EA029146B1 - Method for production of cationic amphiphilic block copolymers of n,n-dimethylaminoethyl methacrylate for nucleic acid delivery to living cells - Google Patents
Method for production of cationic amphiphilic block copolymers of n,n-dimethylaminoethyl methacrylate for nucleic acid delivery to living cells Download PDFInfo
- Publication number
- EA029146B1 EA029146B1 EA201501099A EA201501099A EA029146B1 EA 029146 B1 EA029146 B1 EA 029146B1 EA 201501099 A EA201501099 A EA 201501099A EA 201501099 A EA201501099 A EA 201501099A EA 029146 B1 EA029146 B1 EA 029146B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- dithiobenzoate
- polymer
- mol
- dimethylaminoethyl methacrylate
- block
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F2/00—Processes of polymerisation
- C08F2/38—Polymerisation using regulators, e.g. chain terminating agents, e.g. telomerisation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F10/00—Homopolymers and copolymers of unsaturated aliphatic hydrocarbons having only one carbon-to-carbon double bond
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F293/00—Macromolecular compounds obtained by polymerisation on to a macromolecule having groups capable of inducing the formation of new polymer chains bound exclusively at one or both ends of the starting macromolecule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
Abstract
Description
Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, молекулярной биологии и медицины и может быть использовано для генной терапии наследственных, онкологических и инфекционных заболеваний. Заявляемый способ синтеза катионных амфифильных блок-сополимеров для трансфекции эукариотических клеток, отличающийся использованием псевдоживых методов радикальной полимеризации и тем, что в структуре всех синтезируемых блок-сополимеров присутствует катионный блок слабого полиамина - полиЩЫ-диметиламиноэтилметакрилата), и гидрофобный блок, представляющий собой полимер или олигомер разветвленного или щеточного строения - поли(олигопропиленгликольакрилат), включает на первом этапе получение полимерного агента обратимой передачи цепи на основе Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата путем полимеризации Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата в присутствии 0.01-0.001 моль/л динитрила азоизомасляной кислоты и 0.1-0.01 моль/л раствора дитиобензоатного (дитиобензоат цианизопентановой кислоты) или тритиокарбонатного (8,8'-бис-(метил-2изобутират)тритиокарбонат) агента обратимой передачи цепи, в результате чего образуется полимер Ν,Νдиметиламиноэтилметакрилата, содержащий тритиокарбонатную или дитиобензоатную группу, на втором этапе полученный полимер (0.1-0.01 моль/л) и динитрил азоизомасляной кислоты (0.01-0.001 моль/л) растворяется в смеси олигопропиленгликольакрилат/бензол (3:7) и проводится полимеризация при 80°С в течение 24-48 ч, полученный блок-сополимер выделяется из раствора с последующим лиофильным высушиванием в вакууме. Полученные препараты амфифильных катионных сополимеров проявили высокую трансфекционную активность как при трансфекции культуры клеток плазмидной ДНК, так и миРНК, сравнимую или даже превосходящую эффективность, достигнутую с использованием препаратов сравнения.The invention relates to the field of chemistry of high-molecular compounds, molecular biology and medicine and can be used for gene therapy of hereditary, oncological and infectious diseases. The inventive method for the synthesis of cationic amphiphilic block copolymers for transfection of eukaryotic cells, characterized by the use of pseudo-living radical polymerization methods and the fact that the structure of all synthesized block copolymers contains a cationic block of a weak polyamine - poly-dimethylaminoethyl methacrylate), and a hydrophobic block that represents a polymer presenting a polymethrin polymer (a poly-dimethylaminoethyl methacrylate), and a hydrophobic block representing a polymer presenting a polymer that is a polymer presenting a polymethylene polymethylamine) branched or brush structure - poly (oligopropylene glycol acrylate), includes at the first stage the preparation of a reversible transfer polymer agent Ep on the basis of Ν, Ν-dimethylaminoethyl methacrylate by polymerization of Ν, имет-dimethylaminoethyl methacrylate in the presence of 0.01-0.001 mol / l of azoisobutyric acid dinitrile and 0.1-0.01 mol / l of a solution of ditiobenzoate solution (), using a set of 0-iso-butyric acid and 0.1-0.01 mol / l of a solution of dithiobenzoate acid (), using a set of tiisobenzoate acid) (methyl 2-isobutyrate) tritiocarbonate) a reversible chain transfer agent, resulting in a polymer Ν, Ν dimethylaminoethyl methacrylate, containing a tritiocarbonate or dithiobenzoate group, in the second stage, the polymer (0.1-0.01 mol / l) and the dinitrile azoisomaslyan nd acid (0.01-0.001 mol / l) was dissolved in a mixture oligopropilenglikolakrilat / benzene (3: 7) and the polymerization is carried out at 80 ° C for 24-48 hours, the resulting block copolymer out of solution, followed by freeze-drying in vacuo. The resulting amphiphilic cationic copolymer preparations showed a high transfection activity both when transfecting a cell culture with plasmid DNA and miRNA, comparable or even exceeding the efficiency achieved using reference preparations.
029146029146
Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, молекулярной биологии и медицины и может быть использовано для генной терапии наследственных, онкологических и инфекционных заболеваний. Использование этого изобретения возможно для лечения вирусных заболеваний, для которых разработаны вирусоспецифические антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, ДНКзимы или миРНК, способные эффективно подавлять репродукцию вирусов. Изобретение может быть также использовано для доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки ίη νίίτο для получения трансгенных эукариотических линий.The invention relates to the field of chemistry of high-molecular compounds, molecular biology and medicine and can be used for gene therapy of hereditary, oncological and infectious diseases. The use of this invention is possible for the treatment of viral diseases for which virus-specific antisense oligonucleotides, ribozymes, DNAzymes or miRNAs have been developed that can effectively suppress the reproduction of viruses. The invention can also be used to deliver nucleic acids in eukaryotic cells ίη νίίτο to produce transgenic eukaryotic lines.
Уровень техникиThe level of technology
Нуклеиновые кислоты, кодирующие различные гены, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, аптамеры и малые интерферирующие РНК могли бы быть идеальными по избирательности действия лекарственными веществами. Однако нуклеиновые кислоты практически не проникают в живые клетки вследствие высокой плотности отрицательного заряда, одноименного по отношению к заряду клеточной мембраны. Поэтому создание носителей, способных обратимо связывать нуклеиновые кислоты, доносить их до клеточной мембраны и высвобождать в цитозоле или ядре, могло бы существенно расширить арсенал лекарственных средств для борьбы с различными заболеваниями как инфекционной, так и метаболической этиологии.Nucleic acids encoding various genes, antisense oligonucleotides, ribozymes, aptamers and small interfering RNAs could be ideal for the selective action of drugs. However, nucleic acids practically do not penetrate into living cells due to the high density of the negative charge, which is the same with respect to the charge of the cell membrane. Therefore, the creation of carriers capable of reversibly binding nucleic acids, bringing them to the cell membrane and releasing in the cytosol or nucleus, could significantly expand the arsenal of drugs to combat various diseases of both infectious and metabolic etiology.
В последние два десятилетия генной терапии как методу лечения вирусных инфекций уделяется существенное внимание. Усилия исследователей в данный момент фокусируются на создании эффективного трансфецирующего агента для генной терапии, который компактизует и защитит генетический материал от нуклеаз сыворотки крови и будет способствовать его проникновению в клетки-мишени [1].In the past two decades, gene therapy as a method of treating viral infections has received considerable attention. The efforts of researchers are currently focused on creating an effective transfecting agent for gene therapy, which compacts and protects genetic material from serum nucleases and will facilitate its penetration into target cells [1].
Невирусные носители, такие как катионные липиды, дендримеры и пептиды, все способны компактазовать и связывать нуклеиновые кислоты (НК), способствуя их проникновению в клетки. Однако, в отличие от вирусных аналогов, у которых развиты способы преодолевать клеточные барьеры и механизмы иммунного ответа в организме, невирусные носители НК показывают гораздо меньшую транфецирующую способность, так как они задерживаются многочисленными вне- и внутриклеточными защитными барьерами. Однако биосовместимость и возможность синтеза этих соединений делают их очень привлекательными для использования в генной терапии. В результате, в течение последних десяти лет, многочисленные исследования были посвящены получению катионных соединений, которые могут образовывать комплексы с НК и преодолевать клеточные барьеры [1, 2].Non-viral carriers such as cationic lipids, dendrimers, and peptides are all capable of compacting and binding nucleic acids (NK), facilitating their entry into cells. However, unlike viral analogues, which have developed ways to overcome cellular barriers and immune response mechanisms in the body, non-viral NK carriers show much less transfective capacity, as they are retained by numerous extracellular and intracellular protective barriers. However, the biocompatibility and the ability to synthesize these compounds make them very attractive for use in gene therapy. As a result, over the past ten years, numerous studies have been devoted to the production of cationic compounds that can form complexes with NK and overcome cell barriers [1, 2].
Первым барьером, который необходимо преодолеть полиплексу на пути до клетки-мишени, является кровь и внеклеточная среда. Именно поэтому необходимо подобрать такие физико-химические параметры комплекса, чтобы увеличить его стабильность, избежать неспецифических взаимодействий и возможности иммунного ответа. Во-первых, в составе полиплекса ДНК должна быть защищена от действия внеклеточных нуклеаз. Во-вторых, отрицательно заряженные белки сыворотки крови (альбумин, фибриноген, иммуноглобулины и др.), а также белки внеклеточного матрикса (коллагены) способны адсорбироваться на поверхности заряженных полиплексов, что ведет за собой изменение поверхностного заряда полиплексов, приводит к увеличению размера комплексов и к их агрегации.The first barrier that the polyplex needs to overcome on the way to the target cell is blood and the extracellular environment. That is why it is necessary to select such physico-chemical parameters of the complex in order to increase its stability, avoid nonspecific interactions and the possibility of an immune response. First, the composition of the DNA polyplex must be protected from the action of extracellular nucleases. Secondly, negatively charged serum proteins (albumin, fibrinogen, immunoglobulins, etc.), as well as extracellular matrix proteins (collagens) are able to adsorb on the surface of charged polyplexes, which leads to a change in the surface charge of the polyplexes, leads to an increase in the size of the complexes and to their aggregation.
Следующим этапом доставки генетического материала в клетки-мишени является их взаимодействие с плазматической мембраной и поглощение клеткой. Связывание полиплексов с клетками происходит в результате электростатического взаимодействия с отрицательно заряженной (за счет отрицательно заряженных поверхностных мембранных белков - протеогликанов) плазматической мембраной. В большинстве случаев такие полиплексы поглощаются путём неспецифического эндоцитоза. Для эффективного проникновения через плазматическую мембрану клетки оптимальным значением размера комплекса ДНК-поликатион является 70-90 нм.The next step in the delivery of genetic material into target cells is their interaction with the plasma membrane and cell uptake. The binding of polyplexes to cells occurs as a result of electrostatic interaction with a negatively charged (due to negatively charged surface membrane proteins - proteoglycans) plasma membrane. In most cases, such polyplexes are absorbed by nonspecific endocytosis. For effective penetration through the plasma membrane of the cell, the optimal size of the DNA polycation complex is 70-90 nm.
Одним из самых важных этапов транспортного пути полиплексов является их выход из эндосом. Эндосомы представляют собой везикулы с белково-липидной мембраной, функция которых состоит в транспорте белков в определенные части клетки. За счёт работы протонных насосов в них понижается рН (рН 6.5). Дальнейший транспорт может идти либо по пути рециркуляции с выбросом поглощённых молекул во внемембранное пространство, либо по литическому пути, когда происходит дальнейшее закисление среды в поздних эндосомах, и макромолекулы поступают в лизосомы. В лизосомах содержимое закисляется до рН 5, и поглощенные молекулы деградируют под действием гидролитических ферментов, которые активны при низком рН. Продукты деградации удаляются из клетки путём экзоцитоза или переносятся в цитоплазму, где используются как строительный материал [3].One of the most important stages of the transport path of polyplexes is their exit from the endosomes. Endosomes are vesicles with a protein-lipid membrane, the function of which is to transport proteins to certain parts of the cell. Due to the work of proton pumps, their pH decreases (pH 6.5). Further transport can go either along the recirculation path with the release of the absorbed molecules into the non-membrane space, or along the political path, when further medium acidification occurs in the late endosomes, and the macromolecules enter the lysosomes. In lysosomes, the contents are acidified to pH 5, and the absorbed molecules are degraded by the action of hydrolytic enzymes, which are active at low pH. Degradation products are removed from the cell by exocytosis or transferred to the cytoplasm, where they are used as a building material [3].
Выйдя из лизосом, полиплексы оказываются в цитозоле, после чего комплекс диссоциирует на свободный поликатион и ДНК. Считается, что это происходит за счёт конкуренции за катионные группы между фосфатными группами ДНК и низкомолекулярными соединениями и анионами цитоплазмы. В некоторых случаях диссоциация комплекса происходит, по-видимому, в ядре. Главным барьером на пути плазмидной ДНК в клеточное ядро служит двойная ядерная оболочка. Через ядерный поровой комплекс путём пассивной диффузии могут проходить только маленькие молекулы (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после диссоциации комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет сигнала ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмидной ДНК (не более 0,1-0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1-2 чAfter leaving the lysosomes, the polyplexes end up in the cytosol, after which the complex dissociates into a free polycation and DNA. It is believed that this occurs due to competition for cationic groups between DNA phosphate groups and low molecular weight compounds and cytoplasmic anions. In some cases, the dissociation of the complex occurs, apparently, in the nucleus. The main barrier to plasmid DNA into the cell nucleus is the double nuclear envelope. Only small molecules (<40 kD, ~ 10 nm) can pass through the nuclear pore complex by passive diffusion. Since the free plasmid DNA released after the dissociation of the complex does not have a nuclear localization signal, a very small part of the plasmid DNA will pass into the nucleus (no more than 0.1-0.001%). In addition, it was found that about 50% of the injected DNA is degraded in the cytosol after 1-2 h
- 1 029146- 1 029146
после введения. В опухолевых клетках эта проблема решается за счет активной пролиферации: ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная мембрана растворяется.after the introduction. In tumor cells, this problem is solved by active proliferation: DNA easily penetrates into the nuclei of daughter cells during the mitotic cycle, when the nuclear membrane dissolves.
При доставке в клетку малых интерферирующих РНК проблема ядерного транспорта вообще не стоит, т.к. явление РНК-интерференции происходит в цитозоле. Однако в данном случае особенно важно, чтобы олигонуклеотид освободился от полимера-носителя и имел возможность связаться с белкамиWhen small interfering RNAs are delivered to the cell, the problem of nuclear transport is not at all, since the phenomenon of RNA interference occurs in the cytosol. However, in this case it is especially important that the oligonucleotide is free from the polymer carrier and has the ability to bind to proteins.
К18С.K18S.
Таким образом, для обеспечения эффективной доставки ДНК в клетки поликатионы должны обратимо взаимодействовать с ДНК, образуя стабильные положительно заряженные комплексы малого размера при физиологических значениях рН и ионной силы. Эти комплексы должны быть устойчивы к присутствию макромолекулярных компонентов биологических жидкостей и, наконец, молекулы ДНК, включенные в комплекс, должны быть защищены от биодеструкции.Thus, to ensure effective delivery of DNA into cells, polycations must reversibly interact with DNA, forming stable, positively charged complexes of small size at physiological pH and ionic strengths. These complexes must be resistant to the presence of macromolecular components of biological fluids and, finally, the DNA molecules included in the complex must be protected from biodegradation.
В настоящее время запатентован целый ряд подходов, основанных на использовании поликатионов для доставки ДНК в эукариотические клетки. Так, один из первых патентов, касающихся использования поликатионов для трансфекции живых клеток принадлежит фирме Кйопе-Рои1епс Коте. В нем предлагается использовать полиэтиленимин (ПЭИ) с молекулярной массой до 50 кДа для трансфекции эукариотических клеток [4]. Приблизительно в то же время было также предложено использовать для доставки ДНК полиэтиленимин, модифицированный углеводородными радикалами [5, 6].Currently, a number of approaches based on the use of polycations for the delivery of DNA to eukaryotic cells have been patented. Thus, one of the first patents concerning the use of polycations for the transfection of living cells belongs to the firm Kyope-Roilets Kote. It proposes the use of polyethyleneimine (PEI) with a molecular weight of up to 50 kDa for transfection of eukaryotic cells [4]. At about the same time, it was also proposed to use polyethyleneimine modified with hydrocarbon radicals for DNA delivery [5, 6].
Высокая трансфекционная автивность ПЭИ в значительной мере обусловлена тем, что данный полимер является слабым полиоснованием, и при рН 7, т.е. в среде окружающей клетку, протонирован лишь на 10-30%. При попадании в эндосомы и лизосомы, рН в которых составляет около 5-5.5, этот полимер протонируется, что приводит к повышению эндосомального рН. Это активирует эндосомальную Н+-АТФазу, которая начинает накачивать протоны во внутреннюю среду эндосом. В итоге это может приводить к осмотическому набуханию и лизису эндосомалыюй мембраны с выходом комплекса полимера и ДНК в цитозоль [7].The high transfectional avidity of PEI is largely due to the fact that this polymer is weakly based, and at pH 7, i.e. in the environment surrounding the cell, protonated only by 10-30%. When released into endosomes and lysosomes, the pH of which is about 5-5.5, this polymer is protonated, which leads to an increase in endosomal pH. This activates the endosomal H + -ATPase, which begins to pump protons into the internal environment of the endosomes. As a result, this can lead to osmotic swelling and lysis of the endosomal membrane with the release of the polymer and DNA complex in the cytosol [7].
Далее конструкции с участием ПЭИ были усовершенствованы. В частности, было предложено использовать этот же полимер с привитыми цепями полиэтиленгликоля, несущими на противоположном конце олигопептид ТАТ (пептидная последовательность оболочечного белка вируса иммунодефицита человека 1 типа), причем такой полимер эффективен для доставки генетического материала в легкие [8]. Полиэтиленимин также может усиливать трансфекцию в композиции с белками вызывающими компактизацию ДНК, например, с гистонами [9]. Позже было предложено использовать ПЭИ на стадии формирования комплекса с ДНК при пониженных значениях рН (3.5-4.5), что способствует более эффективной компактизации нуклеиновой кислоты [10]. Также было предложено использовать биодеградируемые аналоги ПЭИ, содержащие дисульфидные связи, подверженные расщеплению в восстановительных условиях, в том числе в живой клетке [11]. ПЭИ модифицированный остатками ароматических аминокислот было предложено использовать для доставки малых интерферирующих РНК [12].Further designs with the participation of PEI were improved. In particular, it was proposed to use the same polymer with grafted polyethylene glycol chains carrying TAT oligopeptide (peptide sequence of the type 1 human immunodeficiency virus envelope protein) at the opposite end, and this polymer is effective for delivering genetic material to the lungs [8]. Polyethyleneimine can also enhance transfection in combination with proteins that cause DNA compaction, for example, with histones [9]. Later it was proposed to use PEI at the stage of complex formation with DNA at lower pH values (3.5–4.5), which contributes to a more efficient compaction of nucleic acid [10]. It was also proposed to use biodegradable PEI analogues containing disulfide bonds that are susceptible to cleavage under reducing conditions, including in a living cell [11]. PEI modified by aromatic amino acid residues has been proposed to be used for the delivery of small interfering RNA [12].
Существует целый ряд патентов, в которых в качестве поликатионной основы для трансфекции клеток используется поли-Ь-лизин (ПЛ). Этот полимер, а также целый ряд карбоцепных полимеров с первичными аминогруппами (полиаллиламин, поли(аминоэтилметакрилат и др.) были предложены для компактизации ДНК [13]. Хотя сам по себе этот полипептид неэффективен для доставки ДНК, он может служить удобной платформой для создания модульных конструкций, содержащий пептидные последовательности, способствующие проникновению нуклеиновой кислоты в клетку (например, имидазольные группы) [14], а также рецептор-узнающие молекулы (углеводы, способные связываться с мембранными пектинами, гормоны, ΚΟΌ-пептиды и т.д.) [15].There are a number of patents in which poly-b-lysine (PL) is used as a polycationic basis for transfecting cells. This polymer, as well as a number of chain-chain polymers with primary amino groups (polyallylamine, poly (aminoethyl methacrylate, etc.) have been proposed for DNA compaction [13]. Although this polypeptide itself is not effective for delivering DNA, it can serve as a convenient platform for creating modular constructs containing peptide sequences that promote the penetration of nucleic acid into the cell (for example, imidazole groups) [14], as well as receptor-recognizing molecules (carbohydrates that can bind to membrane pectins, hormone s, ΚΟΌ-peptides, etc.) [15].
Существует также целый ряд способов доставки нуклеиновых кислот в клетки, основанных на использовании природного полисахарида хитозана и его производных. Так, было показано, что фракционирование частично деполимеризованных препаратов хитозана по молекулярным массам с выделением фракции, содержащей около 18 звеньев (разброс от 15 до 21 звена) приводит к трехкратном/повышению эффективности трансфекции [16]. Модификация хитозана имидазолуксусной кислотой с помощью Νэтил-Ы'-изопропилкарбодиимида приводит к повышению его трансфецирующей активности почти на 2 порядка [17].There are also a number of ways to deliver nucleic acids into cells based on the use of the natural polysaccharide chitosan and its derivatives. Thus, it was shown that the fractionation of partially depolymerized chitosan preparations according to molecular masses with the release of a fraction containing about 18 units (range from 15 to 21 units) leads to a threefold / increase in the efficiency of transfection [16]. Modification of chitosan with imidazole acetic acid with ethyl-L'-isopropylcarbodiimide leads to an increase in its transfecting activity by almost 2 orders of magnitude [17].
Наиболее близким к патентуемому способу является метод доставки ДНК в клетки с помощью катионных полимерных частиц, состоящих из полиакрилатов, полиметакрилатов, в том числе поли(Ы,Ы диметиламиноэтилметакрилата), полиалкилцианоакрилатов, предпочтительно, полибутилцианоакрилатов, полиариламидов, полилактатов, полигликолятов, полиортоэфиров, желатины, полисахаридов, альбумина, полистирола, поливиниловых эфиров, полиакролеина, полиглутарового альдегида и его производных, их сополимеров и смесей [18]. Полимерный носитель, заявленный в данном патенте, представляет собой твердые частицы полибутилцианоакрилата, покрытые катионными полимерами и ПАВ Т\\ееп 80 для стабилизации частиц в водном растворе.The closest to the claimed method is a DNA delivery method in the cells using the cationic polymer particles consisting of polyacrylates, polymethacrylates, including poly (N, N dimethylaminoethyl) polialkiltsianoakrilatov preferably polybutylcyanoacrylate, Polyarylamide, polylactate, poliglikolyatov, polyorthoesters, gelatin, polysaccharides, albumin, polystyrene, polyvinyl ethers, polyacrolein, polygluteraldehyde and its derivatives, their copolymers and mixtures [18]. The polymer carrier claimed in this patent is solid particles of polybutylcyanoacrylate, coated with cationic polymers and surfactants T \\ eep 80 for stabilizing particles in aqueous solution.
Носитель для доставки ДНК, патентуемый в настоящей заявке, представляет собой блок-сополимер с узким молекулярно-массовым распределением. Данное соединение содержит гидрофобный и гидрофильный блоки, т.е. имеет амфифильное строение. В водном растворе этот блок-сополимер образует ми- 2 029146The carrier for the delivery of DNA, patented in this application, is a block copolymer with a narrow molecular weight distribution. This compound contains hydrophobic and hydrophilic blocks, i.e. has an amphiphilic structure. In aqueous solution, this block copolymer forms a mi-2 029146
целлы, размер которых сильно зависит от температуры раствора.cella, the size of which strongly depends on the temperature of the solution.
Другим аналогом предлагаемого подхода является серия патентов на получение липополиаминов, в которых предлагается использовать для доставки ДНК полиэтиленимин, модифицированный гидрофобными радикалами [6, 19]. Показано, что такая модификация увеличивает трансфекционную активность полиамина, однако при этом заметно увеличивается его цитотоксичность.Another analogue of the proposed approach is a series of patents for the preparation of lipopolyamines, in which it is proposed to use polyethyleneimine modified with hydrophobic radicals for DNA delivery [6, 19]. It is shown that this modification increases the transfection activity of the polyamine, however, its cytotoxicity increases markedly.
В настоящем изобретении поставлена задача создания поликатионного носителя, способного дестабилизировать эндосомальные мембраны не только за счет эффекта протонной губки, но и за счет структуры его гидрофобного блока. Для этого были синтезированы носители поликатионной природы, имеющие блочное строение, и содержащие в своем катионном блоке слабый полиамин поли(Ы,П-диметиламиноэтилметакрилат) (ПДМАЭМА), а в гидрофобном - поли(олигопропиленгликольакрилат) (ПОПГА). Для синтеза блок-сополимеров была использована радикальная полимеризация в условиях обратимой передачи цепи (ОПЦ-полимеризация), обеспечивающая узкое молекулярно-массовое распределение.In the present invention, the task is to create a polycationic carrier capable of destabilizing endosomal membranes not only due to the effect of the proton sponge, but also due to the structure of its hydrophobic block. For this, polycation carriers with a block structure and containing weak polyamine poly (S, P-dimethylaminoethyl methacrylate) (PDMAEMA) in their cation block, and poly (oligopropylene glycol acrylate) (PAHA) were synthesized in their cation block. For the synthesis of block copolymers, radical polymerization was used under conditions of reversible chain transfer (OPC-polymerization), providing a narrow molecular weight distribution.
Признаками, отличающими настоящее изобретение от аналогов являются катионный носитель для трансфекции имеет блочное строение;Signs that distinguish the present invention from analogs are cationic carrier for transfection has a block structure;
катионный блок представляет собой слабый полиамин, содержащий вторичные или третичные аминогруппы;the cationic block is a weak polyamine containing secondary or tertiary amino groups;
гидрофобный блок представляет собой полимер или олигомер разветвленного или щеточного строения, содержащий гидрофобные полиалкиленоксиды или другие гибкоцепные полимеры, характеризующиеся нижней критической температурой растворения (НКТР);the hydrophobic block is a polymer or oligomer of a branched or brush structure containing hydrophobic polyalkylene oxides or other flexible-chain polymers characterized by a lower critical dissolution temperature (LCTR);
блок-сополимер имеет узкое молекулярно-массовое распределение; блок-сополимер способен образовывать мицеллы в водном растворе; мицеллообразование блок-сополимера зависит от температуры;the block copolymer has a narrow molecular weight distribution; the block copolymer is capable of forming micelles in aqueous solution; micelle formation of block copolymer depends on temperature;
блок-сополимер взаимодействует с нуклеиновыми кислотами в водно-солевом буферном растворе, вызывая их компактизацию;the block copolymer interacts with nucleic acids in water-salt buffer solution, causing their compaction;
структура и размер комплексов блок-сополимеров с нуклеиновыми кислотами зависят от температуры;the structure and size of complexes of block copolymers with nucleic acids depend on temperature;
трансфекционная активность носителей превышает активность полиэтиленимина (25 кДа) и сопоставима с активностью коммерческого препарата ЫроГесПтше 2000 (ЧпуПгодсп. США).transfectional activity of the carriers exceeds the activity of polyethylenimine (25 kDa) and is comparable to the activity of the commercial drug, TroGest 2000, (CpodPodsp. USA).
Раскрытие изобретенияDISCLOSURE OF INVENTION
Способ получения блок-сополимеров поли(Ы,П-диметиламиноэтилметакрилата) (ПДМАЭМА) и поли(олигопропиленгликольакрилата) ПОПГА основан на радикальной полимеризации в условиях обратимой передачи цепи [20]. Данный подход основан на том, что тиокарбонильные соединения 2С(=8)8К (ОПЦ-агенты) обратимо реагируют с радикалом роста, образуя интермедиаты Ιηΐ1 и Ιηΐ2, способные расщепляться по радикальному механизму; в ходе этих реакций в системе регенерируются макрорадикалы Ρη· или Рт·, способные участвовать в реакции роста цени вплоть до следующего акта взаимодействия с ОПЦ-агентом (фиг. 1), вследствие чего радикальная полимеризация приобретает черты живых анионных процессов [21, 22, 23].The method for producing poly (S, P-dimethylaminoethyl methacrylate) (PDMAEMA) and poly (oligopropylene glycol acrylate) block copolymers POPGA is based on radical polymerization under conditions of reversible chain transfer [20]. This approach is based on the fact that thiocarbonyl compounds 2C (= 8) 8K (OPC agents) react reversibly with the growth radical, forming the ΙΙΐ1 and Ιηΐ2 intermediates capable of splitting by a radical mechanism; In the course of these reactions, macroradicals Ρ η · or Р t · are regenerated in the system, capable of participating in the price growth reaction up to the next interaction act with the OPC agent (Fig. 1), as a result of which the radical polymerization acquires the features of living anionic processes [21, 22 , 23].
Данный подход к синтезу полимеров имеет два существенных достоинства с точки зрения полимерного дизайна вообще и создания полимерных носителей для биологически активных соединений в частности.This approach to the synthesis of polymers has two significant advantages from the point of view of polymer design in general and the creation of polymer carriers for biologically active compounds in particular.
Во-первых, при его использовании молекулярная масса полимера линейно растет по мере расходования мономера в реакционной смеси, т.е. с ростом конверсии. При этом полученный полимер, как правило, имеет более узкое молекулярно-массовое распределение, чем полимер, полученный методом классической радикальной полимеризации.First, when it is used, the molecular weight of the polymer increases linearly as the monomer is consumed in the reaction mixture, i.e. with increasing conversion. At the same time, the polymer obtained, as a rule, has a narrower molecular weight distribution than the polymer obtained by the method of classical radical polymerization.
Во-вторых, данный подход открывает широкие перспективы получения блок-сополимеров с контролируемой последовательностью и длиной блоков. Дело в том, что большинство макромолекул, образовавшихся в условиях ОПЦ-полимеризации, содержат группы ОПЦ-агента. Поэтому если такой полимер 2С(=8)8Ап очистить от не израсходовавшегося мономера и ввести в реакцию с другим мономером В в присутствии инициатора, то блок Вт будет расти именно на цепи Ап, как показано на фиг. 2.Secondly, this approach opens up broad prospects for obtaining block copolymers with controlled sequence and block length. The fact is that the majority of macromolecules formed under the conditions of OPC-polymerization contain groups of OPC-agent. Therefore, if such a polymer 2C (= 8) 8A p is cleared of unused monomer and reacted with another monomer B in the presence of an initiator, then the block B t will grow exactly on the chain A p , as shown in FIG. 2
В аспекте биомедицинских приложений полимеров, полученных с помощью ОПЦ-полимеризации, актуальным является вопрос о токсичности ОПЦ-агента, входящего в состав полимера. Этот вопрос исследовался в литературе, и полученные результаты показывают, что уровень токсичности полимеров, полученных методом ОПЦ-полимеризации, сильно зависит от типа клеток и используемого ОПЦ-агента [24, 25]. Так, клетки макрофагальной линии Ра\\'264.7 более чувствительны к полимерам, полученным с помощью ОПЦ-полимеризации, чем фибробластоидная линия ΝΙΗ3Τ3 или клетки яичников китайского хомячка СНО.In the aspect of biomedical applications of polymers obtained using OPC-polymerization, the question of the toxicity of OPC-agent included in the polymer is relevant. This question has been studied in the literature, and the results show that the level of toxicity of polymers obtained by the OPC-polymerization method strongly depends on the cell type and the OPC-agent used [24, 25]. Thus, the cells of the macrophage line Pa \\ '264.7 are more sensitive to polymers obtained using OPC polymerization than the fibroblastoid line ΝΙΗ3-3 or the Chinese hamster ovary cells CHO.
В качестве реагента обратимой передачи цепи в данном изобретении использовали полимеры ПДМАЭМА и ПОПГ А, которые были получены с использованием двух типов агентов обратимой передачи цепи - 8,8'-бис-(метил-2-изобутират)тритиокарбоната (МИБТК) и дитиобензоата цианизопентановой кислоты (ЦКБ) (фиг. 3).As reagent of reversible chain transfer in the present invention, polymers PDMAEMA and POPG A were used, which were obtained using two types of agents of reversible chain transfer, 8.8'-bis- (methyl 2-isobutyrate) tritiocarbonate (MIBTC) and cyanisopentanoic acid dithiobenzoate (CCB) (Fig. 3).
В качестве агентов обратимой передачи цепи в данном изобретении использовали 8,8'-бис-(метил2-изобутират)тритиокарбонат (МИБТК) и дитиобензоат цианизопентановой кислоты (ЦКБ).As reversible chain transfer agents in this invention, 8,8'-bis- (methyl2-isobutyrate) tritiocarbonate (MIBTA) and cyanisopentanoic acid dithiobenzoate (CCB) were used.
- 3 029146- 3 029146
МИБТК является симметричным тритиокарбонатным ОПЦ-агентом и содержит две одинаковые лабильные С-δ связи, что обеспечивает рост полимерной цепи в два конца, давая возможность достаточно легко получать триблок-сополимеры типа АВА. При этом тритиокарбонатная группа -З-С(=З)-З - остается в центре полимерной цепи (фиг. 4а).MIBTK is a symmetric tritiocarbonate OPC agent and contains two identical labile C-δ bonds, which ensures the growth of the polymer chain at two ends, making it possible to obtain rather easily ABA-type triblock copolymers. At the same time, the tritiocarbonate group —S — C (= 3) —C — remains in the center of the polymer chain (Fig. 4a).
Дитиобензоатный ОПЦ-агент (ЦИБ) содержит только одну лабильную С-З-связь, поэтому в его присутствии остаток ОПЦ-агента РЬ-С(=З)З-, обеспечивающий реализацию псевдоживого механизма, находится на конце цепи. В этом случае добавление второго мономера к полимерному ОПЦ-агенту приводит к получению диблок-сополимера типа АВ, содержащего дитиобензоатную группу на конце цепи (фиг. 4б).The dithiobenzoate OPC agent (CIB) contains only one labile C-3 bond, therefore, in its presence, the residue of the PLC-agent Pb-C (= C) 3-, ensuring the implementation of the pseudo-living mechanism, is located at the end of the chain. In this case, the addition of a second monomer to the polymer OPC agent results in a diblock copolymer of type AB containing a dithiobenzoate group at the end of the chain (Fig. 4b).
Эффективный контроль ОПЦ-полимеризации возможен только в том случае, если равновесие в реакции образования интермедиата 1 (фиг. 2) сдвинуто вправо. В этом случае при фрагментации интермедиата образуется макромолекула, содержащая дитиоэфирную группу и способная выполнять функции полимерного ОПЦ-агента. Естественно, что соотношение констант скорости прямой и обратной реакции образования интермедиата 1, Ις,,/ΐν,,,ι. зависит от природы ОПЦ-агента и мономера.Effective control of OPC-polymerization is possible only if the equilibrium in the reaction of formation of intermediate 1 (Fig. 2) is shifted to the right. In this case, upon fragmentation of the intermediate, a macromolecule is formed, containing a dithioether group and capable of performing the functions of a polymeric OPC agent. Naturally, the ratio of the rate constants of the direct and inverse reactions of the formation of the intermediate 1, ,, / ΐν ,,, ι. depends on the nature of the OPC agent and monomer.
Блок-сополимеры на основе ДМАЭМА и ОПГА, полученные с помощью ОПЦ-полимеризации имеют индекс полидисперсности 1.2-1.9, предпочтительно 1.5. При этом степень полимеризации ПДМАЭМА варьирует от 100 до 300, предпочтительно около 200. Степень полимеризации блока ПОПГА может изменяться от 20 до 100, предпочтительно составляет 40-80, при этом в мономере ГЮПГА степень полимеризации пропиленгликоля должна варьироваться от 5 до 10 звеньев, предпочтительно должна составлять 7 звеньев.The block copolymers based on DMAEMA and OPGA obtained by OPC polymerization have a polydispersity index of 1.2-1.9, preferably 1.5. The degree of polymerization of PDMAEMA varies from 100 to 300, preferably about 200. The degree of polymerization of the OPAA unit can vary from 20 to 100, preferably 40-80, while in the monomer HUPHA the degree of polymerization of propylene glycol should vary from 5 to 10 units, preferably make up 7 links.
Блок-сополимеры ПДМАЭМА и ПОПГА имеют амфифильную природу, поэтому они склонны к агрегации в водном растворе с образованием мицелл. При физиологических условиях критическая концентрация мицеллообразования блок-сополимеров варьируется в диапазоне от 1 до 10 мкг/мл, предпочтительно составляет 2.5 мкг/мл, что на порядок меньше ККМ большинства полимерных ПАВ.The block copolymers PDMAEMA and POPGA are amphiphilic in nature, so they tend to aggregate in aqueous solution to form micelles. Under physiological conditions, the critical micelle concentration of block copolymers varies in the range from 1 to 10 μg / ml, preferably is 2.5 μg / ml, which is an order of magnitude smaller than the CMC of most polymeric surfactants.
Структура и стабильность мицелл зависят от концентрации низкомолекулярного электролита, рН и температуры раствора, причем с ростом температуры средний гидродинамический радиус мицелл увеличивается от 15 до 300 нм. Повышение ионной силы выше 0.15 М или рН выше 8.5 приводит к уменьшению размеров мицелл.The structure and stability of micelles depend on the concentration of a low-molecular-weight electrolyte, the pH and the temperature of the solution, and with an increase in temperature, the average hydrodynamic radius of micelles increases from 15 to 300 nm. An increase in ionic strength above 0.15 M or a pH above 8.5 leads to a decrease in the size of micelles.
Полученные блок-сополимеры взаимодействуют с ДНК в водном растворе с образованием комплексов, средний гидродинамический радиус которых составляет 100-150 нм, что более чем на порядок меньше гидродинамического радиуса свободной молекулы нуклеиновой кислоты. Тем не менее, размер комплексов сильно зависит от температуры, при которой они готовятся, причем наименьшие по размеру комплексы (около 70 нм) образуются при смешивании растворов нуклеиновой кислоты и блоксополимера нагретых до температуры +37°С. Комплексы несколько большего, но сходного по порядку величины, размера (около 100 нм) образуются при +4°С. Категорически не рекомендуется готовить комплексы при комнатной температуре, поскольку в этих условиях образуются чрезвычайно поли дисперсные частицы комплексов со средним гидродинамическим радиусом превышающим 300 нм, что может быть больше толщины мелких кровеносных капилляров, а значит использование таких комплексов ίη νίνο может приводить к эмболизации.The resulting block copolymers interact with DNA in an aqueous solution to form complexes, the average hydrodynamic radius of which is 100-150 nm, which is more than an order of magnitude smaller than the hydrodynamic radius of the free nucleic acid molecule. However, the size of the complexes strongly depends on the temperature at which they are prepared, and the smallest complexes (about 70 nm) are formed by mixing solutions of nucleic acid and block copolymer heated to a temperature of + 37 ° C. Complexes of a somewhat larger, but in order of magnitude, size (about 100 nm) are formed at + 4 ° C. It is strictly not recommended to prepare complexes at room temperature, since under these conditions extremely poly dispersed particles of complexes with an average hydrodynamic radius exceeding 300 nm are formed, which may be greater than the thickness of small blood capillaries, and therefore the use of such complexes ίη νίνο may lead to embolization.
Блок-сополимеры ПДМАЭМА и ПОПГА проявляют существенно меньшую цитотоксичность, чем гомополимеры ПДМАЭМА и ПЭИ, использованные в изобретении в качестве аналога. Наибольшая нетоксичная концентрация (ННК) блок-сополимеров для клеток рака яичников китайского хомяка СНО варьировалась в интервале от 20 до 50 мкг/мл в зависимости от состава, в то время как ННК гомополимера ПДМАЭМА составляет 12 мкг/мл, а ПЭИ - 4 мкг/мл. Таким образом, блок-сополимеры ПДМАЭМА и ПОПГА проявляют заметно меньшую цитотоксичность, чем ранее использовавшиеся аналоги.The block copolymers PDMAEMA and POPGA exhibit significantly less cytotoxicity than the homopolymers PDMAEMA and PEI used in the invention as an analog. The highest non-toxic concentration (NNA) of block copolymers for Chinese hamster CHO ovarian cancer cells ranged from 20 to 50 µg / ml depending on the composition, while the NOC of PDMAEMA homopolymer was 12 µg / ml and PEI was 4 µg / ml. Thus, block copolymers of PDMAEMA and POPGA exhibit markedly lower cytotoxicity than the previously used analogs.
Полученные блок-сополимеры проявляют высокую способность трансфецировать эукариотические клетки плазмидной ДНК. При этом наибольшую эффективность трансфекции плазмидной ДНК демонстрируют комплексы плазмидной ДНК с триблок-сополимерами ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ГЮПГА при составе комплекса, соответствующем молярному соотношению аминогрупп полимера к фосфатным группам нуклеиновой кислоты, Ν:Ρ = 7.5, и с диблок-сополимерами ПДМАЭМА-блок-ПОПГА при соотношении Ν:Ρ =15. Эффективность трансфекции плазмидной ДНК с использованием ПОПГА-блокПДМАЭМА-блок-ПОПГА (при соотношении Ν:Ρ = 7.5) была в 3 раза выше, чем у коммерчески доступного препарата ЫроГесОппте 2000 и ПЭИ.The resulting block copolymers exhibit a high ability to transfect eukaryotic plasmid DNA cells. At the same time, plasmid DNA complexes with PbPA-block-PDMAEMA-block-GUPHA triblock copolymers exhibit the highest efficiency of transfection of plasmid DNA with the composition of the complex corresponding to the molar ratio of polymer amino groups to the phosphate groups of nucleic acid, ин: Ρ = 7.5, and with diblock-copolymers PDMAEMA-block POPGA with the ratio: = 15. The efficiency of transfection of plasmid DNA using POPA-block PDMAEMA-block-POPA (with the ratio Ν: = 7.5) was 3 times higher than that of the commercially available preparation OroGesOptte 2000 and PEI.
Эти же блок-сополимеры проявили высокую способность доставлять в клетки малые интерферирующие РНК. Для оценки эффективности подавления гена-мишени в изобретении использовали две различные системы. Во-первых, культуру клеток СНО-1ис, стабильно трансфецированную геном светляковой люциферазы. Комплексы синтетической миРНК, направленной к гену люциферазы, и триблоксополимера ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА подавляют люциферазную активность на 89 и 93% при соотношении Ν:Ρ = 7.5 и 15 соответственно, что на 7 и 10% больше, чем у препарата сравнения ЫроГесЮтте 2000. Диблок-сополимеры ПДМАЭМА-блок-ПОПГА проявляют наибольшую эффективность при соотношении Ν:Ρ = 15 и вызывают подавление люциферазной активности на 80-90%, что близко к эффекту, оказываемому ЫроГес1атше 2000.These same block copolymers showed a high ability to deliver small interfering RNA into cells. To assess the effectiveness of suppressing the target genes in the invention, two different systems were used. First, a CHO-1c cell culture stably transfected with the firefly luciferase gene. Complexes of synthetic miRNAs directed to the luciferase gene and the POPA-block-PDMAEMA-block-POPGA triblock copolymer suppress luciferase activity by 89 and 93% with the ratio Ν: Ρ = 7.5 and 15, respectively, which is 7 and 10% more than the drug comparisons of ГroGesYutte 2000. PDMAEMA-block-POPGA diblock copolymers exhibit the greatest efficiency at a ratio of Ρ: = 15 and cause the suppression of luciferase activity by 80-90%, which is close to the effect exerted by ЫrHest1000.
- 4 029146- 4 029146
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Пример 1.Example 1
Синтез блок-сополимеров на основе реагентов обратимой передачи цепи поли(Ы,Ыдиметиламиноэтилметакрилат)дитиобензоата или поли(НЫ-диметиламиноэтилметакрилат)тритиокарбоната.Synthesis of block copolymers based on reagents for the reversible chain transfer of poly (S, Y, dimethylaminoethyl methacrylate) dithiobenzoate or poly (HY-dimethylaminoethyl methacrylate) tritiocarbonate.
Для синтеза полимерных агентов обратимой передачи цепи на основе Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата готовили раствор динитрила азоизомасляной кислоты в концентрации от 0.01 до 0.001 моль/л в свежеперегнанном диметиламиноэтилметакрилате. Полученный раствор добавляли к дитиобензоату цианизопентановой кислоты или 8,8'-бис-(метил-2-изобутират)тритиокарбонату в концентрации от 0.1 до 0.01 моль/л. Реакционную смесь заливали в ампулу, подсоединяли ее к вакуумной установке и дегазировали путем повторения циклов замораживания-размораживания до остаточного давления 5х10-3 мм рт.ст., затем ампулу отпаивали. Образец полимеризовали при 80°С в течение 24-48 ч. Полимер выделяли методом лиофильного высушивания из бензола на вакуумной установке. Образец охарактеризовывали методом гель-проникающей хроматографии. В результате, в зависимости от использованного ОПЦагента, получали поли(НЫ-диметиламиноэтилметакрилат)дитиобензоат (ПДМАЭМА-Б) или поли(Ы,Ыдиметиламиноэтилметакрилат)тритиокарбонат (ПДМАЭМА-ТК).For the synthesis of polymeric agents of reversible chain transfer based on Ν,-dimethylaminoethyl methacrylate, a solution of dinitrile of azoisobutyric acid in a concentration of 0.01 to 0.001 mol / l in freshly distilled dimethylaminoethyl methacrylate was prepared. The resulting solution was added to cyanisopentanoic acid dithiobenzoate or 8,8'-bis- (methyl-2-isobutyrate) tritiocarbonate in a concentration of 0.1 to 0.01 mol / l. The reaction mixture was poured into an ampoule, connected to a vacuum unit and degassed by repeating freeze-thaw cycles to a residual pressure of 5x10 -3 mm Hg, then the ampoule was sealed off. The sample was polymerized at 80 ° C for 24-48 hours. The polymer was isolated by freeze drying from benzene in a vacuum unit. The sample was characterized by gel permeation chromatography. As a result, depending on the OPCAGENT used, poly (HH-dimethylaminoethyl methacrylate) dithiobenzoate (PDMAEMA-B) or poly (S, Ydimethylaminoethyl methacrylate) tritiocarbonate (PDMAEMA-TK) was obtained.
Для синтеза диблок-сополимера ПДМАЭМА-блок-ПОПГ А на основе монофункционального ОПЦагента дитиобензоата цианизопентановой кислоты готовили раствор динитрила азоизомасляной кислоты (0.01-0.001 моль/л) в смеси олигопропиленгликольакрилат/бензол (3:7) и добавляли его к полимерному ОПЦ-агенту (ПДМАЭМА-Б, 0.1-0.01 моль/л). Полученную смесь заливали в ампулу и дегазировали на вакуумной установке, ампулу отпаивали и помешали в термостат, разогретый до 80°С на 24-48 ч. По окончании полимеризации ампулу вскрывали, содержимое растворяли в избытке бензола и далее отгоняли растворитель на роторном испарителе. Полученный сухой остаток растворяли в воде, диализовали и полимер выделяли методом лиофильной сушки из водного раствора на вакуумной установке. Блоксополимер характеризовали методом гель-проникающей хроматографии.For the synthesis of the PDMAEMA-block-POPA diblock copolymer, a dinitrile solution of azoisobutyric acid dinitrile (0.01-0.001 mol / l) in a mixture of oligopropylene glycol acrylate / benzene (3: 7) was added and added in a mixture of cyanisopentanoic acid and 0,7-0.001 mol / l) in a mixture of oligopropylene glycol acrylate / benzene (3: 7) and added in a mixture of 3: 7 and molar / liter). PDMAEMA-B, 0.1-0.01 mol / l). The resulting mixture was poured into an ampoule and degassed on a vacuum unit, the ampoule was sealed and placed in a thermostat heated to 80 ° C for 24-48 hours. After the polymerization was completed, the ampoule was opened, the contents were dissolved in benzene excess and the solvent was distilled off on a rotary evaporator. The obtained dry residue was dissolved in water, dialyzed and the polymer was isolated by the method of freeze drying from an aqueous solution in a vacuum unit. Block copolymer was characterized by gel permeation chromatography.
Пример 2.Example 2
Синтез блок-сополимеров на основе полимерных агентов обратимой передачи цепи поли(олигопропиленгликольакрилат)дитиобензоата (ПОПГА-Б) или поли(олигопропиленгликольакрилат)тритиокарбоната (ПОПГА-ТК).Synthesis of block copolymers based on polymeric agents of reversible chain transfer of poly (oligopropylene glycol acrylate) dithiobenzoate (POPGA-B) or poly (oligopropylene glycol acrylate) tritiocarbonate (POPGA-TK).
Для синтеза реагентов обратимой передачи цепи на основе поли(олигопропиленгликольакрилата) готовили раствор динитрила азоизомасляной кислоты (0.01-0.001 моль/л) в смеси олигополипропиленгликольакрилат/бензол (1:1 об.). Полученный раствор добавляли к дитиобензоату цианизопентановой кислоты или 8,8'-бис-(метил-2-изобутират)тритиокарбонату (0.01-0.1 моль/л). Реакционную смесь заливали в ампулу, подсоединяли ее к вакуумной установке и дегазировали путем повторения циклов замораживания-размораживания до остаточного давления 5х10-3 мм рт.ст., затем ампулу отпаивали. Образец полимеризовали при 80°С в течение 4-24 ч. Полимер выделяли методом лиофильного высушивания из бензола на вакуумной установке. Молекулярно-массовые характеристики образца определяли методом гельпроникающей хроматографии. В результате в зависимости от использованного ОПЦ-агента получали поли(олигопропиленгликольакрилат)дитиобензоат (ПОПГА-Б) или поли(олигопропиленгликольакрилат)тритиокарбонат (ПОПГА-ТК).A solution of dinitrile of azoisobutyric acid (0.01-0.001 mol / l) in a mixture of oligopolypropylene glycol acrylate / benzene (1: 1 vol.) Was prepared for the synthesis of reversible chain transfer reagents based on poly (oligopropylene glycol acrylate). The resulting solution was added to cyanisopentanoic acid dithiobenzoate or 8.8'-bis- (methyl 2-isobutyrate) tritiocarbonate (0.01-0.1 mol / l). The reaction mixture was poured into an ampoule, connected to a vacuum unit and degassed by repeating freeze-thaw cycles to a residual pressure of 5x10 -3 mm Hg, then the ampoule was sealed off. The sample was polymerized at 80 ° C for 4-24 hours. The polymer was isolated by freeze drying from benzene in a vacuum unit. The molecular weight characteristics of the sample were determined by gel permeation chromatography. As a result, depending on the OPC agent used, poly (oligopropylene glycol acrylate) dithiobenzoate (POPGA-B) or poly (oligopropylene glycol acrylate) tritiocarbonate (POPGA-TK) was obtained.
Для синтеза триблок-сополимера ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА готовили раствор ПОПГА-ТК (0.01-0.001 моль/л) и динитрила азоизомасляной кислоты (0,1-0,01 моль/л) в смеси диметиламиноэтилметакрилат/бензол (4:1 об.). Полученную смесь заливали в ампулу и дегазировали на вакуумной остановке, ампулу отпаивали и помещали в термостат, разогретый до 80°С на 4-24 ч. По окончании полимеризации ампулу вскрывали, содержимое растворяли в избытке бензола и далее отгоняли растворитель на роторе. Полученный сухой остаток растворяли в воде, диализовали и полимер выделяли методом лиофильной сушки из водного раствора на вакуумной установке. Блок-сополимер характеризовали методом гель-проникающей хроматографии. Аналогичным способом получали блок-сополимер с обращенной последовательностью блоков ПДМАЭМА-блок-ПОПГА-блок-ПДМАЭМА, используя ПДМАЭМАТК в качестве полимерного агента обратимой передачи цепи.For the synthesis of the POPA-block-PDMAEMA-block-POPGA triblock copolymer, a solution of POPGA-TC (0.01-0.001 mol / l) and azoisobutyric acid dinitrile (0.1-0.01 mol / l) in a mixture of dimethylaminoethylmethacrylate / benzene (4 : 1 rev.). The resulting mixture was poured into an ampoule and degassed at a vacuum stop, the ampoule was sealed and placed in a thermostat heated to 80 ° C for 4-24 hours. At the end of the polymerization, the ampoule was opened, the contents were dissolved in an excess of benzene and then the solvent was distilled off on the rotor. The obtained dry residue was dissolved in water, dialyzed and the polymer was isolated by the method of freeze drying from an aqueous solution in a vacuum unit. The block copolymer was characterized by gel permeation chromatography. In a similar way, a block copolymer with a reversed sequence of PDMAEMA-block-POPGA-block-PDMAEMA block was prepared using PDMAEMAT as a reversible chain transfer polymer agent.
Пример 3.Example 3
Оценка трансфекционной активности комплексов амфифильных блок-сополимеров с плазмидной ДНК и малыми интерферирующими (миРНК)Evaluation of the transfection activity of amphiphilic block copolymers with plasmid DNA and small interfering (miRNA) complexes
Для оценки трансфекционной активности комплексов амфифильных блок-сополимеров с плазмидной ДНК и миРНК использовали культуры клеток яичника китайского хомячка СНО и СНО-1ис (клетки СНО, стабильно трансфецированные геном светляковой люциферазы) соответственно.To assess the transfectional activity of amphiphilic block copolymers with plasmid DNA and miRNA, Chinese hamster CHO and CHO-1is ovary cells (CHO cells stably transfected with the firefly luciferase gene), respectively, were used.
Культуру клеток СНО обрабатывали комплексами, содержащими плазмидную ДНК рСМУ1ис (Рготеда, США) и препараты синтезированных катионных амфифильных блок-сополимеров: ПОПГАблок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА, ПДМАЭМА-блок-ПОПГА-блок-ПДМАЭМА, ПДМАЭМА-блокПОПГА, ПОПГА-блок-ПДМАЭМА, а также гомополимер ПДМАЭМА в различных соотношениях Ν:Ρ = 7,5, 15. Эффективность трансфекции оценивали по активности люциферазы через 24 ч после обработки комплексами с помощью коммерческого набора реагентов Ьисйегаке аккау кук1ет (Рготеда, США) вThe culture of CHO cells treated with complexes containing plasmid DNA rSMU1is (Rgoteda, USA) and synthesized drugs cationic amphiphilic block copolymers: POPGAblok-PDMAEMA-blokPOPGA, blokPOPGA-PDMAEMA-b-PDMAEMA, PDMAEMA-blokPOPGA, POPGA-block PDMAEMA, as well as homopolymer PDMAEMA in different ratios Ν: = 7.5, 15. Transfection efficiency was evaluated by luciferase activity 24 hours after treatment with the complexes using a commercial reagent kit Liishegak akkauket (Rgothed, USA) in
- 5 029146- 5 029146
планшетном анализаторе. В качестве препаратов сравнения использовали коммерческий трансфекционный агент ЫроГееШшше 2000 (1пуйго§епе, США) и разветвленный полиэтиленимин 25кДа (ПЭИ) (31§ша, США). Также в эксперименты включали отрицательный контроль, который представлял собой препараты "голой" плазмидной ДНК или миРНК. Комплексы ДНК с сополимерами для трансфекции готовили в соотношениях Ν:Ρ - 7.5 и 15 (фиг. 5а, 5б). Наибольшую эффективность трансфекции плазмидной ДНК продемонстрировали сополимеры ДМАЭМА-ОПГА в соотношении Ν:Ρ - 7.5, а также ПОПГА-блокПДМАЭМА и ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА в соотношении 15 (фиг. 5а, 5б), как по сравнению с другими синтезированными сополимерами, так и с исходными блоками для сополимеров.tablet analyzer. The comparative drugs used were the commercial transfection agent, HYROHEER 2000 or higher (1Pigo, USA) and 25 kDa branched polyethyleneimine (PEI) (USA, USA). The experiments also included a negative control, which was a preparation of naked plasmid DNA or miRNA. DNA complexes with copolymers for transfection were prepared in ratios Ν: - 7.5 and 15 (Fig. 5a, 5b). The highest efficiency of transfection of plasmid DNA was demonstrated by DMAEMA-OPGA copolymers in the ratio Ν: Ρ - 7.5, as well as POPGA-blockPDMAEMA and POPGA-block-PDMAEMA-block-POPGA in the ratio 15 (Fig. 5a, 5b), as compared to other synthesized copolymers, and with the original blocks for the copolymers.
В соотношении Ν:Ρ - 15 эффективность трансфекции с использованием комплексов ПОПГА-блокПДМАЭМА-блок-ПОПГА и ПОПГА-блок-ПДМАЭМА была соответственно в 83 и 53 раза выше, чем в экспериментах с гомополимером ПДМАЭМА, и не ниже эффективности препаратов сравнения (ПЭИ и Е1ро£ес1аш1пе 2000).In the ratio Ν: Ρ - 15, the transfection efficiency using the POPGA-block PDMAEMA-block-POPGA and POPGA-block-PDMAEMA complexes was 83 and 53 times higher, respectively, than in experiments with the PDMAEMA homopolymer, and not lower than the effectiveness of reference preparations (PEI and £ £ £ £ 1 £ 2000).
Эффективность трансфекции плазмидной ДНК с использованием ПДМАЭМА-блок-ПОПГА (при соотношении Ν:Ρ - 7.5) была в 64 раза выше, чем у ПДМАЭМА, и не уступала по эффективности препаратам сравнения. При увеличении соотношения Ν:Ρ до 15 эффективность трансфекции препарата ПДМАЭМА-блок-ПОПГА снижалась (в 2.4 раза по сравнению с эффективностью при Ν:Ρ = 7.5). Это, вероятно, связано с увеличением токсичности исследуемых сополимеров.The efficiency of transfection of plasmid DNA using PDMAEMA-block-POPA (with a ratio of Ν: Ρ - 7.5) was 64 times higher than that of PDMAEMA, and was not inferior in effectiveness to reference preparations. With an increase in the Ρ: Ρ ratio to 15, the transfection efficiency of the PDMAEMA-block-POPA drug decreased (by a factor of 2.4 compared with the efficiency at Ν: = 7.5). This is probably due to the increased toxicity of the copolymers under study.
Комплексы для трансфекции миРНК готовили в соотношениях Ν:Ρ = 7.5 и 15. В данной серии экспериментов использовали культуру клеток СНО-1ис, стабильно трансфецированную геном светляковой люциферазы. Комплексы для трансфекции готовили из синтетических миРНК, направленных к гену люциферазы, и амфифильных блок-сополимеров. Результаты, полученные в экспериментах с блоксополимерами, представляли в виде люциферазной активности в клетках, обработанных комплексами на основе специфической (направленной к гену люциферазы) и неспецифической миРНК (направленной к Р-гену респираторно-синцитиального вируса). Результаты выражали в виде процента остаточной люциферазной активности в клетках, обработанных специфической миРНК по сравнению с неспецифической (фиг. 6а, 6б). Как и в экспериментах с плазмидной ДНК высокую эффективность трансфекции миРНК продемонстрировал препарат ПОПГА-блок-ПДМАЭМА-блок-ПОПГА, который подавлял люциферазную активность на 78% при соотношении Ν:Ρ - 7.5. Блок-сополимеры ПДМАЭМА-блок-ПОПГА проявили одинаково высокую эффективность трансфекции при соотношении Ν:Ρ - 7.5 и 15, и обеспечили подавление люциферазной активности на 89%. Это на 7% больше по сравнению с ЫроГесГашше 2000.Complexes for siRNA transfection were prepared in ratios Ν: = 7.5 and 15. In this series of experiments, a CHO-1c cell culture, stably transfected with the light-luciferase gene, was used. Complexes for transfection were prepared from synthetic miRNAs directed to the luciferase gene and amphiphilic block copolymers. The results obtained in experiments with block copolymers were presented in the form of luciferase activity in cells treated with complexes based on specific (directed to the luciferase gene) and nonspecific miRNA (directed to the R-gene of the respiratory syncytial virus). The results were expressed as a percentage of residual luciferase activity in cells treated with specific miRNA compared with non-specific (Fig. 6a, 6b). As in experiments with plasmid DNA, the high efficiency of siRNA transfection was demonstrated by the POPGA-block-PDMAEMA-block-POPGA drug, which suppressed luciferase activity by 78% with the ratio Ν: - 7.5. The block copolymers of PDMAEMA-block POPGA showed equally high transfection efficiency at a ratio of Ν: - 7.5 and 15, and provided suppression of luciferase activity by 89%. This is a 7% increase compared with YroGesGasche 2000.
Таким образом, препараты амфифильных катионных сополимеров на основе ПДМАЭМА и ПОПГА проявили высокую трансфекционную активность как при трансфекции культуры клеток плазмидной ДНК, так и миРНК, сравнимую или даже превосходящую эффективность, достигнутую с использованием препаратов сравнения.Thus, amphiphilic cationic copolymers based on PDMAEMA and POPGA showed high transfection activity both when transfecting a culture of plasmid DNA cells and miRNA, comparable or even exceeding the efficiency achieved with the use of reference preparations.
Цитируемая литератураCited literature
1. К.о± С.М., ЗипОагат 8. Еп§теегт§ зупШейс уес1огз Гог ίιηρΓονεά ϋΝΑ НеНуегу:1. K.o ± S.M., ZipOagat 8. Hrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrе Gogh огιηρΓονεά ϋΝΑ No Neue:
1п81§Ыз Ггот 1п1гасе11и1аг Райиуауз. Агти. Кеу. ВютесГ Εη§. ν. 6, р. 397-426 (2004).1п81§Вз Ггот 1п1гасе11 и1аг Райиуауз. Agti. Keu. VutessG §η§. ν. 6, p. 397-426 (2004).
2. ΜΐηΙζϋΓ М.А., 81тапек Е.Е. Мопу1га1 уесЮгз Гог ^епе ОеПуегу. СЬет. Кеу. ν. 109, р.2. ΜΐηΙζϋΓ MA, 81tepek E.E. Mopuga1 uesYugz Gog ^ epe oePuegu. Syt Keu. ν. 109, p.
259-302 (2009).259-302 (2009).
3. СЬо Υ.\ν., Κΐιη Εϋ., Рагк К.. Ро1уеайоп ^епе скПуегу зуз1етз: езсаре Ггот епНозотез 1о еу1озо1.1 РЬагт РЬагтасок у. 55, р. 721-734 (2003).3. CHO Υ. \ Ν., Κΐιη Εϋ., Ragk K .. Roleuay ^ epe skPuegu zuz1etz: sesare Ggot epnozotez 1o euzozo1.1 Ryagt Ryagtasok y. 55, p. 721-734 (2003).
- 6 029146- 6 029146
4. ВеЬг Ι-Р., Оетепе1х В., Ье/оиакЬ I7., Мегдпу М., 8сЬегтап ϋ., Воиззй О. Ыискк аОб согЬаттд сотрозШоп, ргерагайоп апб изез оГ вате. Патент ЕС № 06013240 (1997).4. Bebg Ι -R., Oetepelyh V., Le / Oiak I 7. , Meghdpu M., 8stegtap ϋ., Voizzy O. Yiskk AOb sogyattd sotrozShop, rgeragayop apb iz oz oGatat. EU Patent No. 06013240 (1997).
5.беап-Раи1 ВеЬг б.-Р., Оетепе1х В., ЗсЬегтап ϋ., ЗсЬ'Л'аПг В., Кету 1.-8. СотрозШоп соп1а1шп§ пискк атбз, ргерагайоп апб изез. Патент Франции № 94/00159 (1994).5. Beap-Rai1 Wehr B., R., Otepex V., Zsiegtap п., Sci'L'aPg V., Ketu 1.-8. SotrozShop sop1a1shp§piskk atbz, rgeragayop apb isez. French Patent No. 94/00159 (1994).
6. ВеЬг б.-Р.. ЬоеГГкг б.-Р. 1лроро1уаттез,11те1г ргерагайоп апб {Ьеп изе. Патент ЕС №6. Weber b.-R .. BGGKg b.-R. 1lroroattez, 11grgeegayop apb {Bez iz. EU Patent No.
056167458 (1995).056167458 (1995).
7. ВоиззЛ О., Ьегоиак'Ь Р., 7ап{а М.А., Мегдпу Μ.ϋ., 8сЬегтап ϋ., Петепе1х В., ВеЬг 1-Р. А уегзаЫе νβείοτ Гог §епе апс! оЬ§опис1еоЬбе {гапзГег ΐηίο се11з ΐη сиЬиге апб ΐη νίνο: ро1уе1Ьу1ештте. Ргос ИаЯ Асаб 8οί и 8 Α. ν. 92, N 16. р.7297-301 (1995).7. Vozdzl O., Leoiak R., 7ap {a MA, Megdpu Yu.., 8stegtap Yu., Petepekh V., Behb 1-P. And thank you, Goger! A description of the {gpzGeg ηίο today, η and Ьηиг η η νίνο: po1e11y1stltte. Progress iaa asab 8οί and 8. ν. 92, N 16. p. 7297-301 (1995).
8. Кбззе1 Т, Кбеетапп Ε., Νειι М., Стеззкг Т., 8сЬтеЫ Т. Νοη-νΐ^Ι уес{ог зуз1ет Гог {Ье беЬуегу оГпис1е1с асгб ΐηίο {Ье 1ип£. Патент США № 2007/38693.8. Кбззе1 Т, Кбеетап Ε., Νειι M., Stezzkg T., 8stey T. Νοη-νΐ ^ Ι уес {oguz1et Gog {lebeyugega of gorpile1s asgb ηίο {be 1ypt £. U.S. Patent No. 2007/38693.
9. 8сЬегтап Ό., Вук О., ЗсЬтуаИг В. Νιιοίεϊο асЫ-соШаттд сотрозШоп, ргерагайоп апб изе {ЬегеоГ. Патент США № 5,945,400 (1999).9. 8stegtap., Vuk O., ScrAlIg V. Νιιοίεϊο asY-soSattd sotrozShop, rgeragayop apb ize {Legeog. U.S. Patent No. 5,945,400 (1999).
10. УатадисЫ Ν., Никитой) Υ. МеЙюб оГ {гапзГесйп§ се11з ννίΐΠ пискк аибз изт§ ас1бШеб ро1уегЬу1епетнпе. Японский патент № 2009-174234. (2009).10. Uathadisi Ν., Nikita) Υ. Meyubub {gapzGesyp§ se11z ννίΐΠ piskk aibz iz§ as1bEb royueboulepetetnpe. Japanese Patent No. 2009-174234. (2009).
11. ОорГге1сЬ А., Вгеипщ М„, ЬипдтуЬг и., В1ипк Т. Сайоте ро1утегз Гог Ьапзрогйпд пискк аибз ΐη се11з Патент США № 2009/0215166 А1 (2009).11. OORGGEI A., VEIPSHCH MI, LIPDTUGRI., V1IPK T. Sayote Robertowl Gogensproperty AIBZ Süll 11 US Patent No. 2009/0215166 A1 (2009).
12. Α6ΐΕ А., ЕгЬасЬег Р., 81оск Р., НаГбг Ν. Меапз Гог беПуегу оГ пис1е1с албз асйуе Гог §епе зйепстд изт§ зупШейс ро1утегз. Патент США № 2010/0297756 А1 (2010).12. Α6ΐΕ A., EgbЬeg R., 81sk R., NaGbg Ν. Meapz Gog Bepuegu og pisti1s albz asyue Gogh Fucieziepdzt§ zupSheys roytepz. U.S. Patent No. 2010/0297756 A1 (2010).
13. Ьупп ϋ.Μ., МШег Α.ϋ. СЬаг§е-бупапис рс1утегз апб беЬуегу оГ апютс сотроипбз. Патент ЕС № 07883720 (2004).13. Güpp .Μ., MSHeg Α.ϋ. CME-Bupupice RS1AUTHULLBOOGERGHG APS. EU Patent No. 07883720 (2004).
14. Μΐ6ουχ Р., Мопзгдпу М. Ро1у.тепс сотркхез Гог {Ье {гапзГесйоп оГ пискк атбз, ννΐίΠ гез!биез саизтд {Ье без{аЪШгаЬоп оГ се11 тетЪгапез. Патент ЕС № 06372499 (1999).14. Μΐ6ουχχ R., Mopzgdpu M. Ro1u.teps sotrkkhez Gog {Le {GapzHesyop oG Piskk Atbz, ννΐίΠ Gez Biez Saiztd {Le without {HumbleBest Gd11 11). EU Patent No. 06372499 (1999).
15. Мбоих Р., ЕгЬасЬег Р., КосЬе-Оецгетоп! А.-С., Мопзщпу М. Ро1у1узте соп]и§а{ез. Патент ЕС № 055958974 (1994).15. Mboih R., Egbyeg R., Kos'e-Ozecgetop! A.-S., Mopzshppu M. Po1u1uzte sop] and Ãa {ez. EU Patent No. 055958974 (1994).
16. Айигззоп Р., СЬпз{епзеп В.К., Кортд-Ноддагб М., Уагпит К.М. Ыоп-У1га1 §епе беЬуегу зуз{ет. Патент США № 7,767,456 В2 (2010).16. Ayigzzop R., Cpz {Ezzep V.K., Kortd-Noddagb M., Oughpit K.M. BoPiHa1 U.S. Patent No. 7,767,456 B2 (2010).
17. Коу К., СтЬози В., КазФп 8. МобШеб ро1узассЬапбе-Ъазеб беЬуегу оГпискк асббз.17. Kou K., Stzozi V., KazFp 8. Mobsheb ro1uzassbapbe-азazeb bueguu oGpiskk asbbs.
Патент США № 2010/0311654 А1 (2010).U.S. Patent No. 2010/0311654 A1 (2010).
18. 8аЬе1 В., У/а1г С., Кбпде К. Изе оГ папорагйскз Гог {Ье ΏΝΑ абпйшзйайоп ίο а 1аг§е{ ог§ап. Патент США № 7,402,573 В2 (2008).18. Bele B., U / a1 S., Kbpde K. Ize oG paporygysk Gog {Le abpieschiaiop ίο a lagge {ogap. U.S. Patent No. 7,402,573 B2 (2008).
19. Регдизоп Ώ.Υ., Κΐιη δ. XV. Епеаг ро1уе1Ьу1еттте-з1его1 соп)и§а{ез Гог §епе беЬуегу. Патент ЕС № 07863470 (2007).19. Regdizop Ώ.Υ., Κΐιη δ. Xv. Enep po1ue1Bu1tettte-zilego1 sop) and ga {eGogh giepe beguga. EU Patent No. 07863470 (2007).
20. СЫеГап СЬоп§ Υ.Κ., Егсо1е Р., Кгзйпа I., бейегу б., Ее Т.Р.Т., Мауабиппе К.Т.А., Меуз О.Р., Моаб СТ., Моаб О., Вбггагбо Е., ТЬапд 8.Н. // Масгошо1еси1ез. 1998. V.20. Sygep Sop§ Υ.Κ., Egsole R., Kgzypa I., Beyegu b., Her T. R. T., Mauabippe KTA, Meuz OR, Moab ST., Moab O ., Vbgggbo E., Tbapd 8.N. // Mascotrales. 1998. V.
31. №16. Р. 5559-5562.31. №16. R. 5559-5562.
21. Зайцев С.Д., Семчиков Ю.Д., Черникова Е.В. Контролируемая радикальная сополимеризация Ν-винилпирролидона и 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропилакрилата. //21. Zaitsev, S.D., Semchikov, Yu.D., Chernikova, E.V. Controlled radical copolymerization of α-vinylpyrrolidone and 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropylacrylate. //
Высокомолек. Соед. 2009. Сер. А, т. 51. №3. с. 517-521.High-altitude Comp. 2009. Ser. A, t. 51. №3. with. 517-521.
22. Терпугова П.С., Павлов А.С., Гарина Е.С., Черникова Е.В. Управляемый синтез узкодисперсных полимеров акрилового ряда. // Пластмассы: со специальными свойствами (межвузовский сборник научных трудов). 2006. ч. 1. с.35-38,22. Terpugova P.S., Pavlov A.S., Garina E.S., Chernikova E.V. Controlled synthesis of narrow polymers of the acrylic series. // Plastics: with special properties (intercollegiate collection of scientific papers). 2006. Part 1. p.35-38,
23. Черникова Е.В. “Псевдоживая радикальная полимеризация по механизму обратимой передачи цепи (обзор) // Пластмассы со специальными свойствами (межвузовский сборник научных трудов). 2006. ч. 1. с. 7-16.23. Chernikova E.V. “Pseudo-living radical polymerization by the mechanism of reversible chain transfer (review) // Plastics with special properties (intercollegiate collection of scientific papers). 2006. Part 1. p. 7-16.
24. СЬап§ С.Х¥., Вауз Е., Тао Е., А1сопсе1 8.Ν., Маупагб Н.О. ОИТегепсез ΐη суййохкйу оГ ро1у(РЕОА)з зуп{Ьез12еб Ьу геуегаЫе абб Шоп-ГгадтеЫайоп сЬат {гапзГег ро1утеп2:аЬоп. // СЬет. Соттип. (СатЬ). 2009 V. 24. Р. 3580-3582.24. Chap§, C.X., Wauz, E., Tao, E., A1sopese1 8.Ν., Maupagb N.O. Oitegepsez сη suyyohykyu og ro1u (PEOA) szup {lez12eb bv geyugey abb shop-ggadteyyyop syat {gappzGergote1: abop. // Sjet. Sottip. (Sat). 2009 V. 24. R. 3580-3582.
25. Р13зи\сап ϋ., Воуег С., Оипазекагап К., ПаУ13 Т.Р., ВиЬпиз V. Ιη уйго су{о{ох1сйу оГгай роНутегз. // Вютасготоксикз 2010. V. 11. Р. 412—420.25. R13zi \ sap ϋ., Voyeg S., Oipazekagap K., PaU13 TR, Vypiz V. η uygo su {o {okh1yu oGgay roNutegz. // Vutasgotoksikz 2010. V. 11. R. 412-420.
Описание рисунковDescription of drawings
Фиг. 1. Схема процессов, происходящих при псевдоживой радикальной полимеризации с обратимой передачей цепиFIG. 1. Diagram of processes occurring during pseudo-living radical polymerization with reversible chain transfer
Ρη· и Рт· - радикалы роста; М - мономер; Ζ и К - алкильные или арильные заместители в молекуле ОПЦ-агента.Ρ η · and Р t · are growth radicals; M is a monomer; Ζ and K are alkyl or aryl substituents in the OPC agent molecule.
Фиг. 2. Получение блок-сополимеров с помощью ОПЦ-полимеризации.FIG. 2. Getting block copolymers using OPC-polymerization.
Если полимер Ζϋ(=δ)δΑη очистить от не израсходовавшегося мономера и ввести в реакцию с другим мономером В в присутствии инициатора, то блок Вт будет расти именно на цепи Ап.If the polymer Ζϋ (= δ) δΑη is cleared of unused monomer and reacted with another monomer B in the presence of an initiator, then the block W will grow on chain An.
Фиг. 3. Формулы использованных в изобретении ОПЦ-агентов -Б,Б'-бис-(метил-2-изобутират)тритиокарбоната (МИБТК) и дитиобензоата цианизопентановой кислоты (ЦКБ).FIG. 3. The formulas used in the invention of OPC-agents B, B'-bis- (methyl 2-isobutyrate) tritiocarbonate (MIBTK) and cyanisopentanoic acid dithiobenzoate (CCB).
- 7 029146- 7 029146
Фиг. 4. Схема ОПЦ-полимеризации в присутствии тритиокарбонатов (а) и дитиобензоатов (б).FIG. 4. Scheme OPC-polymerization in the presence of tritiocarbonates (a) and dithiobenzoates (b).
Фиг. 5. Результаты трансфекции клеток СНО препаратами сополимеров в комплексе с плазмидной ДНК рСМУ1ис в соотношении Ν:Ρ: (а) 7.5, (б) 15.FIG. 5. Results of transfection of CHO cells with copolymer preparations in combination with the plasmid DNA pCMU1is in the ratio:: (a) 7.5, (b) 15.
ПОПГА - поли(олигопропиленгликольакрилат); ПДМАЭМА - полиЩ^-диметиламиноэтилметакрилат); ПЭИ 25 кД - разветвленный полиэтиленимин, 25 кД.POPA - poly (oligopropylene glycol acrylate); PDMAEMA - poly (S-d-dimethylaminoethyl methacrylate); PEI 25 kD - branched polyethylenimine, 25 kD.
Фиг. 6. Результаты трансфекции клеток СНО-1ис препаратами сополимеров в комплексе с миРНК к гену светляковой люциферазы (миРНК-1ис) и неспецифической миРНК к Р гену респираторносинцитиального вируса (миРНК-КЗУ).FIG. 6. Results of transfection of CHO-1c cells with copolymer preparations in complex with miRNA to the gene of the firefly luciferase (miRNA-1c) and nonspecific miRNA to the P gene of the respiratory syncytic virus (miRNA-CGU).
ПОПГА - поли(олигопропиленгликольакрилат); ПДМАЭМА - полиЩ^-диметиламиноэтилметакрилат).POPA - poly (oligopropylene glycol acrylate); PDMAEMA — polyisch-dimethylaminoethyl methacrylate).
Claims (3)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014145246A RU2617059C2 (en) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Method for production of amphiphilic block copolymers n, n-dimethylaminoethyl methacrylate for nucleic acid delivery to living cells |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201501099A2 EA201501099A2 (en) | 2016-07-29 |
| EA201501099A3 EA201501099A3 (en) | 2016-11-30 |
| EA029146B1 true EA029146B1 (en) | 2018-02-28 |
Family
ID=56114720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201501099A EA029146B1 (en) | 2014-11-11 | 2015-10-08 | Method for production of cationic amphiphilic block copolymers of n,n-dimethylaminoethyl methacrylate for nucleic acid delivery to living cells |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA029146B1 (en) |
| RU (1) | RU2617059C2 (en) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102017217620A1 (en) * | 2017-10-04 | 2019-04-04 | Evonik Röhm Gmbh | Process for the preparation of dimethylaminoalkyl (meth) acrylates |
| EP3652139B1 (en) | 2018-05-23 | 2020-09-23 | Evonik Operations GmbH | Method for preparing keto-functionalized aromatic (meth)acrylates |
| EP3652151B1 (en) | 2018-07-17 | 2020-08-12 | Evonik Operations GmbH | Method for preparing c-h acidic (meth)acrylates |
| EP3599232A1 (en) | 2018-07-26 | 2020-01-29 | Evonik Operations GmbH | Method for the preparation of n-methyl(meth)acrylamide |
| CN109337084B (en) * | 2018-09-10 | 2021-02-12 | 天津理工大学 | Preparation method of intelligent gene vector with active oxygen and pH dual responsiveness and charge reversal characteristics |
| CN115368523B (en) * | 2022-09-19 | 2024-03-19 | 安徽农业大学 | Multi-block thermoplastic elastomer and preparation method thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7018655B2 (en) * | 2002-03-18 | 2006-03-28 | Labopharm, Inc. | Amphiphilic diblock, triblock and star-block copolymers and their pharmaceutical compositions |
| US7402573B2 (en) * | 2002-07-29 | 2008-07-22 | Nanodel Technologies Gmbh | Use of nanoparticles for the DNA administration to a target organ |
| RU2449785C2 (en) * | 2007-12-31 | 2012-05-10 | Самъянг Корпорейшн | Micellar composition of amphiphilic block copolymer containing taxane and method for preparing it |
-
2014
- 2014-11-11 RU RU2014145246A patent/RU2617059C2/en active
-
2015
- 2015-10-08 EA EA201501099A patent/EA029146B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7018655B2 (en) * | 2002-03-18 | 2006-03-28 | Labopharm, Inc. | Amphiphilic diblock, triblock and star-block copolymers and their pharmaceutical compositions |
| US7402573B2 (en) * | 2002-07-29 | 2008-07-22 | Nanodel Technologies Gmbh | Use of nanoparticles for the DNA administration to a target organ |
| RU2449785C2 (en) * | 2007-12-31 | 2012-05-10 | Самъянг Корпорейшн | Micellar composition of amphiphilic block copolymer containing taxane and method for preparing it |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| МАКСИМОВА Е. и др. Разработка поликатионных носителей для доставки синтетических интерферирующих РНК, специфически подавляющих репродукцию респираторных вирусов in vitro и in vivo. XIX Молодежная научная конференция "Ломоносов" - секция Химия. Московский государственный университет им. Ломоносова, М., 2012, с. 92 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2014145246A (en) | 2016-06-10 |
| EA201501099A2 (en) | 2016-07-29 |
| EA201501099A3 (en) | 2016-11-30 |
| RU2617059C2 (en) | 2017-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA029146B1 (en) | Method for production of cationic amphiphilic block copolymers of n,n-dimethylaminoethyl methacrylate for nucleic acid delivery to living cells | |
| Tan et al. | Polycation architecture and assembly direct successful gene delivery: micelleplexes outperform polyplexes via optimal DNA packaging | |
| Agarwal et al. | PDMAEMA based gene delivery materials | |
| Kabanov et al. | Pluronic® block copolymers: novel functional molecules for gene therapy | |
| Kargaard et al. | Polymeric siRNA gene delivery–transfection efficiency versus cytotoxicity | |
| Lin et al. | Degradable, pH-sensitive, membrane-destabilizing, comb-like polymers for intracellular delivery of nucleic acids | |
| Wagner | Polymers for siRNA delivery: inspired by viruses to be targeted, dynamic, and precise | |
| Cho et al. | Synthesis of biocompatible PEG-based star polymers with cationic and degradable core for siRNA delivery | |
| Tamura et al. | Enhanced cytoplasmic delivery of siRNA using a stabilized polyion complex based on PEGylated nanogels with a cross-linked polyamine structure | |
| Zhou et al. | Novel zwitterionic vectors: Multi-functional delivery systems for therapeutic genes and drugs | |
| US10172956B2 (en) | Polymeric nanoparticles | |
| Lundy et al. | Neutral polymeric micelles for RNA delivery | |
| KR102142180B1 (en) | Compositions for introducing nucleic acid into cells | |
| Truong et al. | Self-catalyzed degradable cationic polymer for release of DNA | |
| Wu et al. | Glucose-containing diblock polycations exhibit molecular weight, charge, and cell-type dependence for pDNA delivery | |
| Fliervoet et al. | Polymers and hydrogels for local nucleic acid delivery | |
| Chung et al. | Reducible siRNA dimeric conjugates for efficient cellular uptake and gene silencing | |
| US20230233693A1 (en) | Poly(amine-co-ester) polymers with modified end groups and enhanced pulmonary delivery | |
| Laaser et al. | Interpolyelectrolyte complexes of polycationic micelles and linear polyanions: Structural stability and temporal evolution | |
| Li et al. | Cationic hyperbranched polymers with biocompatible shells for siRNA delivery | |
| Laaser et al. | Architecture-Dependent Stabilization of Polyelectrolyte Complexes between Polyanions and Cationic Triblock Terpolymer Micelles | |
| Azimifar et al. | Evaluation of the efficiency of modified PAMAM dendrimer with low molecular weight protamine peptide to deliver IL‐12 plasmid into stem cells as cancer therapy vehicles | |
| Rose et al. | Polymer siRNA conjugates synthesised by controlled radical polymerisation | |
| Fröhlich et al. | Peptide-and polymer-based delivery of therapeutic RNA | |
| Cohen-Karni et al. | Fentanyl initiated polymers prepared by atrp for targeted delivery |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KG TJ TM RU |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): KZ |