RU2617059C2 - Method for production of amphiphilic block copolymers n, n-dimethylaminoethyl methacrylate for nucleic acid delivery to living cells - Google Patents
Method for production of amphiphilic block copolymers n, n-dimethylaminoethyl methacrylate for nucleic acid delivery to living cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2617059C2 RU2617059C2 RU2014145246A RU2014145246A RU2617059C2 RU 2617059 C2 RU2617059 C2 RU 2617059C2 RU 2014145246 A RU2014145246 A RU 2014145246A RU 2014145246 A RU2014145246 A RU 2014145246A RU 2617059 C2 RU2617059 C2 RU 2617059C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- block
- poly
- dimethylaminoethyl methacrylate
- glycol acrylate
- chain transfer
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F2/00—Processes of polymerisation
- C08F2/38—Polymerisation using regulators, e.g. chain terminating agents, e.g. telomerisation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F10/00—Homopolymers and copolymers of unsaturated aliphatic hydrocarbons having only one carbon-to-carbon double bond
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F293/00—Macromolecular compounds obtained by polymerisation on to a macromolecule having groups capable of inducing the formation of new polymer chains bound exclusively at one or both ends of the starting macromolecule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Graft Or Block Polymers (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, молекулярной биологии и медицины и может быть использовано для генной терапиинаследственных, онкологическихи инфекционных заболеваний. Использование этого изобретения возможно для лечения вирусных заболеваний, для которых разработаны вирусоспецифические антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, ДНКзимы или миРНК, способные эффективно подавлять репродукцию вирусов. Изобретение может быть также использовано для доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки invitro для получения трансгенных эукариотических линий.The invention relates to the field of chemistry of macromolecular compounds, molecular biology and medicine and can be used for gene therapy of hereditary, oncological and infectious diseases. The use of this invention is possible for the treatment of viral diseases for which virus-specific antisense oligonucleotides, ribozymes, DNAzymes or siRNAs have been developed that are capable of effectively inhibiting the reproduction of viruses. The invention can also be used to deliver nucleic acids to invitro eukaryotic cells to produce transgenic eukaryotic lines.
Уровень техникиState of the art
Нуклеиновые кислоты, кодирующие различные гены, антисмысловыеолигонуклеотиды, рибозимы, аптамеры и малые интерферирующие РНК могли бы быть идеальными по избирательности действия лекарственными веществами. Однако нуклеиновые кислоты практически не проникают в живые клетки вследствие высокой плотности отрицательного заряда, одноименного по отношению к заряду клеточной мембраны. Поэтому создание носителей, способных обратимо связывать нуклеиновые кислоты, доносить их до клеточной мембраны и высвобождать в цитозоле или ядре, могло бы существенно расширить арсенал лекарственных средств для борьбы с различными заболеваниями как инфекционной, так и метаболической этиологии.Nucleic acids encoding various genes, antisense oligonucleotides, ribozymes, aptamers, and small interfering RNAs could be ideal in the selectivity of action of drug substances. However, nucleic acids practically do not penetrate into living cells due to the high density of the negative charge of the same name with respect to the charge of the cell membrane. Therefore, the creation of carriers capable of reversibly binding nucleic acids, delivering them to the cell membrane and releasing them in the cytosol or nucleus could significantly expand the arsenal of drugs to combat various diseases of both infectious and metabolic etiology.
В последние два десятилетия генной терапии, как методу лечения вирусных инфекций уделяется существенное внимание. Усилия исследователей в данный момент фокусируются на создании эффективного трансфецирующего агента для генной терапии, который компактизует и защитит генетический материал от нуклеаз сыворотки крови и будет способствовать его проникновению в клетки-мишени [1].In the last two decades of gene therapy, as a method of treating viral infections, significant attention has been paid. The efforts of researchers are currently focused on creating an effective transfecting agent for gene therapy, which compacts and protects genetic material from serum nucleases and will facilitate its penetration into target cells [1].
Невирусные носители, такие как катионные липиды, дендримеры и пептиды, все способны компактизовать и связывать нуклеиновые кислоты (НК), способствуя их проникновению в клетки. Однако, в отличие от вирусных аналогов, у которых развиты способы преодолевать клеточные барьеры и механизмы иммунного ответа в организме, невирусные носители НК показывают гораздо меньшую транфецирующую способность, так как они задерживаются многочисленными вне- и внутриклеточными защитными барьерами. Однако биосовместимость и возможность синтеза этих соединений делают их очень привлекательными для использования в генной терапии. В результате, в течение последних десяти лет, многочисленные исследования были посвящены получению катионных соединений, которые могут образовывать комплексы с НК и преодолевать клеточные барьеры [1-2].Non-viral carriers, such as cationic lipids, dendrimers and peptides, are all capable of compacting and binding nucleic acids (NKs), facilitating their penetration into cells. However, unlike viral analogues, which have developed methods to overcome cellular barriers and immune response mechanisms in the body, non-viral NK carriers show much less transfection ability, since they are retained by numerous extra- and intracellular protective barriers. However, the biocompatibility and the possibility of synthesizing these compounds make them very attractive for use in gene therapy. As a result, over the past ten years, numerous studies have been devoted to the production of cationic compounds, which can form complexes with NK and overcome cell barriers [1-2].
Первым барьером, который необходимо преодолеть полиплексу на пути до клетки-мишени, является кровь и внеклеточная среда. Именно поэтому необходимо подобрать такие физико-химические параметры комплекса, чтобы увеличить его стабильность, избежать неспецифических взаимодействий и возможности иммунного ответа. Во-первых, в составе полиплекса ДНК должна быть защищена от действия внеклеточных нуклеаз. Во-вторых, отрицательно заряженные белки сыворотки крови (альбумин, фибриноген, иммуноглобулины и др.), а также белки внеклеточного матрикса (коллагены) способны адсорбироваться на поверхности заряженных полиплексов, что ведет за собой изменение поверхностного заряда полиплексов, приводит к увеличению размера комплексов и к их агрегации.The first barrier to overcome the polyplex on the way to the target cell is blood and extracellular medium. That is why it is necessary to select such physicochemical parameters of the complex in order to increase its stability, avoid non-specific interactions and the possibility of an immune response. First, as part of a polyplex, DNA must be protected from the action of extracellular nucleases. Secondly, negatively charged serum proteins (albumin, fibrinogen, immunoglobulins, etc.), as well as extracellular matrix proteins (collagens) are able to adsorb on the surface of charged polyplexes, which leads to a change in the surface charge of polyplexes, leading to an increase in the size of complexes and to their aggregation.
Следующим этапом доставки генетического материала в клетки-мишени является их взаимодействие с плазматической мембраной и поглощение клеткой. Связывание полиплексов с клетками происходит в результате электростатического взаимодействия с отрицательно заряженной (за счет отрицательно заряженных поверхностных мембранных белков - протеогликанов) плазматической мембраной. В большинстве случаев такие полиплексы поглощаются путем неспецифического эндоцитоза. Для эффективного проникновения через плазматическую мембрану клетки оптимальным значением размера комплекса ДНК-поликатион является 70-90 нм.The next step in the delivery of genetic material to target cells is their interaction with the plasma membrane and cell uptake. The binding of polyplexes to cells occurs as a result of electrostatic interaction with a negatively charged (due to negatively charged surface membrane proteins - proteoglycans) plasma membrane. In most cases, such polyplexes are absorbed by non-specific endocytosis. For effective penetration through the plasma membrane of the cell, the optimal size of the DNA-polycation complex is 70-90 nm.
Одним из самых важных этапов транспортного пути полиплексов является их выход из эндосом. Эндосомы представляют собой везикулы с белково-липидной мембраной, функция которых состоит в транспорте белков в определенные части клетки. За счет работы протонных насосов в них понижается рН (рН 6.5). Дальнейший транспорт может идти либо по пути рециркуляции с выбросом поглощенных молекул во внемембранное пространство, либо по литическому пути, когда происходит дальнейшее закисление среды в поздних эндосомах, и макромолекулы поступают в лизосомы. В лизосомах содержимое закисляется до рН 5, и поглощенные молекулы деградируют под действием гидролитических ферментов, которые активны при низком рН. Продукты деградации удаляются из клетки путем экзоцитоза или переносятся в цитоплазму, где используются как строительный материал [3].One of the most important stages of the transport path of polyplexes is their exit from endosomes. Endosomes are vesicles with a protein-lipid membrane, the function of which is to transport proteins to certain parts of the cell. Due to the operation of proton pumps, the pH in them decreases (pH 6.5). Further transport can follow either the recirculation path with the release of absorbed molecules into the extramembrane space, or the political path, when the medium is further acidified in the late endosomes, and the macromolecules enter the lysosomes. In lysosomes, the contents are acidified to pH 5, and the absorbed molecules are degraded by hydrolytic enzymes that are active at low pH. Degradation products are removed from the cell by exocytosis or transferred to the cytoplasm, where they are used as building material [3].
Выйдя из лизосом, полиплексы оказываются в цитозоле, после чего комплекс диссоциирует на свободный поликатион и ДНК. Считается, что это происходит за счет конкуренции за катионные группы между фосфатными группами ДНК и низкомолекулярньгми соединениями и анионами цитоплазмы. В некоторых случаях диссоциация комплекса происходит, по-видимому, в ядре. Главным барьером на пути плазмидной ДНК в клеточное ядро служит двойная ядерная оболочка. Через ядерный поровой комплекс путем пассивной диффузии могут проходить только маленькие молекулы (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после диссоциации комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет сигнала ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмидной ДНК (не более 0,1-0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1-2 часа после введения. В опухолевых клетках эта проблема решается за счет активной пролиферации: ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная мембрана растворяется.After leaving lysosomes, polyplexes end up in the cytosol, after which the complex dissociates into free polycation and DNA. It is believed that this occurs due to competition for cationic groups between the phosphate groups of DNA and low molecular weight compounds and anions of the cytoplasm. In some cases, the dissociation of the complex occurs, apparently, in the nucleus. The main barrier to plasmid DNA in the cell nucleus is the double nuclear membrane. Only small molecules (<40 kD, ~ 10 nm) can pass through the nuclear pore complex by passive diffusion. Since the free plasmid DNA freed after dissociation of the complex does not have a nuclear localization signal, a very small part of plasmid DNA will pass into the nucleus (not more than 0.1-0.001%). In addition, it was found that about 50% of the injected DNA degrades in the cytosol within 1-2 hours after injection. In tumor cells, this problem is solved by active proliferation: DNA easily penetrates the nuclei of daughter cells during the mitotic cycle, when the nuclear membrane dissolves.
При доставке в клетку малых интерферирующих РНК проблема ядерного транспорта вообще не стоит, т.к. явление РНК-интерференции происходит в цитозоле. Однако в данном случае особенно важно, чтобы олигонуклеотид освободился от полимера-носителя и имел возможность связаться с белками RISC.When small interfering RNA is delivered to the cell, the problem of nuclear transport is not at all worth it, because the phenomenon of RNA interference occurs in the cytosol. However, in this case, it is especially important that the oligonucleotide is freed from the carrier polymer and is able to bind to RISC proteins.
Таким образом, для обеспечения эффективной доставки ДНК в клетки, поликатионы должны обратимо взаимодействовать с ДНК, образуя стабильные положительно заряженные комплексы малого размера при физиологических значениях рН и ионной силы. Эти комплексы должны быть устойчивы к присутствию макромолекулярных компонентов биологических жидкостей и, наконец, молекулы ДНК, включенные в комплекс, должны быть защищены от биодеструкции.Thus, to ensure efficient delivery of DNA to cells, polycations must reversibly interact with DNA, forming stable positively charged complexes of small size at physiological pH and ionic strength. These complexes must be resistant to the presence of macromolecular components of biological fluids and, finally, the DNA molecules included in the complex must be protected from biodegradation.
В настоящее время запатентован целый ряд подходов, основанных на использовании поликатионов для доставки ДНК в эукариотические клетки. Так, один из первых патентов, касающихся использования поликатионов для трансфекции живых клеток принадлежит фирме Rhone-PoulencRore. В нем предлагается использовать полизтиленимин (ПЭИ) с молекулярной массой до 50 кДа для трансфекции эукариотических клеток [4]. Приблизительно в то же время было также предложено использовать для доставки ДНК полиэтиленимин, модифицированный углеводородными радикалами [5, 6].Currently, a number of approaches based on the use of polycations for the delivery of DNA to eukaryotic cells have been patented. So, one of the first patents regarding the use of polycations for transfection of living cells belongs to the company Rhone-PoulencRore. It proposes the use of polythenyleneimine (PEI) with a molecular weight of up to 50 kDa for transfection of eukaryotic cells [4]. Around the same time, it was also proposed to use polyethyleneimine modified with hydrocarbon radicals for DNA delivery [5, 6].
Высокая трансфекционная автивность ПЭИ в значительной мере обусловлена тем, что данный полимер является слабым полиоснованием, и при рН 7, т.е. в среде окружающей клетку, протонирован лишь на 10-30%. При попадании в эндосомы и лизосомы, рН в которых составляет около 5-5.5, этот полимер протонируется, что приводит к повышению эндосомального рН. Это активирует эндосомальную Н+-АТФазу, которая начинает накачивать протоны во внутреннюю среду эндосом. В итоге это может приводить к осмотическому набуханию и лизису эндосомальной мембраны с выходом комплекса полимера и ДНК в цитозоль [7].The high transfection reactivity of PEI is largely due to the fact that this polymer is a weak polybase, and at pH 7, i.e. in the environment surrounding the cell, it is protonated only by 10-30%. When it enters endosomes and lysosomes, the pH of which is about 5-5.5, this polymer is protonated, which leads to an increase in endosomal pH. This activates the endosomal H + -ATPase, which begins to pump protons into the internal environment of the endosomes. As a result, this can lead to osmotic swelling and lysis of the endosomal membrane with the release of the polymer and DNA complex into the cytosol [7].
Далее конструкции с участием ПЭИ были усовершенствованы. В частности, было предложено использовать этот же полимер с привитыми цепями полиэтиленгликоля, несущими на противоположном конце олигопептид ТАТ (пептидная последовательность оболочечного белка вируса иммунодефицита человека 1 типа), причем такой полимер эффективен для доставки генетического материала в легкие [8]. Полиэтиленимин также может усиливать трансфекцию в композиции с белками вызывающими компактизацию ДНК, например, с гистонами [9]. Позже было предложено использовать ПЭИ на стадии формирования комплекса с ДНК при пониженных значениях рН (3.5-4.5), что способствует более эффективной компактизации нуклеиновой кислоты [10]. Также было предложено использовать биодеградируемые аналоги ПЭИ, содержащие дисульфидные связи, подверженные расщеплению в восстановительных условиях, в том числе в живой клетке [11]. ПЭИ модифицированный остатками ароматических аминокислот было предложено использовать для доставки малых интерферирующих РНК [12].Further designs involving PEI were improved. In particular, it was proposed to use the same polymer with grafted polyethylene glycol chains carrying the TAT oligopeptide (peptide sequence of the envelope protein of
Существует целый ряд патентов, в которых в качестве поликатионной основы для трансфекции клеток используется поли-L-лизин (ПЛ). Этот полимер, а также целый ряд карбоцепных полимеров с первичными аминогруппами (полиаллиламин, поли(аминоэтилметакрилат и др.) были предложены для компактизации ДНК [13]. Хотя сам по себе этот полипептид неэффективен для доставки ДНК, он может служить удобной платформой для создания модульных конструкций, содержащий пептидные последовательности, способствующие проникновению нуклеиновой кислоты в клетку (например, имидазольные группы) [14], а также рецептор-узнающие молекулы (углеводы, способные связываться с мембранными лектинами, гормоны, RGD-пептиды, и т.д.) [15].There are a number of patents in which poly-L-lysine (PL) is used as the polycationic base for transfecting cells. This polymer, as well as a number of carbochain polymers with primary amino groups (polyallylamine, poly (aminoethyl methacrylate, etc.), were proposed for compacting DNA [13]. Although this polypeptide itself is ineffective for DNA delivery, it can serve as a convenient platform for creating modular constructs containing peptide sequences that facilitate the penetration of nucleic acids into the cell (for example, imidazole groups) [14], as well as receptor-recognizing molecules (carbohydrates that can bind to membrane lectins, hormones s, RGD-peptides, etc.) [15].
Существует также целый ряд способов доставки нуклеиновых кислот в клетки, основанных на использовании природного полисахарида хитозана и его производных. Так, было показано, что фракционирование частично деполимеризованных препаратов хитозана по молекулярным массам с выделением фракции, содержащей около 18 звеньев (разброс от 15 до 21 звена)приводит к трехкратному повышению эффективности трансфекции [16]. Модификация хитозанаимидазолуксусной кислотой с помощью N-этил-N'-изопропилкарбодиимида приводит к повышению его трансфецирующей активности почти на 2 порядка [17].There are also a number of methods for delivering nucleic acids to cells based on the use of the natural chitosan polysaccharide and its derivatives. Thus, it was shown that fractionation of partially depolymerized chitosan preparations by molecular weights with the separation of a fraction containing about 18 units (spread from 15 to 21 units) leads to a three-fold increase in transfection efficiency [16]. Modification of chitosanamidazoleacetic acid with N-ethyl-N'-isopropylcarbodiimide leads to an increase in its transfection activity by almost 2 orders of magnitude [17].
Наиболее близким к патентуемому способу является метод доставки ДНК в клетки с помощью катионных полимерных частиц, состоящих из полиакрилатов, полиметакрилатов, в том числе поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилата), полиалкилцианоакрилатов, предпочтительно, полибутилцианоакрилатов, полиариламидов, полилактатов, полигликолятов, полиортоэфиров, желатины, полисахаридов, альбумина, полистирола, поливиниловых эфиров, полиакролеина, полиглутарового альдегида и его производных, их сополимеров и смесей [18]. Полимерный носитель, заявленный в данном патенте, представляет собой твердые частицы полибутилцианоакрилата, покрытые катионными полимерами и ПАВ Tween 80 для стабилизации частиц в водном растворе.Closest to the patented method is a method for delivering DNA to cells using cationic polymer particles consisting of polyacrylates, polymethacrylates, including poly (N, N-dimethylaminoethyl methacrylate), polyalkylcyanoacrylates, preferably polybutylcyanoacrylates, polyarylamides, polylactates, polyglycolates , polysaccharides, albumin, polystyrene, polyvinyl ethers, polyacrolein, polyglutaric aldehyde and its derivatives, their copolymers and mixtures [18]. The polymer carrier claimed in this patent is solid particles of polybutyl cyanoacrylate coated with cationic polymers and Tween 80 surfactants to stabilize the particles in an aqueous solution.
Носитель для доставки ДНК, патентуемый в настоящей заявке, представляет собой блок-сополимер с узким молекулярно-массовым распределением. Данное соединение содержит гидрофобный и гидрофильный блоки, т.е. имеет амфифильное строение. В водном растворе этот блок-сополимер образует мицеллы, размер которых сильно зависит от температуры раствора.The carrier for the delivery of DNA patented in this application is a block copolymer with a narrow molecular weight distribution. This compound contains hydrophobic and hydrophilic blocks, i.e. has an amphiphilic structure. In an aqueous solution, this block copolymer forms micelles, the size of which depends heavily on the temperature of the solution.
Другим аналогом предлагаемого подхода является серия патентов на получение липополиаминов, в которых предлагается использовать для доставки ДНК полиэтиленимин, модифицированный гидрофобными радикалами [6, 19]. Показано, что такая модификация увеличивает трансфекционную активность полиамина, однако при этом заметно увеличивается его цитотоксичность.Another analogue of the proposed approach is a series of patents for the production of lipopoliamines, in which it is proposed to use polyethyleneimine modified with hydrophobic radicals for DNA delivery [6, 19]. It was shown that such a modification increases the transfection activity of polyamine, however, its cytotoxicity significantly increases.
В настоящем изобретении поставлена задача создания поликатионного носителя, способного дестабилизировать эндосомальные мембраны не только за счет эффекта протонной губки, но и за счет структуры его гидрофобного блока. Для этого были синтезированы носителиполикатионной природы, имеющие блочное строение, и содержащие в своем катионном блоке слабый полиамин поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилат) (ПДМАЭМА), а в гидрофобном поли(олигопропиленгликольакрилат) (ПОПГА). Для синтеза блок-сополимеров была использована радикальная полимеризация в условиях обратимой передачи цепи (ОПЦ-полимеризация), обеспечивающая узкое молекулярно-массовое распределение.In the present invention, the task is to create a polycationic carrier capable of destabilizing endosomal membranes not only due to the effect of the proton sponge, but also due to the structure of its hydrophobic block. For this, polycationic carriers with a block structure were synthesized and contained weak polyamine poly (N, N-dimethylaminoethyl methacrylate) (PDMAEMA) in their cationic block and hydrophobic poly (oligopropylene glycol acrylate) (POPGA). For the synthesis of block copolymers, radical polymerization was used under conditions of reversible chain transfer (OPC polymerization), which ensured a narrow molecular weight distribution.
Признаками, отличающими настоящее изобретение от аналогов являются:The features distinguishing the present invention from analogues are:
- катионный носитель для трансфекции имеет блочное строение;- cationic carrier for transfection has a block structure;
- катионный блок представляет собой слабый полиамин, содержащий вторичные или третичные аминогруппы;- the cationic block is a weak polyamine containing secondary or tertiary amino groups;
- гидрофобный блок представляет собой полимер или олигомер разветвленного или щеточного строения, содержащий гидрофобные полиалкиленоксиды или другие гибкоцепныеполимеры, характеризующиеся нижней критической температурой растворения (НКТР);- the hydrophobic block is a branched or brush-type polymer or oligomer containing hydrophobic polyalkylene oxides or other flexible chain polymers characterized by a lower critical dissolution temperature (NCTR);
- блок-сополимер имеет узкое молекулярно-массовое распределение;- the block copolymer has a narrow molecular weight distribution;
- блок-сополимер способен образовывать мицеллы в водном растворе;- the block copolymer is capable of forming micelles in an aqueous solution;
- мицеллообразование блок-сополимера зависит от температуры;- micelle formation of the block copolymer is temperature dependent;
- блок-сополимер взаимодействует с нуклеиновыми кислотами в водно-солевом буферном растворе, вызывая их компактизацию;- the block copolymer interacts with nucleic acids in a water-salt buffer solution, causing their compaction;
- структура и размер комплексов блок-сополимеров с нуклеиновыми кислотами зависят от температуры;- the structure and size of complexes of block copolymers with nucleic acids depend on temperature;
- трансфекционная активность носителей превышает активность полиэтиленимина (25 кДа) и сопоставима с активностью коммерческого препарата Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США).- transfection activity of carriers exceeds the activity of polyethyleneimine (25 kDa) and is comparable with the activity of the commercial drug Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA).
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Сущность изобретения состоит в том, что способ получения амфифильных блок-сополимеров для трансфекцииэукариотических клеток, предусматривает использование псевдоживых методов радикальной полимеризации, причем в структуре всех синтезируемых блок-сополимеров присутствует катионный блок слабогополиамина-поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилата) и гидрофобный блок, представляющий собой полимер или олигомер разветвленного или щеточного строения - поли(олигопропиленгликольакрилат), включающий на первом этапе получение полимерного агента обратимой передачи цепи на основе N,N-диметиламиноэтилметакрилата путем приготовления раствора, содержащего 0.01-0.001 моль/л динитрилаазоизомасляной кислоты и 0.1-0.01 моль/л раствора дитиобензоатного (дитиобензоат циан-изопентановой кислоты) или тритиокарбонатного(S,S'-бис-(метил-2-изобутират)тритиокарбонат) агента обратимой передачи цепи в N,N-диметиламиноэтилметакрилате, присоединении его к вакуумной установке и тщательном удалении следов кислорода, запаивании полученного дегазированного раствора в ампулу и нагревании при 80°C в течение 24-48 часов, в результате чего образуется полимер N,N-диметиламиноэтилметакрилата, содержащий тритиокарбонатную или дитиобензоатную группу, на втором этапе полученный полимер (0.1-0.01 моль/л) и динитрилазоизомасляной кислоты (0.01-0.001 моль/л) растворяется в смеси олигопропиленгликольакрилат/бензол (3:7) и проводится полимеризация при 80°C в течение 24-48 час, полученный блок-сополимер выделяется из раствора упариванием свободного мономера и очищается методом диализа против дистиллированной воды с последующим лиофильным высушиванием в вакууме.The essence of the invention lies in the fact that the method of producing amphiphilic block copolymers for transfection of eukaryotic cells, involves the use of pseudo-living methods of radical polymerization, and in the structure of all synthesized block copolymers there is a cationic block of weakly polyamine-poly (N, N-dimethylaminoethyl methacrylate) and a hydrophobic block representing a polymer or oligomer of a branched or brush structure - poly (oligopropylene glycol acrylate), which includes, at the first stage, the preparation of a polymer agent fraternal chain transfer based on N, N-dimethylaminoethyl methacrylate by preparation of a solution containing 0.01-0.001 mol / L dinitrile azoisobutyric acid and 0.1-0.01 mol / L solution of dithiobenzoate (cyano-isopentanoic acid dithiobenzoate) or tritiocarbonate (S, S'-bis ( methyl 2-isobutyrate) tritiocarbonate) reversible chain transfer agent in N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, attaching it to a vacuum unit and carefully removing traces of oxygen, sealing the resulting degassed solution into an ampoule and heating at 80 ° C for 24-48 hours ow, resulting in the formation of a polymer of N, N-dimethylaminoethyl methacrylate containing a trithiocarbonate or dithiobenzoate group, in the second step the polymer obtained (0.1-0.01 mol / l) and dinitrilazoisobutyric acid (0.01-0.001 mol / l) is dissolved in a mixture of oligopropylene glycol acrylate / benzene 3: 7) and polymerization is carried out at 80 ° C for 24-48 hours, the resulting block copolymer is isolated from the solution by evaporation of the free monomer and purified by dialysis against distilled water, followed by freeze drying in vacuum.
Предпочтительно, в качестве полимерных агентов обратимой передачи цепи используются полимерыполи(олигопропиленгликольакрилата), содержащие дитиобензоатную или тритиокарбонатную группу, которые получены с использованием двух типов агентов обратимой передачи цепи - дитиобензоата циан-изопентановой кислоты и S,S'-бис-(метил-2-изобутират)тритиокарбоната.Preferably, polymeric poly (oligopropylene glycol acrylate) polymers containing a dithiobenzoate or trithiocarbonate group that are prepared using two types of reversible chain transfer agents — cyano-isopentanoic dithiobenzoate and S, S'-bis (methyl-2- isobutyrate) trithiocarbonate.
В частных случаях реализации способа синтезируемые блок-сополимеры взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами в водно-солевом буферном растворе, вызывая их значительную компактизацию, и обладают в культурах эукариотических клеток высокой трансфекционной активностью в комплексе с различными типами нуклеиновых кислот, в том числе плазмидной ДНК и малыми интерферирующими РНК.In particular cases of the implementation of the method, the synthesized block copolymers interact with nucleic acids in a water-salt buffer solution, causing their significant compaction, and in cultures of eukaryotic cells have high transfection activity in combination with various types of nucleic acids, including plasmid DNA and small interfering RNA
Заявляемый способ получения (синтеза) катионных блок-сополимеров поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилата) (ПДМАЭМА) и поли(олигопропиленгликольакрилата) ПОПГА основан на явлении радикальной полимеризации в условиях обратимой передачи цепи[20]. Данный подход основан на том, что тиокарбонильные соединения ZC(=S)SR (ОПЦ-агенты) обратимо реагируют с радикалом роста, образуя интермедиаты Int1 и Int2, способные расщепляться по радикальному механизму; в ходе этих реакций в системе регенерируются макрорадикалы или , способные участвовать в реакции роста цепи вплоть до следующего акта взаимодействия с ОПЦ-агентом (фиг. 1), вследствие чего радикальная полимеризация приобретает черты живых анионных процессов [21, 22, 23].The inventive method for the preparation (synthesis) of cationic block copolymers of poly (N, N-dimethylaminoethyl methacrylate) (PDMAEMA) and poly (oligopropylene glycol acrylate) POPHA is based on the phenomenon of radical polymerization under conditions of reversible chain transfer [20]. This approach is based on the fact that the thiocarbonyl compounds ZC (= S) SR (OPC agents) reversibly react with a growth radical, forming intermediates Int1 and Int2, capable of being cleaved by the radical mechanism; during these reactions, macroradicals are regenerated in the system or capable of participating in the chain growth reaction up to the next act of interaction with the OPC agent (Fig. 1), as a result of which radical polymerization takes on the features of living anion processes [21, 22, 23].
Данный подход к синтезу полимеров имеет два существенных достоинства с точки зрения полимерного дизайна вообще и создания полимерных носителей для биологически активных соединений в частности.This approach to the synthesis of polymers has two significant advantages in terms of polymer design in general and the creation of polymer carriers for biologically active compounds in particular.
Во-первых, при его использовании молекулярная масса полимера линейно растет по мере расходования мономера в реакционной смеси, т.е. с ростом конверсии. При этом полученный полимер, как правило, имеет более узкое молекулярно-массовое распределение, чем полимер, полученный методом классической радикальной полимеризации.First, when it is used, the molecular weight of the polymer increases linearly as the monomer is consumed in the reaction mixture, i.e. with increasing conversions. In this case, the resulting polymer, as a rule, has a narrower molecular weight distribution than the polymer obtained by classical radical polymerization.
Во-вторых, данный подход открывает широкие перспективы получения блок-сополимеров с контролируемой последовательностью и длиной блоков. Дело в том, что большинство макромолекул, образовавшихся в условиях ОПЦ-полимеризации, содержат группы ОПЦ-агента. Поэтому если такой полимер ZC(=S)SAn очистить от неизрасходованного мономера и ввести в реакцию с другим мономером В в присутствии инициатора, то блок Bm будет расти именно на цепи An, как показано на фиг. 2.Secondly, this approach opens up broad prospects for obtaining block copolymers with a controlled sequence and block length. The fact is that most macromolecules formed under the conditions of OPC polymerization contain groups of the OPC agent. Therefore, if such a polymer ZC (= S) SA n is cleaned of unspent monomer and reacted with another monomer B in the presence of an initiator, then the block B m will grow precisely on the chain A n , as shown in FIG. 2.
В аспекте биомедицинских приложений полимеров, полученных с помощью ОПЦ-полимеризации, актуальным является вопрос о токсичности ОПЦ-агента, входящего в состав полимера. Этот вопрос исследовался в литературе, и полученные результаты показывают, что уровень токсичности полимеров, полученных методом ОПЦ-полимеризации, сильно зависит от типа клеток и используемого ОПЦ-агента [24, 25]. Так, клетки макрофагальной линии Raw264.7 более чувствительны к полимерам, полученным с помощью ОПЦ-полимеризации, чем фибробластоидная линия NIH3T3 или клетки яичников китайского хомячка СНО. [Ошибка! Неизвестный аргумент ключа., Ошибка! Неизвестный аргумент ключа.].In the aspect of biomedical applications of polymers obtained using OPC polymerization, the issue of toxicity of the OPC agent that is part of the polymer is relevant. This issue was studied in the literature, and the results show that the toxicity level of polymers obtained by the OPC polymerization method strongly depends on the type of cells and the OPC agent used [24, 25]. Thus, cells of the macrophage line Raw264.7 are more sensitive to polymers obtained by OPC polymerization than the fibroblastoid line NIH3T3 or ovary cells of the Chinese hamster CHO. [Mistake! Unknown key argument., Error! Unknown key argument.].
В качестве реагента обратимой передачи цепи в данном изобретении использовали полимеры ПДМАЭМА и ПОПГА, которые были получены с использованием двух типов агентов обратимой передачи цепи - S,S'-бис-(метил-2-изобутират)тритиокарбоната (МИБТК) и дитиобензоата циан-изопентановой кислоты (ЦКБ) (фиг. 3).In the present invention, PDMAEMA and POPHA polymers, which were obtained using two types of reversible chain transfer agents, S, S'-bis (methyl-2-isobutyrate) tritiocarbonate (MIBTC) and cyano-isopentane dithiobenzoate, were used as reagent for chain reversal in this invention. acids (CCB) (Fig. 3).
В качестве агентов обратимой передачи цепи в данном изобретении использовали S,S'-бис-(метил-2-изобутират)тритиокарбонат (МИБТК) и дитиобензоат циан-изопентановой кислоты (ЦКБ).S, S'-bis- (methyl-2-isobutyrate) trithiocarbonate (MIBTC) and cyano-isopentanoic acid dithiobenzoate (CCB) were used as reverse chain transfer agents in the present invention.
МИБТК является симметричным тритиокарбонатным ОПЦ-агентом и содержит две одинаковые лабильные C-S связи, что обеспечивает рост полимерной цепи в два конца, давая возможность достаточно легко получать триблок-сополимеры типа ABA. При этом тритиокарбонатная гpyппa-S-C(=S)-S- остается в центре полимерной цепи (фиг. 4а).MIBTK is a symmetric tritiocarbonate OPC agent and contains two identical labile C-S bonds, which ensures the growth of the polymer chain in two ends, making it possible to easily obtain triblock copolymers of the ABA type. In this case, the trityocarbonate group-S-C (= S) -S- remains in the center of the polymer chain (Fig. 4a).
Дитиобензоатный ОПЦ-агент (ЦИБ) содержит только одну лабильную C-S-связь, поэтому в его присутствии остаток ОПЦ-агента Ph-С(=S)S-, обеспечивающий реализацию псевдоживого механизма, находится на конце цепи. В этом случае добавление второго мономера к полимерному ОПЦ-агенту приводит к получению диблок-сополимера типа АВ, содержащего дитиобензоатную группу на конце цепи (фиг. 4б).The dithiobenzoate OPC agent (CIB) contains only one labile C-S bond; therefore, in its presence, the remainder of the OPC agent Ph-C (= S) S-, which ensures the implementation of the pseudo-living mechanism, is at the end of the chain. In this case, the addition of the second monomer to the polymer OPC agent results in the formation of an AB type diblock copolymer containing a dithiobenzoate group at the end of the chain (Fig. 4b).
Эффективный контроль ОПЦ-полимеризации возможен только в том случае, если равновесие в реакции образования интермедиата 1 (фиг. 2) сдвинуто вправо. В этом случае при фрагментации интермедиата образуется макромолекула, содержащая дитиоэфирную группу и способная выполнять функции полимерного ОПЦ-агента. Естественно, что соотношение констант скорости прямой и обратной реакции образования интермедиата 1, kad/k-ad, зависит от природы ОПЦ-агента и мономера.Effective control of OPC polymerization is possible only if the equilibrium in the reaction of the formation of intermediate 1 (Fig. 2) is shifted to the right. In this case, upon fragmentation of the intermediate, a macromolecule is formed containing a dithioether group and capable of performing the functions of a polymer OPC agent. Naturally, the ratio of the rate constants of the direct and reverse reaction of the formation of intermediate 1, k ad / k -ad , depends on the nature of the OPC agent and the monomer.
Блок-сополимеры на основе ДМАЭМА и ОПГА, полученные с помощью ОПЦ-полимеризации имеют индекс полидисперсности 1.2-1.9, предпочтительно - 1.5. При этом степень полимеризации ПДМАЭМА варьирует от 100 до 300, предпочтительно, около 200. Степень полимеризации блока ПОПГА может изменяться от 20 до 100, предпочтительно составляет 40-80, при этом в мономере ПОПГА степень полимеризации пропиленгликоля должна варьироваться от 5 до 10 звеньев, предпочтительно - должна составлять 7 звеньев.The block copolymers based on DMAEMA and OPGA obtained by OPC polymerization have a polydispersity index of 1.2-1.9, preferably 1.5. Moreover, the degree of polymerization of PDMAEMA varies from 100 to 300, preferably about 200. The degree of polymerization of the POPA unit can vary from 20 to 100, preferably 40-80, while in the POPA monomer the degree of polymerization of propylene glycol should vary from 5 to 10 units, preferably - Must be 7 links.
Блок-сополимеры ПДМАЭМА и ПОПГА имеют амфифильную природу, поэтому они склонны к агрегации в водном растворе с образованием мицелл. При физиологических условиях критическая концентрация мицеллообразования блок-сополимеров варьируется в диапазоне от 1 до 10 мкг/мл, предпочтительно составляет 2.5 мкг/мл, что на порядок меньше ККМ большинства полимерных ПАВ.PDMAEMA and POPGA block copolymers are amphiphilic in nature, therefore, they are prone to aggregation in an aqueous solution with the formation of micelles. Under physiological conditions, the critical micelle concentration of block copolymers varies from 1 to 10 μg / ml, preferably 2.5 μg / ml, which is an order of magnitude lower than the CMC of most polymeric surfactants.
Структура и стабильность мицелл зависят от концентрации низкомолекулярного электролита, рН и температуры раствора, причем с ростом температуры средний гидродинамический радиус мицелл увеличивается от 15 до 300 нм. Повышение ионной силы выше 0.15 М или рН выше 8.5 приводит к уменьшению размеров мицелл.The structure and stability of micelles depend on the concentration of low molecular weight electrolyte, pH and temperature of the solution, and with increasing temperature, the average hydrodynamic radius of the micelles increases from 15 to 300 nm. An increase in ionic strength above 0.15 M or a pH above 8.5 leads to a decrease in micelle size.
Полученные блок-сополимеры взаимодействуют с ДНК в водном растворе с образованием комплексов, средний гидродинамический радиус которых составляет 100-150 нм, что более чем на порядок меньше гидродинамического радиуса свободной молекулы нуклеиновой кислоты. Тем не менее, размер комплексов сильно зависит от температуры, при которой они готовятся, причем наименьшие по размеру комплексы (около 70 нм) образуются при смешивании растворов нуклеиновой кислоты и блок-сополимера нагретых до температуры +37°C. Комплексы несколько большего, но сходного по порядку величины, размера (около 100 нм) образуются при +4°C. Категорически не рекомендуется готовить комплексы при комнатной температуре, поскольку в этих условиях образуются чрезвычайно полидисперсные частицы комплексов со средним гидродинамическим радиусом превышающим 300 нм, что может быть больше толщины мелких кровеносных капилляров, а значит использование таких комплексов invivo может приводить к эмболизации.The obtained block copolymers interact with DNA in an aqueous solution to form complexes with an average hydrodynamic radius of 100-150 nm, which is more than an order of magnitude smaller than the hydrodynamic radius of a free nucleic acid molecule. Nevertheless, the size of the complexes strongly depends on the temperature at which they are prepared, and the smallest complexes (about 70 nm) are formed by mixing solutions of nucleic acids and block copolymers heated to a temperature of + 37 ° C. The complexes of a slightly larger, but similar in order of magnitude, size (about 100 nm) are formed at + 4 ° C. It is strongly not recommended to prepare complexes at room temperature, since under these conditions extremely polydisperse particles of complexes with an average hydrodynamic radius exceeding 300 nm are formed, which may be greater than the thickness of small blood capillaries, which means that the use of such complexes in vivo can lead to embolization.
Блок-сополимеры ПДМАЭМА и ПОПГА проявляют существенно меньшую цитотоксичность, чем гомополимеры ПДМАЭМА и ПЭИ, использованные в изобретении в качестве аналога. Наибольшая нетоксичная концентрация (ННК) блок-сополимеров для клеток рака яичников китайского хомяка СНО варьировалась в интервале от 20 до 50 мкг/мл в зависимости от состава, в то время как ННК гомополимера ПДМАЭМА составляет 12 мкг/мл, а ПЭИ - 4 мкг/мл. Таким образом, блок-сополимеры ПДМАЭМА и ПОПГА проявляют заметно меньшую цитотоксичность, чем ранее использовавшиеся аналоги.The PDMAEMA and POPGA block copolymers exhibit significantly lower cytotoxicity than the PDMAEMA and PEI homopolymers used as an analog in the invention. The highest non-toxic concentration (NNK) of block copolymers for ovarian cancer cells of the Chinese hamster CHO ranged from 20 to 50 μg / ml depending on the composition, while the NMA of the PDMAEMA homopolymer was 12 μg / ml and PEI was 4 μg / ml Thus, the PDMAEMA and POPGA block copolymers exhibit markedly lower cytotoxicity than the previously used analogues.
Полученные блок-сополимеры проявляют высокую способность трансфецировать эукариотические клетки плазмидной ДНК. При этом наибольшую эффективность трансфекцииплазмидной ДНК демонстрируют комплексы плазмидной ДНК с триблок-сополимерами ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА при составе комплекса, соответсвтующем молярному соотношению амтногрупп полимера к фосфатным группам нуклеиновой кислоты, N:P=7.5, и с диблок-сополимерами ПДМАЭМА-блок-ПОПГА при соотношении N:P=15. Эффективность трансфекцииплазмидной ДНК с использованием ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА (при соотношении N:P=7.5) была в 3 раза выше, чем у коммерчески доступного препарата Lipofectamine 2000 и ПЭИ.The obtained block copolymers exhibit high ability to transfect eukaryotic plasmid DNA cells. In this case, the most efficient transfection of plasmid DNA is demonstrated by the complexes of plasmid DNA with triblock copolymers of POPGA-block-PDMAEMA-block-POPGA with the composition of the complex corresponding to the molar ratio of polymer amine groups to phosphate groups of nucleic acid, N: P = 7.5, and with diblockE copolymers of PDM -Block-POPGA with a ratio of N: P = 15. The transfection efficiency of plasmid DNA using POPGA-block-PDMAEMA-block-POPGA (at a ratio of N: P = 7.5) was 3 times higher than that of the commercially
Эти же блок-сополимеры проявили высокую способность доставлять в клетки малые интерферирующие РНК. Для оценки эффективности подавления гена-мишени в изобретении использовали две различные системы. Во-первых, культуру клеток CHO-luc, стабильно трансфецированную геном светляковой люциферазы. Комплексы синтетическойми РНК, направленной к гену люциферазы, и триблок-сополимера ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА подавляют люциферазную активность на 89 и 93% при соотношении N:P=7.5 и 15, соответственно, что на 7 и 10% больше, чем у препарата сравнения Lipofectamine 2000. Диблок-сополимеры ПДМАЭМА-блок-ПОПГА проявляют наибольшую эффективность при соотношении N:P=15 и вызывают подавление люциферазной активности на 80-90%, что близко к эффекту, оказываемому Lipofectamine 2000.The same block copolymers showed a high ability to deliver small interfering RNAs into cells. Two different systems were used in the invention to evaluate the effectiveness of suppressing the target gene. Firstly, a CHO-luc cell culture stably transfected with the firefly luciferase gene. The complexes of synthetic RNA directed to the luciferase gene and the triblock copolymer POPGA-block-PDMAEMA-block-POPGA inhibit luciferase activity by 89 and 93% at a ratio of N: P = 7.5 and 15, respectively, which is 7 and 10% more than that of the
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Пример 1.Example 1
Синтез блок-сополимеров на основе реагентов обратимой передачи цепи поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилат)-дитиобензоата или поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилат)-тритиокарбоната.Synthesis of block copolymers based on reversible chain transfer reagents of poly (N, N-dimethylaminoethyl methacrylate) -dithiobenzoate or poly (N, N-dimethylaminoethyl methacrylate) -tritiocarbonate.
Для синтеза полимерных агентов обратимой передачи цепи на основе N,N-диметиламиноэтилметакрилата готовили раствор динитрила азоизомасляной кислоты в концентрации от 0,01 до 0,001 моль/л в свежеперегнанном диметиламиноэтилметакрилате. К полученному раствору добавляли дитиобензоат циан-изопентановой кислоты или S,S'-бис-(метил-2-изобутират)тритиокарбонат до конечной концентрации от 0,1 до 0,01 моль/л. Реакционную смесь заливали в ампулу, подсоединяли ее к вакуумной установке и дегазировали путем повторения циклов замораживания-размораживания до остаточного давления 5×10-3 мм рт.ст., затем ампулу запаивали. Образец полимеризовали при 80°C в течение 24-48 ч. Полимер выделяли методом лиофильного высушивания из бензола на вакуумной установке. Образец охарактеризовывали методом гель-проникающей хроматографии. В результате, в зависимости от использованного ОПЦ-агента, получали поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилат)-дитиобензоат (ПДМАЭМА-Б) или поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилат)-тритиокарбонат (ПДМАЭМА-ТК).For the synthesis of polymeric agents for reversible chain transfer based on N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, a solution of azoisobutyric acid dinitrile was prepared in a concentration of 0.01 to 0.001 mol / L in freshly distilled dimethylaminoethyl methacrylate. Cyanisopentanoic acid dithiobenzoate or S, S'-bis- (methyl-2-isobutyrate) trithiocarbonate was added to the resulting solution to a final concentration of 0.1 to 0.01 mol / L. The reaction mixture was poured into an ampoule, connected to a vacuum unit, and degassed by repeating freeze-thaw cycles to a residual pressure of 5 × 10 -3 mm Hg, then the ampoule was sealed. The sample was polymerized at 80 ° C for 24-48 h. The polymer was isolated by freeze drying from benzene in a vacuum unit. The sample was characterized by gel permeation chromatography. As a result, depending on the OPC agent used, poly (N, N-dimethylaminoethylmethacrylate) -dithiobenzoate (PDMAEMA-B) or poly (N, N-dimethylaminoethylmethacrylate) -tritiocarbonate (PDMAEMA-TK) was obtained.
Для синтеза диблок-сополимера ПДМАЭМА-блок-ПОПГА на основе монофункционального ОПЦ-агента дитиобензоата циан-изопентановой кислоты готовили раствор динитрила азоизомасляной кислоты (0,01-0,001 моль/л) в смеси олигопропиленгликольакрилат/бензол (3:7 по объему) и добавляли его к полимерному ОПЦ-агенту (ПДМАЭМА-Б, 0,1-0,01 моль/л). Полученную смесь заливали в ампулу и дегазировали на вакуумной установке, ампулу запаивали и помещали в термостат, разогретый до 80°C, на 24-48 ч. По окончании полимеризации ампулу вскрывали, содержимое растворяли в избытке бензола и далее отгоняли растворитель на роторном испарителе. Полученный сухой остаток растворяли в воде, диализовали и полимер выделяли методом лиофильной сушки из водного раствора на вакуумной установке. Блок-сополимер характеризовали методом гель-проникающей хроматографии.To synthesize the PDMAEMA-block-POPGA diblock copolymer based on the monofunctional OPC agent of cyan-isopentanoic acid dithiobenzoate, a solution of azoisobutyric acid dinitrile (0.01-0.001 mol / L) in an oligopropylene glycol acrylate / benzene mixture (3: 7 by volume) was prepared it to the polymer OPC agent (PDMAEMA-B, 0.1-0.01 mol / l). The resulting mixture was poured into an ampoule and degassed in a vacuum unit, the ampoule was sealed and placed in a thermostat heated to 80 ° C for 24-48 hours. After polymerization, the ampoule was opened, the contents were dissolved in excess benzene, and then the solvent was distilled off on a rotary evaporator. The resulting dry residue was dissolved in water, dialyzed, and the polymer was isolated by freeze drying from an aqueous solution in a vacuum unit. The block copolymer was characterized by gel permeation chromatography.
Пример 2.Example 2
Синтез блок-сополимеров на основе полимерных агентов обратимой передачи цепи поли(олигопропиленгликольакрилат)-дитиобензоата (ПОПГА-Б) или поли(олигопропил енгликольакрилат)-тритиокарбоната (ПОПГ А-ТК).Synthesis of block copolymers based on polymeric agents for reversible chain transfer of poly (oligopropylene glycol acrylate) -dithiobenzoate (POPGA-B) or poly (oligopropyl anglycol acrylate) -tritiocarbonate (POPG A-TK).
Для синтеза реагентов обратимой передачи цепи на основе поли(олигопропиленгликольакрилата) готовили раствор динитрила азоизомасляной кислоты (0,01-0,001 моль/л) в смеси олигополипропиленгликольакрилат/бензол (1:1 по объему). К полученному раствору добавляли дитиобензоат циан-изопентановой кислоты или S,S'-бис-(метил-2-изобутират)тритиокарбонат до конечной концентрации 0,01-0,1 моль/л. Реакционную смесь заливали в ампулу, подсоединяли ее к вакуумной установке и дегазировали путем повторения циклов замораживания-размораживания до остаточного давления 5×10-3 мм рт.ст., затем ампулу запаивали. Образец полимеризовали при 80°C в течение 4-24 ч. Полимер выделяли методом лиофильного высушивания из бензола на вакуумной установке. Молекулярно-массовые характеристики образца определяли методом гель-проникающей хроматографии. В результате в зависимости от использованного ОПЦ-агента получали поли(олигопропиленгликольакрилат)-дитиобензоат (ПОПГА-Б) или поли(олигопропиленгликольакрилат)-тритиокарбонат (ПОПГА-ТК).For the synthesis of reversible chain transfer reagents based on poly (oligopropylene glycol acrylate), a solution of azoisobutyric acid dinitrile (0.01-0.001 mol / L) in an oligopolypropylene glycol acrylate / benzene mixture (1: 1 by volume) was prepared. Cyanisopentanoic acid dithiobenzoate or S, S'-bis- (methyl-2-isobutyrate) trithiocarbonate was added to the resulting solution to a final concentration of 0.01-0.1 mol / L. The reaction mixture was poured into an ampoule, connected to a vacuum unit, and degassed by repeating freeze-thaw cycles to a residual pressure of 5 × 10 -3 mm Hg, then the ampoule was sealed. The sample was polymerized at 80 ° C for 4-24 hours. The polymer was isolated by freeze drying from benzene in a vacuum unit. Molecular weight characteristics of the sample were determined by gel permeation chromatography. As a result, depending on the OPC agent used, poly (oligopropylene glycol acrylate) -dithiobenzoate (POPGA-B) or poly (oligopropylene glycol acrylate) -tritiocarbonate (POPGA-TK) was obtained.
Для синтеза триблок-сополимера ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА готовили раствор ПОПГА-ТК (0,01-0,001 моль/л) и динитрила азоизомасляной кислоты (0,1-0,01 моль/л) в смеси диметиламиноэтилметакрилат/бензол (4:1 по объему). Полученную смесь заливали в ампулу и дегазировали на вакуумной остановке, ампулу запаивали и помещали в термостат, разогретый до 80°C на 4-24 ч. По окончании полимеризации ампулу вскрывали, содержимое растворяли в избытке бензола и далее отгоняли растворитель на роторе. Полученный сухой остаток растворяли в воде, диализовали и полимер выделяли методом лиофильной сушки из водного раствора на вакуумной установке. Блок-сополимер характеризовали методом гель-проникающей хроматографии. Аналогичным способом получали блок-сополимер с обращенной последовательностью блоков ПДМАЭМА-блок-ПОПГА-блок-ПДМАЭМА, используя ПДМАЭМА-ТК в качестве полимерного агента обратимой передачи цепи.For the synthesis of the triblock copolymer POPGA-block-PDMAEMA-block-POPGA, a solution of POPGA-TK (0.01-0.001 mol / L) and dinitrile azoisobutyric acid (0.1-0.01 mol / L) in a mixture of dimethylaminoethyl methacrylate / benzene was prepared (4: 1 by volume). The resulting mixture was poured into an ampoule and degassed at a vacuum stop, the ampoule was sealed and placed in a thermostat, heated to 80 ° C for 4-24 h. After polymerization, the ampoule was opened, the contents were dissolved in excess benzene, and then the solvent was distilled off on a rotor. The resulting dry residue was dissolved in water, dialyzed, and the polymer was isolated by freeze drying from an aqueous solution in a vacuum unit. The block copolymer was characterized by gel permeation chromatography. In a similar manner, a PDMAEMA-block-POPGA-block-PDMAEMA block copolymer with an inverted sequence of blocks was obtained using PDMAEMA-TK as a polymer agent for reversible chain transfer.
Пример 3.Example 3
Оценка трансфекционной активности комплексов амфифильных блок-сополимеров с плазмидной ДНК и малыми интерферирующими РНК (миРНК).Assessment of the transfection activity of complexes of amphiphilic block copolymers with plasmid DNA and small interfering RNAs (siRNAs).
Для оценки трансфекционной активности комплексов амфифильных блок-сополимеров с плазмидной ДНК и миРНК использовали культуры клеток яичника китайского хомячка СНО и CHO-luc (клетки СНО, стабильно трансфецированные геном светляковой люциферазы), соответственно.To assess the transfection activity of complexes of amphiphilic block copolymers with plasmid DNA and siRNA, Chinese hamster ovary CHO and CHO-luc cells were used (CHO cells stably transfected with the firefly luciferase gene), respectively.
Культуру клеток СНО обрабатывали комплексами, содержащими плазмидную ДНК pCMVluc (Promega, США) и препараты синтезированных катионных амфифильных блок-сополимеров: ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА, ПДМАЭМА-блок-ПОПГА-блок-ПДМАЭМА, ПДМАЭМА-блок-ПОПГА, ПОПГА-блок-ПДМАЭМА, а также гомополимер ПДМАЭМА в различных соотношениях N:P=7,5 и 15. Эффективность трансфекции оценивали по активности люциферазы через 24 часа после обработки комплексами с помощью коммерческого набора реагентов Luciferase assay system (Promega, США) в планшетном анализаторе. В качестве препаратов сравнения использовали коммерческий трансфекционный агент Lipofectamine 2000 (Invitrogene, США) и разветвленный полиэтиленимин 25 кДа (ПЭИ) (Sigma, США). Также в эксперименты включали отрицательный контроль, который представлял собой препараты "голой" плазмидной ДНК или миРНК. Комплексы ДНК с сополимерами для трансфекции готовили в соотношениях N:P - 7,5 и 15. Наибольшую эффективность трансфекции плазмидной ДНК продемонстрировали сополимеры ДМАЭМА-ОПГА в соотношении N:P - 7,5, а также ПОПГА-блок-ПДМАЭМА и ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА в соотношении 15 (фиг. 5а, 5б), как по сравнению с другими синтезированными сополимерами, так и с исходными блоками для сополимеров.CHO cell culture was treated with complexes containing plasmid DNA pCMVluc (Promega, USA) and preparations of synthesized cationic amphiphilic block copolymers: POPGA-block-PDMAEMA-block-POPGA, PDMAEMA-block-POPGA-block-PDMAEMA, PDMAEMA-block-POPGA, POPGA-block-PDMAEMA, as well as PDMAEMA homopolymer in various ratios N: P = 7.5 and 15. Transfection efficiency was evaluated by luciferase activity 24 hours after treatment with complexes using a commercial Luciferase assay system reagent kit (Promega, USA) in a tablet analyzer.
В соотношении N:P - 15 эффективность трансфекции с использованием комплексов ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА и ПОПГА-блок-ПДМАЭМА была, соответственно, в 83 и 53 раза выше, чем в экспериментах с гомополимером ПДМАЭМА и не ниже эффективности препаратов сравнения (ПЭИ и Lipofectamine 2000). Эффективность трансфекции плазмидной ДНК с использованием ПДМАЭМА-блок-ПОПГА (при соотношении N:P - 7,5) была в 64 раза выше, чем у ПДМАЭМА и не уступала по эффективности препаратам сравнения. При увеличении соотношения N:P до 15 эффективность трансфекции препарата ПДМАЭМА-блок-ПОПГА снижалась (в 2,4 раза по сравнению с эффективностью при N:P=7,5). Это, вероятно, связано с увеличением токсического эффекта исследуемых сополимеров при увеличении их концентрации.In the ratio N: P - 15, the efficiency of transfection using the POPGA-block-PDMAEMA-block-POPGA and POPGA-block-PDMAEMA complexes was 83 and 53 times higher than in experiments with the PDMAEMA homopolymer and not lower than the effectiveness of the comparison drugs (PEI and Lipofectamine 2000). The efficiency of transfection of plasmid DNA using PDMAEMA-block-POPGA (at a ratio of N: P of 7.5) was 64 times higher than that of PDMAEMA and was not inferior in comparison to comparison drugs. With an increase in the N: P ratio to 15, the efficiency of transfection of the PDMAEMA-block-POPGA preparation decreased (2.4 times compared with the efficiency at N: P = 7.5). This is probably due to an increase in the toxic effect of the studied copolymers with an increase in their concentration.
Комплексы для трансфекции миРНК готовили в соотношениях N:P=7,5 и 15. В данной серии экспериментов использовали культуру клеток CHO-luc, стабильно трансфецированную геном светляковой люциферазы. Комплексы для трансфекции готовили из синтетических миРНК, направленных к гену люциферазы, и амфифильных блок-сополимеров. Результаты, полученные в экспериментах с блок-сополимерами, представляли в виде люциферазной активности в клетках, обработанных комплексами на основе специфической (направленной к гену люциферазы) и неспецифической миРНК (направленной к Р-гену респираторно-синцитиального вируса). Результаты выражали в виде процента остаточной люциферазной активности в клетках, обработанных специфической миРНК по сравнению с неспецифической (фиг. 6а, 6б). Как и в экспериментах с плазмидной ДНК высокую эффективность трансфекции миРНК продемонстрировал препарат ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА, который подавлял люциферазную активность на 78% при соотношении N:P - 7,5. Блок-сополимеры ПДМАЭМА-блок-ПОПГА проявили одинаково высокую эффективность трансфекции при соотношении N:P - 7,5 и 15, и обеспечили подавление люциферазной активности на 89%. Это на 7% больше по сравнению с Lipofectamine 2000.Complexes for siRNA transfection were prepared in ratios N: P = 7.5 and 15. In this series of experiments, a CHO-luc cell culture stably transfected with the firefly luciferase gene was used. Complexes for transfection were prepared from synthetic siRNAs directed to the luciferase gene and amphiphilic block copolymers. The results obtained in experiments with block copolymers were presented as luciferase activity in cells treated with complexes based on specific (directed to the luciferase gene) and nonspecific siRNA (directed to the P gene of respiratory syncytial virus). The results were expressed as the percentage of residual luciferase activity in cells treated with specific siRNA compared with non-specific (Fig. 6a, 6b). As in experiments with plasmid DNA, the drug POPGA-block-PDMAEMA-block-POPGA demonstrated high efficiency of miRNA transfection, which suppressed luciferase activity by 78% at a N: P ratio of 7.5. Block copolymers of PDMAEMA-block-POPGA showed equally high transfection efficiency at a ratio of N: P of 7.5 and 15, and ensured the suppression of luciferase activity by 89%. This is 7% more compared to
Таким образом, препараты амфифильных катионных сополимеров на основе ПДМАЭМА и ПОПГА проявили высокую трансфекционную активность как при трансфекции культуры клеток плазмидной ДНК, так и миРНК, сравнимую или даже превосходящую эффективность, достигнутую с использованием препаратов сравнения.Thus, the preparations of amphiphilic cationic copolymers based on PDMAEMA and POPGA showed high transfection activity both during transfection of plasmid DNA cell culture and siRNA, comparable or even superior to the efficiency achieved using comparison preparations.
В соотношении N:P - 15 эффективность трансфекции с использованием комплексов ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА и ПОПГА-блок-ПДМАЭМА была, соответственно, в 83 и 53 раза выше, чем в экспериментах с гомополимером ПДМАЭМА и не ниже эффективности препаратов сравнения (ПЭИ и Lipofectamine 2000). Эффективность трансфекцииплазмидной ДНК с использованием ПДМАЭМА-блок-ПОПГА (при соотношении N:P - 7.5) была в 64 раза выше, чем у ПДМАЭМА и не уступала по эффективности препаратам сравнения. При увеличении соотношения N:P до 15 эффективность трансфекции препарата ПДМАЭМА-блок-ПОПГА снижалась (в 2.4 раза по сравнению с эффективностью при N:P=7.5). Это, вероятно, связано с увеличением токсичности исследуемых сополимеров.In the ratio N: P - 15, the efficiency of transfection using the POPGA-block-PDMAEMA-block-POPGA and POPGA-block-PDMAEMA complexes was 83 and 53 times higher than in experiments with the PDMAEMA homopolymer and not lower than the effectiveness of the comparison drugs (PEI and Lipofectamine 2000). The efficiency of transfection of plasmid DNA using PDMAEMA-block-POPGA (at a ratio of N: P - 7.5) was 64 times higher than that of PDMAEMA and was not inferior in comparison to the comparison drugs. With an increase in the N: P ratio to 15, the efficiency of transfection of the PDMAEMA-block-POPGA preparation decreased (2.4 times compared with the efficiency at N: P = 7.5). This is probably due to an increase in the toxicity of the studied copolymers.
Комплексы для трансфекциими РНК готовили в соотношениях N:P=7.5 и 15. В данной серии экспериментов использовали культуру клеток CHO-luc, стабильно трансфецированную геном светляковой люциферазы. Комплексы для трансфекции готовили из синтетических миРНК, направленных к гену люциферазы, и амфифильных блок-сополимеров. Результаты, полученные в экспериментах с блок-сополимерами, представляли в виде люциферазной активности в клетках, обработанных комплексами на основе специфической (направленной к гену люциферазы) и неспецифической миРНК (направленной к Р-гену респираторно-синцитиального вируса). Результаты выражали в виде процента остаточной люциферазной активности в клетках, обработанных специфической миРНК по сравнению с неспецифической (фиг.6а, 66). Как и в экспериментах с плазмидной ДНК высокую эффективность трансфекциими РНК продемонстрировал препарат ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА, который подавлял люциферазную активность на 78% при соотношении N:P - 7.5. Блок-сополимеры ПДМАЭМА-блок-ПОПГА проявили одинаково высокую эффективность трансфекции при соотношении N:P - 7.5 и 15, и обеспечили подавление люциферазной активности на 89%. Это на 7% больше по сравнению с Lipofectamine 2000.Complexes for RNA transfection were prepared in ratios N: P = 7.5 and 15. In this series of experiments, we used a CHO-luc cell culture stably transfected with the firefly luciferase gene. Complexes for transfection were prepared from synthetic siRNAs directed to the luciferase gene and amphiphilic block copolymers. The results obtained in experiments with block copolymers were presented as luciferase activity in cells treated with complexes based on specific (directed to the luciferase gene) and nonspecific siRNA (directed to the P gene of respiratory syncytial virus). The results were expressed as the percentage of residual luciferase activity in cells treated with specific siRNA compared with non-specific (figa, 66). As in experiments with plasmid DNA, POPGA-block-PDMAEMA-block-POPGA demonstrated high efficiency of RNA transfection, which suppressed luciferase activity by 78% at a N: P ratio of 7.5. PDMAEMA-block-POPGA block copolymers showed the same high transfection efficiency at N: P ratios of 7.5 and 15, and ensured 89% suppression of luciferase activity. This is 7% more compared to
Таким образом, препараты амфифильных катионных сополимеров на основе ПДМАЭМА и ПОПГА проявили высокую трансфекционную активность как при трансфекции культуры клеток плазмидной ДНК, так и миРНК, сравнимую или даже превосходящую эффективность, достигнутую с использованием препаратов сравнения.Thus, the preparations of amphiphilic cationic copolymers based on PDMAEMA and POPGA showed high transfection activity both during transfection of plasmid DNA cell culture and siRNA, comparable or even superior to the efficiency achieved using comparison preparations.
ЛитератураLiterature
1. Roth C.M., Sundaram S. Engineering synthetic vectors for improved DNA delivery: Insights from Intracellular Pathways. Annu. Rev. Biomed. Eng. v. 6, p. 397-426 (2004).1. Roth C. M., Sundaram S. Engineering synthetic vectors for improved DNA delivery: Insights from Intracellular Pathways. Annu. Rev. Biomed. Eng. v. 6, p. 397-426 (2004).
2. Mintzer M.A., Simanek E.E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem. Rev. v. 109, p. 259-302 (2009).2. Mintzer M.A., Simanek E.E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem. Rev. v. 109, p. 259-302 (2009).
3. Cho Y.W., Kim J.D., Park K.. Polycation gene delivery systems: escape from endosomes to cytosol. J Pharm Pharmacol, v. 55, p. 721-734 (2003).3. Cho Y. W., Kim J. D., Park K. Polycation gene delivery systems: escape from endosomes to cytosol. J Pharm Pharmacol, v. 55, p. 721-734 (2003).
4. Behr J.-P., Demeneix В., Lezoualch F., Mergny M., Scherman D., Boussif O. Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same. Патент ЕС №06013240 (1997).4. Behr J.-P., Demeneix B., Lezoualch F., Mergny M., Scherman D., Boussif O. Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same. EU Patent No. 06013240 (1997).
5. Jean-PaulBehr J.-P., Demeneix B., Scherman D., Schwartz B., Remy J.-S. Compositioncontainingnucleicacids, preparationanduses. ПатентФранции №94/00159 (1994). 6 Behr J.-P., Loeffler J.-P. Lipopolyamines, theirpreparationandtheiruse. Патент ЕС №056167458 (1995).5. Jean-Paul Behr J.-P., Demeneix B., Scherman D., Schwartz B., Remy J.-S. Compositioncontainingnucleicacids, preparationanduses. French Patent No. 94/00159 (1994). 6 Behr J.-P., Loeffler J.-P. Lipopolyamines, theirpreparationandtheiruse. EU Patent No. 056167458 (1995).
7. Boussif O., Lezoualc'h F., Zanta M.A., Mergny M.D., Scherman D., Demeneix В., Behr J.-P. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci USA. v. 92, N 16. p. 7297-301 (1995).7. Boussif O., Lezoualc'h F., Zanta M.A., Mergny M.D., Scherman D., Demeneix B., Behr J.-P. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci USA. v. 92, N 16. p. 7297-301 (1995).
8. Kissel T, Kleemann E., Neu M., Gessler Т., Schmehl T. Non-viral vector system for the delivery of nucleic acid into the lung. Патент США №2007/38693.8. Kissel T, Kleemann E., Neu M., Gessler T., Schmehl T. Non-viral vector system for the delivery of nucleic acid into the lung. U.S. Patent No. 2007/38693.
9. Scherman D., Byk G., Schwartz B. Nucleic acid-containing composition, preparation and use thereof. Патент США №5,945,400 (1999).9. Scherman D., Byk G., Schwartz B. Nucleic acid-containing composition, preparation and use thereof. U.S. Patent No. 5,945,400 (1999).
10. Yamaguchi N., Fukumoto Y. Method of transfecting cells with nucleic acids using acidified polyethyleneimine. Японский патент №2009-174234. (2009).10. Yamaguchi N., Fukumoto Y. Method of transfecting cells with nucleic acids using acidified polyethyleneimine. Japanese Patent No. 2009-174234. (2009).
11. Gxpfreich A., Breunig M., Lungwitz U., Blunk T. Cationic polymers for transporting nucleic acids in cells Патент США №2009/0215166 A1 (2009).11. Gxpfreich A., Breunig M., Lungwitz U., Blunk T. Cationic polymers for transporting nucleic acids in cells US Patent No. 2009/0215166 A1 (2009).
12. Adib A., Erbacher P., Stock F., Hafdi N. Means for delivery of nucleic acids active for gene silencing using synthetic polymers. Патент США №2010/0297756 A1 (2010).12. Adib A., Erbacher P., Stock F., Hafdi N. Means for delivery of nucleic acids active for gene silencing using synthetic polymers. U.S. Patent No. 2010/0297756 A1 (2010).
13. Lynn D.M., Miller A.D. Charge-dynamic polymers and delivery of anionic compounds. Патент ЕС №07883720 (2004).13. Lynn D.M., Miller A.D. Charge-dynamic polymers and delivery of anionic compounds. EU Patent No. 07883720 (2004).
14. Midoux P., Monsigny M. Polymeric complexes for the transfection of nucleic acids, with residues causing the destabilization of cell membranes. Патент ЕС №06372499 (1999).14. Midoux P., Monsigny M. Polymeric complexes for the transfection of nucleic acids, with residues causing the destabilization of cell membranes. EU Patent No. 06372499 (1999).
15. Midoux P., Erbacher P., Roche-Degremont A.-C., Monsigny M. Polylysine conjugates. Патент ЕС №055958974 (1994).15. Midoux P., Erbacher P., Roche-Degremont A.-C., Monsigny M. Polylysine conjugates. EU Patent No. 055958974 (1994).
16. Artursson P., Christensen B.K., Koping-Hoggard M., Varnum K.M. Non-viral gene delivery system. Патент США №7,767,456 B2 (2010).16. Artursson P., Christensen B.K., Koping-Hoggard M., Varnum K.M. Non-viral gene delivery system. U.S. Patent No. 7,767,456 B2 (2010).
17. Roy K., Ghosu В., Kasturi S. Modified polysaccharide-based delivery of nucleic acids. Патент США №2010/0311654 Al (2010).17. Roy K., Ghosu B., Kasturi S. Modified polysaccharide-based delivery of nucleic acids. U.S. Patent No. 2010/0311654 Al (2010).
18. Sabei В., Walz C., Ringe K. Use of nanoparticles for the DNA administration to a target organ. Патент США №7,402,573 B2 (2008).18. Sabei B., Walz C., Ringe K. Use of nanoparticles for the DNA administration to a target organ. U.S. Patent No. 7,402,573 B2 (2008).
19. Ferguson D.Y., Kim S.W. Linear polyethylenimine-sterol conjugates for gene delivery. Патент EC №07863470 (2007).19. Ferguson D.Y., Kim S.W. Linear polyethylenimine-sterol conjugates for gene delivery. EC Patent No. 07863470 (2007).
20. Chiefari J., Chong Y.K., Ercole F., Krstina J., Jeffery J., Le T.P.T., Mayadunne R.T.A., Meijs G.F., Moad C.L., Moad G., Rizzardo E., Thang S.H. // Macromolecules. 1998. V. 31. №16. P. 5559-5562.20. Chiefari J., Chong Y.K., Ercole F., Krstina J., Jeffery J., Le T.P.T., Mayadunne R.T.A., Meijs G.F., Moad C.L., Moad G., Rizzardo E., Thang S.H. // Macromolecules. 1998. V. 31. No. 16. P. 5559-5562.
21. Зайцев С.Д., Семчиков Ю.Д., Черникова E.B. Контролируемая радикальная сополимеризация N-винилпирролидона и 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропилакрилата. // Высокомолек. Соед. 2009. Сер. А, т. 51. №3. с. 517-521.21. Zaitsev S.D., Semchikov Yu.D., Chernikova E.B. Controlled radical copolymerization of N-vinylpyrrolidone and 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropyl acrylate. // High Molecule. Connection 2009. Ser. A, t. 51. No. 3. from. 517-521.
22. Терпугова П.С., Павлов А.С., Гарина Е.С., Черникова Е.В. Управляемый синтез узкодисперсных полимеров акрилового ряда. // Пластмассы со специальными свойствами (межвузовский сборник научных трудов). 2006. ч. 1. с. 35-38.22. Terpugova P.S., Pavlov A.S., Garina E.S., Chernikova E.V. Controlled synthesis of finely dispersed polymers of acrylic series. // Plastics with special properties (inter-university collection of scientific papers). 2006.
23. Черникова Е.В. "Псевдоживаярадикальная полимеризация по механизму обратимой передачи цепи (обзор) // Пластмассы со специальнымисвойствами (межвузовский сборник научных трудов). 2006. ч. 1. с. 7-16.23. Chernikova E.V. “Pseudo-living radical polymerization by the mechanism of reversible chain transmission (review) // Plastics with special properties (inter-university collection of scientific papers). 2006.
24. Chang C.W., Bays E., Tao L., Alconcel S.N., Maynard H.D. Differencesincytotoxicityofpoly(PEGA)ssynthesizedbyreversibleaddition-fragmentationchaintransferpolymerization. // Chem. Commun. (Camb). 2009 V. 24. P. 3580-3582.24. Chang C.W., Bays E., Tao L., Alconcel S.N., Maynard H.D. Differencesincytotoxicityofpoly (PEGA) ssynthesizedbyreversibleaddition-fragmentationchaintransferpolymerization. // Chem. Commun. (Camb). 2009 V. 24. P. 3580-3582.
25. Pissuwan D., Boyer C., GunasekaranK., Davis T.P., BulmusV. Invitrocytotoxicityofraftpolymers. // Biomacromolecules 2010. V. 11. P. 412-420.25. Pissuwan D., Boyer C., Gunasekaran K., Davis T.P., BulmusV. Invitrocytotoxicityofraftpolymers. // Biomacromolecules 2010.V. 11.P. 412-420.
Описание чертежейDescription of drawings
Фиг. 1. Схема процессов, происходящих при псевдоживой радикальной полимеризации с обратимой передачей цепиFIG. 1. Scheme of processes occurring during pseudo-living radical polymerization with reversible chain transfer
и - радикалы роста; М - мономер; Z и R - алкильные или арильные заместители в молекуле ОПЦ-агента. and - growth radicals; M is a monomer; Z and R are alkyl or aryl substituents in the OPC agent molecule.
Фиг. 2. Получение блок-сополимеров с помощью ОПЦ-полимеризации.FIG. 2. Obtaining block copolymers using OPC polymerization.
Если полимер ZC(=S)SAn очистить от не израсходовавшегося мономера и ввести в реакцию с другим мономером В в присутствии инициатора, то блок Bm будет расти именно на цепи An.If the polymer ZC (= S) SA n is cleaned of unspent monomer and reacted with another monomer B in the presence of an initiator, then the block B m will grow precisely on the chain A n .
Фиг. 3. Формулы использованных в изобретении ОПЦ-агентов -S,S'-бис-(метил-2-изобутират)тритиокарбоната (МИБТК) и дитиобензоата циан-изопентановой кислоты (ЦКБ).FIG. 3. The formulas of the OPC agents used in the invention are -S, S'-bis- (methyl-2-isobutyrate) trithiocarbonate (MIBTC) and cyano-isopentanoic acid dithiobenzoate (CCB).
Фиг. 4. Схема ОПЦ-полимеризации в присутствии тритиокарбонатов (а) и дитиобензоатов (б)FIG. 4. Scheme of OPC polymerization in the presence of (a) trithiocarbonates and (b) dithiobenzoates
Фиг. 5. Результаты трансфекции клеток СНО препаратами сополимеров в комплексе с плазмидной ДНК pCMVluc в соотношении N:P: (а) 7.5, (б) 15.FIG. 5. The results of transfection of CHO cells with copolymer preparations in combination with plasmid DNA pCMVluc in the ratio N: P: (a) 7.5, (b) 15.
ПОПГА - поли(олигопропиленгликольакрилат); ПДМАЭМА - поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилат); ПЭИ 25 кД - разветвленный полиэтиленимин, 25 кД.POPGA - poly (oligopropylene glycol acrylate); PDMAEMA - poly (N, N-dimethylaminoethyl methacrylate); PEI 25 kD - branched polyethyleneimine, 25 kD.
Фиг. 6. Результаты трансфекции клеток CHO-luc препаратами сополимеров в комплексе с миРНК к гену светляковой люциферазы (миРНК-luc) и неспецифической миРНК к Р гену респираторно-синцитиального вируса (миРНК-RSV).FIG. 6. Results of transfection of CHO-luc cells with copolymer preparations in complex with siRNA to the firefly luciferase gene (siRNA-luc) and nonspecific siRNA to the R gene of the respiratory syncytial virus (siRNA-RSV).
ПОПГА - поли(олигопропиленгликольакрилат); ПДМАЭМА - поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилат).POPGA - poly (oligopropylene glycol acrylate); PDMAEMA - poly (N, N-dimethylaminoethyl methacrylate).
Claims (3)
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014145246A RU2617059C2 (en) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Method for production of amphiphilic block copolymers n, n-dimethylaminoethyl methacrylate for nucleic acid delivery to living cells |
EA201501099A EA029146B1 (en) | 2014-11-11 | 2015-10-08 | Method for production of cationic amphiphilic block copolymers of n,n-dimethylaminoethyl methacrylate for nucleic acid delivery to living cells |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014145246A RU2617059C2 (en) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Method for production of amphiphilic block copolymers n, n-dimethylaminoethyl methacrylate for nucleic acid delivery to living cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014145246A RU2014145246A (en) | 2016-06-10 |
RU2617059C2 true RU2617059C2 (en) | 2017-04-19 |
Family
ID=56114720
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014145246A RU2617059C2 (en) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Method for production of amphiphilic block copolymers n, n-dimethylaminoethyl methacrylate for nucleic acid delivery to living cells |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EA (1) | EA029146B1 (en) |
RU (1) | RU2617059C2 (en) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102017217620A1 (en) * | 2017-10-04 | 2019-04-04 | Evonik Röhm Gmbh | Process for the preparation of dimethylaminoalkyl (meth) acrylates |
EP3652139B1 (en) | 2018-05-23 | 2020-09-23 | Evonik Operations GmbH | Method for preparing keto-functionalized aromatic (meth)acrylates |
MX2021000530A (en) | 2018-07-17 | 2021-06-08 | Evonik Operations Gmbh | Method for preparing c-h acidic (meth)acrylates. |
EP3599232A1 (en) | 2018-07-26 | 2020-01-29 | Evonik Operations GmbH | Method for the preparation of n-methyl(meth)acrylamide |
CN109337084B (en) * | 2018-09-10 | 2021-02-12 | 天津理工大学 | Preparation method of intelligent gene vector with active oxygen and pH dual responsiveness and charge reversal characteristics |
CN115368523B (en) * | 2022-09-19 | 2024-03-19 | 安徽农业大学 | Multi-block thermoplastic elastomer and preparation method thereof |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050175710A1 (en) * | 2002-07-29 | 2005-08-11 | Bernhard Sabel | Use of nanoparticles for the DNA administration to a target organ |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7018655B2 (en) * | 2002-03-18 | 2006-03-28 | Labopharm, Inc. | Amphiphilic diblock, triblock and star-block copolymers and their pharmaceutical compositions |
KR101024742B1 (en) * | 2007-12-31 | 2011-03-24 | 주식회사 삼양사 | Amphiphilic Block Copolymer Micelle Composition Containing Taxane and Manufacturing Process of The Same |
-
2014
- 2014-11-11 RU RU2014145246A patent/RU2617059C2/en active
-
2015
- 2015-10-08 EA EA201501099A patent/EA029146B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050175710A1 (en) * | 2002-07-29 | 2005-08-11 | Bernhard Sabel | Use of nanoparticles for the DNA administration to a target organ |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Aditi M. Jhaveri et al. Multifunctional polymeric micelles for delivery of drugs and siRNA / Frontiers in Pharmacology, April 2014, Vol.5, pp.1-26. Nikos Hadjichristidis et al. Linear and non-linear triblock terpolymers. Synthesis, self-assembly in selective solvents and in bulk / Progress in Polymer Science, 2005, Vol.30, pp.725-782. Черникова Е.В. Псевдоживая радикальная гомо- и сополимеризация по механизму обратимой передачи цепи / Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук, 2010, 325 с.. Xian Jun Lo. Poly(DMAEMA-co-PPGMA): Dual-Responsive ‘‘Reversible’’ Micelles / Journal of Applied Polymer Science, 2012, pp.1-9. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2014145246A (en) | 2016-06-10 |
EA029146B1 (en) | 2018-02-28 |
EA201501099A3 (en) | 2016-11-30 |
EA201501099A2 (en) | 2016-07-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2617059C2 (en) | Method for production of amphiphilic block copolymers n, n-dimethylaminoethyl methacrylate for nucleic acid delivery to living cells | |
Tan et al. | Polycation architecture and assembly direct successful gene delivery: micelleplexes outperform polyplexes via optimal DNA packaging | |
Agarwal et al. | PDMAEMA based gene delivery materials | |
Wagner | Polymers for siRNA delivery: inspired by viruses to be targeted, dynamic, and precise | |
US10172956B2 (en) | Polymeric nanoparticles | |
Tiera et al. | Synthetic and natural polycations for gene therapy: state of the art and new perspectives | |
Chang et al. | A combination of guanidyl and phenyl groups on a dendrimer enables efficient siRNA and DNA delivery | |
RU2715227C2 (en) | Composition for introducing nucleic acid into cells | |
US12064484B2 (en) | Compositions for introducing RNA into cells | |
Truong et al. | Self-catalyzed degradable cationic polymer for release of DNA | |
US20090068743A1 (en) | Cationic alpha-amino acid-containing biodegradable polymer gene transfer compositions | |
Yu et al. | Bioresponsive polymers for nonviral gene delivery | |
Kundu et al. | Synthetic polymeric vectors in gene therapy | |
CA3183351A1 (en) | Poly(amine-co-ester) polymers with modified end groups and enhanced pulmonary delivery | |
Zhou et al. | Branched glycerol-based copolymer with ultrahigh p65 siRNA delivery efficiency for enhanced cancer therapy | |
Zeng et al. | Amino acid-functionalized dendritic polyglycerol for safe and effective siRNA delivery | |
Shuai et al. | mRNA delivery via non-viral carriers for biomedical applications | |
Fröhlich et al. | Peptide-and polymer-based delivery of therapeutic RNA | |
Yan et al. | Structural exploration of polycationic nanoparticles for siRNA delivery | |
WO2011120953A1 (en) | Polymers for delivering molecules of interest | |
Soni | Strategies and approaches for siRNA delivery | |
Cheng | Polymeric Gene Delivery Systems | |
William et al. | Application of Bioresponsive Polymers in Gene Delivery | |
Lote | Synthesis and Evaluation of Oligospermines for Nucleic Acid Delivery | |
JP2009274997A (en) | Gene transfer agent, method for producing the same and nucleic acid complex |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HE9A | Changing address for correspondence with an applicant |