аминогликозидов и карбапенемов, чтобы повысить вероятность эффективного терапевтического воздействия и снизить риск возникновения антибиотикорезистентности (2-6) (Burgess D.S., Nathisuwan S. 2002; Bodey G.P., et al. 1985; Hilf M, et al. 1989; Leibovici L, et al. 1997; Siegman-lgra Y., et al. 1998).There are no published data evaluating the difference in the effectiveness of combination and monotherapy for infections caused by P. aeruginosa. There are no randomized trials, and not randomized trials on this problem are single and show conflicting results. Most authors, including Russian ones, consider combination therapy of infections caused by Pseudomonas aeruginosa to be preferred over monotherapy. Various combinations of cephalosporins, fluoroquinolones, aminoglycosides, and carbapenems are generally recommended to increase the likelihood of effective therapeutic effects and reduce the risk of antibiotic resistance (2-6) (Burgess DS, Nathisuwan S. 2002; Bodey GP, et al. 1985; Hilf M , et al. 1989; Leibovici L, et al. 1997; Siegman-lgra Y., et al. 1998).
Таким образом, антибиотикорезистентные клинические штаммы синегнойной палочки широко распространены и вызывают серьезные проблемы при выборе схемы лечения, вызванных ими инфекций. Возникает необходимость использования высокотоксичных антибиотиков, что приводит к возникновению опасных побочных эффектов у пациентов, нарушающих нормальное функционирование жизненно важных органов.Thus, antibiotic-resistant clinical strains of Pseudomonas aeruginosa are widespread and cause serious problems when choosing the treatment regimen caused by infections. There is a need to use highly toxic antibiotics, which leads to dangerous side effects in patients who disrupt the normal functioning of vital organs.
Вследствие этого многие фармацевтические компании замедлили или прекратили программы по разработке новых антибиотиков, поскольку новые антибиотики стало сложнее коммерциализовывать из-за их низкой эффективности в условиях высокого распространения антибиотико-резистентных штаммов бактерий.As a result, many pharmaceutical companies have slowed down or discontinued new antibiotic development programs, as new antibiotics have become more difficult to commercialize because of their low efficacy in the face of the high prevalence of antibiotic-resistant bacteria strains.
Несмотря на то, что изучение патогенов на молекулярно-генетическом уровне позволяет идентифицировать новые мишени для разработки антибактериальных средств, не основанных на бактерицидном или бактериостатическом действии, в настоящее время на рынке фармпрепаратов такие препараты отсутствуют.Despite the fact that the study of pathogens at the molecular genetic level allows us to identify new targets for the development of antibacterial agents that are not based on bactericidal or bacteriostatic action, such drugs are currently not available on the pharmaceutical market.
Очевидно, что необходимо разрабатывать принципиально новые подходы и препараты для лечения бактериальных инфекций, которые могут применяться как самостоятельно, так и при комбинированной терапии. Фундаментальные исследования последних 10 лет позволили изменить стратегию борьбы с инфекциями. В частности, в качестве мишеней для поиска антибактериальных препаратов выбирают факторы патогенности бактерий. Такие препараты должны не убивать микробы, а подавлять вирулентность, не создавая условий для селективного отбора, что принципиально снижает риск развития генетически детерминированной резистентности к применяемому препарату. Таким образом, увеличение доли антибиотикорезистентных бактериальных инфекций требует поиска не только новых антибиотиков, но и эффективных ингибиторов факторов вирулентности, подавляющих инфекцию по иному механизму.It is obvious that it is necessary to develop fundamentally new approaches and drugs for the treatment of bacterial infections that can be used both independently and in combination therapy. Basic research over the past 10 years has made it possible to change the strategy for fighting infections. In particular, bacterial pathogenicity factors are chosen as targets for the search for antibacterial drugs. Such drugs should not kill microbes, but suppress virulence, without creating conditions for selective selection, which fundamentally reduces the risk of developing genetically determined resistance to the drug used. Thus, an increase in the proportion of antibiotic-resistant bacterial infections requires the search for not only new antibiotics, but also effective inhibitors of virulence factors that suppress the infection by a different mechanism.
Важнейшим фактором реализации бактериями патогенных свойств является транспорт белковых факторов вирулентности в клетку макроорганизма. Процесс осуществляется путем секреции и экспорта эффекторных молекул через мембраны, либо непосредственно в цитоплазму клетки-хозяина, что приводит к изменению ее нормального физиологического состояния и способствует инвазии и внутриклеточному размножению патогена. В настоящее время известно семь систем секреции, различающихся по структуре секреторного аппарата и специфической направленностью действия эффекторных молекул.The most important factor in the realization of pathogenic properties by bacteria is the transport of protein virulence factors into the cell of a macroorganism. The process is carried out by secretion and export of effector molecules through membranes, or directly into the cytoplasm of the host cell, which leads to a change in its normal physiological state and contributes to the invasion and intracellular reproduction of the pathogen. Currently, seven secretion systems are known that differ in the structure of the secretory apparatus and the specific direction of action of the effector molecules.
Перспективной мишенью для разработки новых антибактериальных препаратов является система секреции III типа (ССТТ) грамотрицательных бактерий, осуществляющая перенос белков - факторов патогенности из бактериальной клетки непосредственно в цитоплазму эукариотической клетки. ССТТ присутствует только у патогенных бактерий; именно благодаря ее функционированию широкий спектр бактерий с различным типом паразитирования (экзо- и эндопаразиты) реализуют свои патогенные свойства. Мутации, приводящие к нарушению функций ССТТ, вызывают снижение или потерю вирулентности (7) (А.С. McShan, R.N. De Guzman, 2015).A promising target for the development of new antibacterial drugs is a type III secretion system (CCT) of gram-negative bacteria, which transfers proteins, pathogenicity factors, from a bacterial cell directly to the cytoplasm of a eukaryotic cell. STST is present only in pathogenic bacteria; It is thanks to its functioning that a wide range of bacteria with various types of parasitization (exo- and endoparasites) realize their pathogenic properties. Mutations leading to impaired CTST functions cause a decrease or loss of virulence (7) (A.S. McShan, R.N. De Guzman, 2015).
У P.aeruginosa белки, секретируемые посредством третьей транспортной системы, являются токсинами, вызывающими гибель клеток путем апоптоза или некроза. Основное их действие направлено на подавление иммунного ответа: они ингибируют миграцию и фагоцитоз макрофагов и нейтрофилов, рекрутируемых к очагу инфекции, вызывают гибель иммунных клеток. Так, при пневмонии, белки ССТТ создают иммуносупрессию в тканях легкого, что позволяет не только синегнойной палочке персистировать в легких, но и способствует развитию суперинфекции при заражении другими патогенами.In P. aeruginosa, proteins secreted by the third transport system are toxins that cause cell death by apoptosis or necrosis. Their main action is aimed at suppressing the immune response: they inhibit the migration and phagocytosis of macrophages and neutrophils recruited to the site of infection, causing the death of immune cells. So, with pneumonia, CTTT proteins create immunosuppression in lung tissues, which allows not only Pseudomonas aeruginosa to persist in the lungs, but also contributes to the development of superinfection when infected with other pathogens.
В целом, секретируемые белки псевдомонад участвуют в установлении инфекции и диссеминации патогена при острой инфекции, и ответственны за персистенцию при хронической инфекции. Элиминация P.aeruginosa у больного косвенно способствует его сопротивляемости к другим инфекциям, за счет повышения защитных свойств организма хозяина, подавленных в результате действия ССТТ P.aeruginosa.In general, secreted pseudomonad proteins are involved in the establishment of infection and dissemination of the pathogen in acute infection, and are responsible for persistence in chronic infection. Elimination of P.aeruginosa in a patient indirectly contributes to its resistance to other infections, due to the increase in the protective properties of the host organism, suppressed as a result of the action of CTST P.aeruginosa.
К настоящему времени идентифицировано 4 эффекторных белка ССТТ P.aeruginosa, ExoU, ExoS, ЕхоТ, ExoY. Фактически все штаммы псевдомонад имеют гены, кодирующие секреторный аппарат, однако большинство штаммов не содержат полный набор генов, детерминирующих эффекторные белки. Клинические штаммы P.aeruginosa характеризуются различными генотипами и фенотипами, что влияет на тяжесть заболевания и клинический прогноз. Изучение частоты смертельных исходов, бактериальной персистенции в легких, диссеминации бактерий показало, что секреция токсина ExoU вносит наибольший вклад в вирулентность, в то время как секреция белка ExoS белка связана с меньшей вирулентностью, а белок ЕхоТ имеет минимальный эффект на проявление вирулентных свойств патогена. Патогенез поражения легких связан с активностью ExoU, который индуцирует прокоагулянтные процессы в эпителиальных клетках, гиперпроницаемость сосудов, активацию тромбоцитов и образование тромбов при псевдомонадной пневмонии и сепсисе. Токсическое действие ExoU направлено против фагоцитов, а также на преодоление эпителиального барьера, что способствует бактериальной диссеминации и персистенции (8) (B.J. Berube et al. 2016).To date, 4 CTT effector proteins P.aeruginosa, ExoU, ExoS, ExoT, ExoY have been identified. Virtually all strains of pseudomonads have genes encoding the secretory apparatus, however, most strains do not contain a complete set of genes that determine effector proteins. Clinical P.aeruginosa strains are characterized by different genotypes and phenotypes, which affects the severity of the disease and the clinical prognosis. Studying the frequency of deaths, bacterial persistence in the lungs, and dissemination of bacteria showed that the secretion of ExoU toxin makes the greatest contribution to virulence, while the secretion of ExoS protein is associated with less virulence, and ExoT protein has a minimal effect on the manifestation of the virulent properties of the pathogen. The pathogenesis of lung damage is associated with ExoU activity, which induces procoagulant processes in epithelial cells, vascular hyperpermeability, platelet activation, and blood clots in pseudomonas pneumonia and sepsis. The toxic effect of ExoU is directed against phagocytes, as well as overcoming the epithelial barrier, which contributes to bacterial dissemination and persistence (8) (B.J. Berube et al. 2016).
Поиски ингибиторов ССТТ активно продолжаются в настоящее время, т.к. терапия такими препаратами имеет ряд преимуществ по сравнению с антибиотиками:The search for CCTT inhibitors is currently ongoing. therapy with such drugs has several advantages compared to antibiotics:
- ингибиторы ССТТ не способствуют отбору устойчивых форм микроорганизмов, поскольку не вызывают гибель и не подавляет размножение патогенов, а только ингибируют их вирулентность. Эрадикация возбудителя, утратившего вирулентные свойства, происходит в результате действия иммунных защитных сил организма-хозяина.- CTST inhibitors do not contribute to the selection of resistant forms of microorganisms, since they do not cause death and do not inhibit the reproduction of pathogens, but only inhibit their virulence. The eradication of a pathogen that has lost its virulent properties occurs as a result of the action of the immune defenses of the host organism.
- ингибиторы ССТТ перспективны для лечения инфекций, вызванных патогенами, устойчивыми к антибиотикам, т.к. эти ингибиторы действуют на возбудителя вне зависимости от приобретенной резистентности к антибиотикам.- CTST inhibitors are promising for the treatment of infections caused by antibiotic-resistant pathogens, as these inhibitors act on the pathogen, regardless of acquired antibiotic resistance.
- поскольку ингибиторы ССТТ оказывают воздействие только на патогенные микроорганизмы, терапия этими препаратами не будет вызывать гибель нормальной микрофлоры человека и развития дисбактериозов.- since CCTT inhibitors affect only pathogenic microorganisms, therapy with these drugs will not cause the death of normal human microflora and the development of dysbiosis.
- потеря вирулентности возбудителем под воздействием ингибитора значительно снизит вред, наносимый патогеном организму хозяину.- the loss of virulence by the pathogen under the influence of an inhibitor will significantly reduce the damage caused by the pathogen to the host organism.
В настоящее время в научных публикациях и в патентах описан целый ряд ингибиторов ССТТ P.aeruginosa, имеющих различную химическую структуру, принадлежащих к различным классам низкомолекулярных соединений, а также специфические антитела к белку кончика иглы инжектосомы (9) (A. Ahalieyah et al. 2016). Наиболее изучены два основных класса низкомолекулярных соединений, гидразоны салицилового альдегида (salicylidene acylhydrazides) (10, 11) Slepenkin A., et al. 2011; A. Anantharajah, et al. 2012) и тиазолидиноны (thiazolidinones) (12, 13) (Felise H.B., et al. 2008;. Kline Т., et al. 2009). Для нескольких ингибиторов были выявлены конкретные мишени в ССТТ, но большинство мишеней для ингибиторов ССТТ еще предстоит идентифицировать или охарактеризовать. Большинство ингибиторов ССТТ являются соединениями, отобранными в результате скрининга синтетических химических библиотек, но также есть ингибиторы природного происхождения - ауродокс, каминозид, гуадиномин, (-)-хопеафенол, цитрусовые флавоноиды, пиерисидин, псевдокерамин, салицилиденеанилид, лактоферрин, альгинат, муцин и др. Помимо низкомолекулярных соединений ингибирующие действие на ССТТ показано для некоторых высокомолекулярных веществ, которые представлены полимерами, белками, полипептидами-миметиками, полисахаридами (9) (A. Ahalieyah et al. 2016).Currently, scientific publications and patents describe a number of P.aeruginosa CTTT inhibitors with different chemical structures, belonging to different classes of low molecular weight compounds, as well as specific antibodies to the injection tip protein of the injectosome (9) (A. Ahalieyah et al. 2016. ) Two main classes of low molecular weight compounds, the hydrazones of salicylic aldehyde (salicylidene acylhydrazides) (10, 11) Slepenkin A., et al. 2011; A. Anantharajah, et al. 2012) and thiazolidinones (thiazolidinones) (12, 13) (Felise H. B., et al. 2008; Kline, T., et al. 2009). For several inhibitors, specific targets have been identified in CCTT, but most targets for CCTT inhibitors have yet to be identified or characterized. Most CCTT inhibitors are compounds selected by screening synthetic chemical libraries, but there are also naturally occurring inhibitors - aurodox, kaminoside, guadinomine, (-) - hopeaphenol, citrus flavonoids, pyerisidine, pseudoceramine, salicylideneanilide, dracterin, lactoferin. In addition to low molecular weight compounds, the inhibitory effect on CTST is shown for some high molecular weight substances, which are represented by polymers, proteins, mimetic polypeptides, polysaccharides (9) (A. Ahalieya h et al. 2016).
По направлению воздействия на ССТТ ингибиторы могут быть разделены на следующие группы:In the direction of action on CTST, inhibitors can be divided into the following groups:
- действующие на генетическую регуляцию СССТ (растительные фенольные соединения, N-гидрокси-бензимидазолы, салицилиден ацилразиды);- acting on the genetic regulation of SSST (plant phenolic compounds, N-hydroxybenzimidazoles, salicylidene acylrazides);
- действующие на функционирование аппарата ССТТ (гидроксихинолины, тиазолидиноны, фенилацетамиды, PcrV-антитела (КВ001; V2L2MD), PcrV/Psl-антитела MEDI3902);- Acting on the functioning of the CCTT apparatus (hydroxyquinolines, thiazolidinones, phenylacetamides, PcrV antibodies (KB001; V2L2MD), PcrV / Psl antibodies MEDI3902);
- действующие на эффекторные белки ССТТ (экзоцин, арильные сульфаниламиды, псевдолипаза А);- acting on the CTST effector proteins (exocin, aryl sulfonamides, pseudolipase A);
- ингибиторы неопределенного действия (С20, С22, С24, С34 и С38, (-)-hopeaphenol, галлий (III) - салицилиден ацилгидразиды) (9) (A. Ahalieyah et al. 2016).- inhibitors of indefinite action (C20, C22, C24, C34 and C38, (-) - hopeaphenol, gallium (III) - salicylidene acylhydrazides) (9) (A. Ahalieyah et al. 2016).
Таким образом, к настоящему времени известен целый ряд технических решений, связанных с получением ингибиторов ССТТ псевдомонад. Среди них низкомолекулярные соединения различных классов, а также специфические антитела к структурному белку ССТТ.Thus, to date, a number of technical solutions are known related to the preparation of pseudomonas CTTT inhibitors. Among them, low molecular weight compounds of various classes, as well as specific antibodies to the structural protein CTST.
Для всех полученных ингибиторов показана активность в отношении подавления секреторной функции патогена в условиях in vitro. При этом для большинства ингибиторов не идентифицирована конкретная мишень действия и не изучен молекулярный механизм ингибирования. Следовательно, полученные к настоящему времени ингибиторы ССТТ могут обладать различной активностью, подавляя секрецию, как специфически, так и опосредовано через иные молекулярные мишени патогена.For all inhibitors obtained, activity was shown to inhibit the secretory function of the pathogen in vitro. However, for most inhibitors, a specific target of action has not been identified and the molecular mechanism of inhibition has not been studied. Therefore, CTTT inhibitors obtained to date may have different activity, inhibiting secretion, both specifically and indirectly through other molecular targets of the pathogen.
При разработке эффективных лекарственных препаратов на основе ингибиторов ССТТ для лечения инфекционных заболеваний ключевой задачей является доказательство антибактериального действия полученных ингибиторов на моделях инфекционного процесса у животных. Это обусловлено тем, что подавление секреторной функции патогена снижает его вирулентность, но не влияет на жизнеспособность, т.е. напрямую не связано с подавлением инфекции. Тем самым, для ингибиторов ССТТ требуется экспериментально подтвердить концепцию о том, что снижение вирулентности приведет к блокированию инфекции в организме хозяина. Кроме того, потенциальные лекарственные препараты должны характеризоваться отсутствием токсического эффекта на организм хозяина и на нормальную микрофлору.In the development of effective drugs based on CCTT inhibitors for the treatment of infectious diseases, the key task is to prove the antibacterial action of the obtained inhibitors in animal models of the infection process. This is due to the fact that suppression of the secretory function of a pathogen reduces its virulence, but does not affect viability, i.e. not directly related to suppression of infection. Thus, for CTST inhibitors, it is required to experimentally confirm the concept that a decrease in virulence will lead to blocking of infection in the host organism. In addition, potential drugs should be characterized by the absence of a toxic effect on the host organism and on the normal microflora.
Среди известных ингибиторов терапевтический эффект в виде подавления синегнойной инфекции в моделях in vivo был показан для специфических антител к компонентам иглы ССТТ-PcrV-антитела (КВ001; V2L2MD) (16, 17) (Francois, В. et al. 2012; Warrener, P. et al. 2014) и PcrV/Psl-антитела (MEDI3902) (18) (DiGiandomenico, A. et al. 2014). Однако эту группу препаратов на основе антител следует рассматривать отдельно в связи с тем, что они относятся к группе иммунобиологических лекарственных препаратов. Также терапевтический эффект в виде подавления синегнойной инфекции в моделях in vivo был показан для низкомолекулярного соединения INP1855, принадлежащего к классу гидроксихинолинов (14, 15) (А. Anantharajah, Е. Faure, J.М. Buyck, et al. 2016; Enquist, P.A., et al. 2012). Данное решение, как наиболее близкое к заявляемому по назначению - как ингибитор, терапевтический эффект которого выражается в виде подавления синегнойной инфекции, было принято авторами за прототип.Among known inhibitors, the therapeutic effect in the form of suppression of Pseudomonas aeruginosa in in vivo models has been shown for specific antibodies to the components of the CCTT-PcrV antibody needle (KB001; V2L2MD) (16, 17) (Francois, B. et al. 2012; Warrener, P . et al. 2014) and PcrV / Psl antibodies (MEDI3902) (18) (DiGiandomenico, A. et al. 2014). However, this group of drugs based on antibodies should be considered separately due to the fact that they belong to the group of immunobiological drugs. Also, the therapeutic effect in the form of suppression of Pseudomonas aeruginosa in in vivo models was shown for the low molecular weight compound INP1855 belonging to the class of hydroxyquinolines (14, 15) (A. Anantharajah, E. Faure, J.M. Buyck, et al. 2016; Enquist, PA, et al. 2012). This decision, as the closest to the claimed purpose - as an inhibitor, the therapeutic effect of which is expressed in the form of suppression of Pseudomonas infection, was taken by the authors as a prototype.
Химическая структура ингибитора ССТТ P. aeruginosa, выбранного в качестве прототипаThe chemical structure of the CTTT inhibitor P. aeruginosa, selected as a prototype
По прототипу данного изобретения, сущность которого отражена в работе по изучению подавляющего инфекцию действия ингибитора ССТТ, относящегося к классу гидроксихинолинов, в отношении острой легочной инфекции у мышей, вызванной синегнойной палочкой, показано, что однократное интраназальное введение препарата INP1855 в дозе 4,5 мкг сразу после заражения летальной дозой P.aeruginosa повышало процент выживших животных с 38% (в контроле) до 88% через 48 час после заражения, т.е. наблюдали подавление гибели животных в 5 раз. У мышей, получавших INP1855, наблюдали снижение на 2-3% патологических изменений в легких и примерно в 30 раз снижение количества бактерий в легких. Был также показан дозозависимый эффект INP1855 при внутрибрюшинном введении через 4 ч. после заражения псевдомонадами (14) (A. Anantharajah, Е. Faure, J.М. Buyck, et al. 2016).According to the prototype of this invention, the essence of which is reflected in the study of the suppressing infection of the action of the CTTT inhibitor belonging to the class of hydroxyquinolines in relation to acute pulmonary infection in mice caused by Pseudomonas aeruginosa, it was shown that a single intranasal administration of INP1855 at a dose of 4.5 μg after infection with a lethal dose, P.aeruginosa increased the percentage of surviving animals from 38% (in control) to 88% 48 hours after infection, i.e. observed inhibition of animal death by 5 times. In mice treated with INP1855, a 2-3% decrease in pathological changes in the lungs and an approximately 30-fold decrease in the number of bacteria in the lungs were observed. The dose-dependent effect of INP1855 upon
Эта работа является единственной опубликованной, показывающей эффективность низкомолекулярного ингибитора ССТТ на модели in vivo, но имеет ряд недостатков в отношении активности и изученности полученного ингибитора.This work is the only one published showing the efficacy of a low molecular weight CTTT inhibitor in an in vivo model, but has a number of drawbacks with respect to the activity and knowledge of the resulting inhibitor.
1. Эксперименты на животных были проведены с одним штаммом Pseudomonas aeruginosa, который характеризуется exoU+ генотипом, при этом оппозитный генотип exoS+, являясь инвазивным, вызывает генерализованные инфекции и сепсис, а также является преобладающим среди всех клинических штаммов, от 85 до 75%.1. Animal experiments were carried out with one strain of Pseudomonas aeruginosa, which is characterized by the exoU + genotype, while the opposite exoS + genotype, being invasive, causes generalized infections and sepsis, and is also prevalent among all clinical strains, from 85 to 75%.
2. Не была разработана полная схема лечения.2. A complete treatment regimen has not been developed.
3. Не было показано полное подавление накопления возбудителя в тканях легкого. Количество высеваемых из легкого псевдомонад после лечения ингибитором сохранялось в значительном числе, более чем, 105 КОЕ/легкое. При этом известно, что не долеченная инфекция может приводить к развитию хронических состояний и рецидивов на фоне ослабления иммунного статуса.3. The complete suppression of pathogen accumulation in lung tissues has not been shown. The amount of pseudomonas sown from the lung after treatment with the inhibitor remained in a significant number, more than 10 5 CFU / lung. It is also known that untreated infection can lead to the development of chronic conditions and relapses against the background of a weakened immune status.
4. Не проведена характеристика токсичности полученного ингибитора для экспериментальных животных.4. The toxicity characterization of the obtained inhibitor for experimental animals was not performed.
5. Не изучено влияние полученного ингибитора на нормальную микрофлору.5. The effect of the obtained inhibitor on the normal microflora has not been studied.
Таким образом, существует необходимость проведения дальнейших исследований с целью расширения арсенала ингибиторов системы секреции III типа P.aeruginosa, изучения их эффективности на моделях инфекционного процесса у животных, испытаний их возможной токсичности для организма хозяина и микрофлоры. Такие исследования направлены на разработку нового поколения антибактериальных препаратов с отличным от антибиотиков механизмом действия и эффективными в отношении антибиотикорезистентных штаммов синегнойной палочки.Thus, there is a need for further studies to expand the arsenal of inhibitors of the type III secretion system P.aeruginosa, study their effectiveness in models of the infection process in animals, and test their possible toxicity to the host organism and microflora. Such studies are aimed at developing a new generation of antibacterial drugs with a mechanism of action different from antibiotics and effective against antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Технической задачей, решаемой данным изобретением, является:The technical problem solved by this invention is:
- подавление инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa с различным генотипом по генам эффекторных белков ССТТ и различным профилем антибиотикорезистентности.- suppression of infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa with a different genotype for the genes for CTT effector proteins and a different antibiotic resistance profile.
- подавление инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa у зараженного организма на модели in vivo, вне зависимости от приобретенной антибиотикорезистентности.- suppression of infection caused by Pseudomonas aeruginosa in an infected organism in an in vivo model, regardless of acquired antibiotic resistance.
- отсутствие ингибирующего действия на нормальную микрофлору макроорганизма при применении 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa.- the absence of an inhibitory effect on the normal microflora of the macroorganism when using 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4 -difluorophenyl) -carboxamide to suppress infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa.
Указанная задача решается путемThe specified problem is solved by
применения 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa в живом организме, а также способом подавления инфекции вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa заключающимся в воздействии на штаммы Pseudomonas aeruginosa эффективным количеством этого соединения.the use of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] -thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide to suppress infection, caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa in a living organism, as well as a method of suppressing an infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa by exposing the strains of Pseudomonas aeruginosa to an effective amount of this compound.
Термины и определенияTerms and Definitions
«Инфекция» - совокупность биологических процессов, возникающих и развивающихся в организме хозяина при внедрении и размножении в нем патогенных микробов."Infection" - a set of biological processes that occur and develop in the host during the introduction and reproduction of pathogenic microbes in it.
«Подавление инфекции» - процесс ограничения проявления факторов, развивающихся в организме хозяина после внедрения и размножения патогенов"Inhibition of infection" is the process of limiting the manifestation of factors developing in the host body after the introduction and reproduction of pathogens
«Накопление патогена в тканях» - процесс, характеризующийся размножением бактерий“Pathogen accumulation in tissues” - a process characterized by the growth of bacteria
«Подавление бактерий» - блокирование жизнеспособности бактерий в результате негативного действия на метаболизм и/или на размножение"Bacterial suppression" - blocking the viability of bacteria as a result of negative effects on metabolism and / or on reproduction
«Факторы патогенности» - механизмы, обеспечивающие колонизацию микробов, их устойчивость к микробицидным факторам организма, инвазивность и токсигенность, а также способность к длительному персистированию"Pathogenicity factors" - mechanisms that ensure the colonization of microbes, their resistance to microbicidal factors of the body, invasiveness and toxigenicity, as well as the ability to long-term persistence
«Подавление факторов патогенности» - ингибирование процессов колонизации, устойчивости к микробицидным факторам организма, инвазивности, токсигенности и персистирования“Suppression of pathogenicity factors” - inhibition of colonization processes, resistance to microbicidal factors of the body, invasiveness, toxigenicity and persistence
«Генотип» - совокупность генов данного организма."Genotype" - a set of genes of a given organism.
«Система секреции III типа бактерий» - аппарат бактериальной клетки, обеспечивающий одноэтапный транспорт эффекторных молекул патогенности из цитоплазмы бактерии в цитозоль эукариотической клетки макроорганизма. Рассматривается как один из основных факторов патогенности грамотрицательных бактерий, реализующих инвазию, токсигенность и диссеминацию патогена в инфицированном организме (далее ССТТ).The “type III secretion system of bacteria” is a bacterial cell apparatus that provides a one-stage transport of pathogenicity effector molecules from the bacterial cytoplasm to the cytosol of a eukaryotic macroorganism cell. It is considered as one of the main pathogenicity factors of gram-negative bacteria, which realize invasion, toxigenicity and dissemination of the pathogen in the infected body (hereinafter referred to as CTST).
«Профиль антибиотикорезистентности» - отсутствие чувствительности бактерий к конкретным антимикробным препаратам"Antibiotic resistance profile" - lack of sensitivity of bacteria to specific antimicrobial agents
«Формирование антибиотикорезистентности» - свойство отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции. Формирование резистентности обусловлено генетически: приобретением новой генетической информации или изменением уровня экспрессии собственных генов. Резистентные штаммы выживают и распространяются в условиях селективного действия антибиотиков.“Formation of antibiotic resistance” is the property of individual bacterial strains to remain viable at those antibiotic concentrations that suppress the bulk of the microbial population. The formation of resistance is genetically determined: the acquisition of new genetic information or a change in the expression level of one's own genes. Resistant strains survive and spread under the selective action of antibiotics.
«In vitro» - технология выполнения экспериментов, когда опыты проводятся «в пробирке» - вне живого организма на культуре живых клеток или в бесклеточной модели.“In vitro” is a technology for performing experiments when experiments are carried out “in vitro” - outside a living organism in a culture of living cells or in a cell-free model.
«In vivo» - технология выполнения экспериментов на живом организме, на человеке или на животной модели."In vivo" is a technology for performing experiments on a living organism, on a person, or on an animal model.
«Облигатные внутриклеточные бактерии» - бактерии, размножающиеся только внутри эукариотических клеток, ввиду энергетической зависимости от макроэргических молекул клетки хозяина. Культивируются in vitro только в клеточных культурах. Инфекцию в макроорганизме вызывают в результате внутриклеточной колонизации и воздействия на метаболизм клетки хозяина."Obligatory intracellular bacteria" - bacteria that multiply only inside eukaryotic cells, due to energy dependence on macroergic molecules of the host cell. Cultivated in vitro only in cell cultures. An infection in a macroorganism is caused by intracellular colonization and effects on the metabolism of the host cell.
«Внеклеточные патогенные бактерии» - бактерии, размножающиеся в организме хозяина вне клеток и вызывающие инфекцию в результате действия факторов патогенности."Extracellular pathogenic bacteria" - bacteria that multiply in the host body outside the cells and cause infection as a result of the action of pathogenicity factors.
Авторами были синтезированы и запатентованы биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии, представляющие собой замещенные производные 1,3,4-тиадиазолинов (I), тиадиазинонов (II) и тиадиазепинонов (III), полученные на основе тиогидразидов оксаминовых кислот (патент РФ №2447066). Полученные активные низкомолекулярные соединения являются ингибиторами системы секреции III типа у патогенных бактерий. Для полученных соединений было показано подавление размножения патогенных бактерий в культуре клеток в условиях in vitro на примере хламидий. Хламидии являются представителями облигатных внутриклеточных паразитов, у которых система секреции III типа обеспечивает контакт с клеткой хозяина, а ее ингибирование блокирует размножение бактерий. Специфичность ингибиторов в отношении системы секреции III типа была продемонстрирована при детекции эффекторного белка хламидий, секретируемого с помощью ССТТ, в мембрану хламидийной фагосомы. В этом патенте не было исследовано и экспериментально показано, что полученные низкомолекулярные ингибиторы подавляют секрецию эффекторных белков ССТТ у внеклеточных патогенов. При этом механизм взаимодействия внутриклеточных и внеклеточных патогенов с организмом хозяина принципиально различен, а система секреции III типа у этих двух групп бактерий выполняет различные функции. У внутриклеточных патогенов ССТТ обеспечивает возможность внутриклеточного выживания, а у внеклеточных - развитие инфекции в результате токсического действия молекул эффекторов в отношении иммунных и барьерных клеток. В патенте не была экспериментально продемонстрирована возможность подавления инфекции в организме животного при действии полученных ингибиторов ССТТ. Кроме того, не было изучено влияние выбранных ингибиторов ССТТ на секреторный аппарат P.aeruginosa и на развитие инфекционного процесса у лабораторных животных.The authors synthesized and patented biologically active substances that suppress pathogenic bacteria, which are substituted derivatives of 1,3,4-thiadiazolines (I), thiadiazinones (II) and thiadiazepinones (III), obtained on the basis of oxamic acid thiohydrazides (RF patent No. 2447066) . The resulting active low molecular weight compounds are inhibitors of the type III secretion system in pathogenic bacteria. For the obtained compounds, the inhibition of the propagation of pathogenic bacteria in cell culture in vitro was shown by the example of chlamydia. Chlamydia is a representative of obligate intracellular parasites, in which a type III secretion system provides contact with the host cell, and its inhibition blocks the growth of bacteria. The specificity of inhibitors with respect to the type III secretion system was demonstrated by the detection of chlamydia effector protein secreted by CCTT into the membrane of the chlamydial phagosome. In this patent, it was not investigated and experimentally shown that the obtained low molecular weight inhibitors inhibit the secretion of CTST effector proteins in extracellular pathogens. Moreover, the mechanism of interaction of intracellular and extracellular pathogens with the host organism is fundamentally different, and the type III secretion system in these two groups of bacteria performs different functions. In intracellular pathogens, CTST provides the possibility of intracellular survival, and in extracellular pathogens, the development of infection as a result of the toxic effect of effector molecules against immune and barrier cells. The patent has not experimentally demonstrated the possibility of suppressing infection in the animal's body under the action of the obtained CTST inhibitors. In addition, the effect of the selected CTST inhibitors on the secretory apparatus of P.aeruginosa and on the development of the infectious process in laboratory animals has not been studied.
Поэтому разработка применения 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида и способа подавления инфекции, вызванной антибиотикорезистентными штаммами Pseudomonas aeruginosa, на модели инфекции у животных с помощью низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа, представленного в настоящем изобретении, обладает «новизной» и изобретательским уровнем.Therefore, the development of the use of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide and a method of suppressing the infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa in a model of infection in animals using the low-molecular type III secretion system inhibitor of the present invention has a "novelty" and inventive step.
Краткое описание фигурBrief Description of the Figures
На фиг. 1 представлена схема синтеза 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида VIII (соединение CL-55).In FIG. 1 shows a synthesis scheme for 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide VIII (connection CL-55).
На фиг. 2 показана реакция препаратов секретируемых белков P. aeruginosa с антителами к эффектору ЕхоТ. Красным цветом отмечена сильная реакция. Название штаммов P. aeruginosa отмечены сверху рисунка.In FIG. Figure 2 shows the reaction of preparations of secreted P. aeruginosa proteins with antibodies to the ExoT effector. A strong reaction is marked in red. The name of the P. aeruginosa strains are marked on top of the figure.
На фиг. 3 показано подавление активности ССТТ клинических штаммов 1625/36/2015 с exoU+ генотипом (А) и КБ6 с exoS+ генотипом (Б) P.aeruginosa (после индукции ССТТ 5 мМ EGTA и действии разных концентраций CL-55 при постановке метода иммуноблота с сывороткой к ЕхоТ белку (53 кДа), обозначен стрелками.In FIG. Figure 3 shows the suppression of the activity of CCTT of
ПримерыExamples
1. Получение низкомолекулярного ингибитора ССТТ на основе синтеза 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида1. Obtaining a low molecular weight CTTT inhibitor based on the synthesis of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4- difluorophenyl) carboxamide
2. Исследование механизма действия 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на клинических штаммах Pseudomonas aeruginosa с различным профилем резистентности к антибиотикам.2. Investigation of the mechanism of action of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide on clinical strains of Pseudomonas aeruginosa with different antibiotic resistance profiles.
3. Изучение токсичности 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для животных.3. Toxicity study of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide for animals.
4. Влияние 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на жизнеспособность бактерий in vitro и in vivo.4. Effect of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide on viability bacteria in vitro and in vivo.
5. Определение эффективной ингибирующей дозы 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на лабораторных животных.5. Determination of the effective inhibitory dose of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) - carboxamide in laboratory animals.
6. Изучение терапевтической эффективности ингибитора ССТТ на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов.6. The study of the therapeutic efficacy of the CTTT inhibitor in a model of experimental infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa of two different CTTT genotypes.
7. Изучение профилактической эффективности ингибитора ССТТ на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов.7. The study of the prophylactic effectiveness of the CTTT inhibitor in a model of experimental infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa of two different CTTT genotypes.
Пример 1:Example 1:
Получение низкомолекулярного ингибитора ССТТ на основе синтеза 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамидаObtaining a low molecular weight CTST inhibitor based on the synthesis of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide
Действующим веществом антибактериального лекарственного средства на основе низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа в заявленном изобретении является 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид VIII (соединение CL-55), который получается циклизацией хлоруксусной кислотой тиогидразида оксаминовой кислоты VII и процесс его синтеза включает в себя получение и последующее взаимодействие хлорацетамида III с предварительно приготовленным раствором элементной серы с морфолином, последующее взаимодействие монотиооксамидов IV с гидразин-гидратом, реакцию полученного гидразида V с 3-этокси-4-гидрокси-бензальдегидом и восстановление полученного гидразона VI боргидридом натрия в метаноле.The active substance of an antibacterial drug based on a low molecular weight type III secretion system inhibitor in the claimed invention is 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] -thiadiazine -2- (2,4-difluorophenyl) -carboxamide VIII (compound CL-55), which is obtained by cyclization of oxamic acid thiohydrazide chloroacetic acid VII and its synthesis process involves the preparation and subsequent reaction of chloroacetamide III with a pre-prepared solution of elemental sulfur with morpholine , last yuschee monotiooksamidov reacting IV with hydrazine hydrate, the reaction is obtained with the hydrazide V 3-ethoxy-4-hydroxy-benzaldehyde and reduction of the resulting hydrazone VI with sodium borohydride in methanol.
Общий подход с синтезу 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид VIII (соединение CL-55) представлен на фигуре 1.General approach for the synthesis of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide VIII (compound CL-55) is shown in FIG. 1.
Синтез 2-хлор-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (III). К раствору 130 гр (1 моль) 2,4-дифторанилина (I) в 1000 мл ДМФА добавляют при охлаждении 87,5 мл (1,1 моль) хлорацетилхлорида (II), следя за тем, чтобы температура реакционной смеси не превышала 20°C. После окончания прибавления раствора хлорида (II) перемешивают при комнатной температуре раствор еще 2 часа. Затем выливают реакционную смесь в 2000 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре многократно водой и сушат в вакуум-эксикаторе. Выход ацетамида (III) - 179 гр (87%). Т. пл. 101-102°C. ЯМР 1Н CDCl3 (δ, м.д., J, Гц): 4,20 (с, 2Н, ArCH2Cl); 7,10-7,25 (м, 2Н, Ar); 7,53 (м, 1Н, Ar); 10,25 (с, 1Н, Ar-NH-СО). Найдено (%): С 46.62, Н 2.99, N 6.84. Вычислено (%): С 46.74, Н 2.94, N 6.81. Масс-спектр, m/z: 205.Synthesis of 2-chloro-N- (2,4-difluorophenyl) -acetamide (III). To a solution of 130 g (1 mol) of 2,4-difluoroaniline (I) in 1000 ml of DMF, 87.5 ml (1.1 mol) of chloroacetyl chloride (II) are added with cooling, ensuring that the temperature of the reaction mixture does not exceed 20 ° C. After completion of the addition of the chloride (II) solution, the solution was stirred at room temperature for another 2 hours. Then the reaction mixture is poured into 2000 ml of cold water and the precipitate is filtered off. It is washed on the filter many times with water and dried in a vacuum desiccator. The yield of acetamide (III) is 179 g (87%). T. pl. 101-102 ° C. NMR 1 H CDCl 3 (δ, ppm, J, Hz): 4.20 (s, 2H, ArCH 2 Cl); 7.10-7.25 (m, 2H, Ar); 7.53 (m, 1H, Ar); 10.25 (s, 1H, Ar-NH-CO). Found (%): C 46.62, H 2.99, N 6.84. Calculated (%): C 46.74, H 2.94, N 6.81. Mass spectrum, m / z: 205.
Синтез 2-морфолин-4-ил-2-тиоксо-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (IV). Предварительно приготавливают раствор 2,6 моль элементной серы в 800 мл ДМФА и добавляют одной порцией 2,6 моль морфолина. Полученную смесь перемешивают в течение 30 минут и добавляют к образовавшейся коричнево-красной суспензии раствор 179 гр (0,87 моль) хлорацетамида (III) в в 200 мл ДМФА, при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 10°C. Полученную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 12 часов. После окончания реакции (контроль по ТСХ), реакционную смесь выливают в воду, подкисляют реакционную смесь до рН 4-5, затем отфильтровывают выпавшие бледно-желтые кристаллы и промывают их на фильтре многократно водой. Затем растворяют их в ацетоне, отфильтровывают непрореагировавшую серу. Затем упаривают ацетон, остаток перекристаллизовывают из этанола и получают 189 гр бледно-желтых кристаллов морфолида (IV). Выход - 76%.Synthesis of 2-morpholin-4-yl-2-thioxo-N- (2,4-difluorophenyl) -acetamide (IV). A solution of 2.6 mol of elemental sulfur in 800 ml of DMF is preliminarily prepared and 2.6 mol of morpholine is added in one portion. The resulting mixture was stirred for 30 minutes and a solution of 179 g (0.87 mol) of chloroacetamide (III) in 200 ml of DMF was added to the resulting brown-red suspension while cooling, so that the temperature did not exceed 10 ° C. The resulting mixture was kept at room temperature for 12 hours. After completion of the reaction (TLC control), the reaction mixture was poured into water, the reaction mixture was acidified to pH 4-5, then the precipitated pale yellow crystals were filtered off and washed on the filter many times with water. Then they are dissolved in acetone, unreacted sulfur is filtered off. Then acetone was evaporated, the residue was recrystallized from ethanol to obtain 189 g of pale yellow crystals of morpholide (IV). The yield is 76%.
Синтез 2-гидразино-2-тиоксо-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (V). Полученный морфолид (IV) растворяют в 500 мл изопропанола и добавляют 40 мл (0,79 моль) гидразин-гидрата и кипятят в течение 30 минут. Затем выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его в вакуум-эксикаторе. Выход: (V) - 101,2 гр, (73%). Т. пл. 154-156°C. ЯМР 1Н CDCl3 (δ, м.д., J, Гц): 7,10-7,26 (м, 2Н, Ar); 7,50 (м, 1Н, Ar); 10,30 (с, 1Н, Ar-NH-СО). Найдено (%): С 41.40, Н 3.18, N 18.25. Вычислено (%): С 41.56, Н 3.05, N 18.17. Масс-спектр, m/z: 231.Synthesis of 2-hydrazino-2-thioxo-N- (2,4-difluorophenyl) -acetamide (V). The resulting morpholide (IV) was dissolved in 500 ml of isopropanol and 40 ml (0.79 mol) of hydrazine hydrate was added and boiled for 30 minutes. Then it is poured into water and acidified with dilute hydrochloric acid to pH 7. The precipitate is filtered off and dried in a vacuum desiccator. Yield: (V) - 101.2 g, (73%). T. pl. 154-156 ° C. NMR 1 H CDCl 3 (δ, ppm, J, Hz): 7.10-7.26 (m, 2H, Ar); 7.50 (m, 1H, Ar); 10.30 (s, 1H, Ar-NH-CO). Found (%): C 41.40, H 3.18, N 18.25. Calculated (%): C 41.56, H 3.05, N 18.17. Mass spectrum, m / z: 231.
Синтез 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (VI). К 101 гр (0,44 моль) 2-гидразино-2-тиоксо-N-(2,4-дифтор-фенил)-ацетамида (V) в 500 мл этанола добавляют 0,44 моль 3-этокси-4-гидрокси-бензальдегида и кипятят при перемешивании в течение 5 минут. Охлаждают реакционную смесь и отфильтровывают 113,7 гр (68%) выпавших желтых кристаллов 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (VI), промывают их на фильтре холодным этанолом и используют далее без дополнительной очистки.Synthesis of 2- [N ’- (3-ethoxy-4-hydroxy-benzylidene) -hydrazino] -2-thioxo-N- (2,4-difluorophenyl) -acetamide (VI). To 101 g (0.44 mol) of 2-hydrazino-2-thioxo-N- (2,4-difluoro-phenyl) -acetamide (V) in 500 ml of ethanol, 0.44 mol of 3-ethoxy-4-hydroxy- benzaldehyde and boil with stirring for 5 minutes. Cool the reaction mixture and filter off 113.7 g (68%) of the precipitated yellow crystals of 2- [N '- (3-ethoxy-4-hydroxy-benzylidene) -hydrazino] -2-thioxo-N- (2,4-difluorophenyl) -acetamide (VI), they are washed on the filter with cold ethanol and used further without further purification.
Синтез 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензил)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифтор-фенил)-ацетамида (VII). При охлаждении льдом (0-5°C) и перемешивании добавляют 17 гр (0,45 ммоль) боргидрида натрия к суспензии 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифтор-фенил)-ацетамида небольшими порциями. Реакционную смесь оставляют на 2 часа при охлаждении и перемешивании, затем добавляют 25 мл воды и нейтрализовывают разбавленной соляной кислотой до рН 7. Выпавший светло-желтый осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из изопропанола. Выход (VII) - 91,4 гр, (75%). Т. пл. 119-121°C. ЯМР 1Н CDCl3 (δ, м.д., J, Гц): 1.35 (т, 3H, -O-СН2СН3, J=7,22); 3,96 (кд, 2Н, -О-СН2СН3, J=7,00 (13,90)); 4,32 (с, 1Н, -NH-CH2-Ar); 6,98-7,62 (м, 6Н, Ar); 9,02 (с, 1Н, ArOH); 10,12 (с, 1Н, Ar-NH-СО). Найдено (%): С 53.45, Н 4.58, N 10.94. Вычислено (%): С 53.54, Н 4.49, N 11.02. Масс-спектр, m/z: 381.Synthesis of 2- [N '- (3-ethoxy-4-hydroxy-benzyl) -hydrazino] -2-thioxo-N- (2,4-difluoro-phenyl) -acetamide (VII). While cooling with ice (0-5 ° C) and stirring, 17 g (0.45 mmol) of sodium borohydride was added to a suspension of 2- [N '- (3-ethoxy-4-hydroxy-benzylidene) -hydrazino] -2-thioxo- N- (2,4-difluoro-phenyl) -acetamide in small portions. The reaction mixture is left for 2 hours while cooling and stirring, then 25 ml of water are added and neutralized with dilute hydrochloric acid to pH 7. The precipitated light yellow precipitate is filtered off and recrystallized from isopropanol. Yield (VII) - 91.4 g, (75%). T. pl. 119-121 ° C. NMR 1 H CDCl 3 (δ, ppm, J, Hz): 1.35 (t, 3H, —O — CH 2 CH 3 , J = 7.22); 3.96 (cd, 2H, -O-CH 2 CH 3 , J = 7.00 (13.90)); 4.32 (s, 1H, -NH-CH 2 -Ar); 6.98-7.62 (m, 6H, Ar); 9.02 (s, 1H, ArOH); 10.12 (s, 1H, Ar-NH-CO). Found (%): C 53.45, H 4.58, N 10.94. Calculated (%): C 53.54, H 4.49, N 11.02. Mass spectrum, m / z: 381.
Синтез 4-(3-этокси-4-гидрокси-бензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-карбокси-(2,4-дифторфенил)амида (соединение CL-55) (VIII). 91 гр (0,24 моль) 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензил)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифтор-фенил)-ацетамида (VII) добавляют к раствору 0,29 моль хлоруксусной кислоты в 5 мл изопропанола. Добавляют к реакционной смеси каталитическое количество ацетата аммония и кипятят 4 часа (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь охлаждают, отфильтровывают выпавшие кристаллы и промывают их на фильтре водой и холодным этанолом. Остаток четырехкратно перекристаллизовывают из этанола. Выход (VIII) - 75,7 гр, (75%). Т. пл. 129-130°C. ЯМР 1Н (400 MHz, DMSO-d6): 1.33 (т, 3H, -О-СН2СН3); 3,71 (с, 2Н, S-CH2-CO); 4,01 (кд, 2Н, -O-СН2СН3); 4,92 (с, 2Н, -NH-CH2-Ar); 6,75-6,81 (м, 2Н, Ar); 6,98 (с, 1Н, Ar); 7,12-7,17 (м, 1Н, Ar); 7,36-7,42 (м, 1Н, Ar); 7,59-7,65 (м, 1Н, Ar); 8,90 (с, 1Н, -NH-СН2-Ar); 10,06 (с, 1Н, ArOH). ЯМР 13С (100 MHz, DMSO-d6): 15.16, 25.48, 53.56, 64.29, 104.95, 111.98, 114.23, 115.88, 121.49, 128.02, 128.31, 141.16, 146.90, 154.93, 157.41, 158.00, 159.06, 159.75, 161.49; Найдено (%): С 56.50 Н 4.62, N 10.31. Вычислено (%): С 56.57 Н 4.50, N 10.42. Масс-спектр, m/z: 421.Synthesis of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazine-2-carboxy (2,4-difluorophenyl) amide ( compound CL-55) (VIII). 91 g (0.24 mol) of 2- [N '- (3-ethoxy-4-hydroxy-benzyl) -hydrazino] -2-thioxo-N- (2,4-difluoro-phenyl) -acetamide (VII) is added to a solution of 0.29 mol of chloroacetic acid in 5 ml of isopropanol. A catalytic amount of ammonium acetate was added to the reaction mixture and boiled for 4 hours (TLC control). After the reaction, the reaction mixture is cooled, the precipitated crystals are filtered off and washed on the filter with water and cold ethanol. The residue was recrystallized four times from ethanol. Yield (VIII) - 75.7 g, (75%). T. pl. 129-130 ° C. NMR 1 H (400 MHz, DMSO-d6): 1.33 (t, 3H, —O — CH 2 CH 3 ); 3.71 (s, 2H, S-CH 2 -CO); 4.01 (cd, 2H, -O-CH 2 CH 3 ); 4.92 (s, 2H, -NH-CH 2 -Ar); 6.75-6.81 (m, 2H, Ar); 6.98 (s, 1H, Ar); 7.12-7.17 (m, 1H, Ar); 7.36-7.42 (m, 1H, Ar); 7.59-7.65 (m, 1H, Ar); 8.90 (s, 1H, -NH-CH 2 -Ar); 10.06 (s, 1H, ArOH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6): 15.16, 25.48, 53.56, 64.29, 104.95, 111.98, 114.23, 115.88, 121.49, 128.02, 128.31, 141.16, 146.90, 154.93, 157.41, 158.00, 159.06, 159.75, 161.49; Found (%): C 56.50 H 4.62, N 10.31. Calculated (%): C 56.57 H 4.50, N 10.42. Mass spectrum, m / z: 421.
Пример 2.Example 2
Исследование механизма действия 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) на штаммах клинического происхождения Pseudomonas aeruginosa с различным профилем резистентности к антибиотикам.Study of the mechanism of action of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide (CL -55) on strains of clinical origin Pseudomonas aeruginosa with different antibiotic resistance profiles.
Механизм действия низкомолекулярного ингибитора ССТТ - CL-55: ингибирование транспорта в эукариотическую клетку факторов патогенности, эффекторных белков ССТТ, ExoS, ЕхоТ, ExoY и ExoU, в результате специфического подавления ССТТ патогена.The mechanism of action of the low molecular weight CTTT inhibitor is CL-55: inhibition of the transport of pathogenicity factors, CTTT, ExoS, ExoT, ExoY and ExoU effector proteins into a eukaryotic cell, as a result of the specific suppression of the CTTT pathogen.
С целью изучения действия ингибитора ССТТ - CL-55 на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa с разным профилем резистентности к антибиотикам были проведены следующие исследования:In order to study the effect of the CTTT inhibitor - CL-55 on the clinical strains of Pseudomonas aeruginosa with different antibiotic resistance profiles, the following studies were carried out:
1. Изучена роль ССТТ у клинических антибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa на основе изучения наличие генов, кодирующих эффекторные белки ССТТ, и активности секреторного аппарата у этих штаммов в условиях in vitro.1. The role of CCTT in clinical antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa was studied based on the study of the presence of genes encoding the CTTT effector proteins and the activity of the secretory apparatus in these strains in vitro.
2. Охарактеризовано ингибирующее действие 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) на функциональную активность ССТТ клинических антибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa.2. The inhibitory effect of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide was characterized (CL-55) on the functional activity of CCTT of clinical antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa.
Изучение роли ССТТ у клинических антибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosaStudy of the role of CCTT in clinical antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa
Исследование проводили на 77 штаммах синегнойной палочки, выделенных из образцов клинического материала в стационарах Москвы. Штаммы были выделены из отделяемого дыхательных путей, из крови и отделяемого открытых инфицированных ран. 96% (74 штамма) были устойчивыми хотя бы к одному антибиотику, 62% характеризовались множественной резистентностью.The study was conducted on 77 strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from samples of clinical material in Moscow hospitals. Strains were isolated from the discharge of the respiratory tract, from the blood and discharge of the open infected wounds. 96% (74 strains) were resistant to at least one antibiotic, 62% were characterized by multiple resistance.
Изучение частоты встречаемости генов, кодирующих белки - эффекторы ССТТ псевдомонад, у полученных госпитальных штаммов проводили с помощью ПЦР с ДНК штаммов. При отработке условий проведения реакции были использованы референс-штаммы P.aeruginosa с известным ССТТ генотипом, РАО (exoS+exoT+exoY+exoU-) и РА103 (exoS-ехоТ+exoY+exoU+). В таблице 1 представлена последовательность праймеров, выбранных для определения наличия генов ССТТ P.aeruginosa.A study of the frequency of occurrence of the genes encoding proteins - effectors of CTST pseudomonads in the obtained hospital strains was carried out using PCR with DNA strains. When working out the conditions for the reaction, reference strains of P. aeruginosa with the well-known CTT genotype, PAO (exoS + exoT + exoY + exoU-) and PA103 (exoS-exoT + exoY + exoU +) were used. Table 1 presents the sequence of primers selected to determine the presence of CTTT genes of P.aeruginosa.
Среди всех проанализированных штаммов exoU+ генотип встречался в 13,8%, полученных из отделений интенсивной терапии ("ОРИТ"), и в несколько большем проценте - 22,7% у штаммов из других отделений ("не-ОРИТ"). exoS+ генотип был выявлен у анализируемых госпитальных штаммов в значительно большем проценте, чем exoU+ генотип, что соответствует известным опубликованным данным. Так, в группе штаммов, полученных из "ОРИТ", exoS+ генотип был детектирован в 86,2%, а в группе "не-ОРИТ" - в 79,5%. В таблице 2 представлены результаты ССТТ генотипирования клинических штаммов P.aeruginosa при определении генов эффекторных белков методом ПЦР и результаты характеристики функциональной активности ССТТ при определении секреции ЕхоТ белка методом иммуноблота.Among all analyzed exoU + strains, the genotype was found in 13.8% obtained from intensive care units ("ICU"), and in a slightly higher percentage - 22.7% in strains from other departments ("non-ICU"). The exoS + genotype was detected in the analyzed hospital strains in a significantly higher percentage than the exoU + genotype, which corresponds to well-known published data. So, in the group of strains obtained from ICU, the exoS + genotype was detected in 86.2%, and in the group of non-ICU in 79.5%. Table 2 presents the results of CTST genotyping of clinical P.aeruginosa strains when determining genes for effector proteins by PCR and the characteristics of the functional activity of CTST in determining the secretion of ExoT protein by immunoblot.
С целью изучения активности ССТТ у клинических штаммов псевдомонад в условиях in vitro использовали модель индукции функциональной активности транспортной системы при снижении концентрации кальция в среде культивирования бактерий. Для этого к активно делящейся культуре псевдомонад добавляли хелатор кальция, EGTA, и тестировали присутствие секреторного белка ЕхоТ в культуральной среде с помощью специфических антител методом иммуноблота. Ночную культуру исследуемых штаммов P. aeruginosa разводили 1/100 в свежей среде LB, добавляли 5 мМ EGTA и продолжали выращивание при перемешивании в течение 3 часов при 37°C. После культивирования бактериальные клетки осаждали центрифугированием. Внеклеточные белки концентрировали трихлоруксусной кислотой (10% насыщения), отмывали 100% ацетоном и суспензировали в 1-кратном буфере для образцов. Электрофорез в полиакриламидном геле проводили по методу Laemmli, после чего белки переносили методом полусухого блота из геля на нитроцеллюлозные мембраны с использованием системы ТЕ70 PWR (GE, Moscow, Russia).To study the activity of CCTT in clinical strains of pseudomonas in vitro, we used a model of induction of the functional activity of the transport system with a decrease in the concentration of calcium in the bacterial culture medium. To do this, calcium chelator, EGTA was added to the actively dividing culture of pseudomonads, and the presence of the ExoT secretory protein in the culture medium was tested using specific antibodies by the immunoblot method. The overnight culture of the studied P. aeruginosa strains was diluted 1/100 in fresh LB medium, 5 mM EGTA was added and cultivation was continued under stirring for 3 hours at 37 ° C. After cultivation, bacterial cells were besieged by centrifugation. Extracellular proteins were concentrated with trichloroacetic acid (10% saturation), washed with 100% acetone and suspended in a 1-fold sample buffer. Polyacrylamide gel electrophoresis was carried out according to the Laemmli method, after which the proteins were transferred by the method of semi-dry blot from the gel to nitrocellulose membranes using the TE70 PWR system (GE, Moscow, Russia).
Нитроцеллюлозные мембраны окрашивали красителем Ponceau S для проверки качества переноса, после чего отмывали раствором 20 mM Tris-HCl+150 тМ NaCl+0.05% Tween20 (TBS-T), блокировали 5% раствором обезжиренного молока в TBS-T и инкубировали с мышиными антителами к белку ЕхоТ в разведении 1/20 000 в течение ночи при 4°C. Реакцию учитывали после инкубации мембран с анти-мышиным конъюгатом, меченным пероксидазой хрена (разведение 1/5000) в течение 1 часа при комнатной температуре и обработкой мембран реагентом для хемилюминисценции. В качестве положительного контроля использовали очищенный препарат АДФ-рибозилирующего фрагмента ЕхоТ. Реакцию учитывали на хемилюминометре (Vilber Lourmat, Eberhardzell Germany).Nitrocellulose membranes were stained with Ponceau S dye to verify transfer quality, and then washed with 20 mM Tris-HCl + 150 tM NaCl + 0.05% Tween20 (TBS-T) solution, blocked with 5% skim milk in TBS-T and incubated with murine antibodies ExoT protein at a dilution of 1/20,000 overnight at 4 ° C. The reaction was taken into account after incubation of the membranes with anti-mouse conjugate labeled with horseradish peroxidase (1/5000 dilution) for 1 hour at room temperature and treatment of the membranes with chemiluminescence reagent. As a positive control, a purified preparation of the ADP-ribosylating ExoT fragment was used. The reaction was taken into account on a chemiluminometer (Vilber Lourmat, Eberhardzell Germany).
Изучение функциональной активности ССТТ у полученных клинических штаммов P.aeruginosa в условиях индукции низкими концентрациями кальция показало, что 89% штаммов секретируют эффекторный белок ЕхоТ (табл. 2, фиг. 2).A study of the functional activity of CCTT in the obtained clinical strains of P.aeruginosa under conditions of induction with low concentrations of calcium showed that 89% of the strains secrete the ExoT effector protein (Table 2, Fig. 2).
Характеристику функциональной активности ССТТ госпитальных клинических штаммов P. aeruginosa проводили также методом определения цитотоксичности. Токсичность в отношении эукариотических клеток, связанная с секрецией ExoU или ExoS белков, в условиях in vitro проявляется очень быстро, в течение первых 3-4 часов, и выражается в нарушении целостности клеточной мембраны с последующей гибелью клеток путем некроза. Мы использовали в тестах на цитотоксичность клетки линии СНО (Chinese hamster ovary cells) и оценивали гибель клеток в тесте по количественному определению лактатдегидрогеназы в культуральной среде через 3 часа после внесения на клетки штаммов псевдомонад. Лактатдегидрогеназа - стабильный фермент, который присутствует в цитоплазме клетки, а при нарушении целостности цитоплазматической мембраны попадает во внешнюю среду.The functional activity of the CCTT of hospital clinical strains of P. aeruginosa was also characterized by the method of determining cytotoxicity. Toxicity to eukaryotic cells associated with the secretion of ExoU or ExoS proteins in vitro manifests itself very quickly, during the first 3-4 hours, and is expressed in violation of the integrity of the cell membrane with subsequent cell death by necrosis. We used in the tests for cytotoxicity cells of the CHO line (Chinese hamster ovary cells) and evaluated cell death in the test by quantitative determination of lactate dehydrogenase in the culture medium 3 hours after the introduction of pseudomonas strains on the cells. Lactate dehydrogenase is a stable enzyme that is present in the cytoplasm of a cell, and when the integrity of the cytoplasmic membrane is violated, it enters the external environment.
К суточному монослою клеток СНО, выращенному в 96-луночном планшете, добавляли 18-часовую культуру псевдомонад с МОИ 10 и инкубировали 3 часа. Планшет центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин для осаждения бактерий, а надосадок отбирали. Определение лактатдегидрогеназы проводили с помощью набора CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, США) согласно инструкции. Цитотоксичность выражали в процентах по отношению к значениям в незараженных клетках.An 18-hour pseudomonad culture with MY 10 was added to the diurnal monolayer of CHO cells grown in a 96-well plate and incubated for 3 hours. The plate was centrifuged for 10 min at 4000 rpm to precipitate bacteria, and the supernatant was taken. Determination of lactate dehydrogenase was performed using the CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit (Promega, USA) according to the instructions. Cytotoxicity was expressed as a percentage relative to values in uninfected cells.
В таблице 3 представлены результаты анализа цитотоксичности госпитальных штаммов псевдомонад. На основании полученных данных все штаммы можно было разделить на 4 группы по проценту гибели клеток: токсичные - Т (от 90 до 70%), среднетоксичные - С (от 70 до 50%), малотоксичные - М (от 50 до 20%) и нетоксичные - Н (менее 20%). Результаты показали, что среди протестированных штаммов с exoU+ генотипом токсичностью обладали 91,6%. Среди 31 штамма с exoS+ генотипом токсичными были 21 или 67,7%.Table 3 presents the results of the analysis of cytotoxicity of hospital strains of pseudomonas. Based on the data obtained, all strains could be divided into 4 groups according to the percentage of cell death: toxic - T (from 90 to 70%), medium toxic - C (from 70 to 50%), low toxicity - M (from 50 to 20%) and non-toxic - N (less than 20%). The results showed that among the tested strains with exoU + genotype, toxicity was 91.6%. Among 31 strains with exoS + genotype, 21 or 67.7% were toxic.
Таким образом, в совокупности полученные данные свидетельствуют о наличии ССТТ и ее активности у клинических штаммов с различным профилем антибиотикорезистентности и говорят в пользу ключевой роли системы секреции III типа в развитии инфекционного процесса, что делает ССТТ перспективной мишенью для подавления инфекции, вызванной мультирезистентными штаммами синегнойной палочки.Thus, in aggregate, the obtained data indicate the presence of CCT and its activity in clinical strains with a different antibiotic resistance profile and speak in favor of the key role of type III secretion system in the development of the infectious process, which makes CCT a promising target for suppressing the infection caused by multiresistant Pseudomonas aeruginosa strains .
Ингибирующее действие 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) на ССТТ клинических антибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa.Inhibitory effect of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide (CL- 55) on the CTST of clinical antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa.
Ингибирующее действие CL-55 изучали в 2-х тестах: 1) in vitro при индукции ССТТ снижением содержания кальция и определением эффекторного белка ЕхоТ методом иммуноблота; 2) методом определения цитотоксичности для клеток СНО.The inhibitory effect of CL-55 was studied in 2 tests: 1) in vitro upon CCTT induction by a decrease in calcium content and determination of the ExoT effector protein by immunoblot; 2) by determining cytotoxicity for CHO cells.
Для оценки ингибирующей активности CL-55 методом иммуноблота штаммы P. aeruginosa выращивали в жидкой среде LB в присутствии индуктора EGTA (5 мМ) и при добавлении разных концентраций химического соединения CL-55. После выращивания культуры в течение 3 часов бактериальные клетки осаждали центрифугированием. Концентрирование белков, электрофорез и окрашивание нитроцеллюлозных фильтров антителами к белку ЕхоТ проводили в соответствии с методикой описанной выше.To assess the inhibitory activity of CL-55 by immunoblot, P. aeruginosa strains were grown in LB liquid medium in the presence of an EGTA inducer (5 mM) and with the addition of different concentrations of the chemical compound CL-55. After growing the culture for 3 hours, the bacterial cells were besieged by centrifugation. Protein concentration, electrophoresis, and staining of nitrocellulose filters with antibodies to the ExT protein were carried out in accordance with the procedure described above.
Было показано, что CL-55 дозозависимо подавляет транслокацию эффекторного белка ССТТ P. aeruginosa ЕхоТ в условиях индукции in vitro. Ингибирование наблюдали при концентрациях 150 и 200 мкМ (фиг. 3) у клинических штаммов, характеризующихся как exoU+, так и exoS+ генотипом. Таким образом, в тесте in vitro в условиях индукции ССТТ псевдомонад было показано ингибирующее действие низкомолекулярного соединения CL-55.It was shown that CL-55 dose-dependently suppresses translocation of the CTST effector protein P. aeruginosa ExT under in vitro induction conditions. Inhibition was observed at concentrations of 150 and 200 μM (Fig. 3) in clinical strains characterized by both exoU + and exoS + genotype. Thus, in the in vitro test under the conditions of induction of CCT pseudomonas, the inhibitory effect of the low molecular weight compound CL-55 was shown.
Изучение влияния ингибитора ССТТ CL-55 на цитотоксичность клеток СНО проводили по описанной выше методике. Ингибитор добавляли в разных концентрациях к суспензии бактериальных клеток и инкубировали 30 мин до внесения на клетки СНО.The effect of the CTTT CL-55 inhibitor on the cytotoxicity of CHO cells was studied according to the method described above. The inhibitor was added in various concentrations to the suspension of bacterial cells and incubated for 30 min before the introduction of CHO cells.
При изучении цитотоксичности свежевыделенных штаммов бактерий P. aeruginosa на клеточной линии СНО было показано, что добавление к клеткам псевдомонад изучаемых штаммов в дозе 10 МОИ, вызывало сильную цитотоксичность клеток. Предварительное инкубирование бактерий с ингибитором ССТТ в дозах 100 и 150 мкМ снижало цитотоксичность клеток до 0%. В таблице 4 показано действие ингибитора системы секреции III типа CL-55 на клетки СНО, зараженные штаммами P.aeruginosa с exoU+ генотипом. В таблице 5 показано действие ингибитора системы секреции III типа CL-55 на клетки СНО, зараженные штаммами P. aeruginosa с exoS+ генотипом.When studying the cytotoxicity of freshly isolated P. aeruginosa bacterial strains on the CHO cell line, it was shown that the addition of the studied strains to the pseudomonads cells at a dose of 10 MOI caused strong cytotoxicity of the cells. Pre-incubation of bacteria with a CTTT inhibitor at doses of 100 and 150 μM reduced cell cytotoxicity to 0%. Table 4 shows the effect of the CL-55 type III secretion system inhibitor on CHO cells infected with P.aeruginosa strains with exoU + genotype. Table 5 shows the effect of an inhibitor of the CL-55 type III secretion system on CHO cells infected with P. aeruginosa strains with exoS + genotype.
Таким образом, было показано, что при действии ингибитора CL-55 на изученные штаммы псевдомонад подавлялась их цитотоксичность, связанная с ССТТ. В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что низкомолекулярное соединение 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) специфически ингибирует секрецию токсинов- эффекторов системы секреции III типа псевдомонад, вызывающих гибель эукариотических клеток. Блокирование in vitro системы секреции III типа Pseudomonas aeruginosa было показано для клинических штаммов с различными генотипами по генам эффекторных белков ССТТ и различным профилем антибиотикорезистентности.Thus, it was shown that under the action of the CL-55 inhibitor on the studied strains of pseudomonas, their cytotoxicity associated with CTST was suppressed. In general, the results obtained indicate that the low molecular weight compound 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] -thiadiazin-2- (2 , 4-difluorophenyl) -carboxamide (CL-55) specifically inhibits the secretion of toxins-effectors of the pseudomonas type III secretion system, causing the death of eukaryotic cells. Blocking the in vitro secretion system of type III Pseudomonas aeruginosa has been shown for clinical strains with different genotypes for the genes for effector proteins of CTST and a different antibiotic resistance profile.
Пример 3.Example 3
Изучение токсичности 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) для животных.Toxicity study of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide (CL- 55) for animals.
Исследование острой токсичности CL-55 низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа при однократном введении мышамAcute toxicity study of CL-55 low molecular weight type III secretion system inhibitor with a single administration to mice
Острую токсичность изучали на мышах и крысах (самцах и самках) при внутрижелуд очном и внутрибрюшинном способах введения. Срок наблюдения составил 14 суток. Ингибитор животным вводили в возрастающих дозах. Из-за низкой токсичности препарата не была установлена ЛД50. Наибольшая доза, вводимая мышам и крысам, составила 5000 мг/кг, что превышает предполагаемую суточную терапевтическую дозу для человека в 100 раз. Однократное введение Ингибитора CL-55 в высоких дозах не вызывает гибели и токсических изменений в организме животных.Acute toxicity was studied in mice and rats (males and females) with intragastric and intraperitoneal routes of administration. The observation period was 14 days. Inhibitor animals were administered in increasing doses. Due to the low toxicity of the drug, LD 50 was not established. The highest dose administered to mice and rats was 5,000 mg / kg, which is 100 times higher than the estimated daily therapeutic dose for humans. A single injection of the CL-55 Inhibitor in high doses does not cause death and toxic changes in the animal organism.
Результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней, а также данные некропсии свидетельствуют о его хорошей переносимости.The results of toxicometry, observation of experimental animals for 14 days, as well as necropsy data indicate its good tolerance.
Исследование субхронической токсичности CL-55 низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа при многократном введении животнымThe study of subchronic toxicity of CL-55 low molecular weight type III secretion system inhibitor with repeated administration to animals
Исследования субхронической токсичности проводили на половозрелых крысах линии Вистар (самцах и самках) и кроликах породы Советская шиншилла (самцах и самках). Лекарственное средство вводили внутрижелудочно в течение 14 суток 1 раз в день в 2 дозах: терапевтической (50 мг/кг) и десятикратной терапевтической (500 мг/кг). При исследовании токсичности использовали общепринятые методы: интегральные и физиологические показатели, исследования клинических и биохимических показателей крови, исследования мочи, морфометрическую и гистологическую оценку внутренних органов и тканей. Наблюдение за состоянием животных велось ежедневно. Физиологические и гематологические исследования проводили до введения, через сутки и через 28 суток после отмены препарата, морфометрические и гистологические - через сутки и через 28 суток.Subchronic toxicity studies were performed on sexually mature Wistar rats (males and females) and Soviet chinchilla rabbits (males and females). The drug was administered intragastrically for 14 days once a day in 2 doses: therapeutic (50 mg / kg) and ten times therapeutic (500 mg / kg). In the study of toxicity, generally accepted methods were used: integral and physiological indicators, studies of clinical and biochemical blood parameters, urinalysis, morphometric and histological evaluation of internal organs and tissues. Monitoring the condition of the animals was carried out daily. Physiological and hematological studies were carried out before administration, one day and 28 days after drug discontinuation, morphometric and histological studies were performed one day and 28 days later.
Было показано, что многократное, в течение 14 суток, введение антибактериального лекарственного средства в предполагаемой терапевтической дозе, как крысам, так и кроликам, не оказывало выраженного токсического воздействия на функцию основных физиологических систем организма, обменные процессы, систему крови, структуру и функцию внутренних органов животных обоего пола.It was shown that repeated, within 14 days, the introduction of an antibacterial drug in the intended therapeutic dose, both to rats and rabbits, did not have a pronounced toxic effect on the function of the basic physiological systems of the body, metabolic processes, the blood system, structure and function of internal organs animals of both sexes.
При введении крысам дозы 500 мг/кг были выявлены негативные сдвиги: изменение структуры ткани тимуса, снижение в сыворотке крови аланинаминотрансферазы, количество натрия, креатинина и мочевины. Все патологические явления носили обратимый характер.When rats were given a dose of 500 mg / kg, negative changes were revealed: changes in the structure of the thymus tissue, a decrease in serum alanine aminotransferase, and the amount of sodium, creatinine, and urea. All pathological phenomena were reversible.
Исследования на двух видах животных обоего пола (крысах и кроликах) показало, что 14-дневное внутрижелудочное введение ингибитора CL-55 не оказывает местно-раздражающего действия на слизистую желудка.Studies in two species of animals of both sexes (rats and rabbits) showed that 14-day intragastric administration of the CL-55 inhibitor does not have a local irritant effect on the gastric mucosa.
Изучение аллергизующих и иммунотоксических свойств CL-55 - низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типаThe study of allergic and immunotoxic properties of CL-55, a low molecular weight type III secretion system inhibitor
Исследования, проведенные в объеме комплексной оценки аллергогенности (активная кожная анафилаксия, гиперчувствительность замедленного типа, реакция дегрануляции тучных клеток при пероральном введении) на морских свинках, показали, что ингибитор CL-55 при введении в предполагаемой терапевтической дозе (50 мг/кг) не обладает аллергизирующими свойствами. В то же время, введение десятикратной терапевтической дозы (500 мг/кг) приводит к развитию гиперчувствительности немедленного и замедленного типа.Studies conducted in the scope of a comprehensive assessment of allergenicity (active skin anaphylaxis, delayed-type hypersensitivity, oral mast cell degranulation reaction) in guinea pigs showed that the CL-55 inhibitor, when administered at the intended therapeutic dose (50 mg / kg), does not have allergenic properties. At the same time, the introduction of a ten-fold therapeutic dose (500 mg / kg) leads to the development of immediate and delayed hypersensitivity.
Состояние иммунной системы после введения десятикратной (500 мг/кг) и стократной (5000 мг/кг) терапевтической дозы ингибитора CL-55 оценивали по изменению массы и клеточности иммунокомпетентных органов и при оценке фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов.The state of the immune system after administration of a ten-fold (500 mg / kg) and hundred-fold (5000 mg / kg) therapeutic dose of the CL-55 inhibitor was assessed by changes in the mass and cellularity of immunocompetent organs and in assessing the phagocytic activity of peritoneal macrophages.
По полученным данным можно сделать вывод, что изучаемый препарат в высоких дозах не оказывает влияния на иммунную систему.According to the data obtained, it can be concluded that the studied drug in high doses does not affect the immune system.
Изучение мутагенных свойств и канцерогенности CL-55 - низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типаStudy of the mutagenic properties and carcinogenicity of CL-55, a low molecular weight type III secretion system inhibitor
Изучение мутагенной активности и потенциальной канцерогенности соединения CL-55 пооводили в тесте Эймса, в тесте на оценку ДНК-повреждений методом ДНК-комет и в тесте на индукцию хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей.The mutagenic activity and potential carcinogenicity of the CL-55 compound were studied in the Ames test, in the DNA comet test for DNA damage and in the test for the induction of chromosomal aberrations in mouse bone marrow cells.
Результаты проведенных экспериментов позволяют сделать следующие выводы:The results of the experiments allow us to draw the following conclusions:
1. Соединение CL-55 не проявляет мутагенной активности на штаммах Salmonella typhimurium ТА98, ТА100, ТА1535, ТА1537 и на комбинации штаммов E.coli рКМ101 и uvrA, в условиях с метаболической активацией и без таковой.1. Compound CL-55 does not exhibit mutagenic activity on Salmonella typhimurium strains TA98, TA100, TA1535, TA1537 and on a combination of E. coli strains pKM101 and uvrA, under conditions with and without metabolic activation.
2. Соединение CL-55 при однократном внутримышечном введении в дозах 20 и 200 мг/кг на срок 3 и 18 часов не индуцирует ДНК-повреждения в клетках костного мозга, печени, почек и селезенки мышей.2. The compound CL-55 with a single intramuscular injection in doses of 20 and 200 mg / kg for a period of 3 and 18 hours does not induce DNA damage in the cells of the bone marrow, liver, kidneys and spleen of mice.
3. При однократном внутримышечном введении в дозах 20 и 200 мг/кг и при многократном введении в дозе 20 мг/кг соединение CL-55 не индуцирует хромосомных аберраций в клетках костного мозга самцов и самок мышей.3. With a single intramuscular injection at doses of 20 and 200 mg / kg and with repeated administration at a dose of 20 mg / kg, compound CL-55 does not induce chromosomal aberrations in bone marrow cells of male and female mice.
Согласно общепринятой практике и нормативным документам совокупность этих наблюдений свидетельствует об отсутствии у соединения CL-55 мутагенной и потенциальной канцерогенной активности.According to generally accepted practice and regulatory documents, the totality of these observations indicates the absence of mutagenic and potential carcinogenic activity in compound CL-55.
Изучение репродуктивной токсичностиReproductive toxicity study
Было проведено изучение репродуктивной токсичности ингибитора системы секреции III типа CL-55 на животных. Субстанцию вводили внутрижелудочно до спаривания крысам самцам в течение 56 дней, самкам в течение 15 дней в дозах 50 мг/кг и 500 мг/кг (эквивалентных терапевтической и десятикратной терапевтической дозе для человека). Затем опытных животных спаривали с контрольными самками и самцами.A study was conducted of the reproductive toxicity of an inhibitor of the CL-55 type III secretion system in animals. The substance was administered intragastrically before mating to rats for males for 56 days, females for 15 days at doses of 50 mg / kg and 500 mg / kg (equivalent to a therapeutic and ten times the therapeutic dose for humans). Then the experimental animals were mated with control females and males.
Во время исследования изучали: половое поведение животных, влияние препарата на генеративную функцию самцов и самок, показатели физического развития потомства.During the study, we studied: the sexual behavior of animals, the effect of the drug on the generative function of males and females, indicators of the physical development of offspring.
Было установлено, что ингибитор CL-55, вводимый самцам и самкам в терапевтической дозе, не оказывает токсического действия на генеративную функцию и показатели эмбриональной гибели. При наблюдении за развитием потомства не было выявлено различий в динамике массы тела, выживаемости и физическом развитии крысят контрольной и опытных групп.It was found that the CL-55 inhibitor, administered to males and females in a therapeutic dose, does not have a toxic effect on the generative function and indicators of embryonic death. When observing the development of offspring, there were no differences in the dynamics of body weight, survival and physical development of pups of the control and experimental groups.
Введение ингибитора CL-55 самкам в дозе, превышающей суточную терапевтическую в 10 раз, повышает предимплантационную гибель плодов. Длительное введение ингибитора CL-55 самцам в десятикратно увеличенной дозе, ведет к снижению у них индекса сперматогенеза, количества сперматогоний в канальцах, а также к снижению половой активности. Длительное применение ингибитора CL-55 в высоких дозах может приводить к некоторым нарушениям генеративной функции.The introduction of a CL-55 inhibitor in females at a dose exceeding the daily therapeutic by 10 times increases the pre-implantation death of the fetus. Long-term administration of the CL-55 inhibitor to males at a tenfold increased dose leads to a decrease in their spermatogenesis index, the number of spermatogonia in the tubules, and also to a decrease in sexual activity. Long-term use of the CL-55 inhibitor in high doses can lead to some impaired generative function.
Таким образом, лекарственное средство ингибитор системы секреции III типа CL-55, применяемое в терапевтической дозе, не приводит к изменению генеративной функции.Thus, a CL-55 type III secretion system inhibitor drug used in a therapeutic dose does not lead to a change in generative function.
В результате проведенных токсикологических исследований установлено, что 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) является малотоксичным препаратом, что позволяет рекомендовать низкомолекулярный ингибитор системы секреции III типа CL-55 для дальнейшего проведения клинических испытаний.As a result of toxicological studies, it was found that 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl ) -carboxamide (CL-55) is a low-toxic drug, which allows us to recommend a low molecular weight inhibitor of the CL-55 type III secretion system for further clinical trials.
Пример 4.Example 4
Влияние 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на жизнеспособность бактерий in vitro и in vivo.Effect of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide on the viability of bacteria in vitro and in vivo.
Механизм действия ингибитора системы секреции III типа, предполагает подавление эффекторной функции P.aeruginosa. При этом препарат не влияет на жизнеспособность бактерий, т.е. не оказывает прямого бактерицидного действия в условиях in vitro. Антибактериальный эффект препарата CL-55 основан на снижении вирулентности возбудителя, в результате подавления секреции эффекторных белков псевдомонад, являющихся ключевыми факторами патогенности с токсической активностью. Действие ингибитора системы секреции способствует ограничению развития инфекции и подавлению токсических эффектов в зараженном организме. Существенным преимуществом ингибитора ССТТ перед антибиотиками является отсутствие негативного влияния на нормальную микрофлору человека.The mechanism of action of an inhibitor of type III secretion system involves the suppression of the effector function of P.aeruginosa. Moreover, the drug does not affect the viability of bacteria, i.e. does not have a direct bactericidal effect in vitro. The antibacterial effect of the drug CL-55 is based on a decrease in the virulence of the pathogen, as a result of the suppression of the secretion of effector proteins of pseudomonads, which are key pathogenicity factors with toxic activity. The action of an inhibitor of the secretion system helps to limit the development of infection and suppress toxic effects in the infected body. A significant advantage of the CCTT inhibitor over antibiotics is the absence of a negative effect on the normal human microflora.
Характеристика влияния CL-55 - ингибитора системы секреции III типа, на жизнеспособность Pseudomonas aeruginosaCharacterization of the effect of CL-55, an inhibitor of type III secretion system, on the viability of Pseudomonas aeruginosa
Для изучения влияния ингибитора системы секреции III типа на жизнеспособность P. aeruginosa использовали эталонные штаммы (из международных и региональных коллекций) РА-103; РАО; ARCC 27853 и свежевыделенные штаммы (штаммы) P.aeruginosa из образцов клинического материала: №/№-12130-15/2015; 1625-36/2015; 19390-15/2015; 32461-15/2015; 41431-15/2015. Исследования проводили методом серийных разведений в жидкой питательной среде с последующим высевом на твердые питательные среды для подсчета выросших колоний. Для посева использовали цитримидный агар следующего состава: пептона - 20 г; агара - 13 г; хлористого магния - 1,4 г; сернокислого калия - 10 г; цитримида - 0,3 г; глицерина - 10 мл; дистиллированной воды до 1000 мл; рН-7,0-7,2.To study the effect of a type III secretion system inhibitor on the viability of P. aeruginosa, reference strains (from international and regional collections) of RA-103 were used; RAO; ARCC 27853 and freshly isolated strains (strains) of P.aeruginosa from samples of clinical material: No. / No. 12130-15 / 2015; 1625-36 / 2015; 19390-15 / 2015; 32461-15 / 2015; 41431-15 / 2015. The studies were carried out by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium, followed by seeding on solid nutrient media to count the grown colonies. For sowing, citrimide agar of the following composition was used: peptone - 20 g; agar - 13 g; magnesium chloride - 1.4 g; potassium sulfate - 10 g; citrimide - 0.3 g; glycerin - 10 ml; distilled water up to 1000 ml; pH 7.0-7.2.
Подсчет колоний проводили по формуле: N=С×К/n×V,Colony counting was performed according to the formula: N = C × K / n × V,
где N - количество микроорганизмов в 1 мл; С - сумма колоний на всех чашках, n - число чашек, К - разведение, из которого сделан высев; V - объем суспензии, взятый для посева, мл.where N is the number of microorganisms in 1 ml; C is the sum of the colonies on all cups, n is the number of cups, K is the breeding from which the seeding was made; V is the volume of suspension taken for inoculation, ml.
На цитримидном агаре наблюдали сине-зеленый пигмент Р. aeruginosa. Далее проводили сравнение при подсчете КОЕ/мл в контрольных и опытных образцах.A blue-green pigment P. aeruginosa was observed on citrimide agar. Next, a comparison was made when counting CFU / ml in control and experimental samples.
Приготовление рабочих концентраций CL-55 проводили методом двукратных разведений. В качестве растворителя использовали жидкую питательную среду. Жидкий питательный бульон разливали по 0,5 мл в пробирки. В первую пробирку вносили 0,5 мл ингибитора рабочего раствора в концентрации 200 мг/мл. После тщательного перемешивания переносили мерной пипеткой 0,5 мл из этой пробирки во вторую, перемешивали и переносили тоже количество смеси из второй в третью и т.д. Пробирка, не содержащая препарат, служила контролем на рост культуры микроорганизмов. После этого во все пробирки с серийно разведенным препаратом и в контрольную пробирку вносили по 0,2 мл взвеси тест-микроорганизмов.Preparation of working concentrations of CL-55 was carried out by the method of double dilutions. A liquid nutrient medium was used as a solvent. Liquid nutrient broth was poured into 0.5 ml in test tubes. 0.5 ml of a working solution inhibitor at a concentration of 200 mg / ml was added to the first tube. After thorough mixing, 0.5 ml was transferred with a measuring pipette from this tube into the second, the quantity of the mixture was mixed and transferred from the second to the third, etc. A test tube containing no drug served as a control for the growth of microorganism culture. After that, 0.2 ml of suspension of test microorganisms were added to all test tubes with a serially diluted preparation and to a control tube.
Результаты влияния ингибитора системы секреции III типа на жизнеспособность P. aeruginosa in vitro представлены в таблице 6.The results of the influence of an inhibitor of type III secretion system on the vitality of P. aeruginosa in vitro are presented in table 6.
При подсчете колоний, выросших на твердых питательных средах, после совместного культивирования штаммов бактерий Р. aeruginosa с ингибитором системы секреции III типа было показано, что ингибитор не оказывал подавляющего действия на рост музейных штаммов бактерий P. aeruginosa при использовании 3-х разных доз препарата - 100, 50 и 25 мг/л. Эти дозы были выбраны на основании результатов предварительных экспериментов по определению эффективной дозы ингибитора в отношении подавления эффекторной функции псевдомонад в условиях in vitro.When counting colonies grown on solid nutrient media after co-cultivation of P. aeruginosa bacterial strains with an inhibitor of the type III secretion system, it was shown that the inhibitor did not inhibit the growth of P. aeruginosa museum strains of bacteria using 3 different doses of the drug - 100, 50 and 25 mg / l. These doses were selected based on the results of preliminary experiments to determine the effective dose of an inhibitor with respect to suppressing the effector function of pseudomonas in vitro.
При изучении действия ингибитора на жизнеспособность свежевыделенных штаммов P. aeruginosa с различным профилем антибиотикорезистентности также не наблюдали подавления роста при использовании тех же концентраций ингибитора (Табл. 6). Полученные данные согласуются с механизмом действия разрабатываемого препарата, который подавляет вирулентность псевдомонад, но не влияет на их жизнеспособность.When studying the effect of the inhibitor on the viability of freshly isolated P. aeruginosa strains with different antibiotic resistance profiles, growth inhibition was not observed using the same inhibitor concentrations (Table 6). The data obtained are consistent with the mechanism of action of the drug being developed, which suppresses the virulence of pseudomonads, but does not affect their viability.
Таким образом, в соответствии с механизмом действия ингибитор ССТТ CL-55 не подавляет жизнеспособность синегнойной палочки при культивировании in vitro.Thus, according to the mechanism of action, the CCTT inhibitor CL-55 does not inhibit the viability of Pseudomonas aeruginosa in vitro.
Изучение влияния ингибитора ССТТ CL-55 на количественный состав кишечной микрофлоры мышей.Study of the effect of the CTTT inhibitor CL-55 on the quantitative composition of the intestinal microflora of mice.
Для изучения влияния ингибитора на нормальную микрофлору проводили количественную характеристику состава кишечной микрофлоры мышей при действии CL-55 и препарата сравнения - антибиотика ципрофлоксацина.To study the effect of the inhibitor on normal microflora, the composition of the intestinal microflora of mice was quantified by the action of CL-55 and the reference drug antibiotic ciprofloxacin.
Метод определения состава кишечной микрофлорыMethod for determining the composition of intestinal microflora
Материалом для исследования служил кал после естественной дефекации, который собирали в стерильный герметичный контейнер с широким горлышком и плотно закрывающейся крышкой, без консерванта. После взвешивания 1 г нативного кала его гомогенизировали в 9 мл физиологического раствора, получая исходное разведение материала (10-1). Из исходного разведения делали дополнительные 10-кратные разведения в физиологическом растворе. Из разведений делали дозированные посевы на питательные среды для культивирования различных групп микроорганизмов. Посевы инкубировали при 37°C в течение 24-48 часов; чашки со средой Сабуро оставляли после этого еще на 2-е суток при комнатной температуре. Лактобактерии культивировали в термостате с 5% CO2 в течение 48 ч.The material for the study was feces after natural defecation, which was collected in a sterile airtight container with a wide neck and a tight-fitting lid, without preservative. After weighing 1 g of native feces, it was homogenized in 9 ml of physiological saline, obtaining the initial dilution of the material (10 -1 ). An additional 10-fold dilutions in physiological saline were made from the initial dilution. From dilutions, metered cultures were made on nutrient media for the cultivation of various groups of microorganisms. Crops were incubated at 37 ° C for 24-48 hours; plates with Saburo medium were left after that for another 2 days at room temperature. Lactobacilli were cultured in an incubator with 5% CO 2 for 48 hours.
В работе использовали следующие питательные среды:The following nutrient media were used in the work:
1) среда ЖСА - желточно-солевой агар для выявления стафилококков;1) the environment of the ZhSA - vitelline salt agar for the detection of staphylococci;
2) среда Эндо - для выделения энтеробактерий, в т.ч. лактозоположительной кишечной палочки;2) Endo medium - for the isolation of enterobacteria, incl. lactobacillus Escherichia coli;
3) среда Сабуро - агар для выделения дрожжеподобных грибов рода Candida;3) Saburo medium - agar for the isolation of yeast-like fungi of the genus Candida;
4) среда MRS - агар для выделения микроаэрофильных лактобактерий;4) MRS medium - agar for the isolation of microaerophilic lactobacilli;
5) бифидум среда - полужидкий агар для бифидобактерий;5) bifidum medium - semi-liquid agar for bifidobacteria;
6) кровяной агар - для выявления гемолитических бактерий, в т.ч. гемолизирующей E.coli;6) blood agar - to detect hemolytic bacteria, including hemolytic E. coli;
7) энтерококковая среда - для выявления фекальных стрептококков;7) enterococcal environment - to detect fecal streptococci;
8) Hektoen Enteric Agar - среда для обнаружения патогенных энтеробактерий.8) Hektoen Enteric Agar - a medium for the detection of pathogenic enterobacteria.
Материал от животных инкубировали при 37°C в течение 24-48 часов.Material from animals was incubated at 37 ° C for 24-48 hours.
Изучение количественного состава кишечной микрофлоры мышей при введении CL-55 и антибиотика сравнения ципрофлоксацинаThe study of the quantitative composition of the intestinal microflora of mice with the introduction of CL-55 and antibiotic comparison ciprofloxacin
Мыши стока Balb/c получали 2 препарата: CL-55 200 мг/кг 2 раза в день 5 дней подряд энтерально и антибиотик ципрофлоксацин 100 мг/кг 2 раза в день 5 дней подряд энтерально. Сбор экскрементов производился 3 раза: до начала введения препаратов, на 15-е и 28-е сутки после начала введения препаратов.Balb / c mice received 2 preparations: CL-55 200 mg / kg 2 times a day for 5 days in a row enteral and
Проведенные эксперименты позволили получить результаты по изменению состава нормальной микрофлоры толстого кишечника животных на 2 срока после начала введения исследуемых препаратов: 200 мг/кг CL-55 и 100 мг/кг ципрофлоксацина. Результаты количественного состава кишечной микрофлоры мышей до начала введения CL-55 и ципрофлоксацина представлены в таблице 7.The experiments performed allowed us to obtain results on the change in the composition of the normal microflora of the large intestine of animals by 2 terms after the start of administration of the studied drugs: 200 mg / kg CL-55 and 100 mg / kg ciprofloxacin. The results of the quantitative composition of the intestinal microflora of mice prior to the introduction of CL-55 and ciprofloxacin are presented in table 7.
Проведенные эксперименты по сравнительной оценке количественного и качественного состава кишечной микрофлоры при действии изучаемого препарата CL-55 и антибиотика ципрофлоксацина свидетельствуют о том, что применение CL-55 в дозе 100 мг/кг два раза в день энтерально на протяжении 5-и дней не оказывало негативного бактерицидного действия на нормальную микрофлору кишечника животных. В таблице 8 представлены результаты изучения количественного состава кишечной микрофлоры мышей на 15-е сутки после начала введения CL-55 и ципрофлоксацина.The experiments on a comparative assessment of the quantitative and qualitative composition of the intestinal microflora under the action of the studied drug CL-55 and the antibiotic ciprofloxacin indicate that the use of CL-55 at a dose of 100 mg / kg twice a day enteral for 5 days did not have a negative effect. bactericidal action on the normal intestinal microflora of animals. Table 8 presents the results of a study of the quantitative composition of the intestinal microflora of mice on the 15th day after the start of administration of CL-55 and ciprofloxacin.
Результаты исследования показали, что количество изучаемых компонентов облигатной микрофлоры: эпидермального стафилококка, лактозоположительной кишечной палочки, лактобактерий, бифидобактерий, фекального стрептококка, при микробиологическом исследовании кала до начала применения CL-55, через неделю после окончания и через три недели после окончания применения препарата практически оставалось на одном уровне. В таблице 9 представлены результаты изучения количественного состава кишечной микрофлоры мышей на 28-е сутки после начала введения CL-55 и ципрофлоксацина.The results of the study showed that the number of studied components of obligate microflora: epidermal staphylococcus, lactobacillus E. coli, lactobacilli, bifidobacteria, fecal streptococcus, during microbiological examination of feces before using CL-55, one week after the end and three weeks after the end of the drug practically remained on the same level. Table 9 presents the results of a study of the quantitative composition of the intestinal microflora of mice on the 28th day after the start of administration of CL-55 and ciprofloxacin.
Напротив, применение ципрофлоксацина в дозе 100 мг/кг 2 раза в день в течение 5 дней энтерально, привело к снижению количества лактобактерий с 108 КОЕ/г до 105 КОЕ/г, бифидобактерий с 109 КОЕ/г до 106 КОЕ/г, лактозоположительной кишечной палочки с 108 КОЕ/г до 106 КОЕ/г через 15 дней после начала лечения. На 28-е сутки эксперимента в этой группе мышей с введением ципрофлоксацина было отмечено увеличение количества лактобактерий и бифидобактерий на 3 порядка с 105 до 108 по сравнению с предыдущим сроком 15 суток. Уровень лактозоположительной кишечной палочки в этой группе восстановился полностью до исходного уровня 108 КОЕ/г.On the contrary, the use of ciprofloxacin at a dose of 100 mg / kg 2 times a day for 5 days enterally led to a decrease in the number of lactobacilli from 10 8 CFU / g to 10 5 CFU / g and 10 9 CFU / g to 10 6 CFU / g, lactose-positive E. coli from 10 8 CFU / g to 10 6 CFU /
Проведенный статистический анализ количественного состава кишечной микрофлоры мышей на одном сроке с применением непараметрического критерия Краскела-Уоллиса показал достоверное отличие для всех проанализированных групп. При анализе динамики показателя состава микрофлоры на разных сроках с применением непараметрического критерия Фридмана, установлено достоверное отличие между сроком до введения препаратов и 15-ми и 28-ми сутками для всех групп животных (p<0,05).A statistical analysis of the quantitative composition of the intestinal microflora of mice at the same time using the non-parametric Kruskal-Wallis test showed a significant difference for all analyzed groups. When analyzing the dynamics of the microflora composition indicator at different periods using the non-parametric Friedman criterion, a significant difference was established between the period before drug administration and 15 and 28 days for all groups of animals (p <0.05).
Таким образом, по результатам исследования можно сделать вывод о том, что изучаемый ингибитор ССТТ 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид (CL-55), в соответствии с механизмом его действия, не обладает бактерицидным действием на кишечную микрофлору животных. Отсутствие негативного влияния на состав кишечной микрофлоры ингибитора ССТТ перспективного для лечения антибиотикорезистентных госпитальных штаммов синегнойной палочки является его принципиальным преимуществом перед используемыми антибиотиками.Thus, according to the results of the study, we can conclude that the studied CTBT inhibitor 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] -thiadiazine- 2- (2,4-Difluorophenyl) -carboxamide (CL-55), in accordance with its mechanism of action, does not have a bactericidal effect on the intestinal microflora of animals. The absence of a negative effect on the composition of the intestinal microflora of the CCTT inhibitor, which is promising for the treatment of antibiotic-resistant hospital strains of Pseudomonas aeruginosa, is its principal advantage over the antibiotics used.
Пример 5.Example 5
Определение эффективной ингибирующей дозы 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на лабораторных животныхDetermination of an effective inhibitory dose of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide on laboratory animals
Определение эффективной терапевтической дозы ингибитора ССТТ проводили при пероральном способе введения препарата. Штаммы P. aeruginosa.The determination of the effective therapeutic dose of the CSTT inhibitor was carried out with the oral route of administration of the drug. Strains of P. aeruginosa.
В таблице 10 приведена характеристика клинических штаммов Р. aeruginosa, использованных в примерах 5, 6 и 7.Table 10 shows the characteristics of the clinical strains of P. aeruginosa used in examples 5, 6 and 7.
Для моделирования сепсиса, индуцированного антибиотикорезистентными клиническими штаммами P. aeruginosa, были использованы мыши инбредной линии A/JsnYCit (A/Sn), поддерживаемые в питомнике ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ в соответствии с требованиями по содержанию животных МЗ РФ №775. В опытах использовали самцов, весом 18-20 г на начало эксперимента; каждая группа для исследования состояла из 6 животных. Все исследования были выполнены в двух повторах.To simulate sepsis induced by antibiotic-resistant clinical strains of P. aeruginosa, inbred mice A / JsnYCit (A / Sn) mice supported in the nursery of FSBI “FNITsEM im. N.F. Gamalei "of the Ministry of Health of the Russian Federation in accordance with the requirements for the maintenance of animals of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 775. In the experiments used males weighing 18-20 g at the beginning of the experiment; each group for the study consisted of 6 animals. All studies were performed in duplicate.
Содержание животныхKeeping animals
Животные содержались в стандартных условиях в по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев).Animals were kept under standard conditions in the design, equipment and maintenance of experimental biological clinics (vivariums).
Подготовка культуры для заражения. Подготовка бактериальной культуры для заражения была выполнена следующим образом: бактериальную культуру выращивали на жидкой среде Luria-Bertani (LB - бульон) фирмы «DIFCO», USA, при 37°C 20 часов. Через 20 часов рассчитывали титр культуры методом десятикратных разведений на твердой питательной среде. Для заражения культуру разводили физиологическим раствором до необходимой концентрации в соответствии с титром.Preparing the culture for infection. Preparation of the bacterial culture for infection was carried out as follows: the bacterial culture was grown on Luria-Bertani liquid medium (LB broth) from DIFCO, USA, at 37 ° C for 20 hours. After 20 hours, the titer of the culture was calculated by tenfold dilutions on a solid nutrient medium. For infection, the culture was diluted with saline to the required concentration in accordance with the titer.
Заражение. Для создания экспериментальной септической синегнойной инфекции мышам вводили внутрибрюшинно подготовленные как описано выше культуры P. aeruginosa, в различных дозах. Объем вводимой культуры составил 0.5 мл на мышь. Количество мышей в каждой группе составляло 6 животных. После заражения проводили ежесуточно мониторинг продолжительности жизни мышей (критерий - смертность). Также определяли количество бактерий, высеваемых из органов зараженных животных. Материалом для посева для определения количества псевдомонад при септической инфекции служили смывы из брюшной полости (перитониальные лаважи), селезенка, а также кровь.Infection. To create an experimental septic Pseudomonas aeruginosa infection, mice were injected intraperitoneally prepared as described above with P. aeruginosa cultures in various doses. The volume of the introduced culture was 0.5 ml per mouse. The number of mice in each group was 6 animals. After infection, the life expectancy of mice was monitored daily (criterion is mortality). The number of bacteria sown from the organs of infected animals was also determined. Seeding material for determining the number of pseudomonads in septic infections was abdominal swabs (peritonial lavage), spleen, and blood.
Метод определения динамики гибели животных. Ежедневно после заражения 2 раза в день, утром и вечером, проводили наблюдения за состоянием животных и фиксировали сроки падежа экспериментальных животных.Method for determining the dynamics of animal death. Every day after infection, 2 times a day, morning and evening, the state of the animals was monitored and the death periods of the experimental animals were recorded.
Метод определения количества бактерий в крови и органах зараженных животныхMethod for determining the number of bacteria in the blood and organs of infected animals
Мышей, переживших инфекцию, умерщвляли цервикальной дислокацией. Кровь отбирали путем кардиальной пункции и помещали в пробирки, содержащие 100 единиц гепарина натрия. Перитонеальные смывы получали введением в брюшную полость 5 мл стерильного физиологического раствора. Селезенки гомогенизировали с помощью гомогенизатора SilentcrusherM в 1 мл физиологического раствора, полученные гомогенаты центрифугировали 10 мин при 800 об/мин (центрифуга 5415 D Eppendorf) для удаления грубых остатков тканей. Затем готовили серии 10-кратных разведений исходной суспензии гомогенатов селезенок в физиологическом растворе, и 500 мкл каждого разведения помещали на чашку Петри, покрытую цитрамидным агаром. Аналогично готовили серии 10-кратных разведений в физиологическом растворе образцов крови и перитониальных лаважей. Чашки Петри инкубировали при 37°C и через 24 часа культивирования производили подсчет колоний. Концентрацию псевдомонад в органах выражали числом КОЕ в 1 мл.Mice surviving the infection were euthanized by cervical dislocation. Blood was collected by cardiac puncture and placed in test tubes containing 100 units of sodium heparin. Peritoneal washings were obtained by introducing 5 ml of sterile saline into the abdominal cavity. The spleens were homogenized using a SilentcrusherM homogenizer in 1 ml of physiological saline, the resulting homogenates were centrifuged for 10 min at 800 rpm (5415 D Eppendorf centrifuge) to remove coarse tissue residues. Then, a series of 10-fold dilutions of the initial suspension of spleen homogenates in physiological saline was prepared, and 500 μl of each dilution was placed on a Petri dish coated with citramide agar. A series of 10-fold dilutions in a physiological solution of blood samples and peritonial lavages was prepared in a similar manner. Petri dishes were incubated at 37 ° C and colony counts were performed after 24 hours of cultivation. The concentration of pseudomonads in organs was expressed by the number of CFU in 1 ml.
Определение эффективной дозы для перорального введения CL-55 на модели септической инфекцииDetermination of the effective dose for oral administration of CL-55 in a septic infection model
Эффективная доза CL-55 была определена на разработанной модели септической инфекции. Для заражения использовали клинические штаммы с различным генотипом по эффекторам ССТТ (exoU+ или exoS+). Заражение мышей выполняли внутрибрюшинно в соответствии с описанным выше методом. Дозы для заражения были выбраны на основании полученных результатов по определению ЛД50 и ЛД100 для каждого штамма.The effective dose of CL-55 was determined on the developed model of septic infection. For infection, clinical strains with different genotypes for CTTT effectors (exoU + or exoS + ) were used. Infection of mice was performed intraperitoneally in accordance with the method described above. Doses for infection were selected based on the results obtained for the determination of LD 50 and LD 100 for each strain.
Пероральное введение препарата CL-55. При пероральном введении препарата применяли атравматичный металлический зонд (так называемую гаважную иглу), который вводили в пищевод до желудка. Субстанцию препарата тщательно растирали в фарфоровой ступке с минимальным количеством Твин-80. Затем постепенно при интенсивном перемешивании добавляли небольшие порции 1% крахмального клейстера и растирали до однородной массы. Контрольные животные получали эквивалентные объемы крахмального клейстера с Твин-80.Oral administration of the drug CL-55. When the drug was administered orally, an atraumatic metal probe (the so-called gavage needle) was used, which was inserted into the esophagus before the stomach. The substance of the drug was thoroughly ground in a porcelain mortar with a minimum amount of Tween-80. Then gradually, with vigorous stirring, small portions of 1% starch paste were added and triturated to a homogeneous mass. Control animals received equivalent volumes of Tween-80 starch paste.
Для проведения эксперимента были выбраны 4 госпитальных штамма exoS+ и exoU+ типа, имеющие различный профиль антибиотикорезистентности.For the experiment, 4 hospital strains of exoS + and exoU + types with a different antibiotic resistance profile were selected.
Дизайн экспериментов для 4-х штаммовDesign experiments for 4 strains
Были сформированы группы по 6 мышей в каждой. Исследования были выполнены в двух повторах.Groups of 6 mice each were formed. The studies were performed in duplicate.
1 группа - контроль зараженияGroup 1 - infection control
2 группа - зараженные мыши +150 мг/кг CL-55Group 2 - infected mice +150 mg / kg CL-55
3 группа - зараженные мыши +100 мг/кг CL-55Group 3 - infected mice +100 mg / kg CL-55
4 группа - зараженные мыши +50 мг/кг CL-55Group 4 - infected mice +50 mg / kg CL-55
5 группа - незараженные мыши +150 мг/кг CL-55Group 5 - uninfected mice +150 mg / kg CL-55
6 группа - незараженные мыши +100 мг/кг CL-556 group - uninfected mice +100 mg / kg CL-55
7 группа - незараженные мыши +50 мг/кг CL-557 group - uninfected mice +50 mg / kg CL-55
Введение препарата в течение 3-х дней 1 раз в сутки.The introduction of the drug for 3 days 1 time per day.
Мониторинг развития инфекции проводили по динамике гибели животных в течение 7 дней после заражения. Возможное негативное действие препарата CL-55 определяли при введении препарата в 3-х концентрациях незараженным мышам.Monitoring of the development of infection was carried out according to the dynamics of the death of animals within 7 days after infection. The possible negative effect of the drug CL-55 was determined with the introduction of the drug in 3 concentrations to uninfected mice.
Не наблюдали гибели животных при введении 150 мг/кг, 100 мг/кг и 50 мг/кг CL-55 незараженным животным. В таблице 11 представлены результаты по гибели и выживаемости животных по дням при внутрибрюшинном заражении дозой 4×106 КОЕ/мышь клиническим штаммом КБ6/6/2014 exoS+ и получавших CL-55 в дозах 150 мг/кг, 100 мг/кг и 50 мг/кг в течение 3-х дней перорально. Данные приведены для экспериментов в 2-х повторах.No deaths were observed with the administration of 150 mg / kg, 100 mg / kg and 50 mg / kg CL-55 to non-infected animals. Table 11 presents the results of the death and survival of animals by day with an intraperitoneal infection with a dose of 4 × 10 6 CFU / mouse of the clinical strain KB6 / 6/2014 exoS + and those who received CL-55 at doses of 150 mg / kg, 100 mg / kg and 50 mg / kg for 3 days orally. Data are given for experiments in 2 repetitions.
В таблице 12 представлены результаты по гибели и выживаемости животных по дням при внутрибрюшинном заражении дозой 2×106 КОЕ/мышь клиническим штаммом 693/6/2014 exoS+ и получавших CL-55 в дозах 150 мг/кг, 100 мг/кг и 50 мг/кг в течение 3-х дней перорально. Данные приведены для экспериментов в 2-х повторах.Table 12 presents the results of the death and survival of animals by day with an intraperitoneal infection with a dose of 2 × 10 6 CFU / mouse of the clinical strain 693/6/2014 exoS + and receiving CL-55 at doses of 150 mg / kg, 100 mg / kg and 50 mg / kg for 3 days orally. Data are given for experiments in 2 repetitions.
В таблице 13 представлены результаты по гибели и выживаемости животных по дням при внутрибрюшинном заражении дозой 1×106 КОЕ/мышь клиническим штаммом 1840/36/2015 exoU+ и получавших CL-55 в дозах 150 мг/кг, 100 мг/кг и 50 мг/кг в течение 3-х дней перорально. Данные приведены для экспериментов в 2-х повторах.Table 13 presents the results of the death and survival of animals by days with an intraperitoneal infection with a dose of 1 × 10 6 CFU / mouse of the clinical strain 1840/36/2015 exoU + and receiving CL-55 at doses of 150 mg / kg, 100 mg / kg and 50 mg / kg for 3 days orally. Data are given for experiments in 2 repetitions.
В таблице 14 представлены результаты по гибели и выживаемости животных по дням при внутрибрюшинном заражении дозой 1×106 КОЕ/мышь клиническим штаммом 1625/36/2015 exoU+ и получавших CL-55 в дозах 150 мг/кг, 100 мг/кг и 50 мг/кг в течение 3-х дней перорально. Данные приведены для экспериментов в 2-х повторах.Table 14 presents the results of the death and survival of the animals by day with an intraperitoneal infection with a dose of 1 × 10 6 CFU / mouse of the
Таким образом, введение перорально препарата CL-55 в дозах 50 мг/кг в течение 3-х дней 1 раз в сутки приводило к небольшому повышению выживаемости, в 1,5 раза. Введение CL-55 в дозе 100 мг/кг приводило к выраженному снижению смертности, в 2 раза. Введение в том же режиме препарата CL-55 в дозе 150 мг/кг заметно снижало смертность животных в группах, зараженных каждым из штаммов: для зараженных КБ6/6/2014 - в 2,3 раза; для зараженных 693/6/2014 - в 2 раза; для зараженных 1840/36/2015 - в 1.6 раза; для зараженных штаммом 1625/36/2015 выживаемость, получавших CL-55 мышей, составила 92%, при том, что все зараженные мыши без лечения погибли.Thus, the oral administration of the drug CL-55 in doses of 50 mg / kg for 3 days 1 time per day led to a slight increase in survival by 1.5 times. The introduction of CL-55 at a dose of 100 mg / kg led to a pronounced decrease in mortality, 2 times. The introduction in the same regime of the drug CL-55 at a dose of 150 mg / kg markedly reduced the mortality of animals in groups infected with each of the strains: for infected KB6 / 6/2014 - 2.3 times; for infected 693/6/2014 - 2 times; for infected 1840/36/2015 - 1.6 times; for those infected with
Для того чтобы оценить подавление пседомонадной инфекции в органах зараженных мышей, было осуществлено моделирование септической инфекции, так же как описано выше. Заражение осуществляли не летальной, но инфекционной дозой 5×104 КОЕ/мышь штамма КБ6/6/2014, что приводило к развитию псевдомонадной инфекции в органах, но не смерти животных в период наблюдения в течение 4 суток. CL-55 зараженным мышам вводили перорально в дозе 100 мг/кг в течение 3-х дней 1 раз в сутки, что приводило к полному подавлению инфекции в исследованных биологических образцах.In order to evaluate the inhibition of pseudomonas infection in the organs of infected mice, a septic infection was simulated, as described above. Infection was carried out not with a lethal, but with an infectious dose of 5 × 10 4 CFU / mouse of strain KB6 / 6/2014, which led to the development of pseudomonas infection in the organs, but not the death of animals during the observation period for 4 days. CL-55 infected mice were administered orally at a dose of 100 mg / kg for 3 days 1 time per day, which led to a complete suppression of infection in the studied biological samples.
В таблице 15 приведены данные по определению средних количеств псевдомонад в высевах из органов животных, при заражении не летальной дозой штамма КБ6/6/2014, в группах животных получавших CL-55 и без лечения.Table 15 shows the data on the determination of the average amounts of pseudomonas in seeding from animal organs, when infected with a non-lethal dose of strain KB6 / 6/2014, in groups of animals treated with CL-55 and without treatment.
Таким образом, на основании проведенных экспериментов было показано, что при пероральном введении препарата CL-55 в течение трех дней в дозе 100 мг/кг в сутки наблюдали подавление накопления псевдомонад в перитонеальном лаваже, крови и селезенке, т.е. был показано эффективное антибактериальное действие ингибитора ССТТ.Thus, on the basis of the experiments, it was shown that with the oral administration of CL-55 for three days at a dose of 100 mg / kg per day, the accumulation of pseudomonas was suppressed in peritoneal lavage, blood and spleen, i.e. an effective antibacterial effect of the CTTT inhibitor has been shown.
Тем самым, минимальная эффективная доза или фармакологически активная доза для CL-55 составила 100 мг/кг для мышей. На модели летальной септической инфекции, вызванной антибиотикорезистентными клиническими штаммами, при использовании всех испытанных доз отмечали снижение смертности у мышей в 1,5-4 раза, что свидетельствует о возможности достижения более эффективного терапевтического действия препарата при изменении режима терапии (изменение сроков и кратности введения препарата).Thus, the minimum effective dose or pharmacologically active dose for CL-55 was 100 mg / kg for mice. In a model of lethal septic infection caused by antibiotic-resistant clinical strains, using all the tested doses, a 1.5–4-fold decrease in mortality in mice was noted, which indicates the possibility of achieving a more effective therapeutic effect of the drug when changing the treatment regimen (changing the timing and frequency of drug administration )
Пример 6.Example 6
Изучение терапевтической эффективности ингибитора ССТТ на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов.The study of the therapeutic efficacy of the CTTT inhibitor in a model of experimental infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa of two different CTTT genotypes.
Изучение терапевтической эффективности полученного ингибитора CL-55 проводили на модели септической инфекции у мышей и использовали методы накопления псевдомонад и работы с лабораторными животными описанные в Примере 5.The study of the therapeutic efficacy of the obtained CL-55 inhibitor was carried out on a model of septic infection in mice and used the methods of accumulation of pseudomonads and work with laboratory animals described in Example 5.
Мышей заражали штаммами псевдомонад двух разных генотипов exoU+ и exoS+. Эффективность действия CL-55 оценивали по динамике гибели животных в течение 4 дней после заражения и по антибактериальному действию CL-55 в крови и селезенке через 24, 48 и 72 часа после заражения с использованием метода бактериологического высева.Mice were infected with strains of pseudomonads of two different genotypes exoU + and exoS + . The efficacy of CL-55 was evaluated by the dynamics of animal death within 4 days after infection and by the antibacterial effect of CL-55 in the blood and spleen 24, 48 and 72 hours after infection using the bacteriological method of seeding.
Дизайн эксперимента с штаммом exoU+ Design experiment with exoU + strain
Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.Groups of 6 mice each were formed.
1 группа - контроль заражения дозой 2,5×106 КОЕ/мышь (ЛД75) штамма 1840/36/2015 exoU+ Group 1 - infection control with a dose of 2.5 × 10 6 CFU / mouse (LD 75 ) of strain 1840/36/2015 exoU +
2 группа - заражение + лечение CL-55 дозой 100 мг/кг 1-кратно 3 сутокGroup 2 - infection + treatment with CL-55 dose of 100 mg / kg 1 time 3 days
3 группа - заражение + лечение дозой CL-55 50 мг/кг 2-кратно 3 сутокGroup 3 - infection + treatment with a dose of CL-55 50 mg / kg 2-fold 3 days
В таблице 16 приведены результаты терапевтической эффективности CL-55 по выживаемости животных по дням после заражения дозой 2,5×106 КОЕ/мышь (ЛД75) штаммом 1840/36/2015 exoU+ (данные для 2 повторов, в каждой группе по 6 животных).Table 16 shows the results of therapeutic efficacy of CL-55 in animal survival days after infection with a dose of 2.5 × 10 6 CFU / mouse (LD 75 ) strain 1840/36/2015 exoU + (data for 2 repetitions, in each group of 6 animals).
Было показано, что при однократном в течение дня введении препарата CL-55 в дозе 100 мг/кг на протяжении 3 суток после заражения наблюдали снижение гибели животных с 75% (в контроле) до 25%. Увеличение кратности введения препарата с дозой 50 мг/кг до 2-х раз в сутки, в течение 3-х дней после заражения повысило эффективность лечения, более 90% животных выживали.It was shown that with a single injection of CL-55 at a dose of 100 mg / kg for 3 days after infection, a decrease in animal death was observed from 75% (in control) to 25%. An increase in the frequency of administration of the drug with a dose of 50 mg / kg up to 2 times a day, within 3 days after infection, increased the effectiveness of treatment, more than 90% of the animals survived.
Для того, чтобы оценить подавление пседомонадной инфекции в органах зараженных мышей после терапевтического введения CL-55, был поставлен следующий эксперимент.In order to evaluate the inhibition of pseudomonas infection in the organs of infected mice after therapeutic administration of CL-55, the following experiment was performed.
Дизайн эксперимента с штаммом exoU+ Design experiment with exoU + strain
Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.Groups of 6 mice each were formed.
1 группа - контроль заражения дозой ЛД50 (1×106 КОЕ/мышь) штамма 1840/36/2015Group 1 - infection control with a dose of LD 50 (1 × 10 6 CFU / mouse) strain 1840/36/2015
2 группа - заражение + лечение CL-55 дозой 100 мг/кг 1-кратно в течение 3-х сутокGroup 2 - infection + treatment with CL-55 with a dose of 100 mg / kg 1-fold for 3 days
3 группа - заражение + лечение CL-55 дозой 50 мг/кг 2-кратно в течение 3-х суток3 group - infection + treatment with CL-55 dose of 50 mg / kg 2-fold for 3 days
Мышей заражали дозой ЛД50 (1×106 КОЕ/мышь) штамма 1840/36/2015. Лечение начинали в день заражения. Вскрытие осуществляли через 24, 48 и 72 часа после заражения для выживших мышей. В таблице 17 приведены результаты по микробиологическому выделению и определению среднего количества псевдомонад в высевах из селезенок и крови мышей, зараженных дозой ЛД50 (1×106 КОЕ/мышь) штамма 1840/36/2015 в ходе лечения CL-55 в дозе 100 мг/кг однократно.Mice were infected with a dose of LD 50 (1 × 10 6 CFU / mouse) of strain 1840/36/2015. Treatment began on the day of infection. Autopsies were performed 24, 48, and 72 hours after infection for surviving mice. Table 17 shows the results of microbiological isolation and determination of the average number of pseudomonas in the seeding from spleens and blood of mice infected with a dose of LD 50 (1 × 10 6 CFU / mouse) of strain 1840/36/2015 during treatment with CL-55 at a dose of 100 mg / kg once.
Результаты показали, что лечение по схеме 100 мг/кг 1 раз в день в течение 3-х дней приводит к снижению размножения синегнойной палочки как в селезенке, так и в крови. При этом наибольшую разницу по снижению бактериальной нагрузки наблюдали начиная с 48 часов после заражения как для крови, так и для селезенки.The results showed that treatment according to the scheme of 100 mg / kg once a day for 3 days leads to a decrease in the reproduction of Pseudomonas aeruginosa in both the spleen and blood. Moreover, the greatest difference in reducing the bacterial load was observed starting from 48 hours after infection for both blood and spleen.
В таблице 18 приведены результаты по определению среднего количества псевдомонад в высевах из селезенок и крови мышей, зараженных дозой ЛД50 (1×106 КОЕ/мышь) штамма 1840/36/2015 в ходе лечения CL-55 в дозе 50 мг/кг двукратно.Table 18 shows the results of determining the average number of pseudomonas in the plaque from the spleens and blood of mice infected with a dose of LD 50 (1 × 10 6 CFU / mouse) strain 1840/36/2015 during treatment with CL-55 at a dose of 50 mg / kg twice .
Лечение по схеме 50 мг/кг 2 раза в день в течение 3-х дней показало эффективное подавление размножения псевдомонад к 48 и 72 часам после заражения. К этим срокам в селезенке и в крови практически полностью отсутствовали бактерии.Treatment according to the scheme of 50 mg / kg 2 times a day for 3 days showed effective inhibition of pseudomonas multiplication by 48 and 72 hours after infection. By these dates, bacteria were almost completely absent in the spleen and blood.
Подавление пседомонадной инфекции в органах зараженных мышей при использовании отработанной схемы терапии оценивали также при заражении штаммом КБ6/6/2014 exoS+ генотипа.The suppression of pseudomonas infection in the organs of infected mice using the established treatment regimen was also evaluated when infected with strain KB6 / 6/2014 exoS + genotype.
Дизайн эксперимента с штаммом exoS+ ExoS + strain experiment design
Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.Groups of 6 mice each were formed.
1 группа - контроль заражения дозой ЛД10 (1×106 КОЕ/мышь) штамма КБ6/6/2014Group 1 - infection control with a dose of LD 10 (1 × 10 6 CFU / mouse) of strain KB6 / 6/2014
2 группа - заражение + лечение CL-55 дозой 50 мг/кг 2-кратно в течение 3 сутокGroup 2 - infection + treatment with CL-55 dose of 50 mg / kg 2-fold for 3 days
Мышей заражали дозой ЛД10 (1×106 КОЕ/мышь) штамма КБ6/6/2014. Лечение начинали в день заражения. Вскрытие осуществляли через 72 часа после заражения для выживших мышей.Mice were infected with a dose of LD 10 (1 × 10 6 CFU / mouse) of strain KB6 / 6/2014. Treatment began on the day of infection. An autopsy was performed 72 hours after infection for surviving mice.
В таблице 19 представлены результаты по определению среднего количества псевдомонад в высевах из селезенок и крови мышей, зараженных дозой ЛД10 (1×106 КОЕ/мышь) штамма КБ6/6/2014 в ходе лечения CL-55 в дозе 50 мг/кг двукратно.Table 19 presents the results of determining the average number of pseudomonas in the seeding from spleens and blood of mice infected with a dose of LD 10 (1 × 10 6 CFU / mouse) of strain KB6 / 6/2014 during treatment with CL-55 at a dose of 50 mg / kg twice .
Таким образом, была показана терапевтическая эффективность препарата CL-55 - низкомолекулярного ингибитора ССТТ псевдомонад. В качестве эффективной схемы терапии было выбрано лечение в дозе 50 мг/кг 2 раза в день в течение 3-х дней после заражения. Лечение по такой схеме приводило к снижению гибели мышей на 91,7% при заражении псевдомонадами дозой равной ЛД75 и 100% выживаемости при заражении дозой ЛД50 и ЛД10. Оценка антибактериального действия препарата CL-55 выявила снижение накопления возбудителя в крови и селезенке уже через 1 сутки после начала лечения. Через 48 и 72 часа в селезенке и крови леченных мышей возбудитель практически полностью отсутствовал. Терапевтическая эффективность 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида - ингибитора ССТТ была установлена на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов.Thus, the therapeutic efficacy of the drug CL-55, a low molecular weight CTTT inhibitor of pseudomonas, was shown. As an effective treatment regimen, treatment was chosen at a dose of 50 mg / kg 2 times a day for 3 days after infection. Treatment according to this scheme led to a decrease in mouse death by 91.7% when infected with pseudomonads with a dose equal to LD 75 and 100% survival when infected with a dose of LD 50 and LD 10 . Evaluation of the antibacterial effect of the drug CL-55 revealed a decrease in the accumulation of the pathogen in the blood and spleen 1 day after the start of treatment. After 48 and 72 hours, the pathogen was almost completely absent in the spleen and blood of the treated mice. Therapeutic efficacy of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide inhibitor was established on a model of experimental infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa of two different CTST genotypes.
Пример 7.Example 7
Изучение профилактической эффективности ингибитора ССТТ на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотиповStudy of the prophylactic efficacy of a CTTT inhibitor in a model of experimental infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa of two different CTTT genotypes
Изучение профилактической эффективности полученного ингибитора CL-55 проводили на модели септической инфекции у мышей и использовали методы накопления псевдомонад и работы с лабораторными животными описанные в Примере 5.The study of the prophylactic efficacy of the obtained CL-55 inhibitor was carried out on a model of septic infection in mice and the methods of accumulation of pseudomonads and work with laboratory animals described in Example 5 were used.
Лекарственное средство вводилось лабораторным животным перорально в течение 3-х суток до заражения. Эти сроки были выбраны на основании первичных данных по фармакокинетическим исследованиям, которые свидетельствуют о том, что после перорального введения CL-55 он накапливается в хорошо васкуализированных органах, таких как, печень, селезенка, легкие. Мышей заражали штаммами псевдомонад двух разных генотипов, exoS+ и exoU+.The drug was administered to laboratory animals orally for 3 days before infection. These dates were selected on the basis of primary pharmacokinetic studies, which indicate that after oral administration of CL-55, it accumulates in well-vasculated organs such as the liver, spleen, and lungs. Mice were infected with strains of pseudomonads of two different genotypes, exoS + and exoU + .
Дизайн эксперимента для exoS+ генотипаExperiment design for exoS + genotype
Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.Groups of 6 mice each were formed.
1 группа - контроль инфекции при заражении дозой 4×106 КОЕ/мышь (ЛД50) штаммом КБ6/6/2014Group 1 - infection control during infection with a dose of 4 × 10 6 CFU / mouse (LD 50 ) strain KB6 / 6/2014
2 группа - профилактика CL-55 дозой 150 мг/кг 3 суток + заражениеGroup 2 - prevention of CL-55 dose of 150 mg / kg 3 days + infection
3 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг 3 суток + заражениеGroup 3 - prevention of CL-55 with a dose of 100 mg / kg 3 days + infection
4 группа - профилактика CL-55 дозой 50 мг/кг 3 суток + заражениеGroup 4 - prevention of CL-55 dose of 50 mg / kg 3 days + infection
Эффективность профилактического действия CL-55 оценивали по динамике гибели животных в течение 4 дней после заражения.The effectiveness of the preventive action of CL-55 was evaluated by the dynamics of the death of animals within 4 days after infection.
В таблице 20 приведены результаты по изучению эффективности профилактики различными дозами CL-55 в течение 3 суток - выживаемость животных по дням после заражения дозой 4×106 КОЕ/мышь (ЛД50) штаммом КБ6/6/2014 exoS+ (данные для 2 повторов, в каждой группе 6 животных). Результаты исследования показывают высокую профилактическую эффективность перорального введения CL-55 в течение 3-х суток в дозах 150 и 100 мг/кг в отношении выживаемости животных, зараженных дозой ЛД50 штамма КБ6/6/2014.Table 20 shows the results of studying the effectiveness of prophylaxis with various doses of CL-55 for 3 days — animal survival by days after infection with a dose of 4 × 10 6 CFU / mouse (LD 50 ) strain KB6 / 6/2014 exoS + (data for 2 repetitions , in each group 6 animals). The results of the study show the high prophylactic efficacy of oral administration of CL-55 for 3 days at doses of 150 and 100 mg / kg in relation to the survival of animals infected with a dose of LD 50 of strain KB6 / 6/2014.
Дизайн эксперимента для exoS+ генотипаExperiment design for exoS + genotype
Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.Groups of 6 mice each were formed.
1 группа - контроль инфекции при заражении дозой 1×107 КОЕ/мышь (ЛД100) штаммом КБ6/6/2014Group 1 - infection control during infection with a dose of 1 × 10 7 CFU / mouse (LD 100 ) strain KB6 / 6/2014
2 группа - профилактика CL-55 дозой 150 мг/кг 3 суток + заражениеGroup 2 - prevention of CL-55 dose of 150 mg / kg 3 days + infection
3 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг 3 суток + заражениеGroup 3 - prevention of CL-55 with a dose of 100 mg / kg 3 days + infection
4 группа - профилактика CL-55 дозой 50 мг/кг 3 суток + заражениеGroup 4 - prevention of CL-55 dose of 50 mg / kg 3 days + infection
При заражении дозой ЛД100 штамма КБ6/6/2014 результаты выживаемости животных, после профилактического введения CL-55 в течение 3-х суток в дозах 150 и 100 мг/кг были ниже, однако против 100% гибели животных в контрольных группах 67 и 58% животных выживало для доз 150 и 100 мг/кг соответственно. В таблице 21 приведены результаты исследования эффективности профилактики дозами CL-55 150 и 100 мг/кг в течение 3 суток с последующим заражением мышей дозой 1×107 КОЕ/мышь (ЛД100) штамма КБ6/6/2014 - выживаемость животных по дням после заражения (данные для 2 повторов, в каждой группе 6 животных).When infected with a dose of LD 100 of strain KB6 / 6/2014, the survival rates of animals after prophylactic administration of CL-55 for 3 days at doses of 150 and 100 mg / kg were lower, however, against 100% death of animals in the control groups 67 and 58 % of animals survived for doses of 150 and 100 mg / kg, respectively. Table 21 shows the results of a study of the effectiveness of prophylaxis with doses of CL-55 of 150 and 100 mg / kg for 3 days, followed by infection of mice with a dose of 1 × 10 7 CFU / mouse (LD 100 ) of strain KB6 / 6/2014 — animal survival by days after infection (data for 2 repetitions, in each group of 6 animals).
Для того, чтобы оценить подавление пседомонадной инфекции в органах зараженных мышей после профилактического введения CL-55, был поставлен следующий эксперимент.In order to evaluate the inhibition of pseudomonas infection in the organs of infected mice after prophylactic administration of CL-55, the following experiment was performed.
Дизайн эксперимента для штамма exoS+ Experiment design for exoS + strain
Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.Groups of 6 mice each were formed.
1 группа - контроль инфекции при заражении ЛД50 (4×106 КОЕ/мышь) штамма КБ6/6/2014Group 1 - infection control during infection with LD 50 (4 × 10 6 CFU / mouse) strain KB6 / 6/2014
2 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг за 24 ч. до зараженияGroup 2 - prevention of CL-55 with a dose of 100 mg / kg 24 hours before infection
3 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг в течение 2 суток за 48 ч. до зараженияGroup 3 - prevention of CL-55 with a dose of 100 mg / kg for 2 days 48 hours before infection
4 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг в течение 3 суток за 72 ч. до зараженияGroup 4 - prevention of CL-55 with a dose of 100 mg / kg for 3 days 72 hours before infection
Мышей заражали дозой ЛД50 (4×106 КОЕ/мышь) штамма КБ6/6/2014 после окончания профилактики CL-55. Вскрытие осуществляли через 24 ч. после заражения. В таблице 22 приведены результаты определения среднего количества псевдомонад в высевах из селезенок мышей, зараженных дозой ЛД50 (4×106 КОЕ/мышь) штамма КБ6/6/2014 после профилактического введения CL-55 в дозе 100 мг/кг за 24 часа, 48 часов и 72 часа до заражения.Mice were infected with a dose of LD 50 (4 × 10 6 CFU / mouse) of strain KB6 / 6/2014 after completion of CL-55 prophylaxis. Autopsy was performed 24 hours after infection. Table 22 shows the results of determining the average number of pseudomonas in seeding from spleens of mice infected with a dose of LD 50 (4 × 10 6 CFU / mouse) of strain KB6 / 6/2014 after prophylactic administration of CL-55 at a dose of 100 mg / kg in 24 hours, 48 hours and 72 hours before infection.
Таким образом, даже одна профилактическая доза 100 мг/кг CL-55 оказывает выраженное антибактериальное действие и приводит к снижению количества псевдомонад в селезенках на 50% по сравнению с группой без профилактики. Увеличение кратности введения профилактических доз CL-55 до 3-х раз приводит практически к полному подавлению накоплению возбудителя в селезенках.Thus, even one prophylactic dose of 100 mg / kg CL-55 has a pronounced antibacterial effect and leads to a 50% reduction in the number of pseudomonads in the spleen compared with the group without prophylaxis. An increase in the frequency of administration of prophylactic doses of CL-55 to 3 times leads to almost complete suppression of the accumulation of the pathogen in the spleen.
Было проведено изучение эффективности профилактических режимов введения ингибитора системы секреции III типа, лекарственного средства CL-55, при пероральном введении, на септическую псевдомонадную инфекцию, вызванную синегнойной палочкой ExoU фенотипа при заражении дозами ЛД50 и ЛД75.A study was conducted of the effectiveness of the prophylactic regimen for the administration of a type III secretion system inhibitor, CL-55 drug, when administered orally, to septic pseudomonas infection caused by Pseudomonas aeruginosa ExoU phenotype when infected with doses of LD 50 and LD 75 .
Дизайн эксперимента с штаммом exoU+ Design experiment with exoU + strain
Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.Groups of 6 mice each were formed.
1 группа - контроль инфекции при заражении дозой 1,15×106 КОЕ/мышь (ЛД50) штаммом 1840/36/2015Group 1 - infection control during infection with a dose of 1.15 × 10 6 CFU / mouse (LD 50 ) strain 1840/36/2015
2 группа - профилактика CL-55 дозой 150 мг/кг 3 суток + заражениеGroup 2 - prevention of CL-55 dose of 150 mg / kg 3 days + infection
3 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг 3 суток + заражениеGroup 3 - prevention of CL-55 with a dose of 100 mg / kg 3 days + infection
Эффективность профилактического действия CL-55 оценивали в острой септической модели по динамике гибели животных в течение 4 дней после заражения.The effectiveness of the preventive action of CL-55 was evaluated in an acute septic model according to the dynamics of animal death within 4 days after infection.
В таблице 23 приведены результаты исследования эффективности профилактики различными дозами CL-55 в течение 3 суток - выживаемость животных по дням после заражения дозой 1,15×106 КОЕ/мышь (ЛД50) штаммом 1840/36/2015 exoU+ (данные для 2 повторов, в каждой группе 6 животных). Полученные данные показывают профилактическую эффективность перорального введения CL-55 в течение 3-х суток в дозах 150 и 100 мг/кг в отношении выживаемости животных, зараженных дозой ЛД50 штамма 1840/36/2015.Table 23 shows the results of a study of the effectiveness of prophylaxis with various doses of CL-55 for 3 days — animal survival by days after infection with a dose of 1.15 × 10 6 CFU / mouse (LD 50 ) strain 1840/36/2015 exoU + (data for 2 repetitions, in each group of 6 animals). The data obtained show the prophylactic efficacy of oral administration of CL-55 for 3 days at doses of 150 and 100 mg / kg in relation to the survival of animals infected with a dose of LD 50 strain 1840/36/2015.
Дизайн эксперимента с штаммом exoU+ Design experiment with exoU + strain
Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.Groups of 6 mice each were formed.
1 группа - контроль инфекции при заражении дозой 2,25×106 КОЕ/мышь (ЛД75) штаммом 1840/36/2015Group 1 - infection control during infection with a dose of 2.25 × 10 6 CFU / mouse (LD 75 ) strain 1840/36/2015
2 группа - профилактика CL-55 дозой 150 мг/кг 3 суток + заражениеGroup 2 - prevention of CL-55 dose of 150 mg / kg 3 days + infection
3 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг 3 суток + заражениеGroup 3 - prevention of CL-55 with a dose of 100 mg / kg 3 days + infection
Эффективность профилактического действия CL-55 оценивали в острой септической модели по динамике гибели животных в течение 4 дней после заражения.The effectiveness of the preventive action of CL-55 was evaluated in an acute septic model according to the dynamics of animal death within 4 days after infection.
В таблице 24 приведены результаты исследования эффективности профилактики дозами CL-55 150 и 100 мг/кг в течение 3 суток с последующим заражением мышей дозой 2,25×106 КОЕ/мышь (ЛД75) штамма 1840/36/2015 exoU+ - выживаемость животных по дням после заражения (данные для 2 повторов, в каждой группе 6 животных). Полученные данные показали, что при заражении дозой ЛД75 штамма 1840/36/2015 exoU+ выживаемость животных после профилактического введения CL-55 в течение 3-х суток в дозах 150 и 100 мг/кг была также достоверно выше.Table 24 shows the results of a study of the effectiveness of prophylaxis with doses of CL-55 of 150 and 100 mg / kg for 3 days, followed by infection of mice with a dose of 2.25 × 10 6 CFU / mouse (LD 75 ) of strain 1840/36/2015 exoU + - animal survival days after infection (data for 2 repetitions, in each group of 6 animals). The data obtained showed that when infected with a dose of LD 75 of strain 1840/36/2015 exoU +, the survival of animals after prophylactic administration of CL-55 for 3 days at doses of 150 and 100 mg / kg was also significantly higher.
Для того, чтобы оценить подавление пседомонадной инфекции в органах зараженных мышей после профилактического введения CL-55, был поставлен следующий эксперимент.In order to evaluate the inhibition of pseudomonas infection in the organs of infected mice after prophylactic administration of CL-55, the following experiment was performed.
Дизайн эксперимента с штаммом exoU+ Design experiment with exoU + strain
Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.Groups of 6 mice each were formed.
1 группа - контроль инфекции при заражении дозой ЛД50 (1,15×106 КОЕ/мышь)Group 1 - infection control during infection with a dose of LD 50 (1.15 × 10 6 CFU / mouse)
2 группа - профилактика CL-55 дозой 150 мг/кг в течение 3 суток до зараженияGroup 2 - prevention of CL-55 with a dose of 150 mg / kg for 3 days before infection
3 группа - контроль инфекции при заражении дозой ЛД75 (2,25×106 КОЕ/мышь)Group 3 - infection control during infection with a dose of LD 75 (2.25 × 10 6 CFU / mouse)
4 группа - профилактика CL-55 дозой 150 мг/кг в течение 3 суток до зараженияGroup 4 - prevention of CL-55 with a dose of 150 mg / kg for 3 days before infection
Мышей заражали дозами ЛД50 (1,15×106 КОЕ/мышь) и ЛД75 (2,25×106 КОЕ/мышь) штамма 1840/36/2015 exoU+ после окончания профилактики CL-55. Через 72 ч. после заражения проводили вскрытие выживших мышей и определяли количество бактерий в селезенке. В таблице 25 приведены полученные результаты по определению среднего количества псевдомонад в высевах из селезенок мышей, зараженных дозами ЛД50 (1,15×106 КОЕ/мышь) и ЛД75 (2,25×106 КОЕ/мышь) штамма 1840/36/2015 exoU+ после профилактического введения CL-55 в дозе 150 мг/кг за 72 часа до заражения.Mice were infected with doses of LD 50 (1.15 × 10 6 CFU / mouse) and LD 75 (2.25 × 10 6 CFU / mouse) of strain 1840/36/2015 exoU + after completion of CL-55 prophylaxis. 72 hours after infection, the surviving mice were autopsied and the number of bacteria in the spleen was determined. Table 25 summarizes the results obtained by determining the average number of pseudomonas in seeding from spleens of mice infected with doses of LD 50 (1.15 × 10 6 CFU / mouse) and LD 75 (2.25 × 10 6 CFU / mouse) strain 1840/36 / 2015 exoU + after prophylactic administration of CL-55 at a dose of 150 mg / kg 72 hours before infection.
Таким образом, профилактическое применение CL-55 в дозе 150 мг/кг оказывает выраженное антибактериальное действие и приводит к практически полному снижению количества псевдомонад в селезенках при заражении мышей клиническими штаммами с exoS+ и exoU+ генотипами вне зависимости от приобретенной резистентности.Thus, the prophylactic use of CL-55 at a dose of 150 mg / kg has a pronounced antibacterial effect and leads to an almost complete decrease in the number of pseudomonads in the spleen when mice are infected with clinical strains with exoS + and exoU + genotypes, regardless of acquired resistance.
ЗаключениеConclusion
В представленных примерах было экспериментально продемонстрировано, что полученное низкомолекулярное соединение, 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид, является ингибитором ССТТ Pseudomonas aeruginosa. Полученное соединение специфически ингибирует секрецию токсинов - эффекторов системы секреции III типа псевдомонад, вызывающих гибель эукариотических клеток. Блокирование in vitro системы секреции III типа Pseudomonas aeruginosa было показано для клинических штаммов с различными генотипами по генам эффекторных белков ССТТ и различным профилем антибиотикорезистентности.In the examples presented, it was experimentally demonstrated that the obtained low molecular weight compound, 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] -thiadiazin-2- (2 , 4-difluorophenyl) -carboxamide, is an inhibitor of the CTST Pseudomonas aeruginosa. The resulting compound specifically inhibits the secretion of toxins - effectors of the secretion system of type III pseudomonads, causing the death of eukaryotic cells. Blocking the in vitro secretion system of type III Pseudomonas aeruginosa has been shown for clinical strains with different genotypes for the genes for effector proteins of CTST and a different antibiotic resistance profile.
Низкомолекулярный ингибитор ССТТ псевдомонад вызывал подавление развития инфекции на моделях лабораторных животных при использовании как терапевтической, так и профилактической схемы введения препарата. Действие препарата выражалось в значительном увеличении выживаемости животных и подавлению накопления псевдомонад в органах при септической инфекции у мышей. Терапевтическая и профилактическая эффективность 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида была установлена на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов. Таким образом, техническая задача, поставленная в данном изобретении, достигнута.A low molecular weight inhibitor of CTST pseudomonas caused a suppression of the development of infection in laboratory animal models using both a therapeutic and a prophylactic regimen for drug administration. The action of the drug was expressed in a significant increase in animal survival and inhibition of the accumulation of pseudomonads in organs during septic infection in mice. The therapeutic and prophylactic efficacy of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) carboxamide was established on a model of experimental infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa of two different CTST genotypes. Thus, the technical task set in this invention is achieved.
Кроме того, проведенные исследования по изучению токсичности 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на животных показали, что соединение является малотоксичным и может быть рекомендовано для дальнейших доклинических и клинических испытаний. По результатам проведенного исследования также можно сделать вывод о том, что изучаемый ингибитор ССТТ 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид (CL-55), в соответствии с механизмом его действия, не обладает бактерицидным действием на кишечную микрофлору животных. Отсутствие негативного влияния на состав кишечной микрофлоры ингибитора ССТТ, перспективного для лечения антибиотикорезистентных госпитальных штаммов синегнойной палочки, является его принципиальным преимуществом перед используемыми антибиотиками.In addition, toxicity studies of 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4-difluorophenyl) ) -carboxamide in animals has shown that the compound is low toxic and can be recommended for further preclinical and clinical trials. According to the results of the study, it can also be concluded that the studied CTBT inhibitor 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] -thiadiazin-2 - (2,4-difluorophenyl) -carboxamide (CL-55), in accordance with its mechanism of action, does not have a bactericidal effect on the intestinal microflora of animals. The absence of a negative effect on the composition of the intestinal microflora of the CCTT inhibitor, which is promising for the treatment of antibiotic-resistant hospital strains of Pseudomonas aeruginosa, is its principal advantage over the antibiotics used.
Таким образом, поставленная задача, а именно:Thus, the task, namely:
подавление инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa с различным генотипом по генам эффекторных белков ССТТ и различным профилем антибиотикорезистентности.suppression of infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa with different genotypes for the genes for CTST effector proteins and a different antibiotic resistance profile.
- подавление развития инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa у зараженного организма на модели in vivo, вне зависимости от приобретенной антибиотикорезистентности.- suppression of the development of infection caused by Pseudomonas aeruginosa in an infected organism in an in vivo model, regardless of acquired antibiotic resistance.
- отсутствие ингибирующего действия на нормальную микрофлору макроорганизма при применении 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa решена в данном изобретении.- the absence of an inhibitory effect on the normal microflora of the macroorganism when using 4- (3-ethoxy-4-hydroxybenzyl) -5-oxo-5,6-dihydro-4H- [1,3,4] thiadiazin-2- (2,4 -difluorophenyl) -carboxamide to suppress infection caused by antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa is solved in this invention.
Промышленная применимость.Industrial applicability.
Результаты исследований, отраженных в приведенных примерах подтверждают промышленную применимость данного соединения, которое специфически ингибирует секрецию токсинов - эффекторов системы секреции III типа псевдомонад, вызывающих гибель эукариотических клеток.The results of the studies reflected in the examples confirm the industrial applicability of this compound, which specifically inhibits the secretion of toxins - effectors of the pseudomonas type III secretion system, causing the death of eukaryotic cells.
Источники информацииInformation sources
1. Somayeh Moazami Goudarzi, Fereshteh Eftekhar. Multidrug resistance and integron carriage in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in Tehran, Iran. Turkish Journal of Medical Sciences. Turk J Med Sci (2015)45: 789-793/ doi:10.3906/sag-1408-120.1. Somayeh Moazami Goudarzi, Fereshteh Eftekhar. Multidrug resistance and integron carriage in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in Tehran, Iran. Turkish Journal of Medical Sciences. Turk J Med Sci (2015) 45: 789-793 / doi: 10.3906 / sag-1408-120.
2. Burgess DS1, Nathisuwan S. Cefepime, piperacillin/tazobactam, gentamicin, ciprofloxacin, and levofloxacin alone and in combination against Pseudomonas aeruginosa. Diagn Microbiol Infect Dis. 2002 Sep; 44(1):35-41.2. Burgess DS1, Nathisuwan S. Cefepime, piperacillin / tazobactam, gentamicin, ciprofloxacin, and levofloxacin alone and in combination against Pseudomonas aeruginosa. Diagn Microbiol Infect Dis. 2002 Sep; 44 (1): 35-41.
3. Bodey GP, Jadeja L, Elting L. Pseudomonas bacteremia. Retrospective analysis of 410 episodes. 1985Arch. Intern. Med. 145:1621-1629].3. Bodey GP, Jadeja L, Elting L. Pseudomonas bacteremia. Retrospective analysis of 410 episodes. 1985Arch. Intern. Med. 145: 1621-1629].
4. Hilf M, et al. Antibiotic therapy for Pseudomonas aeruginosa bacteremia: outcome correlations in a prospective study of 200 patients. 1989. Am. J. Med. 87:540-546.4. Hilf M, et al. Antibiotic therapy for Pseudomonas aeruginosa bacteremia: outcome correlations in a prospective study of 200 patients. 1989. Am. J. Med. 87: 540-546.
5. Leibovici L, et al.. Monotherapy versus beta-lactamaminoglycoside combination treatment for gram-negative bacteremia: a prospective, observational study. 1997, Antimicrob. Agents Chemother. 41: 1127-1133.5. Leibovici L, et al .. Monotherapy versus beta-lactamaminoglycoside combination treatment for gram-negative bacteremia: a prospective, observational study. 1997, Antimicrob. Agents Chemother. 41: 1127-1133.
6. Siegman-lgra Y, Ravona R, Primerman H, Giladi M.. Pseudomonas aeruginosa bacteremia: an analysis of 123 episodes, with particular emphasis on the effect of antibiotic therapy. 1998,Int. J. Infect. Dis. 2:211-215.6. Siegman-lgra Y, Ravona R, Primerman H, Giladi M. .. Pseudomonas aeruginosa bacteremia: an analysis of 123 episodes, with particular emphasis on the effect of antibiotic therapy. 1998, Int. J. Infect. Dis. 2: 211-215.
Claims (2)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016139657A RU2624846C1 (en) | 2016-10-10 | 2016-10-10 | Application of 4-(3-ethoxy-4-hydroxybenzyl)-5-oxo-5,6-dihydro-4h-[1,3,4]-thiadiazine-2-(2,4-difluorophenyl)-carboxamide to suppress infection, caused by antibiotic-resistant pseudomonas aeruginosa strains, and method of suppression of this infection |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016139657A RU2624846C1 (en) | 2016-10-10 | 2016-10-10 | Application of 4-(3-ethoxy-4-hydroxybenzyl)-5-oxo-5,6-dihydro-4h-[1,3,4]-thiadiazine-2-(2,4-difluorophenyl)-carboxamide to suppress infection, caused by antibiotic-resistant pseudomonas aeruginosa strains, and method of suppression of this infection |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2624846C1 true RU2624846C1 (en) | 2017-07-07 |
Family
ID=59312552
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016139657A RU2624846C1 (en) | 2016-10-10 | 2016-10-10 | Application of 4-(3-ethoxy-4-hydroxybenzyl)-5-oxo-5,6-dihydro-4h-[1,3,4]-thiadiazine-2-(2,4-difluorophenyl)-carboxamide to suppress infection, caused by antibiotic-resistant pseudomonas aeruginosa strains, and method of suppression of this infection |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2624846C1 (en) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2737087C1 (en) * | 2020-03-20 | 2020-11-24 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Pharmaceutical composition of 4-(3-ethoxy-4-hydroxybenzyl)-5-oxo-5,6-dihydro-4h-[1,3,4]-thiadiazin-2-(2,4-difluorophenyl) carboxamide in crystalline form , and use thereof as antibacterial agent for treating acute, recurrent and chronic infections |
RU2743927C1 (en) * | 2020-07-10 | 2021-03-01 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | SOLID DISPERSION of 4- (3-ETHOXY-4-HYDROXIBENZIL) -5-OXO-5,6-DIHYDRO-4H- [1,3,4] -THIADIAZINE-2- (2,4-DIFLUOROPHENYL) -CARBOXAMIDE FOR PRODUCING PHARMACEUTICAL FORMULATION AND METHOD OF TREATMENT OF CHRONIC INFECTIOUS DISEASES |
RU2785195C1 (en) * | 2022-10-06 | 2022-12-05 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for production of polymorphous form of 4-(3-ethoxy-4-hydroxybenzyl)-n-(2,4-difluorphenyl)-5-oxo-5,6-dihydro-4h-1,3,4-thiadizine-2-carboxamide |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1577055A (en) * | 1976-05-03 | 1980-10-15 | Celamerck Gmbh & Co Kg | 1,2,6-thiadiazin-4-one derivatives |
US4626536A (en) * | 1983-10-20 | 1986-12-02 | Ed Geistlich Sohne Ag Fur Chemische/Industrie | Compositions for combatting toxaemia |
RU2447066C2 (en) * | 2010-04-15 | 2012-04-10 | Александр Леонидович Гинцбург | Pathogenic bacteria-inhibiting biologically active substances and method of inhibiting pathogenic bacteria type iii secretion |
-
2016
- 2016-10-10 RU RU2016139657A patent/RU2624846C1/en active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1577055A (en) * | 1976-05-03 | 1980-10-15 | Celamerck Gmbh & Co Kg | 1,2,6-thiadiazin-4-one derivatives |
US4626536A (en) * | 1983-10-20 | 1986-12-02 | Ed Geistlich Sohne Ag Fur Chemische/Industrie | Compositions for combatting toxaemia |
RU2447066C2 (en) * | 2010-04-15 | 2012-04-10 | Александр Леонидович Гинцбург | Pathogenic bacteria-inhibiting biologically active substances and method of inhibiting pathogenic bacteria type iii secretion |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ANANTHARAJAH A. et al. Inhibition of the injectisome and flagellar type III secretion systems by INP1855 impairs Pseudomonas aeruginosa pathogenicity and inflammasome activation. J.Infect.Dis. 2016 Oct.1; 214(7): 1105-16 [он лайн] [найдено 22.05.2017] (найдено из интернет: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27412581). * |
СЭНФОРД Дж. и др. Антимикробная терапия. М., Практика, 1996, с.77 табл.4А - с.80 табл.4Б. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2737087C1 (en) * | 2020-03-20 | 2020-11-24 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Pharmaceutical composition of 4-(3-ethoxy-4-hydroxybenzyl)-5-oxo-5,6-dihydro-4h-[1,3,4]-thiadiazin-2-(2,4-difluorophenyl) carboxamide in crystalline form , and use thereof as antibacterial agent for treating acute, recurrent and chronic infections |
RU2743927C1 (en) * | 2020-07-10 | 2021-03-01 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | SOLID DISPERSION of 4- (3-ETHOXY-4-HYDROXIBENZIL) -5-OXO-5,6-DIHYDRO-4H- [1,3,4] -THIADIAZINE-2- (2,4-DIFLUOROPHENYL) -CARBOXAMIDE FOR PRODUCING PHARMACEUTICAL FORMULATION AND METHOD OF TREATMENT OF CHRONIC INFECTIOUS DISEASES |
RU2785195C1 (en) * | 2022-10-06 | 2022-12-05 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for production of polymorphous form of 4-(3-ethoxy-4-hydroxybenzyl)-n-(2,4-difluorphenyl)-5-oxo-5,6-dihydro-4h-1,3,4-thiadizine-2-carboxamide |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Malo et al. | Intestinal alkaline phosphatase promotes gut bacterial growth by reducing the concentration of luminal nucleotide triphosphates | |
US20190099459A1 (en) | Methods and compositions for preventing infection by a Vibrio species | |
JP5132865B2 (en) | Treatment of Helicobacter with isothiocyanate | |
BR112012004945B1 (en) | composition for the prevention or treatment of infectious diseases, pet food or drinking water, sanitizing and cleaning product | |
Gao et al. | Ability of Clostridium butyricum to inhibit Escherichia coli-induced apoptosis in chicken embryo intestinal cells | |
RU2624846C1 (en) | Application of 4-(3-ethoxy-4-hydroxybenzyl)-5-oxo-5,6-dihydro-4h-[1,3,4]-thiadiazine-2-(2,4-difluorophenyl)-carboxamide to suppress infection, caused by antibiotic-resistant pseudomonas aeruginosa strains, and method of suppression of this infection | |
Lv et al. | Myricetin inhibits the type III secretion system of Salmonella enterica serovar typhimurium by downregulating the Salmonella pathogenic island I gene regulatory pathway | |
Seleem et al. | Could the analgesic drugs, paracetamol and indomethacin, function as quorum sensing inhibitors? | |
Abirami et al. | Pyrogallol downregulates the expression of virulence-associated proteins in Acinetobacter baumannii and showing anti-infection activity by improving non-specific immune response in zebrafish model | |
Bhuvaneswari et al. | Antibacterial activity of spirulina (Arthospira platensis geitler) against bacterial pathogens in Aquaculture | |
US20220389392A1 (en) | Crispr cas systems and lysogeny modules | |
Harjai et al. | Contribution of Tamm–Horsfall protein to virulence of Pseudomonas aeruginosa in urinary tract infection | |
Byun et al. | In vivo effects of s-pantoprazole, polaprenzinc, and probiotic blend on chronic small intestinal injury induced by indomethacin | |
JP2006180836A (en) | Lactic acid bacterium controlling infection with food poisoning bacterium, fermentation product, food and medicine composition containing the same | |
KR101333339B1 (en) | Composition for Inhibiting Biofilm and Methods therefor | |
JPWO2018051895A1 (en) | Composition for preventing or improving deterioration of skin condition caused by abnormal growth of specific bacteria in skin, comprising lactic acid bacteria as an active ingredient | |
RU2405821C1 (en) | 'pashkov' bacillus pumilus bacteria strain producer of biologically active substances exhibiting antagonistic activity on opportunistic, pathogenic bacteria, yeast fungi and viruses | |
KR20180113446A (en) | Antimicrobial detergent composition comprising an obovatol compound or extract from magnolia family as an active agent | |
Islam et al. | Determination of optimum survivability factors of highly pathogenic Vibrio cholerae 01 serogroup specific bacteriophage JSF4ϕ | |
KR102208837B1 (en) | Composition for inhibiting adhesion, invasion of bacteria or antibacterial resistance comprising methyl gallate and fluoroquinolone antibacterial agent | |
RU2675110C1 (en) | PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF INTESTINAL MUCOSA INFLAMMATORY DISEASES ON THE BASIS OF LACTOBACILLUS BREVIS 47f STRAIN, MANIFESTING A LOCAL ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY | |
RU2677220C1 (en) | Method treatment of broiler chickens with associative intestinal infection | |
Safarpour-Dehkordi et al. | A comprehensive investigation of the medicinal efficacy of antimicrobial fusion peptides expressed in probiotic bacteria for the treatment of pan drug-resistant (PDR) infections | |
Chowdhury | In vitro Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of Antibiotics Standard Powder Against Different Clinically Isolated pathogenic bacteria & Resistance pattern | |
Hao et al. | CATH-2-derived antimicrobial peptide inhibits multidrug-resistant Escherichia coli infection in chickens |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner |