RU2515371C1 - METHOD OF CULTIVATING ATHEROSCLEROTIC PLAQUE EXPLANTS ex vivo - Google Patents
METHOD OF CULTIVATING ATHEROSCLEROTIC PLAQUE EXPLANTS ex vivo Download PDFInfo
- Publication number
- RU2515371C1 RU2515371C1 RU2012147053/10A RU2012147053A RU2515371C1 RU 2515371 C1 RU2515371 C1 RU 2515371C1 RU 2012147053/10 A RU2012147053/10 A RU 2012147053/10A RU 2012147053 A RU2012147053 A RU 2012147053A RU 2515371 C1 RU2515371 C1 RU 2515371C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tissue
- paraformaldehyde
- paraffin
- blocks
- cultivation
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к биотехнологии, и может быть использовано в медицинских исследованиях в кардиологии для культивирования бляшек ex vivo с целью изучения их формирования и разрыва, позволит изучать эти процессы в контролируемых лабораторных условиях, а также наблюдать за жизнедеятельностью различных клеток в бляшке в заданных условиях и провести сравнение ех vivo и in vivo.The invention relates to medicine, namely to biotechnology, and can be used in medical research in cardiology for the cultivation of plaques ex vivo in order to study their formation and rupture, will allow to study these processes in a controlled laboratory environment, as well as to monitor the life of various cells in plaque under given conditions and compare ex vivo and in vivo.
Долгое время атеросклероз рассматривался как болезнь накопления, вызываемая отложением липидов в стенке сосудов. Однако простое накопление липидов не могло объяснить сложность строения атеросклеротической бляшки. Между тем сложность строения бляшек известна со времен Вирхова, когда было выяснено, что в их состав входят различные клеточные компоненты, в том числе большое количество гладкомышечных клеток, была сформулирована альтернативная гипотеза R.Ross и L.Harker [Faggiotto A, Ross R, Harker L. Studies of hypercholesterolemia in the nonhuman primate. I. Changes that lead to fatty streak formation. Arteriosclerosis. - 1984. - №4.- P.323-340; Ross R, Harker L Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. - 1976. - Vol.193. - P.1094-1100] о том, что пусковым фактором атеросклероза является повреждение эндотелия с последующей активацией тромбоцитов.For a long time, atherosclerosis was considered as an accumulation disease caused by the deposition of lipids in the vascular wall. However, the simple accumulation of lipids could not explain the complexity of the structure of the atherosclerotic plaque. Meanwhile, the complexity of the structure of plaques has been known since the time of Virchow, when it was found out that they contain various cellular components, including a large number of smooth muscle cells, an alternative hypothesis was formulated by R. Ross and L. Harker [Faggiotto A, Ross R, Harker L. Studies of hypercholesterolemia in the nonhuman primate. I. Changes that lead to fatty streak formation. Arteriosclerosis. - 1984. - No. 4.- P.323-340; Ross R, Harker L Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. - 1976. - Vol. 193. - P.1094-1100] that the trigger factor for atherosclerosis is endothelial damage followed by platelet activation.
Обе теории удалось объединить после того, как в последние 10 -15 лет были получены многочисленные данные о ключевой роли иммунных факторов, в частности воспаления, в возникновении и развитии атеросклероза.Both theories were able to be combined after numerous data were obtained in the last 10-15 years on the key role of immune factors, in particular inflammation, in the onset and development of atherosclerosis.
В целом развитие атеросклеротической бляшки обычно рассматривается как реакция организма на отложение в сосудистой стенке инородной субстанции - модифицированных липопротеинов [Kruth HS Sequestration of aggregated low-density lipoproteins by macrophages. Curr Opin Lipidol. - 2002. - №13. - P. 483-488; Geng YJ, Libby P (2002) Progression of atheroma: A struggle between death and procreation. Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2002. - №22. - P.1370-1380].In general, the development of atherosclerotic plaque is usually considered as a reaction of the body to the deposition of foreign substance - modified lipoproteins in the vascular wall [Kruth HS Sequestration of aggregated low density lipoproteins by macrophages. Curr Opin Lipidol. - 2002. - No. 13. - P. 483-488; Geng YJ, Libby P (2002) Progression of atheroma: A struggle between death and procreation. Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2002. - No. 22. - P.1370-1380].
Причины дестабилизации и разрушения бляшки, несмотря на их важность, остаются в значительной степени неизвестными. Одним из таких факторов является расщепление коллагена металлопротеазами, выделяемыми из макрофагов. Однако причины активации самих макрофагов также малоизвестны.The causes of plaque destabilization and destruction, despite their importance, remain largely unknown. One of these factors is the breakdown of collagen by metalloproteases secreted from macrophages. However, the reasons for the activation of macrophages themselves are also little known.
Другие известные процессы, как местные, так и системные, коррелируют с нестабильностью бляшек [Libby Р Inflammation in atherosclerosis. Nature. - 2002. - Vol.420. - P.868-874; Dollery CM, Libby P. Atherosclerosis and proteinase activation. Cardiovasc Res. - 2006. - Vol.69. - Р.625-635].Other known processes, both local and systemic, correlate with plaque instability [Libby P Inflammation in atherosclerosis. Nature. - 2002. - Vol. 420. - P.868-874; Dollery CM, Libby P. Atherosclerosis and proteinase activation. Cardiovasc Res. - 2006. - Vol.69. - P.625-635].
Концепция о ведущей роли иммунных процессов в развитии атеросклероза хотя и является общепринятой и основывается на довольно большом количестве клинических и экспериментальных данных, не отвечает на многие принципиальные вопросы. С ответами на эти вопросы связаны не только понимание фундаментальных вопросов развития атеросклероза, но и разработка профилактических и терапевтических подходов к лечению атеросклероза.The concept of the leading role of immune processes in the development of atherosclerosis, although it is generally accepted and based on a fairly large amount of clinical and experimental data, does not answer many fundamental questions. The answers to these questions are associated not only with an understanding of the fundamental issues in the development of atherosclerosis, but also with the development of preventive and therapeutic approaches to the treatment of atherosclerosis.
К важнейшим невыясненным вопросам относятся следующие:The most important outstanding issues include the following:
1. Практически не изучен клеточный состав атеросклеротических бляшек на разных стадиях их развития. Использовавшиеся до настоящего времени для этой цели методы иммуногистохимического анализа имеют крайне скудную информацию, так как позволяют одновременно определить не более 2-х клеточных маркеров.1. The cellular composition of atherosclerotic plaques at various stages of their development has not been practically studied. The methods of immunohistochemical analysis used so far for this purpose have extremely scarce information, since they allow the simultaneous determination of no more than 2 cell markers.
2. Очень мало сведений о наиболее важном моменте в развитии атеросклеротической бляшки - формировании некротического ядра. Не ясно, почему происходит гибель макрофагов в бляшке.2. Very little information about the most important point in the development of an atherosclerotic plaque - the formation of a necrotic nucleus. It is not clear why macrophage death occurs in the plaque.
3. Не ясно, связана ли активация цитокинов и появление в крови малодифференцированных форм лимфоцитов с изменениями клеточного состава бляшек у тех же пациентов.3. It is not clear whether the activation of cytokines and the appearance in the blood of poorly differentiated forms of lymphocytes with changes in the cellular composition of plaques in the same patients.
Целью исследования, проведенного авторами, является разработка экспериментальной модели атеросклеротической бляшки для изучения процесса ее формирования, в которой бляшка поддерживалась бы и созревала в лабораторных условиях вне организма. Такая система кардинально продвинет наше понимание механизмов атеросклероза. В настоящее время экспериментальная трехмерная модель для изучения атеросклероза отсутствует. Между тем в смежных областях медико-биологической науки, таких как онкология, иммунология, вирусология, именно разработка лабораторных экспериментальных моделей позволила применить современные методы молекулярной биологии к исследованию механизмов патогенеза. Напротив, в кардиологии современные исследования бляшек ограничены однократным анализом данной ткани, извлеченной из тела при хирургических вмешательствах или при аутопсии.The aim of the study conducted by the authors is to develop an experimental model of an atherosclerotic plaque to study the process of its formation, in which the plaque would be maintained and matured in laboratory conditions outside the body. Such a system will dramatically advance our understanding of the mechanisms of atherosclerosis. Currently, an experimental three-dimensional model for the study of atherosclerosis is absent. Meanwhile, in related fields of biomedical science, such as oncology, immunology, and virology, it was the development of laboratory experimental models that made it possible to apply modern methods of molecular biology to the study of the mechanisms of pathogenesis. On the contrary, in cardiology, modern plaque studies are limited to a single analysis of a given tissue removed from the body during surgery or autopsy.
Известно исследование, в котором проводилось культивирование участков атеросклеротически не измененных почечных артерий человека [Voisard, R. HCMV-infection in a human arterial organ culture model: effects on cell proliferation and neointimal hyperplasia / Voisard, R., Krugers, Т., Reinhardt, B. et al. // BMC microbiology. - 2007. - Vol.7. - P.68-74]. В данном исследовании для получения материала использовались участки почечных артерий, полученные при операциях нефрэктомии. Участки почечных артерий помещались в питательную среду для транспортировки DMEM, содержащую HEPES, в которой они доставлялись в лабораторию. Среда для культивирования образцов почечных артерий приготавливалась с использованием среды для культур Ham F12 и Waymouth's MB 752/1, эмбриональной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием, раствора гентомицина, ванкомицина и амфотерицина В. Участки артерий для культивирования нарезались на крупные кольцевидные блоки перпендикулярно просвету сосуда толщиной 3-5 мм и культивировались в чашках Петри со средой описанного выше состава в течение 56 дней в инкубаторе с 5% CO2 при 37°С. Каждые два-три дня проводилась смена питательной среды для культивирования. На 3-й, 7-й, 14-й, 21-й, 28-й, 35-й и 56-й дни образцы тканей промывались в фосфатно-солевом буфере PBS и фиксировались в 4% параформальдегиде. Сохранение жизнеспособности тканей в процессе культивирования было подтверждено с помощью гистологии при иммуногистохимическом окрашивании с использованием антигена PCNA, определяющего пролиферирующие клетки. Недостатки способа: культивировались участки интактных, неизмененных артерий человека, имеющие четкую структуру и высокую устойчивость к процессам культивирования, а атеросклеротически измененные участки артерий человека обладают более выраженной гетерогенностью и значительно более низкой жизнеспособностью по сравнению с интактными артериями; при культивировании образцы помещались в среду для культивирования без дополнительных плотов, что значительно ухудшало бы аэрацию культивируемой ткани, и соответственно, уменьшало выживаемость гетерогенной ткани атеросклеротических бляшек; в составе среды отсутствовали заменимые аминокислоты, пируват натрия, использовались иные среды для культур, что недостаточно для культивирования атеросклеротических бляшек; изучение жизнеспособности культивируемых тканей проводилось значительно реже, чем каждые 3 дня, что могло внести погрешность в результаты эксперимента.A study is known in which cultivation of sections of atherosclerotically unchanged human renal arteries was carried out [Voisard, R. HCMV infection in a human arterial organ culture model: effects on cell proliferation and neointimal hyperplasia / Voisard, R., Krugers, T., Reinhardt, B. et al. // BMC microbiology. - 2007. - Vol. 7. - P.68-74]. In this study, sections of the renal arteries obtained from nephrectomy operations were used to obtain the material. Sections of the renal arteries were placed in a culture medium for transporting DMEM containing HEPES, in which they were delivered to the laboratory. Medium for the cultivation of renal artery samples was prepared using culture medium Ham F12 and Waymouth's MB 752/1, fetal calf serum, inactivated by heating, a solution of gentomycin, vancomycin and amphotericin B. Cultural sections were cut into large annular blocks perpendicular to the lumen of a vessel of thickness 3 -5 mm and were cultured in Petri dishes with medium of the composition described above for 56 days in an incubator with 5% CO 2 at 37 ° C. Every two to three days, a change of culture medium was carried out. On the 3rd, 7th, 14th, 21st, 28th, 35th and 56th days, tissue samples were washed in PBS phosphate-buffered saline and fixed in 4% paraformaldehyde. Preservation of tissue viability during cultivation was confirmed by histology during immunohistochemical staining using the PCNA antigen that determines proliferating cells. The disadvantages of the method: cultivated areas of intact, unchanged human arteries having a clear structure and high resistance to cultivation processes, and atherosclerotically altered areas of human arteries have a more pronounced heterogeneity and significantly lower viability compared to intact arteries; during cultivation, the samples were placed in the medium for cultivation without additional rafts, which would significantly impair the aeration of the cultured tissue, and accordingly, reduce the survival of heterogeneous tissue of atherosclerotic plaques; the medium did not contain replaceable amino acids, sodium pyruvate, other culture media were used, which is insufficient for the cultivation of atherosclerotic plaques; the study of the viability of cultured tissues was conducted much less frequently than every 3 days, which could introduce an error into the results of the experiment.
В ходе проведения исследования (кафедра кардиологии ФПДО МГМСУ им. А.И. Евдокимова по теме «Роль герпес-вирусов в формировании атеросклеротических бляшек») был взят за основу известный способ культивирования эксплантов лимфоидной ткани человека [Grivel J-C. Use of human tissue explants to study human infectious agents / Grivel J-C., Margolis L. // Nat Protoc. - 2009. - Vol.4. - P.256-269.]. Важно отметить, что на всех стадиях развития атеросклеротические бляшки содержат большое количество лимфоидных клеток. Более того, некоторые авторы считают, что на начальном этапе в области бляшки развивается подобие вторичных лимфоидных органов, схожих с лимфатическими узлами. В дальнейшем в интиме артерий происходит накопление липидов, моноциты и гладкомышечных клеток, которые способствуют развитию атеросклеротических бляшек. Способ культивирования эксплантов лимфоидной ткани человека заключается в том, что для получения эксплантов использовались участки миндалин, полученные при операциях тонзилэктомии не позднее, чем через 3-5 часов с момента операции; участки цервиковагинальной и ректосигмовидной ткани, полученные при операциях или при аутопсии пациентов не позднее, чем через 24 часа с момента операции или наступления смерти пациентов. Участки ткани помещались в питательную среду для транспортировки RPMI 1640, в которой они доставлялись в лабораторию без охлаждения и хранились при температуре 15-22°С вплоть до их обработки. В процессе подготовки к культивированию участки ткани экстрагировались с помощью хирургических стерильных скальпелей со съемными лезвиями и стерильных анатомических пинцетов в ламинарном шкафу. При обработке из образцов удалялись все участки ткани с макроскопическими признаками кровоизлияния и некроза ткани. Среда для культивирования лимфоидной ткани приготавливалась с использованием среды для культур RPMI 1640, эмбриональной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием, пирувата натрия, раствора тиментина, гентомицина и амфотерицина В и модифицированной среды Modified Eagle's, содержащей заменимые аминокислоты. Обработанные участки ткани нарезались на кубические блоки размерами 2 мм на 2 мм на 1 мм и культировались в среде описанного выше состава. Для этого блоки ткани помещались в чашки Петри с питательной средой для культивирования на плоты из коллагеновых губок Gelfoam на границе раздела воздух/среда. Ткань культивировались в инкубаторе с 5-7% CO2 при 37°С в течение 15 дней, каждые 3-4 дня проводилась смена питательной среды для культивирования. Выживаемость участков ткани оценивалась с помощью анализа скорости репликации вирусов, определяемой по концентрации вирусных компонентов и цитокинов в среде для культивирования каждые 3 дня. Размер культивируемых блоков тканей очень маленький, что не давало возможности оценивать структурные изменения в тканях с помощью гистологии. Этот способ выбран за прототип.During the study (Department of Cardiology, FPDI MGMSU named after A.I. Evdokimov on the topic “The role of herpes viruses in the formation of atherosclerotic plaques”), a well-known method of cultivating human lymphoid tissue explants [Grivel JC. Use of human tissue explants to study human infectious agents / Grivel JC., Margolis L. // Nat Protoc. - 2009. - Vol. 4. - P.256-269.]. It is important to note that at all stages of development, atherosclerotic plaques contain a large number of lymphoid cells. Moreover, some authors believe that at the initial stage a similarity of secondary lymphoid organs similar to lymph nodes develops in the plaque area. Later, in the intima of the arteries, lipids, monocytes and smooth muscle cells accumulate, which contribute to the development of atherosclerotic plaques. A method of cultivating explants of human lymphoid tissue consists in the use of tonsil sections obtained during tonsillectomy operations no later than 3-5 hours after the operation to obtain explants; sections of cervicovaginal and rectosigmoid tissue obtained during operations or during autopsy of patients no later than 24 hours after the operation or the death of patients. Sections of tissue were placed in a nutrient medium for transportation of RPMI 1640, in which they were delivered to the laboratory without cooling and stored at a temperature of 15-22 ° C until they were processed. In preparation for cultivation, tissue sites were extracted using surgical sterile scalpels with removable blades and sterile anatomical tweezers in a laminar cabinet. During processing, all tissue sections with macroscopic signs of hemorrhage and tissue necrosis were removed from the samples. The lymphoid tissue culture medium was prepared using RPMI 1640 culture medium, fetal calf serum, inactivated, sodium pyruvate, timentin, gentomycin and amphotericin B solution and Modified Eagle's modified medium containing essential amino acids. The treated tissue sections were cut into cubic blocks measuring 2 mm by 2 mm by 1 mm and cultured in the medium of the composition described above. For this, tissue blocks were placed in Petri dishes with culture medium on rafts from Gelfoam collagen sponges at the air / medium interface. The tissue was cultured in an incubator with 5-7% CO 2 at 37 ° C for 15 days, a culture medium was changed every 3-4 days for cultivation. The survival of tissue sites was assessed by analyzing the rate of virus replication, determined by the concentration of viral components and cytokines in the culture medium every 3 days. The size of cultured tissue blocks is very small, which made it impossible to evaluate structural changes in tissues using histology. This method is selected for the prototype.
Однако в процессе проведения исследования было выявлено следующее: размер культивируемых блоков тканей очень маленький, что не давало возможности оценивать структурные изменения в образцах атеросклеротических бляшек с помощью гистологии; выживаемость ткани атеросклеротических бляшек не могла быть оценена по определению концентрации РНК находящихся в тканях вирусов и концентрации выделяемых клетками цитокинов в культивационной среде, так как ткань атеросклеротических бляшек гетерогенна и изначально содержит участки некроза; перед культивированием из образцов удалялись все участки ткани с макроскопическими признаками кровоизлияния и некроза. Культивировались только гомогенные участки ткани, а ткань атеросклеротических бляшек изначально является гетерогенным, сложно структурированным образованием, в ней содержатся некротические ядра и области кровоизлияний, удаление которых привело бы к полной деструктуризации образцов.However, during the study, the following was revealed: the size of the cultured tissue blocks is very small, which made it impossible to assess structural changes in samples of atherosclerotic plaques using histology; the survival of tissue of atherosclerotic plaques could not be estimated by determining the concentration of RNA of viruses in the tissues and the concentration of cytokines secreted by cells in the cultivation medium, since the tissue of atherosclerotic plaques is heterogeneous and initially contains areas of necrosis; Before cultivation, all tissue sections with macroscopic signs of hemorrhage and necrosis were removed from the samples. Only homogeneous tissue sections were cultured, and the tissue of atherosclerotic plaques was initially a heterogeneous, complexly structured formation, it contained necrotic nuclei and hemorrhages, the removal of which would lead to complete destructuring of the samples.
Задачей изобретения является культивирование эксплантов атеросклеротических бляшек.The objective of the invention is the cultivation of explants of atherosclerotic plaques.
Технический результат заключается в сохранении жизнеспособности эксплантов атеросклеротических бляшек при культивировании для дальнейшего изучения механизмов патогенеза атеросклероза.The technical result consists in maintaining the viability of explants of atherosclerotic plaques during cultivation to further study the mechanisms of the pathogenesis of atherosclerosis.
Это достигается за счет того, что в качестве материала эксплантов используют участки сонных артерий, полученных при операциях по поводу стенозирующего атеросклероза сонных артерий, которые хранят в лаборатории в течение не более 2 часов после операции, после экстрагирования полученный материал отмывают в фосфатно-солевом буфере, после чего материал для культивирования нарезают на кольцевидные блоки толщиной 2-3 мм перпендикулярно просвету сосуда, затем 2 блока фиксируют в 2% параформальдегиде и заключают в парафин, а остальные блоки помещают в среду для культивирования, при этом ткань культивируют не менее 20-22 дней, каждые три дня образцы тканей фиксируют в 2% параформальдегиде, затем заключают в парафин, а в последний день культивирования оставшиеся образцы также фиксируют в 2% параформальдегиде, заключают в парафин и исследуют гистологически.This is achieved due to the fact that as the material of the explants use sections of the carotid arteries obtained during operations for stenotic atherosclerosis of the carotid arteries, which are stored in the laboratory for no more than 2 hours after surgery, after extraction, the resulting material is washed in phosphate-buffered saline after which the material for cultivation is cut into annular blocks 2-3 mm thick perpendicular to the lumen of the vessel, then 2 blocks are fixed in 2% paraformaldehyde and enclosed in paraffin, and the rest of the blocks they are cultured for at least 20-22 days, every three days tissue samples are fixed in 2% paraformaldehyde, then enclosed in paraffin, and on the last day of cultivation, the remaining samples are also fixed in 2% paraformaldehyde, enclosed in paraffin and examined histologically.
В качестве материала эксплантов используют участки сонных артерий, так как в организме человека описанные артерии являются наиболее доступными для получения развивающихся в них атеросклеротических бляшек. При этом бляшки в сонных артериях по строению максимально схожи с также интересующими нас бляшками, развивающимися в коронарных артериях.Sections of the carotid arteries are used as explant material, since the described arteries in the human body are the most accessible for obtaining atherosclerotic plaques developing in them. Moreover, the plaques in the carotid arteries are as similar in structure to the plaques of interest to us that develop in the coronary arteries.
Как показали проведенные исследования, для сохранения жизнеспособности эксплантов для культивирования образцы хранят в лаборатории в течение не более 2 часов после операции вплоть до обработки, так как клетки в атеросклеротических бляшках очень быстро подвергаются апоптозу и некрозу при неподходящих условиях внешней среды.As shown by studies, to maintain the viability of explants for cultivation, samples are stored in the laboratory for no more than 2 hours after surgery until processing, since cells in atherosclerotic plaques undergo apoptosis and necrosis very quickly under inappropriate environmental conditions.
После экстрагирования полученный материал отмывают в фосфатно-солевом буфере для удаления мононуклеарных клеток периферической крови.After extraction, the resulting material is washed in phosphate-buffered saline to remove peripheral blood mononuclear cells.
Материал для культивирования нарезают на кольцевидные блоки толщиной 2-3 мм, так как при проведении исследований было выявлено, что выживаемость тканей при культивировании эксплантов размерами 2×2×2 мм значительно снижается уже к 12 дню культивирования. В связи с этим для того, чтобы длительнее сохранялась жизнеспособность и архитектоника эксплантов в процессе культивирования, необходимо культивирование кольцевидных блоков толщиной 2-3 мм.The material for cultivation is cut into annular blocks 2-3 mm thick, since research has revealed that tissue survival during cultivation of explants with dimensions of 2 × 2 × 2 mm is significantly reduced by the 12th day of cultivation. In this regard, in order to maintain viability and architectonics of explants for a longer time during cultivation, it is necessary to cultivate ring-shaped blocks 2-3 mm thick.
Материал для культивирования нарезают перпендикулярно просвету сосуда для того, чтобы сделать возможной гистологическую оценку всех слоев сосудистой стенки и атеросклеротической бляшки.Cultivation material is cut perpendicular to the lumen of the vessel in order to enable histological evaluation of all layers of the vascular wall and atherosclerotic plaque.
В параформальдегиде фиксируют 2 блока для того, чтобы минимизировать ошибку при расчетах площади некроза по гистологическим срезам, возникающую из-за гетерогенности исследуемых блоков атеросклеротических бляшек.2 blocks are fixed in paraformaldehyde in order to minimize the error in calculating the area of necrosis by histological sections arising due to the heterogeneity of the studied blocks of atherosclerotic plaques.
Блоки ткани фиксируют в 2% параформальдегиде, так как размеры эксплантов позволяют проводить быструю фиксацию менее концентрированным раствором формалина.Tissue blocks are fixed in 2% paraformaldehyde, since the size of the explants allows fast fixation with a less concentrated formalin solution.
Блоки ткани заключают в парафин для дальнейшего проведения гистологического исследования.Blocks of tissue are embedded in paraffin for further histological examination.
Остальные блоки, помещенные в среду для культивирования, культивируют не менее 20-22 дней, так как более краткий срок культивирования не позволит изучить изменения, возникающие в эксплантах атеросклеротических бляшек, а также отсроченный эффект препаратов и вирусов на изменение структуры атеросклеротических бляшек.The remaining blocks placed in the culture medium are cultured for at least 20-22 days, since a shorter cultivation period will not allow to study the changes that occur in explants of atherosclerotic plaques, as well as the delayed effect of drugs and viruses on the change in the structure of atherosclerotic plaques.
Образцы тканей фиксируют в 2% параформальдегиде, затем заключают в парафин каждые три дня для того, чтобы четко отслеживать изменения структуры бляшек с течением культивирования.Tissue samples are fixed in 2% paraformaldehyde, then paraffin embedded every three days in order to clearly monitor changes in the structure of plaques during cultivation.
В последний день культивирования оставшиеся образцы также фиксируют в 2% параформальдегиде, заключают в парафин и исследуют гистологически для оценки изменений, возникших в атеросклеротических бляшках в процессе культивирования.On the last day of cultivation, the remaining samples are also fixed in 2% paraformaldehyde, enclosed in paraffin and examined histologically to assess changes that occurred in atherosclerotic plaques during cultivation.
Воспроизводимость методики мы оценивали с помощью гистологии. Для этого мы проводили окрашивание кольцевидных блоков с помощью гематоксилина и эозина, сканировали их с помощью сканера для гистологических срезов и оценивали морфологию участков с помощью программы для обработки фотографий микропрепаратов ImageScope S. Мы сравнивали площадь участков некроза в последовательных образцах культивируемых тканей на 1-й, 4-й, 7-й, 10-й, 13-й, 16-й, 19-й и 22-й дни. Также мы оценивали целостность эндотелиального слоя и внутренней эластической мембраны по сравнению с первым днем культивации. Участки некроза и апоптоза мы определяли по наличию признаков кариопикноза, кариорексиса и кариолизиса в клетках интимы, высокой ацидофильности цитоплазмы клеток, гомогенизации и базофильности коллагеновых и эластических волокон, а также по обнаружению формирующихся апоптотических телец с эозинофильной цитоплазмой.We evaluated the reproducibility of the method using histology. To do this, we stained the ring-shaped blocks with hematoxylin and eosin, scanned them with a scanner for histological sections and evaluated the morphology of the plots using ImageScope S micropreparation software. We compared the area of the necrosis plots in successive samples of cultured tissues on the 1st, 4th, 7th, 10th, 13th, 16th, 19th and 22nd days. We also evaluated the integrity of the endothelial layer and the inner elastic membrane compared to the first day of cultivation. We determined the areas of necrosis and apoptosis by the presence of signs of karyopiknosis, karyorexis and karyolysis in intimal cells, high acidophilicity of cell cytoplasm, homogenization and basophilicity of collagen and elastic fibers, as well as by the detection of forming apoptotic bodies with eosinophilic cytoplasm.
Выживаемость ткани мы дополнительно оценивали по косвенным параметрам - по изменению концентрации находящихся в клетках культивируемых образцов вирусов, что определялось при проведении полимеразной цепной реакции с клетками, выделенными из культивируемых образцов на 1-й, 4-й, 7-й, 10-й, 13-й, 16-й, 19-й и 22-й дни.We additionally estimated tissue survival by indirect parameters — by changing the concentration of cultured virus samples in the cells, which was determined during the polymerase chain reaction with cells isolated from cultured samples on the 1st, 4th, 7th, 10th, 13th, 16th, 19th and 22nd days.
Способ осуществляется следующим образом:The method is as follows:
Для получения материала используют участки сонных артерий, полученные при операциях по поводу стенозирующего атеросклероза сонных артерий.To obtain the material, sections of the carotid arteries obtained during operations for stenotic atherosclerosis of the carotid arteries are used.
Участки сосудов с атеросклеротическими бляшками помещают в питательную среду для транспортировки (например, RPMI 1640), в которой их доставляют в лабораторию и хранят при комнатной температуре вплоть до их обработки в течение не более 2 часов после операции.Sections of vessels with atherosclerotic plaques are placed in a nutrient medium for transportation (for example, RPMI 1640), in which they are delivered to the laboratory and stored at room temperature until they are processed for no more than 2 hours after surgery.
Затем участки артерий с атеросклеротическими бляшками экстрагируют с помощью хирургических стерильных одноразовых скальпелей, скальпелей со съемными лезвиями и стерильных анатомических пинцетов в ламинарном шкафу (например, ламинарном шкафу с вертикальным потоком Nuaire Labgard Nu-603); отмывают в фосфатно-солевом буфере (например, PBS), после чего материал для культивирования нарезают на кольцевидные блоки толщиной 2-3 мм перпендикулярно просвету сосуда, затем 2 блока фиксируют в 2% параформальдегиде и заключают в парафин, а остальные блоки помещают в среду для культивирования атеросклеротических бляшек, содержащую стандартную среду для культур (например, RPMI 1640), эмбриональную телячью сыворотку (например, FBS-heat inactivated), пируват натрия, раствор антибиотика/антимикотика (например, пенициллина, стрептомицина и амфотерицина B), и среду, содержащую заменимые аминокислоты (например, модифицированной среды Modified Eagle's), для этого блоки ткани помещают в чашки Петри с питательной средой описанного выше состава на плоты из коллагеновых губок на границе раздела среда/воздух; ткань культивируют в инкубаторе с 5% CO2 при 37°С в течение не менее 20-22 дней, каждые три дня образцы тканей фиксируют в 2% параформальдегиде, затем заключают в парафин. Также каждые 3-4 дня проводят смену питательной среды для культивирования. В последний день культивирования оставшиеся образцы также фиксируют в 2% параформальдегиде, заключают в парафин и исследуют гистологически.Then, sections of arteries with atherosclerotic plaques are extracted with surgical sterile disposable scalpels, scalpels with removable blades and sterile anatomical forceps in a laminar cabinet (for example, a Nuaire Labgard Nu-603 vertical flow laminar cabinet); washed in phosphate-buffered saline (for example, PBS), after which the cultivation material is cut into annular blocks 2-3 mm thick perpendicular to the lumen of the vessel, then 2 blocks are fixed in 2% paraformaldehyde and enclosed in paraffin, and the remaining blocks are placed in medium for cultivating atherosclerotic plaques containing standard culture medium (e.g. RPMI 1640), fetal calf serum (e.g. FBS heat inactivated), sodium pyruvate, antibiotic / antimycotic solution (e.g. penicillin, streptomycin and amphotericin B), and Reda containing nonessential amino acids (e.g., modified media Modified Eagle's) for that tissue blocks were placed in a Petri dish culture medium composition described above on rafts of collagen sponges at the interface / air interface; the tissue is cultured in an incubator with 5% CO 2 at 37 ° C for at least 20-22 days, every three days tissue samples are fixed in 2% paraformaldehyde, then enclosed in paraffin. Also, every 3-4 days spend a change of culture medium for cultivation. On the last day of cultivation, the remaining samples are also fixed in 2% paraformaldehyde, enclosed in paraffin and examined histologically.
Пример №1.Example No. 1.
В качестве источника материала была взята атеросклеротическая бляшка, полученная при операции по поводу стенозирующего атеросклероза правой внутренней сонной артерии у пациентки 69 лет.An atherosclerotic plaque obtained during surgery for stenotic atherosclerosis of the right internal carotid artery in a 69-year-old patient was taken as a source of material.
Макроскопически выделенный эксплант бляшки имел неосложненную форму, с участками кальциноза, размерами 32×5×7 мм, цилиндрической формы, его поместили в питательную среду для транспортировки RPMI1640, в которой доставили в лабораторию и хранили при комнатной температуре вплоть до обработки в течение 1 часа 40 минут после операции: экстрагировали с помощью хирургических стерильных одноразовых скальпелей, скальпелей со съемными лезвиями и стерильных анатомических пинцетов в ламинарном шкафу с вертикальным потоком Nuaire Labgard Nu-603; затем материал был промыт в фосфатно-солевом буфере и разделен на 14 кольцевидных блоков толщиной 2-3 мм перпендикулярно просвету сосуда, 2 блока были фиксированы в 2% парафармальдегиде и заключены в парафин для проведения гистологии, а остальные 12 блоков поместили на плоты из коллагеновых губкок в чашки Петри 18x18 мм на границе раздела среда/воздух с 2 мл среды для культивирования, содержащей стандартную среду для культур RPMI 1640, эмбриональную телячью сыворотку FBS-heat inactivated, пируват натрия, раствор антибиотика/антимикотика, содержащий пенициллин, стрептомицин и амфотерицин В, и среду, содержащую заменимые аминокислоты - модифицированная среда Modified Eagle's, ткань культивировали в инкубаторе с 5% CO2 при 37°С в течение 22 дней, каждые 3-4 дня проводилась смена среды, каждые три дня (включая 22-й день) образцы тканей фиксировали в 2% параформальдегиде, затем заключали в парафин. В последний день культивирования оставшиеся образцы также фиксируют в 2% параформальдегиде, заключали в парафин и исследовали гистологически.The macroscopically isolated plaque explant had an uncomplicated shape, with 32 × 5 × 7 mm, calcified plots of cylindrical shape, it was placed in RPMI1640 transport medium, in which it was delivered to the laboratory and stored at room temperature until processing for 1 hour 40 minutes after surgery: extracted with surgical sterile disposable scalpels, scalpels with removable blades and sterile anatomical forceps in a vertical flow laminar cabinet Nuaire Labgard Nu-603; then the material was washed in phosphate-buffered saline and divided into 14 ring-shaped blocks 2-3 mm thick perpendicular to the lumen of the vessel, 2 blocks were fixed in 2% parapharmaldehyde and embedded in paraffin for histology, and the remaining 12 blocks were placed on rafts from collagen sponges in 18x18 mm Petri dishes at the medium / air interface with 2 ml of culture medium containing standard culture medium RPMI 1640, fetal calf serum FBS-heat inactivated, sodium pyruvate, antibiotic / antimycotic solution containing penicilli n, streptomycin and amphotericin B, and the medium containing essential amino acids - Modified Eagle's modified medium, the tissue was cultured in an incubator with 5% CO 2 at 37 ° C for 22 days, the medium was changed every 3-4 days, every three days ( including day 22) tissue samples were fixed in 2% paraformaldehyde, then enclosed in paraffin. On the last day of cultivation, the remaining samples are also fixed in 2% paraformaldehyde, embedded in paraffin and examined histologically.
Для осуществления контроля над жизнеспособностью клеток мы приготовили гистологические препараты и провели их окрашивание гематоксилином и эозином. Затем мы сканировали их с помощью сканера для гистологических срезов и оценили морфологию участков с помощью программы для обработки фотографий микропрепаратов ImageScope S. Мы показали, что площадь участков некроза в последовательных образцах культивируемых тканей на 1-й, 4-й, 7-й, 10-й, 13-й, 16-й, 19-й и 22-й дни статистически значимо не увеличивается. Также мы определили, что эндотелиальный слой и внутренняя эластическая мембрана сохраняют свою целостность по сравнению с первым днем культивации. Участки некроза и апоптоза мы определяли по наличию признаков кариопикноза, кариорексиса и кариолизиса в клетках интимы, высокой ацидофильности цитоплазмы клеток, гомогенизации и базофильности коллагеновых и эластических волокон, а также по обнаружению формирующихся апоптотических телец с эозинофильной цитоплазмой.To monitor cell viability, we prepared histological preparations and stained them with hematoxylin and eosin. Then we scanned them with a scanner for histological sections and assessed the morphology of the plots using ImageScope S, a micropreparation software for image processing. We showed that the area of necrosis plots in successive samples of cultured tissues was on the 1st, 4th, 7th, 10th The 13th, 13th, 16th, 19th and 22nd days are not statistically significantly increased. We also determined that the endothelial layer and the inner elastic membrane retain their integrity compared to the first day of cultivation. We determined the areas of necrosis and apoptosis by the presence of signs of karyopiknosis, karyorexis and karyolysis in intimal cells, high acidophilicity of cell cytoplasm, homogenization and basophilicity of collagen and elastic fibers, as well as by the detection of forming apoptotic bodies with eosinophilic cytoplasm.
Выживаемость ткани мы дополнительно оценили по косвенным параметрам - по продолжающейся репликации находящихся в клетках культивируемых образцов герпес-вирусов. Это определялось при проведении полимеразной цепной реакции с клетками, выделенными из культивируемых образцов на 1-й, 4-й, 7-й, 10-й, 13-й, 16-й, 19-й и 22-й дни.We additionally estimated tissue survival by indirect parameters — by the ongoing replication of cultured herpes virus samples in cells. This was determined during the polymerase chain reaction with cells isolated from cultured samples on the 1st, 4th, 7th, 10th, 13th, 16th, 19th and 22nd days.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012147053/10A RU2515371C1 (en) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | METHOD OF CULTIVATING ATHEROSCLEROTIC PLAQUE EXPLANTS ex vivo |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012147053/10A RU2515371C1 (en) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | METHOD OF CULTIVATING ATHEROSCLEROTIC PLAQUE EXPLANTS ex vivo |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2515371C1 true RU2515371C1 (en) | 2014-05-10 |
Family
ID=50629819
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012147053/10A RU2515371C1 (en) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | METHOD OF CULTIVATING ATHEROSCLEROTIC PLAQUE EXPLANTS ex vivo |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2515371C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2616243C1 (en) * | 2015-12-10 | 2017-04-13 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for atherosclerotic plaques cellular composition determination |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2332223C2 (en) * | 2002-01-14 | 2008-08-27 | Генри Форд Хелт Систем | Marrow stromal cell material for application in blood vessel formation and generation of angiogenetic and trophic factors |
-
2012
- 2012-11-07 RU RU2012147053/10A patent/RU2515371C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2332223C2 (en) * | 2002-01-14 | 2008-08-27 | Генри Форд Хелт Систем | Marrow stromal cell material for application in blood vessel formation and generation of angiogenetic and trophic factors |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GRIVEL J.C. et al., Use of human tissue explants to study human infectious agents, Nat. Protoc., 2009, v.4, n.2, p.:256-269. . VOISARD R. et al., HCMV-infection in a human arterial organ culture model: effects on cell proliferation and neointimal hyperplasia, BMC Microbiol., 2007, v.7, p.68-74. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2616243C1 (en) * | 2015-12-10 | 2017-04-13 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for atherosclerotic plaques cellular composition determination |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Luyckx et al. | A new step toward the artificial ovary: survival and proliferation of isolated murine follicles after autologous transplantation in a fibrin scaffold | |
| Hennerbichler et al. | The influence of various storage conditions on cell viability in amniotic membrane | |
| LU500561B1 (en) | In vitro construction method and use of liver organoids | |
| Uhl et al. | Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis | |
| CN110604743B (en) | Application of neutrophils in preparation of medicine for treating and/or preventing autoimmune hepatitis | |
| Reynolds et al. | Primary mouse endothelial cell culture for assays of angiogenesis | |
| CN109789163A (en) | For the therapy based on macrophage used in treatment hepatic injury | |
| Gupta et al. | Chemoradiotherapy screening in a novel biomimetic polymer based pancreatic cancer model | |
| Bölükbas et al. | The preparation of decellularized mouse lung matrix scaffolds for analysis of lung regenerative cell potential | |
| Parmaksiz et al. | Decellularized bSIS-ECM as a regenerative biomaterial for skin wound repair | |
| Bürtin et al. | Creation and maintenance of a living biobank-how we do it | |
| RU2515371C1 (en) | METHOD OF CULTIVATING ATHEROSCLEROTIC PLAQUE EXPLANTS ex vivo | |
| Chen et al. | Experimental nanopulse ablation of multiple membrane parasite on ex vivo hydatid cyst | |
| Chakrabarti et al. | Generation and use of gastric organoids for the study of Helicobacter pylori pathogenesis | |
| Barranco et al. | Immunohistochemical detection of extrinsic and intrinsic mediators of apoptosis in porcine paraffin-embedded tissues | |
| Magli et al. | Myogenic progenitors from mouse pluripotent stem cells for muscle regeneration | |
| Zeng et al. | Assessment of the effect of different vitrification solutions on human ovarian tissue after short‐term xenotransplantation onto the chick embryo chorioallantoic membrane | |
| Box et al. | Simple experimental and spontaneous metastasis assays in mice | |
| JP2020031538A (en) | Method related to pathosis reconstruction of blood vessel disease, disease model and apparatus | |
| RU2605821C1 (en) | Method for assessing biocompatibility of implanted articles | |
| Sahoo et al. | Histogenesis of human fetal liver of various weeks of gestation | |
| Introini et al. | Histoculture and infection with HIV of functional human lymphoid tissue on Gelfoam® | |
| RU2652882C1 (en) | Method for determining the ability of mycobacteria of tuberculosis to growth in alveolar macrophages of patients after the course of antituberculosis therapy | |
| Pons et al. | Human Platelet Lysate as Valid Cell Growth Additive to Assess Protein Acetylation | |
| RU2790982C1 (en) | Method for predicting a possible recurrence of pancreatic adenocarcinoma after its resection or exposure to local destruction methods using radiofrequency ablation as an example |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20141108 |