RU2616243C1 - Method for atherosclerotic plaques cellular composition determination - Google Patents
Method for atherosclerotic plaques cellular composition determination Download PDFInfo
- Publication number
- RU2616243C1 RU2616243C1 RU2015153110A RU2015153110A RU2616243C1 RU 2616243 C1 RU2616243 C1 RU 2616243C1 RU 2015153110 A RU2015153110 A RU 2015153110A RU 2015153110 A RU2015153110 A RU 2015153110A RU 2616243 C1 RU2616243 C1 RU 2616243C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- atherosclerotic plaques
- cell suspension
- plaque
- lymphocytes
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточной и молекулярной технологии, и может быть использовано в медицинских исследованиях в кардиологии для изучения клеточного состава в атеросклеротических бляшках с целью выявления иммунологических механизмов их созревания и разрыва.The invention relates to medicine, in particular to cellular and molecular technology, and can be used in medical research in cardiology to study the cellular composition in atherosclerotic plaques in order to identify the immunological mechanisms of their maturation and rupture.
Сложность строения атеросклеротических бляшек известна со времен Вирхова [Вирхов Р. Целлюлярная патология, в применении к микроскопической анатомии нормальных и ненормальных: пер. с нем. Чт. 16. - М, В типографии Каткова и К., 1859. - С. 480], когда было выяснено, что в их состав входят различные клеточные компоненты, в том числе большое количество иммунных и гладкомышечных клеток. При этом общепринятая теория о том, что развитие атеросклеротической бляшки происходит при отложении в сосудистой стенке инородной субстанции - модифицированных липопротеинов, не могла объяснить клеточную гетерогенность бляшек. В связи с этим была сформулирована альтернативная гипотеза R. Ross и L. Harker [Faggiotto A, Ross R, Harker L. Studies of hypercholesterolemia in the nonhuman primate. I. Changes that lead to fatty streak formation. Arteriosclerosis. - 1984. - №4. - P. 323-340; Ross R, Harker L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. - 1976. - №193. - P. 1094-1100] о том, что пусковым фактором атеросклероза является повреждение эндотелия, сопровождающееся адгезией к его поверхности лейкоцитов и тромбоцитов. Моноциты проходят через эндотелиальную выстилку и превращаются в макрофаги. Параллельно происходит миграция гладкомышечных клеток из медии в субэндотелий и изменение их фенотипа (дедифференцировка). Предполагается, что вначале иммунная система пытается уничтожить чужеродный объект, в частности путем его фагоцитоза макрофагами [Kruth HS Sequestration of aggregated low-density lipoproteins by macrophages. Curr Opin Lipidol. - 2002. - №13. - P. 483-488]. Макрофаги поглощают липопротеиды, однако это приводит к гибели самих фагоцитов и формированию очага некроза [Geng YJ, Libby Р Progression of atheroma: A struggle between death and procreation. Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2002. - №22. - P. 1370-1380], сопровождаемого образованием капсулы. Дальнейшее развитие атеросклеротической бляшки определяется активностью иммунного ответа, в частности воспалением.The complexity of the structure of atherosclerotic plaques has been known since the days of Virchow [R. Virkhov. Cellular pathology, as applied to the microscopic anatomy of normal and abnormal: trans. with him. Th 16. - M, in the printing house of Katkov and K., 1859. - P. 480], when it was found that they consist of various cellular components, including a large number of immune and smooth muscle cells. At the same time, the generally accepted theory that the development of atherosclerotic plaque occurs when foreign substance, modified lipoproteins, is deposited in the vascular wall, could not explain the cellular heterogeneity of the plaques. In this regard, an alternative hypothesis was formulated by R. Ross and L. Harker [Faggiotto A, Ross R, Harker L. Studies of hypercholesterolemia in the nonhuman primate. I. Changes that lead to fatty streak formation. Arteriosclerosis. - 1984. - No. 4. - P. 323-340; Ross R, Harker L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. - 1976. - No. 193. - P. 1094-1100] that the trigger factor in atherosclerosis is endothelial damage, accompanied by adhesion of leukocytes and platelets to its surface. Monocytes pass through the endothelial lining and turn into macrophages. At the same time, smooth muscle cells migrate from the media to the subendothelium and change their phenotype (dedifferentiation). It is believed that initially the immune system attempts to destroy a foreign object, in particular by phagocytosis by macrophages [Kruth HS Sequestration of aggregated low density lipoproteins by macrophages. Curr Opin Lipidol. - 2002. - No. 13. - P. 483-488]. Macrophages absorb lipoproteins, but this leads to the death of the phagocytes themselves and the formation of a focus of necrosis [Geng YJ, Libby P Progression of atheroma: A struggle between death and procreation. Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2002. - No. 22. - P. 1370-1380], followed by capsule formation. Further development of atherosclerotic plaque is determined by the activity of the immune response, in particular inflammation.
Вклад воспаления в развитие атеросклероза обсуждается со времен Рудольфа Вирхова, однако его решающая роль в росте и разрушении бляшек стала признаваться сравнительно недавно. Воспаление - это сложное явление, включающее миграцию реактивных клеток, в частности лимфоцитов и моноцитов, и их многоступенчатую активацию с последующим выбросом различных цитокинов.The contribution of inflammation to the development of atherosclerosis has been discussed since the time of Rudolf Virchow, however, its decisive role in the growth and destruction of plaques has been recognized relatively recently. Inflammation is a complex phenomenon, including the migration of reactive cells, in particular lymphocytes and monocytes, and their multi-stage activation followed by the release of various cytokines.
Известно, что содержание многих провоспалительных цитокинов в крови коррелирует со смертностью у больных коронарной болезнью сердца [Libby Р, Okamoto Y, Rocha VZ, Folco E. Inflammation in atherosclerosis: transition from theory to practice. Circ J. - 2010. - №74. - P. 213-220; Stefanadi E, Tousoulis D, Papageorgiou N, Briasoulis A, Stefanadis C. Inflammatory biomarkers predicting events in atherosclerosis. Curr Med Chem. - 2010. - №17. - P. 1690-1707]. Так, было показано, что повышение содержания определенной группы лимфоцитов в крови связано с увеличением частоты сердечнососудистых событий у пациентов с ИБС, ревматоидным артритом, сахарным диабетом и хронической почечной недостаточностью [Libby P. Role of inflammation in atherosclerosis associated with rheumatoid arthritis. Am J Med. - 2008. - №121. - P. S21-S31; Liuzzo G, Biasucci LM, Trotta G, Brugaletta S, Pinnelli M, Digianuario G, Rizzello V, Rebuzzi AG, Rumi C, Maseri A, Crea F. Unusual CD4_CD28null T lymphocytes and recurrence of acute coronary events. J Am Coll Cardiol. - 2007. - №50. - P. 1450-1458; Giubilato S, Liuzzo G, Brugaletta S, Pitocco D, Graziani F, Smaldone C, Montone RA, Pazzano V, Pedicino D, Biasucci LM, Ghirlanda G, Crea F. Expansion of CD4+CD28null T-lymphocytes in diabetic patients: exploring new pathogenetic mechanisms of increased cardiovascular risk in diabetes mellitus. Eur Heart J. - 2011. - №32. - P. 1214-1226]. He только системное воспаление, но и локальный удаленный воспалительный процесс влияет на состояние атеросклеротических бляшек. Например, была выявлена связь заболеваемости периодонтитом и коронарным атеросклерозом [Humphrey LL, Fu R, Buckley DI, Freeman M, Helfand M. Periodontal disease and coronary heart disease incidence: a systematic review and meta-analysis. J Gen Intern Med. - 2008. - №23. - P. 2079-2086]. Еще более важен тот факт, что воспаление в бляшке может вызывать ее рост и разрыв покрышки, приводя к таким клиническим проявлениям, как нестабильная стенокардия или острый инфаркт миокарда.The content of many pro-inflammatory cytokines in the blood is known to correlate with mortality in patients with coronary heart disease [Libby P, Okamoto Y, Rocha VZ, Folco E. Inflammation in atherosclerosis: transition from theory to practice. Circ J. - 2010. - No. 74. - P. 213-220; Stefanadi E, Tousoulis D, Papageorgiou N, Briasoulis A, Stefanadis C. Inflammatory biomarkers predicting events in atherosclerosis. Curr Med Chem. - 2010. - No. 17. - P. 1690-1707]. Thus, it was shown that an increase in the content of a certain group of lymphocytes in the blood is associated with an increase in the frequency of cardiovascular events in patients with coronary heart disease, rheumatoid arthritis, diabetes mellitus and chronic renal failure [Libby P. Role of inflammation in atherosclerosis associated with rheumatoid arthritis. Am J Med. - 2008. - No. 121. - P. S21-S31; Liuzzo G, Biasucci LM, Trotta G, Brugaletta S, Pinnelli M, Digianuario G, Rizzello V, Rebuzzi AG, Rumi C, Maseri A, Crea F. Unusual CD4_CD28null T lymphocytes and recurrence of acute coronary events. J Am Coll Cardiol. - 2007. - No. 50. - P. 1450-1458; Giubilato S, Liuzzo G, Brugaletta S, Pitocco D, Graziani F, Smaldone C, Montone RA, Pazzano V, Pedicino D, Biasucci LM, Ghirlanda G, Crea F. Expansion of CD4 + CD28null T-lymphocytes in diabetic patients: exploring new pathogenetic mechanisms of increased cardiovascular risk in diabetes mellitus. Eur Heart J. - 2011. - No. 32. - P. 1214-1226]. He not only systemic inflammation, but also a local remote inflammatory process affects the state of atherosclerotic plaques. For example, the association of incidence of periodontitis and coronary atherosclerosis has been identified [Humphrey LL, Fu R, Buckley DI, Freeman M, Helfand M. Periodontal disease and coronary heart disease incidence: a systematic review and meta-analysis. J Gen Intern Med. - 2008. - No. 23. - P. 2079-2086]. Even more important is the fact that inflammation in the plaque can cause its growth and rupture of the tire, leading to such clinical manifestations as unstable angina pectoris or acute myocardial infarction.
Как и воспаление любой другой локализации, воспаление в бляшке характеризуется инфильтрацией и активацией клеток иммунной системы [Naruko Т, Ueda М, Haze К, van der Wal AC, van der Loos CM, Itoh A, Komatsu R, Ikura Y, Ogami M, Shimada Y, Ehara S, Yoshiyama M, Takeuchi K, Yoshikawa J, Becker AE. Neutrophil infiltration of culprit lesions in acute coronary syndromes. Circulation. - 2002. - №106. - P. 2894-2900; Taleb S, Tedgui A, Mallat Z. Regulatory T-cell immunity and its relevance to atherosclerosis. J Intern Med. - 2008. - №263. - Р. 489-199]. Однако детальный анализ состояния отдельных клеток в бляшках до настоящего времени не был проведен за исключением традиционного иммуногистохимического анализа. Гистохимический анализ выявил, что в осложненных бляшках, полученных в ходе каротидной эндартерэктомии, содержится больше лимфоцитов [Rossmann A, Henderson В, Heidecker В, Seiler R, Fraedrich G, Singh M, Parson W, Keller M, Grubeck-Loebenstein B, Wick G. T-cells from advanced atherosclerotic lesions recognize hHSP60 and have a restricted T-cell receptor repertoire. Exp Gerontol. - 2008. - №43. - P. 229-237] и дендритных клеток [Erbel С, Sato К, Meyer FB, Kopecky SL, Frye RL, Goronzy JJ, Weyand CM. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. - 2007. - №102. - P. 123-132], чем в контрольных образцах артерий.Like inflammation of any other localization, plaque inflammation is characterized by the infiltration and activation of immune cells [Naruko T, Ueda M, Haze K, van der Wal AC, van der Loos CM, Itoh A, Komatsu R, Ikura Y, Ogami M, Shimada Y, Ehara S, Yoshiyama M, Takeuchi K, Yoshikawa J, Becker AE. Neutrophil infiltration of culprit lesions in acute coronary syndromes. Circulation. - 2002. - No. 106. - P. 2894-2900; Taleb S, Tedgui A, Mallat Z. Regulatory T-cell immunity and its relevance to atherosclerosis. J Intern Med. - 2008. - No. 263. - R. 489-199]. However, a detailed analysis of the state of individual cells in plaques has not yet been performed, with the exception of traditional immunohistochemical analysis. Histochemical analysis revealed that complicated plaques obtained during carotid endarterectomy contain more lymphocytes [Rossmann A, Henderson B, Heidecker B, Seiler R, Fraedrich G, Singh M, Parson W, Keller M, Grubeck-Loebenstein B, Wick G T-cells from advanced atherosclerotic lesions recognize hHSP60 and have a restricted T-cell receptor repertoire. Exp Gerontol. - 2008. - No. 43. - P. 229-237] and dendritic cells [Erbel C, Sato K, Meyer FB, Kopecky SL, Frye RL, Goronzy JJ, Weyand CM. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. - 2007. - No. 102. - P. 123-132] than in control samples of arteries.
Несмотря на большое количество клинических и экспериментальных данных об образовании, созревании и разрыве атеросклеротических бляшек, механизмы этих явлений остаются во многом неизвестными. Показано, что системное воспаление играет важную роль в этом процессе [Tahara N, Imaizumi Т, Virmani R, Narula J. Clinical feasibility of molecular imaging of plaque inflammation in atherosclerosis. J Nucl Med. - 2009. - №50. - P. 331-334].Despite the large amount of clinical and experimental data on the formation, maturation and rupture of atherosclerotic plaques, the mechanisms of these phenomena remain largely unknown. It has been shown that systemic inflammation plays an important role in this process [Tahara N, Imaizumi T, Virmani R, Narula J. Clinical feasibility of molecular imaging of plaque inflammation in atherosclerosis. J Nucl Med. - 2009. - No. 50. - P. 331-334].
Гистохимический анализ [Gewaltig J, Kummer M, Koella C, Cathomas G, Biedermann ВС.Requirements for CD8 T-cell migration into the human arterial wall. Hum Pathol. - 2008. - №39. - P. 1756-1762] и полимеразная цепная реакция с ДНК, выделенной из атеросклеротических бляшек [De Palma R, Del Galdo F, Abbate G, Chiariello M, Calabro R, Forte L, Cimmino G, Papa MF, Russo MG, Ambrosio G, Giombolini C, Tritto I, Notaristefano S, Berrino L, Rossi F, Golino P. Patients with acute coronary syndrome show oligoclonal T-cell recruitment within unstable plaque: evidence for a local, intracoronary immunologic mechanism. Circulation. - 2006. - №113. - P. 640-646], выявили активацию Т-клеток в нестабильной бляшке, что значительно расширило наше знание факторов, связанных с нестабильностью бляшек.Histochemical analysis [Gewaltig J, Kummer M, Koella C, Cathomas G, Biedermann BC. Requirements for CD8 T-cell migration into the human arterial wall. Hum Pathol. - 2008. - No. 39. - P. 1756-1762] and polymerase chain reaction with DNA isolated from atherosclerotic plaques [De Palma R, Del Galdo F, Abbate G, Chiariello M, Calabro R, Forte L, Cimmino G, Papa MF, Russo MG, Ambrosio G , Giombolini C, Tritto I, Notaristefano S, Berrino L, Rossi F, Golino P. Patients with acute coronary syndrome show oligoclonal T-cell recruitment within unstable plaque: evidence for a local, intracoronary immunologic mechanism. Circulation. - 2006. - No. 113. - P. 640-646], revealed the activation of T cells in an unstable plaque, which greatly expanded our knowledge of the factors associated with the instability of plaques.
Однако этих знаний недостаточно, поскольку полимеразная цепная реакция дает возможность выявить лишь общие характеристики Т-лимфоцитов, а при помощи иммуногистохимии можно определять только один-два клеточных антигена.However, this knowledge is not enough, since the polymerase chain reaction makes it possible to identify only the general characteristics of T-lymphocytes, and using immunohistochemistry, only one or two cellular antigens can be determined.
Для более полной характеристики лимфоцитов и их роли в иммунологических механизмах созревания и разрыва бляшки необходимо проанализировать лимфоцитарные фенотипы и их распределение в отдельных бляшках. Единственная современная технология, позволяющая выполнить эти задачи - это многоцветная проточная цитометрия. Одним из основных препятствий к использованию современной технологии многоцветной проточной цитометрии для всестороннего изучения параметров клеток, содержащихся в бляшке, является сложность выделения клеток из бляшки без повреждения поверхностных клеточных маркеров, определяющих фенотип клеток.For a more complete description of lymphocytes and their role in the immunological mechanisms of plaque maturation and rupture, it is necessary to analyze lymphocytic phenotypes and their distribution in individual plaques. The only modern technology to accomplish these tasks is multicolor flow cytometry. One of the main obstacles to using modern multicolor flow cytometry technology to comprehensively study the parameters of cells contained in a plaque is the difficulty of isolating cells from a plaque without damaging the surface cell markers that determine the cell phenotype.
Известен способ выделения лимфоцитов из ткани атеросклеротических бляшек сонных артерий. В способе использовался метод разделения ткани на мелкие блоки, которые в дальнейшем помещались в культивационную среду на 4-6 часов с различными активаторами миграции лимфоцитов. Далее отдельные лимфоциты, мигрировавшие за время культивирования из ткани в среду, собирались, окрашивались на поверхностные маркеры CD4 и CD8 и подвергались исследованию с помощью проточной цитометрии [Curry MP, Norris S, Golden-Mason L, Doherty DG, Deignan T, Collins C, Traynor O, McEntee GP, Hegarty JE, O’Farrelly C. Isolation of lymphocytes from normal adult human liver suitable for phenotypic and functional characterization. J Immunol Methods. - 2000. - №242 (1-2). - Р. 21-31]. В данном способе не проводился ферментативный гидролиз тканей и фильтрация клеток, анализировались только клетки, мигрировавшие в культуральную среду. Это давало возможность не отрабатывать методику выделения живых клеток и отделения их тканевого дебриса, так как проводился анализ только клеток из жидкостной среды, а не из самой ткани образца. Кроме того в способе рассматривались поверхностные маркеры лишь двух указанных типов. Поэтому данный способ не дает возможности оценить полный клеточный состав атеросклеротических бляшек, так как исследовались только отдельные CD4 и CD8 лимфоциты, которые самостоятельно мигрировали в культивационную среду.A known method for the isolation of lymphocytes from the tissue of atherosclerotic plaques of the carotid arteries. The method used the method of separation of tissue into small blocks, which were then placed in a cultivation medium for 4-6 hours with various activators of lymphocyte migration. Then, individual lymphocytes that migrated from tissue to medium during cultivation were collected, stained for surface markers CD4 and CD8, and examined using flow cytometry [Curry MP, Norris S, Golden-Mason L, Doherty DG, Deignan T, Collins C, Traynor O, McEntee GP, Hegarty JE, O'Farrelly C. Isolation of lymphocytes from normal adult human liver suitable for phenotypic and functional characterization. J Immunol Methods. - 2000. - No. 242 (1-2). - R. 21-31]. In this method, enzymatic hydrolysis of tissues and cell filtration were not carried out, only cells migrated into the culture medium were analyzed. This made it possible not to work out the technique for isolating living cells and separating their tissue debris, since only cells from the liquid medium were analyzed, and not from the sample tissue itself. In addition, the method considered surface markers of only two of these types. Therefore, this method does not make it possible to evaluate the full cellular composition of atherosclerotic plaques, since only individual CD4 and CD8 lymphocytes that independently migrated to the cultivation medium were studied.
Кроме того, известен способ выделения лимфоцитов из ткани миндалин и цервико-вагинального тракта [Saba Е, Grivel JC, Vanpouille С, Brichacek В, Fitzgerald W, Margolis L, Lisco A. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. - 2010. - №3 (3). - P. 280-290], где участки лимфоидной ткани, препарированные на мелкие блоки, подвергались обработке коллагеназой IV типа в концентрации 5 мг/мл в течение 30-90 мин. Далее суспензия клеток окрашивалась различными комбинациями флуоресцентно-меченых антител для определения всех типов клеток, выделенных из лимфоидной ткани, после чего проводился анализ клеточного состава с помощью проточной цитометрии. Однако в данном способе клетки выделялись из образцов тканей солидных иммунных органов, которые имели малую плотность и малую гетерогенность, в связи с чем дополнительная обработка высококонцентрированными ферментами и фильтрация образцов исследователям не требовалась. Однако подобный метод не позволит провести выделение всех типов клеток из высоко гетерогенной и плотно структурированной ткани атеросклеротических бляшек.In addition, there is a method of isolating lymphocytes from the tissue of the tonsils and cervical-vaginal tract [Saba E, Grivel JC, Vanpouille C, Brichacek B, Fitzgerald W, Margolis L, Lisco A. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. - 2010. - No. 3 (3). - P. 280-290], where sections of lymphoid tissue, prepared into small blocks, were treated with type IV collagenase at a concentration of 5 mg / ml for 30-90 minutes. Next, the cell suspension was stained with various combinations of fluorescently-labeled antibodies to determine all types of cells isolated from lymphoid tissue, after which the cell composition was analyzed by flow cytometry. However, in this method, cells were isolated from tissue samples of solid immune organs, which had a low density and low heterogeneity, and therefore the researchers did not need additional treatment with highly concentrated enzymes and filtering the samples. However, such a method will not allow the selection of all types of cells from highly heterogeneous and densely structured tissue of atherosclerotic plaques.
Описан также способ определения состава иммунных клеток, которые выделялись из ткани тонкой кишки свиней. В способе проводилась ферментативная обработка коллагеназой крупных участков тонкой кишки без ее дополнительного препарирования. В дальнейшем проводился анализ с помощью проточной цитометрии лимфоцитов, выделяющихся только из внутреннего гомогенного слоя клеток кишки [Solano-Aguilar GI, Vengroski KG, Beshah E, Lunney JK. Isolation and purification of lymphocyte subsets from gut-associated lymphoid tissue in neonatal swine. - 2000. - №241 (1-2). - P. 185-199]. Так же, как и в предыдущем способе, выделение клеток в данном исследовании проводилось из внутреннего гомогенного слоя мягкотканной структуры кишки, что позволило применять смесь ферментов в низких концентрациях и не проводить дополнительной фильтрации образцов. Однако как и предыдущий, описанный метод не позволит провести выделение всех типов клеток из высоко гетерогенной и плотно структурированной ткани атеросклеротических бляшек.Also described is a method for determining the composition of immune cells that were released from the tissue of the small intestine of pigs. In the method, enzymatic treatment with collagenase of large sections of the small intestine was carried out without its additional preparation. Subsequently, analysis was carried out using flow cytometry of lymphocytes released only from the internal homogeneous layer of intestinal cells [Solano-Aguilar GI, Vengroski KG, Beshah E, Lunney JK. Isolation and purification of lymphocyte subsets from gut-associated lymphoid tissue in neonatal swine. - 2000. - No. 241 (1-2). - P. 185-199]. As in the previous method, the isolation of cells in this study was carried out from the internal homogeneous layer of the soft tissue structure of the intestine, which allowed the use of a mixture of enzymes in low concentrations and not to carry out additional filtering of the samples. However, like the previous one, the described method will not allow the selection of all types of cells from highly heterogeneous and densely structured tissue of atherosclerotic plaques.
Таким образом, по данным литературы существующие на сегодняшний день методы анализа клеточного состава тканей с помощью проточной цитометрии позволяют либо анализировать небольшое количество клеток, которые были выделены не из тканей, а из культуральной среды при кратковременном культивировании ткани; либо проводить выделение с помощью малоактивных ферментов без дополнительной фильтрации и анализировать клетки из мягкотканных гомогенных структур, таких как лимфоидные органы кишки, лимфатические узлы. Однако важно отметить, что структура атеросклеротических бляшек крайне гетерогенна, бляшки содержат не только различные клеточные компоненты, но и большое число внеклеточных структур (кристаллы солей кальция, холестериновые кислоты, некротические массы). В связи с этим выделение всех клеток из данных структур требует отработки этапов фильтрации образцов для увеличения точности анализа всех клеток бляшек с помощью проточной цитометрии.Thus, according to the literature, the existing methods for analyzing the cellular composition of tissues using flow cytometry allow either to analyze a small number of cells that were not isolated from tissues, but from the culture medium during short-term tissue cultivation; either isolate using low-activity enzymes without additional filtration and analyze cells from soft-tissue homogeneous structures, such as lymphoid organs of the intestine, lymph nodes. However, it is important to note that the structure of atherosclerotic plaques is extremely heterogeneous, plaques contain not only various cellular components, but also a large number of extracellular structures (crystals of calcium salts, cholesteric acids, necrotic masses). In this regard, the isolation of all cells from these structures requires testing the stages of filtering samples to increase the accuracy of the analysis of all plaque cells using flow cytometry.
Описан способ определения клеточного состава атеросклеротических бляшек сонных артерий человека с помощью проточной цитометрии [Bonanno Е, Mauriello A, Partenzi A, Anemona L, Spagnoli LG. Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study. Cytometry. - 2000. - №39 (2). - Р. 158-165]. В данном способе в качестве материала для определения клеточного состава атеросклеротических бляшек использовали операционный материал, полученный при проведении операции каротидной эндартеректомии (атеросклеротические бляшки). Бляшки нарезали на кусочки и затем подвергали ферментативной обработке коллагеназой I (250 ед/мл) в течение ночи при 37°C. Суспензию клеток фильтровали через 150 мкм нейлоновый фильтр и окрашивали для проточной цитометрии моноклональными антителами к ассоциированным с цитоплазматической мембраной антигенам в течение 30 минут при 4°C, после чего проводили проточную цитометрию. Недостаток данного способа заключается в том, что после препарирования ткани атеросклеротических бляшек и ферментативной обработки проводилась фильтрация клеточной суспензии с помощью 150 мкм нейлонового фильтра, что не позволит достоверно разделять отдельные типы иммунных клеток при анализе с высокой эффективностью, а также использовать современные проточные цитометры с ограничением диаметра сортировочного сопла.A method for determining the cellular composition of atherosclerotic plaques of human carotid arteries using flow cytometry [Bonanno E, Mauriello A, Partenzi A, Anemona L, Spagnoli LG. Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study. Cytometry - 2000. - No. 39 (2). - R. 158-165]. In this method, as the material for determining the cellular composition of atherosclerotic plaques, the surgical material obtained during the carotid endarterectomy operation (atherosclerotic plaques) was used. Plaques were cut into pieces and then subjected to enzymatic treatment with collagenase I (250 u / ml) overnight at 37 ° C. The cell suspension was filtered through a 150 μm nylon filter and stained for flow cytometry with monoclonal antibodies to antigens associated with the cytoplasmic membrane for 30 minutes at 4 ° C, after which flow cytometry was performed. The disadvantage of this method is that after preparation of the tissue of atherosclerotic plaques and enzymatic treatment, the cell suspension was filtered using a 150 μm nylon filter, which will not allow reliable separation of individual types of immune cells in the analysis with high efficiency, as well as the use of modern flow cytometers with a restriction diameter of the sorting nozzle.
Известен способ определения иммунных клеток из атеросклеротических бляшек человека с помощью проточной цитометрии [Новый метод анализа клеточного состава атеросклеротических бляшек / Гривель Ж.-Ш. [и др.] // Креативная кардиология - 2012. - №1. - С. 26-40], заключающийся в том, что в качестве материала для определения клеточного состава атеросклеротических бляшек используют операционный материал, полученный при проведении операции каротидной эндартеректомии (атеросклеротические бляшки), который транспортируют в культуральной среде RPMI 1640 при комнатной температуре в течение не более 2 часов. От атеросклеротической бляшки отделяют фрагмент размером 2 мм, который фиксируют в 2% формалине. Остаток ткани нарезают на блоки размером 2 мм и подвергают ферментативной обработке. Кусочки бляшки лизируют коллагеназой IV (1,25 мг/мл) в присутствии 0,2 мг/мл ДНКазы I в течение 1 часа при 37°C при постоянном перемешивании. Суспензию клеток фильтруют через 100 мкм нейлоновый фильтр и отмывают в растворе PBS.A known method of determining immune cells from atherosclerotic plaques of a person using flow cytometry [A new method for analyzing the cellular composition of atherosclerotic plaques / Grivel J.-S. [and others] // Creative Cardiology - 2012. - No. 1. - S. 26-40], which consists in the fact that as a material for determining the cellular composition of atherosclerotic plaques, the surgical material obtained during carotid endarterectomy (atherosclerotic plaques) is used, which is transported in RPMI 1640 culture medium at room temperature for not more than 2 hours. A 2 mm fragment is separated from the atherosclerotic plaque, which is fixed in 2% formalin. The remainder of the tissue is cut into blocks of 2 mm in size and subjected to enzymatic treatment. Pieces of the plaque are lysed with collagenase IV (1.25 mg / ml) in the presence of 0.2 mg / ml DNase I for 1 hour at 37 ° C with constant stirring. The cell suspension is filtered through a 100 μm nylon filter and washed in a PBS solution.
Из полученной клеточной суспензии берут 100 мкл для постановки негативного контроля. Для отделения живых клеток от мертвых остальные клетки ресуспензируют в растворе PBS и окрашивают специальным красителем в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре, затем отмывают раствором PBS с 2% содержанием нормальной мышиной сыворотки. Затем суспензию клеток делят на необходимое количество пробирок, оставляя часть для анализа на живые/мертвые клетки, и окрашивают моноклональными для определения CD4 и CD8 Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, NK-клеток, а также степени дифференцировки и активации Т-лимфоцитов, в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре. После окраски клетки отмывают раствором PBS, фиксируют в 1% растворе формальдегида в PBS, и анализируют на проточном цитометре (типа FACS Canto II, BD Biosciences, San Jose, CA). Ставятся одноцветные реакции компенсации для каждой окраски в каждом эксперименте, используя сферические микрочастицы. В качестве контроля для установки области анализа и подтверждения специфичности окраски используются те же комбинации антител, что и в эксперименте, но за вычетом одного из антител. При окончательном анализе используется перекрытие спектров различных флуорофоров с учетом аутофлуоресценции сигналов. Этот способ был выбран за прототип.From the resulting cell suspension, 100 μl was taken to set up a negative control. To separate living cells from dead cells, the remaining cells are resuspended in a PBS solution and stained with a special dye for 15 minutes in the dark at room temperature, then washed with a PBS solution with 2% normal mouse serum. Then, the cell suspension is divided into the required number of tubes, leaving a part for analysis on living / dead cells, and stained monoclonal for determination of CD4 and CD8 T-lymphocytes, B-lymphocytes, NK-cells, as well as the degree of differentiation and activation of T-lymphocytes, for 15 minutes in the dark at room temperature. After staining, the cells are washed with PBS, fixed in a 1% solution of formaldehyde in PBS, and analyzed on a flow cytometer (type FACS Canto II, BD Biosciences, San Jose, CA). Monochromatic compensation reactions are set for each color in each experiment using spherical microparticles. As a control, the same antibody combinations are used as in the experiment to set the analysis area and confirm the specificity of the color, but minus one of the antibodies. The final analysis uses overlapping spectra of various fluorophores, taking into account the autofluorescence of the signals. This method was chosen for the prototype.
Недостаток данного способа заключается в сниженной точности отделения фракции живых клеток от мертвых, приводящей к снижению эффективности определения клеточного состава атеросклеротических бляшек. Применение при фильтрации нейлонового фильтра с размером пор 100 мкм не обеспечивает достаточно эффективного удаления фрагментов и агрегатов мертвых клеток, а также агрегатов липидных клеток и солей кальция, что приводит к очень высокой интенсивности аутофлуоресценции сигнала от большинства лазеров в образцах, которая мешает проведению анализа данных с помощью проточной цитометрии и снижает точность оценки клеточного состава атеросклеротических бляшек.The disadvantage of this method is the reduced accuracy of separating the fraction of living cells from dead cells, leading to a decrease in the efficiency of determining the cellular composition of atherosclerotic plaques. The use of a nylon filter with a pore size of 100 μm when filtering does not provide sufficiently efficient removal of fragments and aggregates of dead cells, as well as aggregates of lipid cells and calcium salts, which leads to a very high intensity of autofluorescence of the signal from most lasers in the samples, which interferes with the analysis of data from using flow cytometry and reduces the accuracy of assessing the cellular composition of atherosclerotic plaques.
Кроме того, применение нейлонового фильтра с размером пор 100 мкм при подготовке суспензии клеток приводит к формированию крупных клеточных агрегатов, в связи с чем использование данной суспензии для анализа на проточных цитометрах современного поколения, имеющих диаметр сортировочного сопла для фокусировки потока жидкости менее 100 мкм, становится не возможным.In addition, the use of a nylon filter with a pore size of 100 μm in the preparation of a cell suspension leads to the formation of large cell aggregates, and therefore the use of this suspension for analysis on flow cytometers of modern generation having a sorting nozzle diameter for focusing the fluid flow is less than 100 μm becomes not possible.
Задачей изобретения является повышение эффективности оценки состава иммунных клеток атеросклеротических бляшек.The objective of the invention is to increase the efficiency of assessing the composition of immune cells of atherosclerotic plaques.
Технический результат заключается в повышении эффективности выделения и точности определения популяции живых клеток, необходимых для исследования состава иммунных клеток из атеросклеротических бляшек на различных моделях проточного цитометра.The technical result consists in increasing the efficiency of isolation and the accuracy of determining the population of living cells necessary for studying the composition of immune cells from atherosclerotic plaques on various flow cytometer models.
Это достигается за счет того, что при приготовлении клеточной суспензии используют нейлоновый фильтр с размером пор 40 мкм.This is achieved due to the fact that in the preparation of the cell suspension using a nylon filter with a pore size of 40 microns.
При прохождении через поры нейлонового фильтра с размером пор 40 мкм агрегаты клеток разбиваются на более мелкие структуры, чем при использовании фильтра с размерами пор 100 мкм, при этом через 40 мкм пору не проходят агрегаты фрагментов умерших клеток, а также солей кальция или жировой ткани адвентиции атеросклеротических бляшек. Уменьшение размера структур в суспензии делает возможным использование последнего поколения проточных цитометров-сортеров, обладающих сортировочным соплом с диаметром 70-100 мкм (Рис. 1, а - изображение потока жидкости проточного цитометра-сортера при анализе клеточной суспензии, фильтрованной с помощью 100 мкм нейлонового фильтра; рис. 1, б - изображение потока жидкости проточного цитометра-сортера при анализе клеточной суспензии, фильтрованной с помощью 40 мкм нейлонового фильтра). Как видно на рис. 1, а, при анализе клеточной суспензии, фильтрованной через 100 мкм фильтр, возникают моменты блокировки потока жидкости проточного цитометра клеточными агрегатами. При анализе клеточной суспензии, фильтрованной через 40 мкм фильтр, выделен фрагмент возможной остановки потока, однако при большем разрешении определено, что блокировка потока жидкости не происходит (Рис. 1, б).When passing through the pores of a nylon filter with a pore size of 40 μm, cell aggregates are broken down into smaller structures than when using a filter with a pore size of 100 μm, while aggregates of fragments of dead cells, as well as calcium salts or adventitia adipose tissue do not pass through the pore 40 atherosclerotic plaques. Reducing the size of structures in the suspension makes it possible to use the latest generation of flow cytometers-sorters with a sorting nozzle with a diameter of 70-100 μm (Fig. 1, a - image of the fluid flow of a flow cytometer-sorter when analyzing a cell suspension filtered using a 100 μm nylon filter ; Fig. 1, b - image of the fluid flow of a flow cytometer sorter when analyzing a cell suspension filtered with a 40 μm nylon filter). As can be seen in fig. 1a, when analyzing a cell suspension filtered through a 100 μm filter, moments of blocking the flow of fluid from the flow cytometer by cell aggregates arise. When analyzing a cell suspension filtered through a 40 μm filter, a fragment of a possible flow stop was identified, however, with a higher resolution, it was determined that blocking the fluid flow does not occur (Fig. 1, b).
Кроме того, удаление перечисленных структур из образцов клеток приводит к значительному уменьшению интенсивности аутофлуоресценции в спектре флуорохромов, сцепленных с анализируемыми антителами и их изотипами. При этом уровень флуоресценции изотипических контролей снижается до 5% от флуореценции позитивного сигнала (Табл. 1).In addition, the removal of these structures from cell samples leads to a significant decrease in the intensity of autofluorescence in the spectrum of fluorochromes coupled to the analyzed antibodies and their isotypes. At the same time, the fluorescence level of isotypic controls is reduced to 5% of the positive signal fluorescence (Table 1).
Как видно из табл. 1, уровень аутофлуоресценции снижается при использовании 40 мкм фильтра по всем каналам флуоресценции проточного цитометра. Таким образом, гораздо более высокой становится точность отделения по интенсивности флуоресцентного сигнала негативных событий от позитивных и более точная оценка количества живых клеток, несущих исследуемые поверхностные маркеры (Табл. 2).As can be seen from the table. 1, the level of autofluorescence decreases when using a 40 μm filter over all fluorescence channels of the flow cytometer. Thus, the accuracy of separating negative events from positive events by the intensity of the fluorescent signal and a more accurate estimate of the number of living cells carrying the surface markers under study becomes much higher (Table 2).
Как видно из табл. 2, количество агрегатов клеток, мертвых клеток, а также дуплетных событий становится значительно ниже при использовании 40 мкм фильтра по сравнению со 100 мкм фильтром.As can be seen from the table. 2, the number of cell aggregates, dead cells, and doublet events becomes significantly lower when using a 40 μm filter compared to a 100 μm filter.
Рисунки, поясняющие сущность изобретения:Figures explaining the invention:
рис. 1, а и б - изображение моментов остановки потока жидкости проточного цитометра-сортера при анализе клеточной суспензии.fig. 1, a and b - the image of the moments of stopping the flow of fluid flow cytometer sorter in the analysis of cell suspension.
Способ осуществляется следующим образом:The method is as follows:
В качестве материала для выделения иммунных клеток из атеросклеротических бляшек используют операционный материал, полученный при проведении операции эндартерэктомии (атеросклеротические бляшки), которые транспортируют в среде RPMI 1640 при комнатной температуре в течение не более 2 часов. От атеросклеротической бляшки отделяют фрагмент размером 2 мм, который фиксируют в 2% формалине. Остаток ткани нарезают на блоки размером 2 мм и затем подвергают ферментативной обработке. Кусочки бляшки лизируют коллагеназой IV (1,25 мг/мл) в присутствии 0,2 мг/мл ДНКазы I в течение 1 часа при 37°C при постоянном перемешивании. Суспензию клеток фильтруют через 100 мкм нейлоновый фильтр и отмывают в растворе PBS. Из полученной клеточной суспензии берут 100 мкл для постановки негативного контроля. Для отделения живых клеток от мертвых остальные клетки ресуспензируют в растворе PBS и окрашивают специальным красителем в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре, затем отмывают раствором PBS с 2% содержанием нормальной мышиной сыворотки. Затем суспензию клеток делят на необходимое количество пробирок, оставляя часть для анализа на живые/мертвые клетки, и окрашивают моноклональными для определения CD4 и CD8 Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, NK-клеток, а также степени дифференцировки и активации Т-лимфоцитов, в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре. После окраски клетки отмывают раствором PBS, фиксируют в 1% растворе формальдегида в PBS, и анализируют на любом типе проточного цитометра (например, прибор FACS Aria II, BD Biosciences, San Jose, СА). Ставятся одноцветные реакции компенсации для каждой окраски в каждом эксперименте, используя сферические микрочастицы. В качестве контроля для установки области анализа и подтверждения специфичности окраски используются те же комбинации антител, что и в эксперименте, но за вычетом одного из антител. При окончательном анализе используется перекрытие спектров различных флуорофоров с учетом аутофлуоресценции сигналов.As a material for the isolation of immune cells from atherosclerotic plaques, surgical material obtained during an endarterectomy (atherosclerotic plaques) is used, which is transported in RPMI 1640 medium at room temperature for no more than 2 hours. A 2 mm fragment is separated from the atherosclerotic plaque, which is fixed in 2% formalin. The remainder of the tissue is cut into blocks of 2 mm in size and then subjected to enzymatic treatment. Pieces of the plaque are lysed with collagenase IV (1.25 mg / ml) in the presence of 0.2 mg / ml DNase I for 1 hour at 37 ° C with constant stirring. The cell suspension is filtered through a 100 μm nylon filter and washed in a PBS solution. From the resulting cell suspension, 100 μl was taken to set up a negative control. To separate living cells from dead cells, the remaining cells are resuspended in a PBS solution and stained with a special dye for 15 minutes in the dark at room temperature, then washed with a PBS solution with 2% normal mouse serum. Then, the cell suspension is divided into the required number of tubes, leaving a part for analysis on living / dead cells, and stained monoclonal for determination of CD4 and CD8 T-lymphocytes, B-lymphocytes, NK-cells, as well as the degree of differentiation and activation of T-lymphocytes, for 15 minutes in the dark at room temperature. After staining, the cells are washed with PBS solution, fixed in a 1% solution of formaldehyde in PBS, and analyzed on any type of flow cytometer (for example, FACS Aria II, BD Biosciences, San Jose, CA). Monochromatic compensation reactions are set for each color in each experiment using spherical microparticles. As a control, the same antibody combinations are used as in the experiment to set the analysis area and confirm the specificity of the color, but minus one of the antibodies. The final analysis uses overlapping spectra of various fluorophores, taking into account the autofluorescence of the signals.
Пример Example
В качестве источника исследуемого материала была взята атеросклеротическая бляшка из правой внутренней сонной артерии при операции эндартерэктомии у пациента мужского пола 69 лет. Бляшка была помещена в транспортную среду RPMI 1640. Образцы в течение 1,5 часов были доставлены в лабораторию. В лаборатории образец бляшки был помещен в чашку Петри, осмотрен и описан макроскопически, сфотографирован и в стерильных условиях порезан на блоки размером 2 мм. 1 кусочек был залит раствором 2% формалина для дальнейшего гистологического исследования. Остальные кусочки бляшки поместили в пробирки типа эппендорф, содержащие раствор коллагеназы IV (1,25 мг/мл) в присутствии 0,2 мг/мл ДНКазы I, инкубировали в течение 1 часа при 37°C при постоянном перемешивании. После этого клетки были профильтрованы через 40 мкм нейлоновый фильтр и отмыты в растворе PBS. Из полученной клеточной суспензии взято 100 мкл для негативного контроля. Остальные клетки ресуспензированы в растворе PBS и окрашены красителем Pacific Orange с реактивной аминогруппой (Invitrogen, Carlsbad, СА) в течение 15 минут в темноте, отмыты раствором PBS с 2% содержанием нормальной мышиной сыворотки. Клетки были поделены по 50 мкл для окраски комбинациями антител и для анализа на живые/мертвые клетки. Для окраски использовались следующие комбинации моноклональных антител, разведенных до оптимального титра: (1) CD45 Cy7-РЕ, CD3 Cy5.5-PerCp, CD4 eFluor780-APC, CD28 РЕ, CD27 FITC, CD197 АРС и CD45RA eFluor 450 для выявления популяций Т-клеток памяти и наивных Т-клеток; (2) CD45 Cy7-РЕ, CD3 Cy5.5-PerCp, CD4 eFluor780-APC, CD25 РЕ, CD146 FITC, CD38 АРС и HLA-DR Pacific blue для определения Т-клеточной активации; а также, (3) CD45 Cy7-РЕ, CD3 Cy5.5-PerCp, CD4 eFluor780-APC, CD 19 РЕ, CD16 FITC, CD56 АРС, CD8 eFluor450 для анализа Т-клеток, В-клеток и натуральных киллеров (NK). Окраска проводилась в 5 мл пробирках в течение 15 минут в темноте, затем клетки отмывались раствором PBS и фиксировались 1% раствором формалина. Также ставились одноцветные реакции компенсации для каждой окраски в каждом эксперименте, используя сферические микрочастицы CompBeads (Becton Dickinson). В качестве контроля для установки области анализа и подтверждения специфичности окраски использовались те же комбинации антител, что и в эксперименте, но за вычетом одного из антител. При окончательном анализе использовалось перекрытие спектров различных флуорофоров с учетом аутофлуоресценции сигналов.Atherosclerotic plaque from the right internal carotid artery during endarterectomy in a 69-year-old male patient was taken as the source of the test material. The plaque was placed in an RPMI 1640 transport medium. Samples were delivered to the laboratory within 1.5 hours. In the laboratory, a plaque sample was placed in a Petri dish, examined and described macroscopically, photographed and, under sterile conditions, cut into 2 mm blocks. 1 piece was filled with a solution of 2% formalin for further histological examination. The remaining pieces of the plaque were placed in eppendorf tubes containing collagenase IV solution (1.25 mg / ml) in the presence of 0.2 mg / ml DNase I, incubated for 1 hour at 37 ° C with constant stirring. After that, the cells were filtered through a 40 μm nylon filter and washed in PBS solution. 100 μl was taken from the resulting cell suspension for negative control. The remaining cells were resuspended in a PBS solution and stained with a Pacific Orange dye with a reactive amino group (Invitrogen, Carlsbad, CA) for 15 minutes in the dark, washed with a PBS solution with 2% normal mouse serum. The cells were divided in 50 μl for staining with combinations of antibodies and for analysis of living / dead cells. The following combinations of monoclonal antibodies diluted to the optimal titer were used for staining: (1) CD45 Cy7-PE, CD3 Cy5.5-PerCp, CD4 eFluor780-APC, CD28 PE, CD27 FITC, CD197 APC and CD45RA eFluor 450 to identify T- populations memory cells and naive T cells; (2) CD45 Cy7-PE, CD3 Cy5.5-PerCp, CD4 eFluor780-APC, CD25 PE, CD146 FITC, CD38 APC and Pacific blue HLA-DR for determining T-cell activation; and (3) CD45 Cy7-PE, CD3 Cy5.5-PerCp, CD4 eFluor780-APC,
При проведении фильтрации с 40 мкм порами общий фон аутофлуоресценции изотипических контролей составил менее 5% от флуоресценции позитивных событий.When filtering with 40 μm pores, the total autofluorescence background of the isotypic controls was less than 5% of the fluorescence of positive events.
При анализе с помощью проточной цитометрии живых клеток, выделенных их бляшки, были получены следующие результаты:In the analysis using flow cytometry of living cells isolated from their plaques, the following results were obtained:
Количество лейкоцитов (CD45+ клеток): 457500 клеток на 1 мг ткани бляшки: гранулоциты - 17.10%, моноциты - 2.63%, лимфоциты - 31.50%.The number of leukocytes (CD45 + cells): 457500 cells per 1 mg of plaque tissue: granulocytes - 17.10%, monocytes - 2.63%, lymphocytes - 31.50%.
Количество лимфоцитов: 144 113 клеток на 1 мг ткани бляшки:The number of lymphocytes: 144 113 cells per 1 mg of plaque tissue:
Т-лимфоциты - 76.40% (110 102 клетки);T-lymphocytes - 76.40% (110 102 cells);
В-лимфоциты - 2.00% (288 клетки);B-lymphocytes - 2.00% (288 cells);
Натуральные киллеры - 17.80% (25 652 клетки): активированные - 10.10%, зрелые - 0.62%, незрелые - 0.00%);Natural killers - 17.80% (25 652 cells): activated - 10.10%, mature - 0.62%, immature - 0.00%);
NKT-клетки - 0.25% (358 клеток): CD4+% - 0.00%, CD8dim - 55.60%, CD8+% - 11.10%, NK-подобные Т-клетки - 33.30%).NKT cells - 0.25% (358 cells): CD4 +% - 0.00%, CD8dim - 55.60%, CD8 +% - 11.10%, NK-like T cells - 33.30%).
При анализе дифференцировки Т-лимфоцитов:When analyzing the differentiation of T-lymphocytes:
наивные клетки: CD8 Naive - 0.89%, CD4 Naive - 2.15%;naive cells: CD8 Naive - 0.89%, CD4 Naive - 2.15%;
клетки памяти:memory cells:
центральные клетки памяти: CD8 Tcm - 25.90%, CD4 Tcm - 36.20%;central memory cells: CD8 Tcm - 25.90%, CD4 Tcm - 36.20%;
эффекторные клетки памяти:effector memory cells:
CD8 Tem - 60.90% (Early differentiated - 33.80%, Terminally differentiated - 37.50%, Intermediate differentiated - 28.70%);CD8 Tem - 60.90% (Early differentiated - 33.80%, Terminally differentiated - 37.50%, Intermediate differentiated - 28.70%);
CD4 Tem - 30.30% (Early differentiated - 29.60%, Terminally differentiated - 7.99%, Intermediate differentiated - 62.41%).CD4 Tem - 30.30% (Early differentiated - 29.60%, Terminally differentiated - 7.99%, Intermediate differentiated - 62.41%).
При анализе активации Т-лимфоцитов:When analyzing the activation of T-lymphocytes:
CD8 CD25 - 16.00%, CD8 CD38 - 47.30% и CD8 HLA-DR - 66.00%;CD8 CD25 - 16.00%, CD8 CD38 - 47.30% and CD8 HLA-DR - 66.00%;
CD4 CD25 - 30.10%, CD4 CD38 - 33.00% и CD4 HLA-DR - 52.20%.CD4 CD25 - 30.10%, CD4 CD38 - 33.00% and CD4 HLA-DR - 52.20%.
Таким образом, нами была успешно исследована степень дифференцировки и активации всей популяции иммунных клеток, выделенных из ткани атеросклеротической бляшки.Thus, we have successfully studied the degree of differentiation and activation of the entire population of immune cells isolated from atherosclerotic plaque tissue.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015153110A RU2616243C1 (en) | 2015-12-10 | 2015-12-10 | Method for atherosclerotic plaques cellular composition determination |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015153110A RU2616243C1 (en) | 2015-12-10 | 2015-12-10 | Method for atherosclerotic plaques cellular composition determination |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2616243C1 true RU2616243C1 (en) | 2017-04-13 |
Family
ID=58642526
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015153110A RU2616243C1 (en) | 2015-12-10 | 2015-12-10 | Method for atherosclerotic plaques cellular composition determination |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2616243C1 (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107643238A (en) * | 2017-09-19 | 2018-01-30 | 中山大学附属第医院 | Method for quantitatively detecting concentration of blood circulation particles |
RU2724856C1 (en) * | 2020-03-10 | 2020-06-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of preparation and inoculation of an atherosclerotic plaque for microbiological examination |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2515371C1 (en) * | 2012-11-07 | 2014-05-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | METHOD OF CULTIVATING ATHEROSCLEROTIC PLAQUE EXPLANTS ex vivo |
RU2552314C2 (en) * | 2013-10-02 | 2015-06-10 | Антон Викторович Тарасов | Method for intravital analysis of atherosclerotic plaque cell composition |
-
2015
- 2015-12-10 RU RU2015153110A patent/RU2616243C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2515371C1 (en) * | 2012-11-07 | 2014-05-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | METHOD OF CULTIVATING ATHEROSCLEROTIC PLAQUE EXPLANTS ex vivo |
RU2552314C2 (en) * | 2013-10-02 | 2015-06-10 | Антон Викторович Тарасов | Method for intravital analysis of atherosclerotic plaque cell composition |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
Dollery CM, Libby P. Atherosclerosis and proteinase activation. Cardiovasc Res. 2006. Vol. 69. Р. 625-635. * |
Libby Р Inflammation in atherosclerosis. Nature. 2002. Vol.420. P.868-874. * |
А. М. Лебедева и др. Атеросклеротические бляшки в системе ex vivo. Клеточная и молекулярная кардиология. 2012, с. 43-50. * |
А.А. Худяков и др. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ КАРДИОМИОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ИЗ ТКАНИ МИОКАРДА. БЮЛЛЛЕТЕНЬ ФЕДЕРАЛЬНОГО ЦЕНТРА СЕРДЦА, КРОВИ И ЭНДОКРИНОЛОГИИ ИМ. В.А. АЛМАЗОВА. Февраль, 2013, с. 17-20. * |
А.А. Худяков и др. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ КАРДИОМИОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ИЗ ТКАНИ МИОКАРДА. БЮЛЛЛЕТЕНЬ ФЕДЕРАЛЬНОГО ЦЕНТРА СЕРДЦА, КРОВИ И ЭНДОКРИНОЛОГИИ ИМ. В.А. АЛМАЗОВА. Февраль, 2013, с. 17-20. А. М. Лебедева и др. Атеросклеротические бляшки в системе ex vivo. Клеточная и молекулярная кардиология. 2012, с. 43-50. Libby Р Inflammation in atherosclerosis. Nature. 2002. Vol.420. P.868-874. Dollery CM, Libby P. Atherosclerosis and proteinase activation. Cardiovasc Res. 2006. Vol. 69. Р. 625-635. * |
Новый метод анализа клеточного состава атеросклеротических бляшек / Гривель Ж. Ш. // Креативная кардиология. 2012. N1. С. 26-40. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107643238A (en) * | 2017-09-19 | 2018-01-30 | 中山大学附属第医院 | Method for quantitatively detecting concentration of blood circulation particles |
RU2724856C1 (en) * | 2020-03-10 | 2020-06-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of preparation and inoculation of an atherosclerotic plaque for microbiological examination |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Majewska et al. | Lymphocytic, cytokine and transcriptomic profiles in peripheral blood of dogs with atopic dermatitis | |
EP2726879B1 (en) | Requlatory t cells and methods of identifying and isolating them using cd6 -expression or the combination of cd4, cd25 and cd127 | |
US10114012B2 (en) | Methods and assays for detecting and quantifying pure subpopulations of white blood cells in immune system disorders | |
JP5992393B2 (en) | Preparation method | |
CA2892482C (en) | Methods for determining the risk of acute graft versus host disease | |
Pennock et al. | In vivo exit of c-kit+/CD49dhi/β7+ mucosal mast cell precursors from the bone marrow following infection with the intestinal nematode Trichinella spiralis | |
Uhde et al. | Phenotypic shift of small intestinal intra-epithelial type 1 innate lymphoid cells in celiac disease is associated with enhanced cytotoxic potential | |
Smit et al. | Single-cell profiling reveals age-associated immunity in atherosclerosis | |
Sanos et al. | Isolation of NK cells and NK-like cells from the intestinal lamina propria | |
RU2616243C1 (en) | Method for atherosclerotic plaques cellular composition determination | |
Chesneau et al. | New method for the expansion of highly purified human regulatory granzyme B-expressing B cells | |
US20180052162A1 (en) | Method to detect the onset and to monitor the recurrence of chronic graft versus host disease in tranplantation patients | |
Härtle et al. | Delineation of chicken immune markers in the era of omics and multicolor flow cytometry | |
Ferlazzo | Isolation and analysis of human natural killer cell subsets | |
Vorkas et al. | Single cell transcriptional profiling reveals helper, effector, and regulatory MAIT cell populations enriched during homeostasis and activation | |
US11213546B2 (en) | Methods to mobilize tissue resident cells for adoptive t cell therapy | |
Xie et al. | In vitro and In vivo CD8+ T Cell Suppression Assays | |
JP7061342B2 (en) | Detection and preparation of effector regulatory T cells | |
Gjorgjimajkoska | The role of donor CD4 T lymphocyte chimerism in lung transplant recipients | |
Penman | Do gut activated immune cells mediate low bone mineral density in paediatric Crohn’s disease? | |
Knoop | The effects of maternal type 1 diabetes on autoreactive CD4+ T cells in neonates | |
Jeal | Isolation, flow cytometric analysis, and suppression assay of CD4+ CD25+ T-regulatory cells | |
Shahneh | Regulatory T Cells in Post-Thrombotic Vessel Repair | |
Zhou | Detection of autoreactive CD8+ T cells in situ and investigation of their antigen-specificities | |
Consentius | Inhibition of the crosstalk between dendritic, natural killer and T cells by mesenchymal stromal/stem cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171211 |