RU2616213C2

RU2616213C2 - Method for correction of innate and adaptive immunity factors dysfunction for chronic renal failure in experiment

Info

Publication number: RU2616213C2
Application number: RU2015128111A
Authority: RU
Inventors: Оксана Анатольевна Гизингер; Михаил Владимирович Осиков; Дмитрий Алексеевич Черепанов; Елена Викторовна Листик
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2017-04-13
Also published as: RU2015128111A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: starting from the 21st day of chronic renal failure simulation, calcium channel blocking amlodipine drug is administered to rats using a pipette at a dose of 0.25 mg/kg per day per animal, for 7 days. Changes in innate and adaptive immunity factors in relation to the performance of laboratory animals who do not receive amlodipine, are recorded. At that, innate immunity cell factors state normalization, phagocytosis and reactive oxygen forms generation ability, intensity of delayed hypersensitivity reaction, increasing of theantibody-forming cells number in the spleen, are established.

EFFECT: method application expands information on the chronic renal failure pathogenesis mechanisms, does not require scarce supplies, is available in the research centers practice, is important for calcium channel blockers efficiency analysis for chronic renal failure treatment.

2 tbl

Description

Способ коррекции дисфункции факторов врожденного и адаптивного иммунитета при хронической почечной недостаточности в экспериментеMethod for correction of dysfunction of innate and adaptive immunity factors in chronic renal failure in experiment

Способ коррекции дисфункции факторов врожденного и адаптивного иммунитета при хронической почечной недостаточности в эксперименте с использованием блокатора кальциевых каналов препарата Амлодипин заключается в коррекции дисфункций факторов врожденного и адаптивного иммунитета при хронической почечной недостаточности (ХПН) в эксперименте, проведенном на лабораторных животных (крысах) с использованием блокатора кальциевых каналов препарата Амлодипин в дозе 0,25 мг/кг в сутки на одно животное в течение 7 дней с регистрацией изменений показателей врожденного и адаптивного иммунитета периферической крови по отношению к показателям животных, не получавших блокатор кальциевых каналов. По динамике иммунологических показателей судят о иммуностимулирующем влиянии препарата Амлодипин при экспериментальной ХПН. Изобретение относится к экспериментальной медицине, иммунологии, патофизиологии, в частности к поиску способа повышения иммунологической эффективности терапии хронической почечной недостаточности с использованием препарата Амлодипин, на модели лабораторных животных, включающего комплекс методов изучения врожденного и адаптивного иммунитета, с целью разработки комплекса методов, позволяющих корректировать иммунные дисфункции у пациентов с хронической почечной недостаточностью.A method for correcting dysfunction of factors of innate and adaptive immunity in chronic renal failure in an experiment using a calcium channel blocker of the drug Amlodipine consists in correcting dysfunctions of factors of innate and adaptive immunity in chronic renal failure (CRF) in an experiment conducted on laboratory animals (rats) using a blocker calcium channels of the drug Amlodipine at a dose of 0.25 mg / kg per day per animal for 7 days with registration of changes in renders of innate and adaptive immunity of peripheral blood in relation to indicators of animals that did not receive calcium channel blocker. The dynamics of immunological parameters judge the immunostimulating effect of the drug Amlodipine in experimental chronic renal failure. The invention relates to experimental medicine, immunology, pathophysiology, in particular to the search for a way to increase the immunological effectiveness of the treatment of chronic renal failure using the drug Amlodipine, on a model of laboratory animals, which includes a set of methods for studying innate and adaptive immunity, with the aim of developing a set of methods that allow you to correct immune dysfunction in patients with chronic renal failure.

Синдром хронической почечной недостаточности (ХПН) является важной проблемой современного здравоохранения, так как с ним связаны негативные последствия для здоровья и чрезвычайно высокие затраты на оказание медицинской помощи [Бикбов, Б.Т. Заместительная терапия больных с хронической почечной недостаточностью методами перитонеального диализа и трансплантации почки в Российской Федерации в 1998-2011 г. (Отчет по данным Российского регистра заместительной почечной терапии. Часть вторая) / Б.Т. Бикбов, Н.А. Томилина // Нефрология и диализ. - 2014. - Т. 16, №2. - С. 192-227]. По данным Российского регистра заместительной почечной терапии, на начало 2012 г. количество больных с терминальной ХПН, получающих заместительную почечную терапию, в РФ составило 28548 человек, или 199,6 на 1 млн. населения, ежегодный темп прироста составляет 9-10% [Бикбов Б.Т., 2014]. При ХПН наблюдаются глобальные изменения гомеостаза, иммунные дисфункции, приводящие к широкому спектру осложнений, определяющих качество и продолжительность жизни данной категории больных, эффективность базисной терапии. Ключевое место в структуре осложнений при ХПН занимают заболевания инфекционного, воспалительного генеза и атеросклерозобусловленная патология. Так, смертность от сепсиса у данной категории больных в 50 раз выше, чем в общей популяции, по другим данным смертность от сепсиса у диализных больных в 100-300 раз выше. По данным Российского регистра заместительной почечной терапии, сопутствующие заболевания инфекционного, воспалительного генеза и атеросклерозобусловленная патология встречаются более чем у 47% больных ХПН, получающих заместительную почечную терапию. В структуре летальности больных ХПН, находящихся на гемодиализе, инфекционные осложнения занимают 2 место после кардиоваскулярной патологии. Возникновение инфекционных и сердечно-сосудистых осложнений у больных ХПН связывают с вторичной иммунной дисфункцией [Kato, S. Aspects of immune dysfunction in end-stage renal disease / S. Kato, M. Chmielewski, H. Honda, R. Pecoits-Filho et al. // Clin. J. Am. Soc. Nephrol. - 2008. - Vol. 3(5). - P. 1526-1533]. В частности, активация эффекторов врожденного иммунитета рассматривается как один из факторов прогрессирования атеросклероза, эндотелиальной дисфункции, артериальной гипертензии, метаболического синдрома [Stinghen, А.Е. Immune mechanisms involved in cardiovascular complications of chronic kidney disease / A.E. Stinghen, S. Bucharles, M.C. Riella, R. Pecoits-Filho // Blood Purif. - 2010. - Vol. 29(2). - P. 114-20]. Депрессию адаптивного иммунитета связывают с высоким риском возникновения и неблагоприятными последствиями инфекционных заболеваний. Изменения иммунного статуса при ХПН являются многогранными, включают дисфункцию эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета, дизрегуляцию иммунного ответа и приводят к повышенному риску инфекционных, злокачественных заболеваний, плохой реакции на вакцинацию, прогрессированию атеросклероза и связанных с ним кардиоваскулярных заболеваний.Chronic renal failure syndrome (CRF) is an important public health problem, since it has negative health consequences and extremely high costs of medical care [Bikbov, B.T. Substitution treatment of patients with chronic renal failure by peritoneal dialysis and kidney transplantation in the Russian Federation in 1998-2011 (Report on the data of the Russian Register of renal replacement therapy. Part Two) / B.T. Bikbov, N.A. Tomilina // Nephrology and dialysis. - 2014. - T. 16, No. 2. - S. 192-227]. According to the Russian Register of renal replacement therapy, at the beginning of 2012 the number of patients with terminal renal failure receiving renal replacement therapy in the Russian Federation amounted to 28,548 people, or 199.6 per 1 million population, the annual growth rate is 9-10% [Bikbov B.T., 2014]. In chronic renal failure, global changes in homeostasis, immune dysfunctions are observed, leading to a wide range of complications that determine the quality and life expectancy of this category of patients, the effectiveness of basic therapy. A key place in the structure of complications in chronic renal failure is occupied by diseases of infectious and inflammatory genesis and atherosclerosis-related pathology. Thus, mortality from sepsis in this category of patients is 50 times higher than in the general population; according to other sources, mortality from sepsis in dialysis patients is 100-300 times higher. According to the Russian registry of renal replacement therapy, concomitant diseases of infectious, inflammatory origin and atherosclerosis-related pathology are found in more than 47% of patients with chronic renal failure receiving renal replacement therapy. In the structure of mortality of patients with chronic renal failure on hemodialysis, infectious complications take 2nd place after cardiovascular pathology. The occurrence of infectious and cardiovascular complications in patients with chronic renal failure is associated with secondary immune dysfunction [Kato, S. Aspects of immune dysfunction in end-stage renal disease / S. Kato, M. Chmielewski, H. Honda, R. Pecoits-Filho et al . // Clin. J. Am. Soc. Nephrol. - 2008. - Vol. 3 (5). - P. 1526-1533]. In particular, activation of innate immunity effectors is considered as one of the factors in the progression of atherosclerosis, endothelial dysfunction, arterial hypertension, and metabolic syndrome [Stinghen, A.E. Immune mechanisms involved in cardiovascular complications of chronic kidney disease / A.E. Stinghen, S. Bucharles, M.C. Riella, R. Pecoits-Filho // Blood Purif. - 2010 .-- Vol. 29 (2). - P. 114-20]. Depression of adaptive immunity is associated with a high risk of occurrence and the adverse effects of infectious diseases. Changes in the immune status in chronic renal failure are multifaceted, include dysfunction of the effectors of innate and adaptive immunity, dysregulation of the immune response and lead to an increased risk of infectious, malignant diseases, poor response to vaccination, progression of atherosclerosis and associated cardiovascular diseases.

Изучение механизмов иммунопатогенеза хронической почечной недостаточности (ХПН) и методов коррекции возникающих при данном заболевании дисфункций является актуальной проблемой современной фундаментальной медицинской науки и предпосылкой для создания средств патогенетической коррекции возникающих нарушений [Betjes, M.G. Immune cell dysfunction and inflammation in end-stage renal disease / M.G. Betjes // Nat. Rev. Nephrol. - 2013. - Vol. 5. - P. 255-265].The study of the mechanisms of immunopathogenesis of chronic renal failure (CRF) and methods of correction of dysfunctions arising from this disease is an urgent problem of modern fundamental medical science and a prerequisite for creating pathogenetic correction of emerging disorders [Betjes, M.G. Immune cell dysfunction and inflammation in end-stage renal disease / M.G. Betjes // Nat. Rev. Nephrol. - 2013 .-- Vol. 5. - P. 255-265].

Поиск факторов, влияющих на нормализацию иммунного статуса при ХПН является актуальной и востребованной в клинических условиях проблемой современной фундаментальной медицины [Stinghen, А.Е., 2010]. В этом отношении интерес вызывает действие блокаторов кальциевых каналов, препарата амлодипин, используемого в терапии ХПН, действие которого основано на рецепторном связывании с дигидропиридиновыми рецепторами и блокировании кальциевых каналов, ингибировании трансмембранного перехода ионов кальция внутрь клетки. Ранее, исследованиями М.В. Осикова с соавторами показали, что применение иммуномодулирующей терапии при экспериментальной ХПН у лабораторных животных in vivo проявляет не только вазодилатирующее, гипотензивное, антиангинальное, спазмолитическое, но и способствует активации реакций врожденного и адаптивного иммунитета у экспериментальных животных (крыс) [Осиков М.В. Уровень эритропоэтина и иммунный статус организма у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев, А.А. Федосов // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - №4; URL: www.science-education.ru/110-9973 (дата обращения: 31.01.2015)].The search for factors influencing the normalization of the immune status in chronic renal failure is an urgent and relevant clinical problem of modern fundamental medicine [Stinghen, A.E., 2010]. In this regard, the action of calcium channel blockers, the drug amlodipine, used in the treatment of chronic renal failure, whose action is based on receptor binding to dihydropyridine receptors and the blocking of calcium channels, inhibition of the transmembrane transition of calcium ions into the cell, is of interest. Previously, the research of M.V. Osikova et al. Showed that the use of immunomodulating therapy in experimental CRF in laboratory animals in vivo shows not only vasodilating, hypotensive, antianginal, antispasmodic, but also promotes activation of innate and adaptive immunity reactions in experimental animals (rats) [Osikov MV The level of erythropoietin and the immune status of the body in patients with chronic renal failure undergoing hemodialysis / M.V. Osikov, L.F. Telesheva, Yu.I. Ageev, A.A. Fedosov // Modern problems of science and education. - 2013. - No. 4; URL: www.science-education.ru/110-9973 (accessed: 01/31/2015)].

На сегодняшний момент для повышения эффективности терапии хронической почечной недостаточности предложен рад способов, в частности предложен «Способ лечения почечной недостаточности [Патент RU №98118878, МПК А61М 1/34. Способ лечения почечной недостаточности. Рос. Федерация, заявл. 16.10.1998; опубл. 20.07.2000. В.М. Клюжев, В.И. Гранкин, А.С. Девятое, A.M. Литвинов, Л.В. Шаплыгин, С.Е. Хорошилов, И.Л. Новосельцев, Л.В. Новицкий. Главный военный госпиталь им. акад. Н.Н. Бурденко], заключающийся в том, что авторами использовано комплексное сочетание гемодиализа и гемодиафильтрации с использованием мембран высокой проницаемости и замещением отфильтрованной плазменной жидкости в объемах, сравнимых с объемом внеклеточной жидкости, которое осуществляют для усиления эффекта детоксикации у больных в тяжелом состоянии с клиникой анурии и развивающимся отеком легких.To date, to improve the effectiveness of the treatment of chronic renal failure, a number of methods have been proposed, in particular, a “Method for the treatment of renal failure [Patent RU No. 98118878, IPC A61M 1/34. A method of treating renal failure. Grew up. Federation declared 10/16/1998; publ. 07/20/2000. V.M. Klyuzhev, V.I. Grankin, A.S. Ninth, A.M. Litvinov, L.V. Shaplygin, S.E. Khoroshilov, I.L. Novoseltsev, L.V. Novitsky. The main military hospital. Acad. N.N. Burdenko], which consists in the fact that the authors used a complex combination of hemodialysis and hemodiafiltration using high permeability membranes and replacing the filtered plasma fluid in volumes comparable to the volume of extracellular fluid, which is carried out to enhance the detoxification effect in seriously ill patients with anuria clinic and developing pulmonary edema.

Недостаток метода - возможность использования только при проведении гемодиализа у больных в тяжелом состоянии с клиникой анурии и развивающимся отеком легких, метод не учитывает наличие иммунных дисфункций у пациента, метод не может быть использован при проведении исследовательских мероприятий in vivo для оценки эффективности лечения хронической почечной недостаточности.The disadvantage of this method is the ability to use it only during hemodialysis in seriously ill patients with a clinic of anuria and developing pulmonary edema, the method does not take into account the presence of immune dysfunctions in the patient, the method cannot be used in in vivo research to evaluate the effectiveness of treatment of chronic renal failure.

Использование блокатора кальциевых каналов препарата амлодипин ранее было использовано для оптимизации функций клеток красной крови, в частности кровяных пластинок при метаболическом синдроме, в частности предложен «Способ быстрой оптимизации функций кровяных пластинок при метаболическом синдроме» [Патент №2272628 C1, МНК: А61К 31/4422, А61К 38/28, А61Р 3/10, А61Р 7/02, А61Р 9/12. Способ быстрой оптимизации функций кровяных пластинок при метаболическом синдроме. Рос. Федерация, заявл. 19.07.2004; опубл. 27.03.2006. И.Н. Медведев, Б.Д. Беспарточный. Патентообладатели: И.Н. Медведев, Б.Д. Беспарточный, Н.И. Громнацкий], где для терапии метаболического синдрома на фоне комплексно подобранной диеты вводят амлодипин в дозе 5 мг 1 раз в одно и то же время при лечении не менее 8 недель, регистрируются выраженные положительные изменения внутрисосудистой активности тромбоцитов за счет коррекции первичного гемостаза и уровня их антиоксидантной защищенности. Недостаток метода - возможность использования при проведении лечебных мероприятий, отсутствие широкого спектра параметров и анализа положительной динамики уровня показателей антиоксидантной системы с показателями иммунного статуса, взаимосвязь которых на сегодняшний день является доказанной.The use of calcium channel blocker amlodipine was previously used to optimize the functions of red blood cells, in particular blood platelets in the metabolic syndrome, in particular, “A method for quickly optimizing blood platelet functions in the metabolic syndrome” was proposed [Patent No. 2272628 C1, MNC: A61K 31/4422 , A61K 38/28, A61P 3/10, A61P 7/02, A61P 9/12. A method for quickly optimizing the functions of blood platelets in the metabolic syndrome. Grew up. Federation declared 07/19/2004; publ. 03/27/2006. I.N. Medvedev, B.D. Non-card. Patent holders: I.N. Medvedev, B.D. Partless, N.I. Gromnatsky], where amlodipine is administered at a dose of 5 mg 1 time at the same time for treatment of the metabolic syndrome against a background of a comprehensively selected diet for at least 8 weeks, pronounced positive changes in the intravascular activity of platelets due to correction of primary hemostasis and their antioxidant level are recorded security. The disadvantage of this method is the possibility of using it during treatment, the absence of a wide range of parameters and the analysis of the positive dynamics of the level of antioxidant system indicators with indicators of the immune status, the relationship of which has been proven to date.

Одним из способов коррекции иммунных нарушений является способ, предложенный Ю.А. Агеевым - Агеев Ю.И. Влияние эритропоэтина на показатели иммунного статуса при экспериментальной хронической почечной недостаточности [Электронный ресурс] / Ю.И. Агеев, М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, А.А. Федосов // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - №3. - Режим доступа: www.science-education.ru/117-13594 (дата обращения: 21.06.2014), при котором было изучено влияние эритропоэтина на показатели иммунного статуса при экспериментальной хронической почечной недостаточности. В предложенном способе иммунокоррекции ХПН показано, что в экспериментальных условиях in vivo показано, что эритропоэтин при ХПН полностью или частично восстанавливает врожденный и адаптивный иммунитет по показателям количественного состава лейкоцитов в крови, поглотительной способности и кислородзависимого метаболизма нейтрофилов, Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа, стимулирует функциональную активность изолированных интактных нейтрофилов и дозозависимо в диапазоне концентраций от 1,88 МЕ/л до 30 МЕ/л ограничивает гибель лимфоцитов, полученных от больных ХПН, что повышает иммунологическую эффективность терапии ХПН, но для комплексных терапевтических мероприятий требует одновременного введения препаратов, обладающих вазодилатирующим, гипотензивным, антиангинальним, спазмолитическим действием. Способ обеспечивает повышение качества терапевтических мероприятий при ХПН и может быль использован с целью терапии осложнений инфекционного и воспалительного генеза при хронической почечной недостаточности. Недостатком метода можно считать необходимость дополнительного введения в схему терапии лекарственных препаратов, обладающих вазодилатирующим, гипотензивным, антиангинальным, спазмолитическим действием.One of the ways to correct immune disorders is the method proposed by Yu.A. Ageev - Ageev Yu.I. The effect of erythropoietin on indicators of immune status in experimental chronic renal failure [Electronic resource] / Yu.I. Ageev, M.V. Osikov, L.F. Telesheva, A.A. Fedosov // Modern problems of science and education. - 2014. - No. 3. - Access mode: www.science-education.ru/117-13594 (accessed: 06/21/2014), in which the effect of erythropoietin on immune status indicators in experimental chronic renal failure was studied. The proposed method of immunocorrection of chronic renal failure shows that in vivo it was shown that erythropoietin in chronic renal failure fully or partially restores innate and adaptive immunity in terms of the quantitative composition of leukocytes in the blood, the absorption capacity and oxygen-dependent metabolism of neutrophils, the Th1 and Th2-dependent immune response , stimulates the functional activity of isolated intact neutrophils and dose-dependently in the range of concentrations from 1.88 IU / l to 30 IU / l limits the death of lymphocytes, p radiation from patients with chronic renal failure, which increases the immunological efficacy of CRF, but for complex therapeutic interventions requires simultaneous administration of drugs with vasodilating, antihypertensive, antianginal, antispasmodic effect. The method provides an improvement in the quality of therapeutic measures in chronic renal failure and can be used to treat complications of infectious and inflammatory genesis in chronic renal failure. The disadvantage of the method can be considered the need for additional introduction into the treatment regimen of drugs with vasodilating, antihypertensive, antianginal, antispasmodic effect.

Другим способом, послужившим прототипом исследования, стал метод коррекции иммунного статуса при хронической почечной недостаточности с использованием эритропоэтина, предложенный М.В. Осиковым с соавторами [Осиков М.В. Уровень эритропоэтина и иммунный статус организма у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев, А.А. Федосов // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - №4; URL: www.science-education.ru/110-9973 (дата обращения: 31.01.2015).] Данный способ применяется в медицине, однако в связи с особенностями патогенеза ХПН в терапевтические мероприятия необходимо включение средств, проявляющих как иммуномодулирующие, так и вазодилатирующие, гипотензивные, антиангинальные, спазмолитические эффекты. Поскольку других подобных методов нами найдено не было, то данные способы взяты за прототип.Another method that served as the prototype of the study was the method of correction of the immune status in chronic renal failure using erythropoietin, proposed by M.V. Osikov with co-authors [Osikov M.V. The level of erythropoietin and the immune status of the body in patients with chronic renal failure undergoing hemodialysis / M.V. Osikov, L.F. Telesheva, Yu.I. Ageev, A.A. Fedosov // Modern problems of science and education. - 2013. - No. 4; URL: www.science-education.ru/110-9973 (accessed: 01/31/2015).] This method is used in medicine, however, due to the specific pathogenesis of chronic renal failure, therapeutic agents that include both immunomodulating and vasodilating agents must be included hypotensive, antianginal, antispasmodic effects. Since we did not find other similar methods, these methods are taken as a prototype.

Для ХПН характерно развитие вторичной иммунной дисфункции с заинтересованностью факторов врожденного и адаптивного иммунитета, выраженной в активации эффекторов врожденного иммунитета, подавлении факторов адаптивного иммунитета, что в итоге приводит к высокому риску развития инфекционной патологии, атеросклерозобусловленных кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний [Betjes, M.G. Immune cell dysfunction and inflammation in end-stage renal disease / M.G. Betjes // Nat. Rev. Nephrol. - 2013. - Vol. 5. - P. 255-265. Cohen, G. Immune Dysfunction in Uremia-An Update / G. Cohen, W.H.

// Toxins (Basel). - 2012. - Vol. 24, №4(11). - P. 962-90]CRF is characterized by the development of secondary immune dysfunction with an interest in innate and adaptive immunity factors, expressed in activation of innate immunity effectors, suppression of adaptive immunity factors, which ultimately leads to a high risk of developing infectious pathology, atherosclerosis-related cardiovascular and cerebrovascular diseases [Betjes, MG Immune cell dunction and inflammation in end-stage renal disease / MG Betjes // Nat. Rev. Nephrol. - 2013 .-- Vol. 5. - P. 255-265. Cohen, G. Immune Dysfunction in Uremia-An Update / G. Cohen, WH

// Toxins (Basel). - 2012. - Vol. 24, No. 4 (11). - P. 962-90]

В основу нашего изобретения положена задача, заключающаяся создании способа повышения иммунологической эффективности терапии хронической почечной недостаточности в эксперименте с использованием блокатора кальциевых каналов препарата Амлодипин, проявляющего вазодилатирующее, гипотензивное, антиангинальное, спазмолитическое и иммунододулирующие эффекты в эксперименте in vivo.The basis of our invention is the task of creating a method for increasing the immunological effectiveness of the treatment of chronic renal failure in an experiment using the calcium channel blocker Amlodipine, which shows vasodilating, hypotensive, antianginal, antispasmodic and immunododulating effects in an in vivo experiment.

Указанная техническая задача решается за счет того, что в нашем способе с использованием модели лабораторных животных (крыс) впервые в экспериментальных условиях ХПН использован метод оценки врожденного и адаптивного иммунитета при действии блокатора кальциевых каналов препарата Амлодипина и показаны иммуномодулирующие эффекты данного препарата, дающие возможность его активного использования в терапии ХПН в качестве средства, влияющего на факторы врожденного и адаптивного иммунитета.This technical problem is solved due to the fact that in our method using a model of laboratory animals (rats) for the first time under experimental conditions of chronic renal failure, we used the method for assessing innate and adaptive immunity under the action of the calcium channel blocker Amlodipine and showed the immunomodulating effects of this drug, which make it possible to actively use in the treatment of chronic renal failure as a means of influencing innate and adaptive immunity factors.

Для проведения исследования по выявлению способа повышения иммунологической эффективности терапии хронической почечной недостаточности в эксперименте с использованием блокатора кальциевых каналов препарата Амлодипин эксперименты in vivo выполнены на 510 белых нелинейных крысах-самцах массой 200-220 г., находящихся в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР №1179 от 10.10.1983 г., свободном доступе к пище и воде при 12-14-часовом световом дне. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с правилами гуманного отношения к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии, регламентированными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ МЗ СССР №775 от 12.08.1977 г.) и положениями Хельсинской Декларации ВОЗ (1997). Моделирование ХПН у крыс создавали путем двухэтапной оперативной резекции 5/6 почечной ткани по методу Шуркалина Б.К. и соавт. в модификации Santos L.S. et al. и Hai-Chun Yang et al. [Шуркалин Б.К., Горский B.A., Фаллер А.П. Руководство по экспериментальной хирургии. - М.: Атмосфера, 2010. 176 с. Surgical reduction of the renal mass in rats: morphologic and functional analysis on the remnant kidney / L.S. Santos [et al.]// Acta Cir Bras. 2006. Vol. 21, №4. P. 252-257.; Yang H., Zuo Y., Fogo A.B. Models of chronic kidney disease // Drug Discov Today Dis Models. 2010. Vol. 7, №1-2. P. 13-19].To conduct a study to identify a way to increase the immunological effectiveness of the treatment of chronic renal failure in an experiment using the calcium channel blocker Amlodipine, in vivo experiments were performed on 510 non-linear white male rats weighing 200-220 g, under standard vivarium conditions on a standard diet in accordance with the norms approved by Order of the Ministry of Health of the USSR No. 1179 of 10/10/1983, free access to food and water at a 12-14 hour light day. All manipulations with experimental animals were carried out in accordance with the rules of humane treatment of animals, methodological recommendations for their removal from experience and euthanasia, regulated by the "Rules for the use of experimental animals (Order of the Ministry of Health of the USSR No. 775 of 08/12/1977) and the provisions of Helsinki WHO Declaration (1997). Modeling CRF in rats was created by two-stage operative resection of 5/6 renal tissue according to the method of B. Shurkalin. et al. in modification Santos L.S. et al. and Hai-Chun Yang et al. [Shurkalin B.K., Gorsky B.A., Fuller A.P. Guide to experimental surgery. - M .: Atmosphere, 2010.176 s. Surgical reduction of the renal mass in rats: morphologic and functional analysis on the remnant kidney / L.S. Santos [et al.] // Acta Cir Bras. 2006. Vol. 21, No. 4. P. 252-257 .; Yang H., Zuo Y., Fogo A.B. Models of chronic kidney disease // Drug Discov Today Dis Models. 2010. Vol. 7, No. 1-2. P. 13-19].

В условиях масочного эфирного наркоза, спонтанного дыхания крысу размещали на операционном столике с подогревом в положении на спине с фиксацией конечностей. Выстригали шерсть в области операционного поля (передняя брюшная стенка), поле обрабатывали антисептиком «Соната-Септ» (ООО «Уралхимфарм-плюс», Россия), после чего выполняли срединную лапаротомию с рассечением кожи, подкожной жировой клетчатки и мышц. Длина разреза составляла в среднем 3,5 см. I этап моделирования ХПН-правосторонняя нефрэктомия. После проведения лапаротомии в брюшную полость вводили 2-3 салфетки, смоченные водным раствором 0,05% хлоргексидина с целью ограничения операционного поля от окружающих тканей. Дном операционной раны являлась правая почка, стенками - боковая стенка брюшной полости и тампоны. Затем рассекали печеночно-почечную связку, вскрывали предпочечную фасцию, почку вывихивали на почечной ножке в вентральном направлении, вокруг почечной ножки накладывали и затягивали лигатуру из шелка №3. Наложение лигатуры повторяли с целью предотвращения ее случайного соскальзывания. После этого проводили отсечение почки дистальнее наложенных лигатур. Производили контроль гемостаза, извлечение тампонов из брюшной полости, послойное ушивали операционную рану. В послеоперационном периоде животных содержали в одиночных клетках с максимальным соблюдением требований асептики и антисептики. II этап моделирования ХПН проводили на седьмые сутки. Осуществляли повторное рассечение брюшной полости, рассечение предпочечной фасции, после чего проводили коагуляцию 80% поверхности единственной почки электроножом «ЭХВЧ 200-1» («Политом-1», Россия). ХПН развивалась на 21 сутки эксперимента. Для верификации ХПН определяли концентрацию в сыворотке креатинина, мочевины, мочевой кислоты. Для проведения исследования иммунных нарушений при экспериментальной ХПН и методах их коррекции блокатором кальциевых каналов 510 белых нелинейных крыс были случайным образом разделены на 3 группы. Группа 1 - контрольная, ложнооперированные животные (n=164). Группа 2 - животные с ХПН (n=196). Группа 3 - животные, которым на фоне ХПН и диализного метода вводили блокатор кальциевых каналов - препарат Амлодипин (n=150). Группа 4 - животные с ХПН, которым был проведен перинеальный диализ, без использования препарата Амлодипин (n=150). Использование перитонеального диализа у животных группы 4 обусловлено тем, что именно данный метод терапии является наиболее эффективным методом и распространенной альтернативой консервативной инфузионной терапии [Gregory C.R. Renal transplantation in cats. // Comp. Cont. Ed., 1993, 15. P. 1325-1339. 3. Gregory C.R. et al. Renal transplantation in clinical veterinary medicine. In Kirk R.W., Bonagura J.D. (eds) // Kirk's Current Veterinary Therapy XI, Small Animal Practice. Phil. W.B. Saunders Co, 1992. P. 870-875. 2, 3]. Используемый нами метод перитонеального диализа использует способность брюшины как эндогенной диализной мембраны к транспорту жидкости и растворенных веществ [Шестаков В.Н. и др. Состояние периферической крови у лабораторных животных при коррекции острой почечной недостаточности растворами для перитонеального диализа // Вестник службы крови России. - 2014. - №. 3. - с. 60-63]. Перитонеальный диализ выполнялся путем вливания в брюшную полость заданного объема перитонеальной диализующей жидкости через ранее установленный катетер, в объеме обычно 10-20 мл/кг, в перитонеальную полость. Диализат находится в брюшной полости от 30 до 120 минут, в зависимости от содержания глюкозы, а затем удаляется обратно через катетер. Во время каждого периода пребывания жидкости в брюшной полости происходило удаление растворенных веществ и ультрафильтрата. Удаление растворенных веществ из внеклеточной жидкости в перитонеальный диализат происходит под влиянием градиента концентрации, при этом перитонеальная мембрана функционирует как полупроницаемая диализная мембрана [Воронцов А.А. и др. Возможности трансплантации донорской почки у больных животных в терминальной стадии хронической почечной недостаточности // Ветеринарная патология. - 2006. - Т. 2. - №. 17. - С. 48-51]. Контрольной группе животных (группа 1) проводилась срединная лапаротомия с рассечением кожи, подкожной жировой клетчатки и мышц с последующим послойным ушиванием операционной раны наглухо. Исследования во всех группах проводили на 30 сутки от 1 этапа операции. Животным 3 группы, начиная с 21 суток эксперимента, пипеточным способом ежедневно вводили блокатор кальциевых каналов в составе препарата «Амлодипин-Тева» (международное непатентованное название: амлодипин, Израиль) в дозе 0,25 мг/кг в сутки на одно животное в течение 7 дней, суммарная доза составила 0,35 мг. Выбор среди материалов исследования пал именно на амлодипин в связи с тем, что это один из наиболее применяемых антигипертензивных препаратов из группы кальциевых блокаторов среди диализных пациентов. Забор крови проводили под общим ингаляционным наркозом (диэтиловый эфир) пункцией сердца в области левого желудочка в вакуумные пробирки фирмы «Вакуэт» (Австрия).Under the conditions of masked ether anesthesia, spontaneous respiration, the rat was placed on the operating table with heating in the supine position with fixation of the limbs. The hair was cut in the area of the operative field (anterior abdominal wall), the field was treated with the Sonata-Sept antiseptic (Uralhimpharm-plus, Russia), and then mid laparotomy was performed with dissection of the skin, subcutaneous fat and muscle. The length of the incision was on average 3.5 cm. Stage I modeling of chronic renal failure-right-sided nephrectomy. After laparotomy, 2-3 wipes were introduced into the abdominal cavity moistened with an aqueous solution of 0.05% chlorhexidine in order to limit the surgical field from surrounding tissues. The bottom of the surgical wound was the right kidney, the walls - the side wall of the abdominal cavity and tampons. Then the hepatic-renal ligament was dissected, the prerenal fascia was opened, the kidney was dislocated on the renal pedicle in the ventral direction, and a ligature made of silk No. 3 was applied and tightened around the renal pedicle. The ligature application was repeated in order to prevent its accidental slipping. After this, the kidney was cut off distally to the superimposed ligatures. Hemostasis was controlled, tampons were removed from the abdominal cavity, and the surgical wound was sutured in layers. In the postoperative period, animals were kept in single cells with maximum compliance with aseptic and antiseptic requirements. The II stage of chronic renal failure modeling was performed on the seventh day. Re-dissection of the abdominal cavity, dissection of the prerenal fascia was carried out, after which 80% of the surface of a single kidney was coagulated with an EKHCh 200-1 electric knife (Politom-1, Russia). CRF developed on day 21 of the experiment. To verify CRF, serum concentrations of creatinine, urea, and uric acid were determined. To conduct studies of immune disorders in experimental chronic renal failure and methods for their correction with a calcium channel blocker, 510 nonlinear white rats were randomly divided into 3 groups. Group 1 - control, false-operated animals (n = 164). Group 2 - animals with chronic renal failure (n = 196). Group 3 - animals that were injected with calcium channel blocker Amlodipine (n = 150) against the background of chronic renal failure and the dialysis method. Group 4 - animals with chronic renal failure who underwent perineal dialysis, without using the drug Amlodipine (n = 150). The use of peritoneal dialysis in animals of group 4 is due to the fact that this particular method of therapy is the most effective method and a common alternative to conservative infusion therapy [Gregory C.R. Renal transplantation in cats. // Comp. Cont. Ed., 1993, 15. P. 1325-1339. 3. Gregory C.R. et al. Renal transplantation in clinical veterinary medicine. In Kirk R.W., Bonagura J.D. (eds) // Kirk's Current Veterinary Therapy XI, Small Animal Practice. Phil. W.B. Saunders Co, 1992. P. 870-875. 2, 3]. The method of peritoneal dialysis used by us uses the ability of the peritoneum as an endogenous dialysis membrane to transport liquid and dissolved substances [Shestakov V.N. et al. The condition of peripheral blood in laboratory animals during correction of acute renal failure with solutions for peritoneal dialysis // Herald of the Russian Blood Service. - 2014. - No. 3. - p. 60-63]. Peritoneal dialysis was performed by pouring a predetermined volume of peritoneal dialysis fluid into the abdominal cavity through a previously installed catheter, usually 10-20 ml / kg, into the peritoneal cavity. The dialysate is in the abdominal cavity for 30 to 120 minutes, depending on the glucose content, and then removed back through the catheter. During each period of fluid in the abdominal cavity, solutes and ultrafiltrate were removed. Removal of solutes from the extracellular fluid into the peritoneal dialysate occurs under the influence of a concentration gradient, while the peritoneal membrane functions as a semipermeable dialysis membrane [A. Vorontsov. et al. Possibilities of donor kidney transplantation in sick animals in the terminal stage of chronic renal failure // Veterinary Pathology. - 2006. - T. 2. - No. 17. - S. 48-51]. The control group of animals (group 1) underwent median laparotomy with dissection of the skin, subcutaneous fat and muscle, followed by layer-by-layer suturing of the surgical wound tightly. Studies in all groups were performed on day 30 from stage 1 of the operation. For animals of the 3rd group, starting from the 21st day of the experiment, a calcium channel blocker was introduced daily by pipetting as part of the drug Amlodipin-Teva (international nonproprietary name: amlodipine, Israel) at a dose of 0.25 mg / kg per day per animal for 7 days, the total dose was 0.35 mg. Amlodipine was the choice among the research materials due to the fact that it is one of the most used antihypertensive drugs from the group of calcium blockers among dialysis patients. Blood sampling was performed under general inhalation anesthesia (diethyl ether) by puncture of the heart in the left ventricle in vacuum tubes of the Wakuet company (Austria).

Количество лейкоцитов в периферической крови лабораторных животных определяли общепринятым методом в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу подсчитывали в мазках крови, фиксированных метиловым спиртом и окрашенных азур II-эозином по Романовскому-Гимзе. Подсчитывали 200 лейкоцитов с дифференциацией эозинофилов, базофилов, метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов. Их количество выражали в относительных (%) и в абсолютных (⋅10⁹/л) величинах. Исследование поглотительной способности фагоцитов периферической крови крыс проводили на модели поглощения частиц латекса. Для оценки фагоцитоза 200 мкл крови смешивали с 20 мкл взвеси частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистирольного латекса. После 60 минут инкубации при температуре 37°С из суспензии готовили препараты, которые высушивали, фиксировали метанолом и окрашивали азур II-эозином по Романовскому-Гимзе. С помощью иммерсионной микроскопии учитывали активность фагоцитоза - (%) клеток, захвативших хотя бы одну частицу латекса, интенсивность фагоцитоза - (у.е.) число поглощенных микросфер латекса в 100 подсчитанных клетках и фагоцитарное число - (у.е.) число поглощенных микросфер латекса на один фагоцит. Кислород-зависимый метаболизм фагоцитов оценивали в НСТ-тесте по методу (Маянского А.Н., Виксмана М.Е. Метод основан на восстановлении фагоцитами нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму диформазан. Проводили спонтанный и индуцированный НСТ-тест. В пробирки с 0,2 мл крови добавляли 0,1 мл 0,2% раствора стандартно разведенного нитросинего тетразолия в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4). Для оценки индуцированного НСТ-теста в каждую пробирку добавляли 20 мкл суспензии частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистерольного латекса (индуцированная серия) или 20 мкл 0,9% NaCl (спонтанная серия). После 30-минутной инкубации при температуре 37°С к реакционной смеси добавляли 3 мл 0,1% соляной кислоты для остановки реакции. Пробирки центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, из осадка готовили мазки. После сушки препараты фиксировали метанолом и окрашивали 0,1% водным раствором сафранина. С помощью иммерсионной микроскопии определяли активность НСТ-теста - % клеток, восстанавливающих НСТ, и интенсивность НСТ-теста по активности восстановления НСТ. Параллельно с помощью НСТ-теста определяли способность нейтрофилов крови отвечать повышением метаболической активности на стимуляцию частицами латекса - индуцированный НСТ-тест. Для этого в пробирку с исследуемым материалом (200 мкл) и НСТ (100 мкл) добавляли 20 мкл взвеси монодисперсного полистирольного латекса, с диаметром частиц 1,7 мкм в концентрации 1×10⁹ частиц/мл. Затем реакция и учет результатов производились вышеуказанным способом. Результаты выражали в %. Оценку гуморального Th2-зависимого иммунного ответа у крыс проводили по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, оценку клеточного Th1-зависимого иммунного ответа - по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами. Интенсивность реакции ГЗТ, количество антителообразующих клеток рассчитывали как в абсолютных величинах, так и в пересчете на 10⁶ ядросодержащих клеток (ЯСК)The number of leukocytes in the peripheral blood of laboratory animals was determined by the generally accepted method in the Goryaev chamber. The leukocyte formula was counted in blood smears fixed with methyl alcohol and stained with azure II-eosin according to Romanovsky-Giemsa. 200 leukocytes with differentiation of eosinophils, basophils, metamyelocytes, stab and segmented neutrophils, lymphocytes, monocytes were counted. Their number was expressed in relative (%) and absolute (⋅10 ⁹ / l) values. A study of the absorptive capacity of rat peripheral blood phagocytes was carried out on a model of latex particle absorption. To assess phagocytosis, 200 μl of blood was mixed with 20 μl of a suspension of monodisperse particles (diameter 1.7 μm) of polystyrene latex. After 60 minutes of incubation at a temperature of 37 ° C, preparations were prepared from the suspension, which were dried, fixed with methanol, and stained with azure II-eosin according to Romanovsky-Giemsa. Using immersion microscopy, we took into account the activity of phagocytosis - (%) of cells that captured at least one latex particle, the intensity of phagocytosis - (cu) the number of absorbed latex microspheres in 100 counted cells and the phagocytic number - (cu) the number of absorbed microspheres latex per phagocyte. Oxygen-dependent phagocyte metabolism was evaluated in the NBT test by the method (A. Mayansky, M.E. Viksman. The method is based on the reduction of nitro blue tetrazolium (NBT) by phagocytes into its insoluble form of diformazan. A spontaneous and induced HCT test was performed. In vitro 0.2 ml of blood was added with 0.1 ml of a 0.2% solution of standard diluted nitro blue tetrazolium in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4). To evaluate the induced HCT test, 20 μl of a suspension of monodisperse particles was added to each tube ( diameter 1.7 μm) polystyrene latex (indu bath series) or 20 μl of 0.9% NaCl (spontaneous series) After 30 minutes of incubation at 37 ° C, 3 ml of 0.1% hydrochloric acid was added to the reaction mixture to stop the reaction.The tubes were centrifuged at 1000 rpm in for 5 minutes, the supernatant was discarded, smears were prepared from the precipitate, after drying, the preparations were fixed with methanol and stained with 0.1% aqueous safranin solution. Using the immersion microscopy, the activity of the HCT test was determined -% of the cells that restore the HCT, and the intensity of the HCT test was HCT recovery activity. At the same time, the ability of blood neutrophils to respond by increasing metabolic activity to stimulation by latex particles — the induced HCT test — was determined using the HCT test. For this, 20 μl of a suspension of monodispersed polystyrene latex with a particle diameter of 1.7 μm at a concentration of 1 × 10 ⁹ particles / ml was added to a test tube with the test material (200 μl) and HCT (100 μl). Then the reaction and the calculation of the results were carried out by the above method. The results were expressed in%. The humoral Th2-dependent immune response in rats was assessed by the number of antibody-forming cells (AOKs) in the spleen of rats immunized with allogeneic red blood cells, the cellular Th1-dependent immune response was assessed by the delayed-type hypersensitivity reaction (HRT) in rats immunized with allogeneic red blood cells. The intensity of the HRT reaction, the number of antibody-forming cells was calculated both in absolute terms and in terms of 10 ⁶ nucleated cells (YSC)

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica v. 8.0 for Windows». Характеристика выборок представлена в формате «М ± m», где М - среднее арифметическое значение признака, m - стандартная ошибка среднего. Для анализа нормальности распределения данных применяли критерий Шапиро-Уилка, Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием непараметрических критериев (U - Манна-Уитни, WW - Вальда-Вольфовитца, Н - Краскела-Уоллиса).Statistical processing of the results was carried out using the software package Statistica v. 8.0 for Windows. " The characteristics of the samples are presented in the format “M ± m”, where M is the arithmetic mean value of the attribute, m is the standard error of the mean. To analyze the normality of the data distribution, the Shapiro-Wilk test was used. Statistical hypotheses in the groups were tested using nonparametric criteria (U - Mann-Whitney, WW - Wald-Wolfowitz, N - Kraskel-Wallis).

Результаты исследования по оценке влияния блокатора кальциевых каналов препарата Амлодипин на иммунный статус лабораторных животных при экспериментальной ХПН показали нормализацию показателей факторов врожденного иммунитета, дисфункции которых регистрировались при экспериментальной ХПН, а именно снижение поглотительной способности фагоцитов, выраженную в снижении активности фагоцитоза, т.е. снижении количества активно фагоцитирующих клеток в кровотоке, интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа, т.е. способности клеток поглощать частицы латекса по сравнению с показателями у лабораторных животных, получавших перитонеальный диализ, где не было зарегистрировано нормализации факторов врожденного иммунитета, а именно повышение поглотительной способности фагоцитов, нормализацию показателей активности и интенсивности фагоцитоза (табл. 1, 2). Кроме того, зарегистрировано снижение активности кислородзависимого метаболизма фагоцитов, нормализации активности и индекса спонтанного НСТ-теста, восстановление функционального резерва нейтрофилов периферической крови, отражающих соответственно количество клеток, генерирующих активных форм кислорода (АФК), и интенсивность генерации АФК отдельным фагоцитом. В группе животных, получавших перитонеальный диализ, нормализации кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов периферической крови отмечено не было При оценке количественного состава лейкоцитов в периферической крови установлено, что применение блокатора кальциевых каналов препарата Амлодипин приводит к снижению относительного количества сегментоядерных нейтрофилов и общего количества нейтрофилов, повышению количества лимфоцитов и моноцитов. Пересчет показателей на абсолютные величины обнаружил снижение общего количества нейтрофилов за счет палочкоядерных и сегментоядерных форм. Отметим регуляторный характер влияния амлодипина на количественный состав лейкоцитов в периферической крови: после его применения количество нейтрофилов, лимфоцитов в крови не отличалось от соответствующих значений в группе ложнооперированных животных. При оценке функциональной активности нейтрофилов в периферической крови при ХПН в условиях применения препарата амлодипина отмечено достоверное изменение поглотительной способности и кислородзависимого метаболизма в нейтрофилах. Амлодипин нормализовал показатели активности фагоцитоза, интенсивность и фагоцитарное число. При этом интенсивность фагоцитоза и фагоцитарное число достигали значений в группе ложнооперированных животных (табл. 1, 2).The results of a study evaluating the effect of calcium channel blocker Amlodipine on the immune status of laboratory animals in experimental chronic renal failure showed normalization of indicators of innate immunity factors, dysfunctions of which were recorded in experimental chronic renal failure, namely, a decrease in the absorption capacity of phagocytes, expressed in a decrease in phagocytosis activity, i.e. a decrease in the number of actively phagocytic cells in the bloodstream, the intensity of phagocytosis and phagocytic number, i.e. the ability of cells to absorb latex particles compared to laboratory animals treated with peritoneal dialysis, where normalization of innate immunity factors was not recorded, namely, an increase in the absorptive capacity of phagocytes, normalization of activity indicators and phagocytosis intensity (Tables 1, 2). In addition, a decrease in the activity of oxygen-dependent phagocyte metabolism, normalization of the activity and index of spontaneous HCT test, restoration of the functional reserve of peripheral blood neutrophils, respectively, reflecting the number of cells generating active forms of oxygen (ROS), and the intensity of ROS generation by a single phagocyte, were recorded. In the group of animals treated with peritoneal dialysis, normalization of the oxygen-dependent metabolism of peripheral blood neutrophilic granulocytes was not observed. When assessing the quantitative composition of leukocytes in peripheral blood, it was found that the use of calcium channel blocker Amlodipine leads to a decrease in the relative number of segmented neutrophils and the total number of neutrophils, an increase in the number of lymphocytes and monocytes. Recalculation of indicators by absolute values revealed a decrease in the total number of neutrophils due to stab and segment forms. Note the regulatory nature of the effect of amlodipine on the quantitative composition of leukocytes in peripheral blood: after its use, the number of neutrophils and lymphocytes in the blood did not differ from the corresponding values in the group of falsely operated animals. When assessing the functional activity of neutrophils in peripheral blood with chronic renal failure under the conditions of the use of the drug amlodipine, a significant change in the absorption capacity and oxygen-dependent metabolism in neutrophils was noted. Amlodipine normalized phagocytosis activity indicators, intensity and phagocytic number. At the same time, the intensity of phagocytosis and phagocytic number reached values in the group of false-operated animals (Tables 1, 2).

В группе 2 (ХПН), показатели врожденного иммунитета, в частности количество лейкоцитов и их функциональная активность были повышены. Полагают, что ведущим механизмом нейтрофильного лейкоцитоза при ХПН является снижение гибели полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) путем апоптоза, что создает предпосылки для длительной циркуляции активированных клеток в крови. Факторами, подавляющими апоптоз ПЯЛ при ХПН, выступают вне- и внутриклеточный ацидоз, легкие цепи свободного иммуноглобулина, ингибиторы Са-АТФазы в цитоплазматической мембране эритроцитов, С5-компонент комплемента, накопление в крови фенилацетата, парааминогиппуровой кислоты, активация процессов свободно-радикального окисления и др. Повышение генерации АФК нейтрофилами у больных с ХПН, находящихся на гемодиализе, как установили шведские исследователи с использованием метода проточной цитометрии, связано с блокадой ключевого антиоксидантного фермента супероксидисмутазы. Кроме того, ацидоз при ХПН выступает не только как фактор пролонгации циркуляции нейтрофилов в крови, но и связан с активацией их поглотительной способности и кислородзависимого метаболизма, опосредованной повышением концентрации в цитоплазме Са²⁺. Активация фагоцитов при терминальной ХПН может быть связана с дисфункцией регуляторных Т-клеток с фенотипом CD4(+)CD25(bright+)FoxP3(+) [Deicher, R. Impact of parathyroidectomy on neutrophil cytosolic calcium in chronic kidney disease patients: A prospective parallel group trial / R. Deicher, В. Kirsch, М. Mullner, K. Kaczirek et al. // J. Intern. Med. - 2005. - Vol. 258. - P. 67-76] (табл. 2).In group 2 (CRF), indicators of innate immunity, in particular, the number of leukocytes and their functional activity were increased. It is believed that the leading mechanism of neutrophilic leukocytosis in chronic renal failure is a decrease in the death of polymorphonuclear leukocytes (PNL) by apoptosis, which creates the prerequisites for a prolonged circulation of activated cells in the blood. The factors suppressing apoptosis of PNT in chronic renal failure include extra- and intracellular acidosis, free immunoglobulin light chains, Ca-ATPase inhibitors in the cytoplasmic erythrocyte membrane, the C5 complement component, accumulation of phenylacetate, paraminogippuric acid in the blood, and the activation of free radical processes An increase in ROS generation by neutrophils in patients with chronic renal failure undergoing hemodialysis, as established by Swedish researchers using flow cytometry, is associated with blockade of key antioxidants an identical enzyme superoxide dismutase. In addition, acidosis in chronic renal failure not only acts as a factor in prolonging the circulation of neutrophils in the blood, but is also associated with the activation of their absorption capacity and oxygen-dependent metabolism, mediated by an increase in the concentration of Ca ²⁺ in the cytoplasm. Phagocyte activation in terminal CRF may be associated with regulatory T-cell dysfunction with the CD4 (+) CD25 (bright +) FoxP3 (+) phenotype [Deicher, R. Impact of parathyroidectomy on neutrophil cytosolic calcium in chronic kidney disease patients: A prospective parallel group trial / R. Deicher, B. Kirsch, M. Mullner, K. Kaczirek et al. // J. Intern. Med. - 2005. - Vol. 258. - P. 67-76] (table. 2).

Амлодипин регулирует выраженность адаптивного иммунного ответа при экспериментальной ХПН, который, как было отмечено в табл. 2, снижен по показателям Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа. Так, интенсивность реакции ГЗТ, отражающая Th1-зависимый иммунный ответ, в условиях применения ЭПО повышается и достигает значения в группе ложнооперированных животных. Количество АОК в селезенке крыс, демонстрирующее Th2-зависимый иммунный ответ, также повышается как в абсолютных величинах, так и в пересчете на 10⁶ ЯСК в селезенке и не отличалась от соответствующих значений в группе ложнооперированных животных. Результаты исследования показали, что в условиях in vivo начиная с 21 суток эксперимента после введения пипеточным способом препарата Амлодипин в дозе 0,25 мг/кг в сутки на одно животное в течение 7 дней, при суммарной дозе 0,35 мг регистрируется нормализация функциональной активности фагоцитов у лабораторных животных с хронической почечной недостаточностью, получавших препарат Амлодипин, по отношению к лабораторным животным, не получавшим Амлодипин, выраженная в нормализации активности фагоцитов в периферической крови по способности клеток захватывать частицы латекса и генерации ими активных форм кислорода: активность фагоцитоза снижается на 33%, интенсивность фагоцитоза снижается на 50%, фагоцитарное число - на 35,8%, активность спонтанного НСТ-теста на 61,11% интенсивность спонтанного НСТ-теста - на 58,6%, интенсивность индуцированного НСТ-теста - на 58,7%, активность индуцированного НСТ-теста - на 30%, функциональный резерв нейтрофилов, рассчитанный по показателям активности НСТ-теста, нейтрофилов периферической крови возрастает на 39,24%, функциональный резерв нейтрофилов, рассчитанный по показателям интенсивности НСТ-теста, возрастает на 24,8%, интенсивность реакции ГЗТ, косвенно отражающая интенсивность Th1-зависимого иммунного ответа, увеличивается на 48%, количество антителообразующих клеток в селезенке снижается как в абсолютных величинах (на 54%), так и в пересчете на 10⁶ ядросодержащих клеток (ЯСК) (на 49%).Amlodipine regulates the severity of the adaptive immune response in experimental CRF, which, as noted in the table. 2, reduced in terms of Th1 and Th2-dependent immune response. Thus, the intensity of the HRT reaction, reflecting the Th1-dependent immune response, increases with the use of EPO and reaches a value in the group of falsely operated animals. The amount of AOK in the rat spleen, showing a Th2-dependent immune response, also increases both in absolute terms and in terms of 10 ⁶ YAS in the spleen and did not differ from the corresponding values in the group of falsely operated animals. The results of the study showed that under in vivo conditions starting from the 21st day of the experiment after administration of the drug Amlodipine in a dose of 0.25 mg / kg per day per animal for 7 days, with a total dose of 0.35 mg, normalization of the functional activity of phagocytes is recorded in laboratory animals with chronic renal failure receiving Amlodipine, compared to laboratory animals not receiving Amlodipine, expressed in normalizing the activity of phagocytes in peripheral blood according to the ability of cells capture latex particles and generate active oxygen species: phagocytosis activity decreases by 33%, phagocytosis intensity decreases by 50%, phagocytic number - by 35.8%, spontaneous HCT test activity by 61.11% spontaneous HCT test intensity - by 58.6%, the intensity of the induced HCT test - by 58.7%, the activity of the induced HCT test - by 30%, the functional reserve of neutrophils, calculated according to the activity indicators of the HCT test, peripheral blood neutrophils increases by 39.24%, functional neutrophil reserve calculated in terms of the intensity of the HCT test, it increases by 24.8%, the intensity of the HRT reaction, indirectly reflecting the intensity of the Th1-dependent immune response, increases by 48%, the number of antibody-forming cells in the spleen decreases both in absolute values (by 54%), and in terms of 10 ⁶ nucleated cells (YSC) (49%).

Таким образом применение блокатора кальциевых каналов препарата Амлодипина при экспериментальной хронической почечной недостаточности приводит к полному или частичному восстановлению количественного состава лейкоцитов в крови, поглотительной способности и кислородзависимого метаболизма нейтрофилов, Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа, тогда как при применении диализной процедуры у животных достоверного восстановления количественного состава лейкоцитов в крови, поглотительной способности и кислородзависимого метаболизма нейтрофилов, Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа не зарегистрировано.Thus, the use of the calcium channel blocker of the drug Amlodipine in experimental chronic renal failure leads to a complete or partial restoration of the quantitative composition of leukocytes in the blood, the absorption capacity and oxygen-dependent metabolism of neutrophils, the Th1- and Th2-dependent immune response, while when using the dialysis procedure in animals, a reliable restoration of the quantitative composition of leukocytes in the blood, absorption capacity and oxygen-dependent metabolism Filov, Th1- and Th2-dependent immune responses have been reported.

Применение способа повышения иммунологической эффективности терапии хронической почечной недостаточности в эксперименте с использованием блокатора кальциевых каналов препарата Амлодипин при экспериментальной хронической почечной недостаточности с использованием модели лабораторных животных позволяет расширить знания о иммунопатогенезе данного заболевания и предложить способ терапии и коррекции дисфункций факторов врожденного и адаптивного иммунитета с помощью блокатора кальциевых каналов препарата Амлодипин.The use of a method of increasing the immunological effectiveness of the treatment of chronic renal failure in an experiment using the calcium channel blocker Amlodipine in experimental chronic renal failure using a model of laboratory animals allows us to expand our knowledge of the immunopathogenesis of this disease and to propose a method for the treatment and correction of dysfunctions of innate and adaptive immunity factors using a blocker calcium channels of the drug Amlodipine.

Предлагаемый способ отличается от существующих тем, что, используя иммунотропные эффекты препарата Амлодипин и положительные изменения факторов врожденного и адаптивного иммунитета, при его применении при экспериментальной хронической почечной недостаточности на модели лабораторных животных по отношению к ранее используемым методам, например перитонеального диализа, приобретается возможность более качественно, без использования человека как объекта исследований, оценить особенности патогенеза ХПН, роли блокаторов кальциевых каналов в повышении иммунологической терапии ХПН, спрогнозировать возможные исходы и риски, связанные с терапией данной патологии и иммуномодуляцией нарушенных иммунных функций. Ввиду корректности метода (уход от необходимости использования человека как объекта исследования), простоты выполнения манипуляций и дешевизны лабораторных методов исследования указанный способ оценки доступен большинству медико-биологических центров, занимающихся изучением соответствующей проблемы и имеющих разрешение на работу с лабораторными животными.The proposed method differs from the existing ones in that, using the immunotropic effects of the drug Amlodipine and positive changes in factors of innate and adaptive immunity, when it is used in experimental chronic renal failure on a model of laboratory animals in relation to previously used methods, for example peritoneal dialysis, it becomes possible to better , without using a person as an object of research, to evaluate the features of the pathogenesis of chronic renal failure, the role of calcium channel blockers All of them are to increase the immunological therapy of chronic renal failure, to predict the possible outcomes and risks associated with the therapy of this pathology and immunomodulation of impaired immune functions. Due to the correctness of the method (avoiding the need to use a person as an object of study), the simplicity of manipulation and the cheapness of laboratory research methods, this assessment method is available to most biomedical centers that study the corresponding problem and have permission to work with laboratory animals.

Заявляемый способ может найти широкое применение в иммунологии, патофизиологии, нефрологии при планировании и проведении экспериментов по изучению патогенеза хронической почечной недостаточности и разработке патогенетической коррекции иммунного статуса при хронической почечной недостаточности, что свидетельствует о его соответствии критерию "промышленная применимость".The inventive method can be widely used in immunology, pathophysiology, nephrology in the planning and conduct of experiments to study the pathogenesis of chronic renal failure and the development of pathogenetic correction of the immune status in chronic renal failure, which indicates its compliance with the criterion of "industrial applicability".

Claims

A method for correcting dysfunction of factors of innate and adaptive immunity in chronic renal failure in an experiment, characterized in that starting from 21 days of modeling chronic renal failure in rats, a calcium channel blocker Amlodipine is administered at a dose of 0.25 mg / kg per day per animal in within 7 days and record changes in factors of innate and adaptive immunity in relation to indicators of laboratory animals not receiving Amlodipine, expressed in normalization of oyaniya cellular factors innate immunity, and their ability to phagocytosis and generation of reactive oxygen species, the intensity of delayed type hypersensitivity reaction, increasing the number of antibody-forming cells in the spleen.