RU2617534C1

RU2617534C1 - Method for oxyhemoglobin reduction assessment in case of inducing effect of cmv infection on red blood cells hemoglobin structure, leading to heinz's bodies formation

Info

Publication number: RU2617534C1
Application number: RU2015151654A
Authority: RU
Inventors: Михаил Тимофеевич Луценко; Ирина Анатольевна Андриевская
Priority date: 2015-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2017-04-25

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: method for hemolytic anemia development determination for pregnant women in the third trimester of gestation in case of chronic cytomegalovirus infection exacerbation includes determination of the cytomegalovirus antibody titer in the peripheral blood, Heinz's bodies determination in erythrocytes, glutathione reductase and oxyhemoglobin content determination, and with an increase in the cytomegalovirus antibody titer to 1:1600, reduction in glutathione reductase erythrocytes to 3.95±0.06 U/gHb, Heinz's bodies presence in erythrocytes of 2 to 5 per each erythrocyte and oxyhemoglobin reduction to 84.0±2.9%, hemolytic anemia is developed in a pregnant woman.

EFFECT: method can effectively detect hemolytic anemia development in pregnant women in the third trimester of gestation at chronic cytomegalovirus infection exacerbation.

1 dwg

Description

1. Цель изобретения - изучить механизм индуцирующего действия цитомегаловирусной инфекции на гемоглобин эритроцитов, приводящий к формированию телец Гейнца и снижению оксигемоглобина.1. The purpose of the invention is to study the mechanism of the inducing effect of cytomegalovirus infection on hemoglobin of red blood cells, leading to the formation of Heinz bodies and a decrease in oxyhemoglobin.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке метода, позволяющего выявить в эритроцитах периферической крови при обострении цитомегаловирусной инфекции телец Гейнца, приводящих к снижению содержания оксигемоглобина.2. The invention relates to medicine, namely to the development of a method to detect peripheral blood in red blood cells during exacerbation of cytomegalovirus infection of Heinz bodies, leading to a decrease in the content of oxyhemoglobin.

3. Раскрытие изобретения3. Disclosure of invention

Тельца Гейнца впервые описаны автором в 1890 [5], представляют округлые глыбкообразные структурные элементы в эритроцитах, расположенные обычно на их периферии. Образование телец Гейнца связано с глубокими дегенеративными изменениями в эритроцитах, в основном связанными с повреждением молекул гема [8]. При появлении телец Гейнца наблюдается подавление оксигенации гемоглобина и увеличивается содержание метгемоглобина. Обнаруживаются тельца Гейнца при воздействии на гемоглобин факторов, приводящих к метгемоглобинобразованию. Исчезновение этих телец вместе с эритроцитами происходит через несколько дней после прекращения токсического воздействия на эритроциты. Таким образом, в основе образования телец Гейнца лежит окисление тиоловых групп глобина и переход гемоглобина в метгемоглобин, которое происходит в связи с окислением Fe²⁺ в Fe³⁺. Процесс окисления зависит от наличия в эритроците восстановленного глютатиона (Г-SH).Heinz bodies were first described by the author in 1890 [5]; they represent rounded, block-like structural elements in red blood cells, usually located on their periphery. The formation of Heinz bodies is associated with deep degenerative changes in red blood cells, mainly associated with damage to heme molecules [8]. When Heinz bodies appear, suppression of hemoglobin oxygenation is observed and the content of methemoglobin increases. Heinz bodies are detected when hemoglobin is exposed to factors leading to methemoglobin formation. The disappearance of these bodies together with red blood cells occurs several days after the termination of toxic effects on red blood cells. Thus, the formation of Heinz bodies is based on the oxidation of thiol groups of globin and the transition of hemoglobin to methemoglobin, which occurs in connection with the oxidation of Fe ²⁺ to Fe ³⁺ . The oxidation process depends on the presence of reduced glutathione (G-SH) in the red blood cell.

Восстановленный глютатион защищает [1] тиоловые группы глобина и препятствует инактивации тиоловых ферментов и сульфгидрильных групп в мембранах эритроцитов.Reduced glutathione protects [1] the thiol groups of globin and inhibits the inactivation of thiol enzymes and sulfhydryl groups in erythrocyte membranes.

4. Новая техническая задача - найти новый метод оценки появления телец Гейнца как свидетеля нарушения оксигенации гемоглобина при обострении в организме хронической цитомегаловирусной инфекции, приводящей к снижению оксигенации гемоглобина.4. A new technical task is to find a new method for assessing the appearance of Heinz bodies as a witness to hemoglobin oxygenation disorders during exacerbation of chronic cytomegalovirus infection in the body, leading to a decrease in hemoglobin oxygenation.

5. Основной причиной формирования телец Гейнца в эритроцитах периферической крови многие авторы [3, 4, 6, 7, 9] считали происходит вследствие токсического воздействия на эритроцитарный гемоглобин N-нитропроизводных элементов, которые и вызывали метгемоглобинобразование при коагуляции гемоглобина. Однако изучая это явление, мы обнаружили, что белки gp64 цитомегаловируса, вступая в контакт с гликофорином мембран эритроцитов, приводят к дезорганизации белково-липидный слой мембран эритроцитов, снижают содержание в них активность SH-групп и стимулируют выработку перекисей жирных кислот, которые являются сильным токсичным фактором, разобщающим глобин от гема, одновременно подавляя активность глютатионредуктазы [1]. В результате на время высокого содержания в крови антигенов ЦМВ в эритроцитах происходит денатурация гемоглобина и появляется большое количество телец Гейнца, которые являются свидетелями снижения оксигенации гемоглобина.5. Many authors [3, 4, 6, 7, 9] believed that the main reason for the formation of Heinz bodies in peripheral blood erythrocytes is due to the toxic effect of N-nitro derivatives on the erythrocyte hemoglobin, which caused methemoglobin formation during hemoglobin coagulation. However, studying this phenomenon, we found that the cytomegalovirus gp64 proteins, coming into contact with glycophorin of erythrocyte membranes, disorganize the protein-lipid layer of erythrocyte membranes, reduce the activity of SH-groups in them and stimulate the production of fatty acid peroxides, which are highly toxic a factor that separates globin from heme, while inhibiting glutathione reductase activity [1]. As a result, hemoglobin denaturation occurs during erythrocytes during the high content of CMV antigens in the blood and a large number of Heinz bodies appear, which are evidence of a decrease in hemoglobin oxygenation.

6. Осуществление изобретения6. The implementation of the invention

6.1. Обследовано 5 беременных на третьем триместре гестации при обострении хронической цитомегаловирусной инфекции на 25-26 неделях гестации. Отмечалось тяжелое течение беременности в связи с диагностированием у них высоковыраженной анемии. Количество оксигемоглобина в периферической крови колебалось от 84 до 86%. В периферической крови на мазках, окрашенных метиленовым фиолетовым, обнаружены крупных размеров тельца Гейнца.6.1. Five pregnant women in the third trimester of gestation were examined with exacerbation of chronic cytomegalovirus infection at 25-26 weeks of gestation. A severe course of pregnancy was noted in connection with the diagnosis of highly pronounced anemia in them. The amount of oxyhemoglobin in peripheral blood ranged from 84 to 86%. In peripheral blood smears stained with methylene violet revealed large sizes of the Heinz body.

6.2. Диагноз обострения хронической цитомегаловирусной инфекции устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM к ЦМВ или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65%, а также наличия ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекс авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (США) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).6.2. The diagnosis of exacerbation of chronic cytomegalovirus infection was established by a comprehensive study of peripheral blood for the presence of CMV IgM or a fourfold or more increase in the titer of IgG antibodies in paired sera over time after 10 days, avidity index more than 65%, and the presence of CMV DNA. The studies were carried out taking into account the requirements of the Helsinki Declaration of the World Medical Association “Ethical Principles for Conducting Research with a Person”, as amended in 2008 and the rules of clinical practice in the Russian Federation, approved by Order of the Ministry of the Russian Federation No. 266 of 06/19/2003. Verification of CMV, determination of type-specific antibodies , the avidity index was carried out by ELISA on a Stat-Fax-2100 spectrophotometer (USA) using Vector-Best CJSC test systems (Novosibirsk), by PCR using a DT-96 apparatus using a set NGO "DNA Technology" (Moscow).

6.3. Глутатионредуктаза определялась спектрофотометрически с помощью наборов реагентов «Sentinel Diagnostics» на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (США).6.3. Glutathione reductase was determined spectrophotometrically using Sentinel Diagnostics reagent kits on a Stat-Fax-2100 spectrophotometer (USA).

6.4. Содержание оксигемоглобина определяли по методу Эвелина и Мэллой [2].6.4. The content of oxyhemoglobin was determined by the method of Evelin and Malloy [2].

6.5. Выявление телец Гейнца осуществляли следующим образом:6.5. The identification of Heinz bodies was carried out as follows:

1 г метилового фиолетового растворяют в 100 мл 0,6% раствора натрия хлорида. На предметное стекло наносят каплю этого раствора и в нее вносят каплю свежевзятой крови из пальца. Накрывают эту смесь покровным стеклом и в закрытой чашке Петри содержат 1-2 часа при комнатной температуре. Края покровного стекла, чтобы не происходило испарения красителя, окантовывали расплавленным парафином. Через 2 часа препарат изучали под цифровым микроскопом и документировали содержание в эритроцитах телец Гейнца (фигура 1).1 g of methyl violet is dissolved in 100 ml of a 0.6% sodium chloride solution. A drop of this solution is applied to a glass slide and a drop of freshly drawn blood from a finger is introduced into it. Cover this mixture with coverslip and contain in a closed Petri dish for 1-2 hours at room temperature. The edges of the coverslip, so that the dye does not evaporate, were edged with molten paraffin. After 2 hours, the drug was studied under a digital microscope and the content of Heinz bodies in red blood cells was documented (Figure 1).

7. Полученные данные7. Received data

У беременных с выявленным обострением хронической цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации при выявлении признаков тяжелой анемии с уровнем оксигемоглобина 84-86% забирали кровь для определения в эритроцитах глутатионредуктазы и отмечали, что ее количество резко у этих беременных снижалось - до 3,95±0,06 Ед/гНb (контроль - 8,20±0,09 Ед/гНb). В окрашенных метиловым фиолетовым эритроцитах содержалось от 2 до 5 телец Гейнца (фигура 1). В норме, если они встречаются, их количество бывает не более 1-2 на один эритроцит. Однако это практически бывает очень редко. Следовательно, обострение ЦМВИ с высоким титром антител может привести к подавлению активности глутатионредуктазы до 3,95 Ед/гНb, на фоне чего происходит денатурация гемоглобина и формирование телец Гейнца, создавая снижение оксигенации гемоглобина до 84,0±2,9%, что приводит к формированию гемолитической анемии на фоне титра антител IgG к цитомегаловирусу 1:1600.In pregnant women with an exacerbation of chronic cytomegalovirus infection in the third trimester of gestation, when signs of severe anemia with an oxyhemoglobin level of 84-86% were detected, blood was taken to determine glutathione reductase in erythrocytes and it was noted that its number decreased sharply in these pregnant women - to 3.95 ± 0. 06 U / gNb (control - 8.20 ± 0.09 U / gNb). Stained with methyl violet erythrocytes contained from 2 to 5 Heinz bodies (Figure 1). Normally, if they occur, their number is no more than 1-2 per red blood cell. However, this is practically very rare. Consequently, exacerbation of CMVI with a high titer of antibodies can suppress glutathione reductase activity to 3.95 U / gHb, against which hemoglobin denaturation and the formation of Heinz bodies occur, creating a decrease in hemoglobin oxygenation to 84.0 ± 2.9%, which leads to the formation of hemolytic anemia against a titer of IgG antibodies to cytomegalovirus 1: 1600.

ЛитератураLiterature

1. Луценко М.Т., Андриевская И.Α., Кутепова О.Л. Морфофункциональная характеристика глутатионового цикла эритроцитов периферической крови беременных, перенесших в период гестации обострение цитомегаловирусной инфекции // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014. Т. 157, №2. С. 246-250.1. Lutsenko M.T., Andrievskaya I.Α., Kutepova O.L. Morphofunctional characteristic of the glutathione cycle of peripheral blood erythrocytes of pregnant women who suffered an exacerbation of cytomegalovirus infection during the gestation period // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014.Vol. 157, No. 2. S. 246-250.

2. Покровский А.А. Биохимические методы исследования. М.: Медицина. 1969. 337 с. 2. Pokrovsky A.A. Biochemical research methods. M .: Medicine. 1969.333 s.

3. Шиффман Ф.Д. Патофизиология крови. Пер. с англ. М.: СПб изд. Бином - «Невский Диалект». 2000 г. 3. Shiffman F. D. Pathophysiology of blood. Per. from English M .: St. Petersburg ed. Binom - "Nevsky Dialect." 2000 year

4. Han Т.Н., Qamirani Ε., Nelson A.G., Kuo L. Regulation of nitric oxid consumption by hypoxic red blood cells. Proc. Nate. Acad. USA. 2003. Vol.100. P. 12504-12509.4. Han T.N., Qamirani Ε., Nelson A.G., Kuo L. Regulation of nitric oxid consumption by hypoxic red blood cells. Proc. Nate. Acad. USA 2003. Vol. 100. P. 12504-12509.

5. Heinz R. Morphologische Verunderungen des rotten Blutkurperchen durch Giffe. Virchow's Archiv fur pathalogische Anatomie and Physiologie and fur klinische Medizin. Berlin. 1890. Vol.122. S. 112-116.5. Heinz R. Morphologische Verunderungen des rotten Blutkurperchen durch Giffe. Virchow's Archiv fur pathalogische Anatomie and Physiologie and fur klinische Medizin. Berlin 1890. Vol. 122. S. 112-116.

6. Lukens J.N. Unstable Hemoglobin Disease Wintrobe's clinical Hematology Edit J.P. Greer, J. Foereter 11^th edition 2004. P. 1313-1318.6. Lukens JN Unstable Hemoglobin Disease Wintrobe's clinical Hematology Edit JP Greer, J. Foereter 11 ^th edition 2004. P. 1313-1318.

7. Pearson W., Bocmans H., Bettqer W., Mc Bride B.W. Accociation of maximum voluntary dietary intake of freeze-dried garlic with Heinz body anemia in horses // Amer. J. Vet. Res. 2005. Vol.66, №3. P. 457-465.7. Pearson W., Bocmans H., Bettqer W., Mc Bride B.W. Accociation of maximum voluntary dietary intake of freeze-dried garlic with Heinz body anemia in horses // Amer. J. Vet. Res. 2005. Vol.66, No. 3. P. 457-465.

8. Scott J., Haut Α., Cartwright G., Wintrobe M. Congenital hemolytic disease associated with red cell inclusion bodies, abnormal pigment metabolism and an electrophoretic hemoglobin abnormality // Blood. 1960. Vol.16. P. 1239-1252.8. Scott J., Haut Α., Cartwright G., Wintrobe M. Congenital hemolytic disease associated with red cell inclusion bodies, abnormal pigment metabolism and an electrophoretic hemoglobin abnormality // Blood. 1960. Vol. 16. P. 1239-1252.

9. Vaugh M.W., Huang K., Kuo L., Liao J.C. Erythrocyte consumption of nitric oxide: Competition and model analysis. Nitric Oxide-Biol. Ch. 2001. Vol.5. P. 18-31.9. Vaugh M.W., Huang K., Kuo L., Liao J.C. Erythrocyte consumption of nitric oxide: Competition and model analysis. Nitric Oxide-Biol. Ch. 2001. Vol. 5. P. 18-31.

Claims

A method for determining the formation of hemolytic anemia in pregnant women in the third trimester of gestation during exacerbation of chronic cytomegalovirus infection, which includes determining the titer of antibodies to cytomegalovirus in peripheral blood, determining Heinz bodies in red blood cells, determining the content of glutathione reductase and oxyhemoglobin, and increasing the titer of antibodies to cytomegal 1: 1600, a decrease in glutathione reductase in red blood cells to 3.95 ± 0.06 U / gHb, appearance of Heinz bodies in red blood cells from 2 to 5 for each red blood cell, and a decrease in hydroxy emoglobina to 84.0 ± 2.9% is generated in a pregnant hemolytic anemia.