RU2611352C1 - Method for prediction of endometrial cancer patients survival on the basis of the esr1 gene expression level - Google Patents
Method for prediction of endometrial cancer patients survival on the basis of the esr1 gene expression level Download PDFInfo
- Publication number
- RU2611352C1 RU2611352C1 RU2015146517A RU2015146517A RU2611352C1 RU 2611352 C1 RU2611352 C1 RU 2611352C1 RU 2015146517 A RU2015146517 A RU 2015146517A RU 2015146517 A RU2015146517 A RU 2015146517A RU 2611352 C1 RU2611352 C1 RU 2611352C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- esr1
- expression
- cancer
- tissue
- normal
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57442—Specifically defined cancers of the uterus and endometrial
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2539/00—Reactions characterised by analysis of gene expression or genome comparison
- C12Q2539/10—The purpose being sequence identification by analysis of gene expression or genome comparison characterised by
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
- C12Q2561/113—Real time assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии, онкологии, и касается способа прогнозирования благоприятного/неблагоприятного прогноза заболевания по уровню относительной экспрессии гена ESR1 у больных раком тела матки.The invention relates to medicine, namely to molecular biology, oncology, and relates to a method for predicting a favorable / unfavorable prognosis of a disease by the level of relative expression of the ESR1 gene in patients with cancer of the uterus.
Рак тела матки является самой распространенной злокачественной опухолью органов малого таза у женщин (World Cancer Report 2014. World Health Organization. Chapter 5.12). Рак тела матки относят к гормонально зависимым опухолям. Эндометрий, являясь «тканью-мишенью» для половых гормонов, чрезвычайно чувствителен к действию эстрогенов (Causes, Risk Factors, and Prevention TOPICS - Do we know what causes endometrial cancer? - cancer.org - American Cancer Society - Retrieved 5 January 2015). Биологический эффект эстрогенов реализуется через их взаимодействие с эстрогенными рецепторами, которые, в свою очередь, активируют гены-мишени во многих тканях. Показано, что повышенная экспрессия ERα (ESR1) сопровождает процессы онкотрансформации во многих тканях (Bardin А., Boulle N., Lazennec G., Vignon F. Loss of ERb expression as a common step in estrogen-dependent tumor progression// Endocrine-Related Cancer. 2004. Vol. 11. P. 537-551). Поэтому в качестве маркеров для прогнозирования вероятности благоприятного/неблагоприятного прогноза заболевания у больных раком тела матки адекватно использовать уровень относительной экспрессии гена эстрогенного рецептора α (ESR1).Uterine cancer is the most common pelvic cancer in women (World Cancer Report 2014. World Health Organization. Chapter 5.12). Uterine cancer is classified as a hormone-dependent tumor. The endometrium, being the target tissue for sex hormones, is extremely sensitive to the effects of estrogen (Causes, Risk Factors, and Prevention TOPICS - Do we know what causes endometrial cancer? - cancer.org - American Cancer Society - Retrieved January 5, 2015). The biological effect of estrogens is realized through their interaction with estrogen receptors, which, in turn, activate target genes in many tissues. It has been shown that increased expression of ERα (ESR1) accompanies the processes of oncotransformation in many tissues (Bardin A., Boulle N., Lazennec G., Vignon F. Loss of ERb expression as a common step in estrogen-dependent tumor progression // Endocrine-Related Cancer. 2004. Vol. 11. P. 537-551). Therefore, as a marker for predicting the probability of a favorable / unfavorable prognosis of the disease in patients with cancer of the uterus, the level of relative expression of the estrogen receptor gene α (ESR1) should be used adequately.
Рецидивы являются одной из ведущих причин неудач в лечении рака тела матки и определяют неблагоприятный прогноз заболевания. Частота возникновения рецидивов варьирует от 28 до 40% при железисто-плоскоклеточном раке и до 5-10% при высокодифференцированной аденокарциноме эндометрия (Урманчеева А.Ф., Ульрих Е.А., Нейштадт Э.Л. и др. Серозно-папиллярный рак эндометрия (клинико-морфологические особенности. Вопр онкологии 2002; 48 (6): 679-83.). Более 80% рецидивов возникает в первые 2 года после радикального лечения (Кузнецов В.В., Нечушкина В.М. Хирургическое лечения рака тела матки. Практ. онкология 2004; (17): 25-32.). С увеличением промежутка времени после операции прогрессивно снижается вероятность появления местного рецидива. Развитие рецидива рака тела матки наиболее часто отмечают в течение первых 16-21 месяцев после операции. По срокам клинического проявления рецидивы разделяют на ранние, установленные в первые 2 года после операции, и поздние, выявленные в срок более 2 лет (например, через 12 лет). Причинами возникновения ранних рецидивов являются крайне агрессивное течение заболевания, имплантационный путь метастазирования, неадекватный объем хирургического вмешательства. Причины и сроки возникновения поздних рецидивов не определены и достаточно не изучены, но, скорее всего, зависят от биологических особенностей опухоли.Relapses are one of the leading causes of failure in the treatment of cancer of the uterus and determine the poor prognosis of the disease. The recurrence rate varies from 28 to 40% for glandular squamous cell carcinoma and up to 5-10% for highly differentiated endometrial adenocarcinoma (Urmancheeva A.F., Ulrich E.A., Neishtadt E.L. et al. Serous papillary endometrial cancer (clinical and morphological features. Oncology 2002; 48 (6): 679-83.). More than 80% of relapses occur in the first 2 years after radical treatment (Kuznetsov V.V., Nechushkina V.M. Surgical treatment of cancer of the uterus Practical Oncology 2004; (17): 25-32.). With an increase in the period of time after surgery, progressively decreases in the occurrence of local recurrence.The development of a cancer recurrence of the uterine body is most often observed during the first 16-21 months after the operation, according to the timing of clinical manifestations, relapses are divided into the earliest established in the first 2 years after the operation, and the late ones detected over 2 years for example, after 12 years.) The causes of early relapses are the extremely aggressive course of the disease, the implantation path of metastasis, and the inadequate amount of surgery. The causes and timing of late relapses have not been determined and have not been sufficiently studied, but most likely depend on the biological characteristics of the tumor.
Анализ патентных источников показал наличие следующих (близких по тематике данному) изобретений:An analysis of patent sources showed the presence of the following (related to this subject) inventions:
1) «Способ прогнозирования выживаемости больных эндометриоидным раком тела матки» (Заявка: 2006103550/14, 08.02.2006, RU1) “A method for predicting the survival of patients with endometrioid cancer of the uterus” (Application: 2006103550/14, 02/08/2006, RU
(11) 2299690(13) C1, опубликовано: 27.05.2007): на основе оценки исходного соматического состояния больной и ряда иммуногистохимических параметров опухоли прогнозируется выживаемость больной эндометриоидным раком тела матки. В качестве иммуногистохимических параметров используются Ki-67 и HER2.(11) 2299690 (13) C1, published: 05/27/2007): based on the assessment of the initial somatic state of the patient and a number of immunohistochemical parameters of the tumor, the survival of the patient with endometrioid cancer of the uterus is predicted. As immunohistochemical parameters, Ki-67 and HER2 are used.
2) «Способ определения эффективности лечения рака тела матки» (Заявка: 2010127670/15, 05.07.2010): на основе определения коэффициента соотношения тетрагидро-11-дезоксикортизола к кортизолу через 1,5-2 недели после окончания лечения в суточной моче прогнозируют длительность безрецидивного периода.2) “A method for determining the effectiveness of the treatment of cancer of the uterine body” (Application: 2010127670/15, 07/05/2010): based on the determination of the ratio of tetrahydro-11-deoxycortisol to cortisol 1.5-2 weeks after the end of treatment in daily urine, the duration is predicted relapse-free period.
3) «Способ прогнозирования развития рецидива при раке тела матки» (Заявка: 2002132759/15, 05.12.2002, RU 2250077 C2, Опубликовано: 20.04.2005, Патентообладатель(и): Ростовский научно-исследовательский онкологический институт (RU), Сидоренко Юрий Сергеевич (RU), Моисеенко Татьяна Ивановна (RU), Франциянц Елена Михайловна (RU), Черярина Наталья Дмитриевна (RU), по данным на 07.07.2015 - прекратил действие): включает биохимическое исследование в ткани злокачественной опухоли и эндометрия, при этом до и после проведения комплексного лечения определяют активности катепсина Д и кислотостабильных ингибиторов, рассчитывают коэффициент соотношения катепсина Д и кислотостабильных ингибиторов, и при уровне коэффициента, превышающем показатели, характерные для ткани интактного эндометрия, более чем в 2,4-2,8 раза, прогнозируют развитие рецидива рака эндометрия в срок до 6 месяцев.3) “A method for predicting the development of relapse in uterine body cancer” (Application: 2002132759/15, 12/05/2002, RU 2250077 C2, Published: 04/20/2005, Patentee (s): Rostov Scientific Research Cancer Institute (RU), Yuri Sidorenko Sergeevich (RU), Moiseenko Tatyana Ivanovna (RU), Frantsuz Elena Mikhailovna (RU), Cheryarina Natalya Dmitrievna (RU), as of 07.07.2015 - stopped acting): includes a biochemical study in the tissue of a malignant tumor and endometrium, while and after complex treatment determine the activity of cathepsin D and Kis lotostable inhibitors, the ratio of cathepsin D and acid-stable inhibitors is calculated, and at a coefficient level exceeding that characteristic of intact endometrial tissue by more than 2.4-2.8 times, the development of recurrence of endometrial cancer in up to 6 months is predicted.
Описанные изобретения используют более трудоемкие и сложные в анализе способы, при этом обладающие меньшей чувствительностью и специфичностью, чем предлагаемый нами.The described inventions use more time-consuming and difficult to analyze methods, while having less sensitivity and specificity than we offer.
Изобретение «Способ прогнозирования выживаемости больных раком тела матки на основании уровня экспрессии гена ESR1» является новым, так как относительная экспрессия данного гена ранее не использовалась для заявленной в способе цели.The invention "A method for predicting the survival of patients with cancer of the uterus based on the level of expression of the ESR1 gene" is new, since the relative expression of this gene has not previously been used for the purpose stated in the method.
Целью заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, недорогостоящего и более точного способа прогнозирования выживаемости пациенток с диагнозом рак тела матки.The aim of the invention is the creation of a new, simple, inexpensive, and more accurate method for predicting the survival of patients with a diagnosis of cancer of the uterus.
Сущность заявляемого способа заключается в том, что получают кДНК на матрице тотальной РНК с помощью реакции обратной транскрипции, проводят амплификацию кДНК с высокоспецифичными праймерами для генов ESR1 и АСТВ, анализируют первичные данные и вычисляют коэффициент относительной экспрессии (К) (соотношения относительной экспрессии гена ESR1 в опухолевой ткани относительно условно нормальной ткани матки), сравнивают полученные значения К с интервалом прогностического коэффициента экспрессии, и при значении К в пределах 0,31≤KESR1≤0,81 прогнозируют благоприятный исход заболевания, а при значении К в пределах 5,84≤КESR1≤9,32 прогнозируют неблагоприятный исход заболевания.The essence of the proposed method lies in the fact that cDNA is obtained on a total RNA matrix using the reverse transcription reaction, cDNA is amplified with highly specific primers for the ESR1 and ASTV genes, primary data are analyzed, and the coefficient of relative expression (K) is calculated (the ratio of relative expression of the ESR1 gene in tumor tissue relative to normal conditionally uterine tissue) is compared with the values obtained for K expression interval predictive coefficient, and a value of K within the f-cast 0,31≤K ESR1 ≤0,81 ziruyut favorable outcome of disease, and a value of K within 5,84≤K ESR1 ≤9,32 predict poor outcome.
Заявленный анализ основан на определении экспрессии гена ESR1, предварительно нормализованного относительно референтного локуса АСТВ, и последующем вычислении соотношения экспрессии гена в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани: К=Ecancer/Enormal.The claimed analysis is based on determining the expression of the ESR1 gene, previously normalized with respect to the ASTV reference locus, and the subsequent calculation of the ratio of gene expression in tumor tissue with respect to normal tissue: K = E cancer / E normal .
Заявленный способ включает следующие приемы: выделение тотальной РНК из тканевых проб с помощью метода гуанидин-тиоционат-фенол-хлороформной экстракции; определение относительной экспрессии генетических локусов методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EvaGreen Dye и специфичных праймеров на матрице синтезированной кДНК; анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора; расчет экспрессии гена на основании соотношения сигналов, продуцируемых ампликонами изучаемой и референсной последовательностей, и обработка данных на соответствие значениям коэффициентов экспрессии, характерным для групп пациенток с благоприятным или неблагоприятным исходом заболевания.The claimed method includes the following methods: the isolation of total RNA from tissue samples using the method of guanidine-thiocyanate-phenol-chloroform extraction; determination of the relative expression of genetic loci by PCR-RV in the presence of EvaGreen Dye and specific primers on the synthesized cDNA matrix; primary data analysis using the software of the amplifier; calculation of gene expression based on the ratio of signals produced by amplicons of the studied and reference sequences, and data processing for compliance with the values of expression coefficients characteristic of groups of patients with a favorable or unfavorable outcome of the disease.
Заявляемый способ осуществляется следующим образом.The inventive method is as follows.
На первом этапе отбирают образцы тканей пациенток - опухолевые и условно здоровые, из операционного или биопсийного материала. Образцы для транспортировки в лабораторию и хранения замораживают в жидком азоте.At the first stage, patient tissue samples are taken - tumor and conditionally healthy, from surgical or biopsy material. Samples for transportation to the laboratory and storage are frozen in liquid nitrogen.
Фрагменты ткани измельчают скальпелем и/или ножницами, дополнительно растирают в фарфоровых ступках в присутствии лизирующего раствора, содержащего 4 М гуанидин тиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% саркозил и 0,1 М 2-меркаптоэтанол. Затем в лизат добавляют 1 М цитрат Na рН 4,0, кислый фенол и смесь хлороформ/изоамиловый спирт, перемешивают на вортексе и охлаждают образцы при 0°C в течение 15 мин. Дальнейшее выделение РНК из тканей проводят по методу по P. Chomczynski & N. Sacchi (2006) (Chomczynski Р, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006; 1(2): 581-5). Выделенная РНК обрабатывается ДНКазой. Перед проведением реакции обратной транскрипции для проверки качества выделенной РНК проводят электрофорез в 2% геле агарозы по методу Masek Т. et al. (Masek Т., Vopalensky V., Suchomelova P., Pospisek M. Denaturing RNA electrophoresis in TAE agarose gels. // Anal Biochem. - 2005 - 336 (1) - P. 46-50). Также перед проведением реакции обратной транскрипции необходимо измерить концентрацию полученных препаратов РНК на флюориметре и нормализовать ее до 2 нг/мкл. Синтез кДНК можно проводить с использованием коммерческих наборов основанных на применении обратной транскриптазы M-MuLV Reverse Transcriptase и случайных праймеров (random hexamer). Реакцию обратной транскрипции проводили при 37°C в течение 30 минут.Tissue fragments are crushed with a scalpel and / or scissors, additionally ground in porcelain mortars in the presence of a lysing solution containing 4 M guanidine thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0.5% sarcosyl and 0.1 M 2-mercaptoethanol. Then, 1 M Na citrate pH 4.0, acid phenol and a mixture of chloroform / isoamyl alcohol were added to the lysate, vortexed and the samples were cooled at 0 ° C for 15 min. Further RNA isolation from tissues is carried out according to the method of P. Chomczynski & N. Sacchi (2006) (Chomczynski P, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006; 1 (2): 581-5). Isolated RNA is treated with DNase. Before conducting the reverse transcription reaction, to check the quality of the isolated RNA, electrophoresis was performed on a 2% agarose gel according to the method of T. Masek et al. (Masek T., Vopalensky V., Suchomelova P., Pospisek M. Denominating RNA electrophoresis in TAE agarose gels. // Anal Biochem. - 2005 - 336 (1) - P. 46-50). Also, before carrying out the reverse transcription reaction, it is necessary to measure the concentration of the obtained RNA preparations on a fluorimeter and normalize it to 2 ng / μl. Synthesis of cDNA can be carried out using commercial kits based on the use of reverse transcriptase M-MuLV Reverse Transcriptase and random primers (random hexamer). The reverse transcription reaction was carried out at 37 ° C for 30 minutes.
Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицировали в 25 мкл ПЦР-смеси, содержащей 12 нг кДНК, 0,25 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl2, 1х-ый ПЦР-буфер и 0,1 е.а. ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, краситель EVA-Green и по 230 нМ прямого и обратного праймеров для референтного гена (актина, АСТВ) или гена-мишени. Прямые и обратные праймеры были разработаны с использованием референсных последовательностей NCBI GenBank (таблица 1).The analyzed sequences of genetic loci were amplified in 25 μl of the PCR mixture containing 12 ng cDNA, 0.25 mm dNTPs, 2.5 mm MgCl2, 1-x PCR buffer and 0.1 EA Thermus aquaticus DNA polymerase, EVA-Green dye, and 230 nM forward and reverse primers for the reference gene (actin, ASTV) or the target gene. Forward and reverse primers were designed using the NCBI GenBank reference sequences (Table 1).
Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводили на термоциклере в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе. Первичная денатурация: t=95°C в течение 3 мин. 40 циклов: t=95°C в течение 10 с, t=60°C в течение 30 с, t=72°C в течение 15 с. В одной постановке в качестве матрицы использовали одновременно кДНК опытной (опухоль) и контрольной (условно здоровая ткань) пробы для определения сигналов, продуцируемых амплификатами локусов ESR1 и референсного АСТВ, каждого в трех повторностях.Quantitative PCR-RV amplification was performed on a thermal cycler in accordance with the manufacturer's instructions for the following program. Primary denaturation: t = 95 ° C for 3 min. 40 cycles: t = 95 ° C for 10 s, t = 60 ° C for 30 s, t = 72 ° C for 15 s. In one formulation, cDNA of an experimental (tumor) and control (conditionally healthy tissue) sample was used simultaneously as a matrix to determine the signals produced by amplitudes of ESR1 loci and reference ASTV, each in triplicate.
Относительная экспрессия генетических локусов вычислялась следующим образом:Relative expression of genetic loci was calculated as follows:
- рассчитывали медиану Ct по трем повторам для целевого локуса и референсного АСТВ,- calculated median C t in three repetitions for the target locus and reference ASTV,
- далее рассчитывали величину ΔCt=Ct(ESR1)-Ct(ACTB),- then calculated the value ΔC t = C t (ESR1) -C t (ACTB),
- относительную экспрессию генетического локуса (RE) рассчитывали по формуле 2-ΔCt.- relative expression of the genetic locus (RE) was calculated by the formula 2 -ΔCt .
Вывод об изменении экспрессии гена делали, сравнивая показатели относительной экспрессии генетических локусов в опухолевой и условно здоровой ткани. Для этого вычисляли медиану REоп опухолевых образцов и медиану REк контрольных (условно здоровая ткань) для каждого генетического локуса и рассчитывали соотношение относительной экспрессии генов в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани матки: К=REcancer/REnormal.The conclusion about the change in gene expression was made by comparing the relative expression of genetic loci in tumor and conditionally healthy tissue. For this, the median RE op of tumor samples and the median RE to the control (conditionally healthy tissue) for each genetic locus were calculated and the ratio of relative gene expression in tumor tissue relative to normal uterine tissue was calculated: K = RE cancer / RE normal .
Далее сравнивают полученные значения К с интервалом прогностического коэффициента экспрессии, и при значении К в пределах 0,31≤КESR1≤0,81 прогнозируют благоприятный исход заболевания, а при значении К в пределах 5,84≤КESR1≤9,32 прогнозируют неблагоприятный исхода заболевания. В таблице 2 представлены коэффициенты экспрессии гена ESR1 в операционных биоптатах у пациенток с благоприятным и неблагоприятным исходом заболевания.Next, the obtained values of K are compared with the interval of the prognostic expression coefficient, and with a value of K within 0.31≤K ESR1 ≤0.81 a favorable outcome of the disease is predicted, and with a value of K within 5.84≤K ESR1 ≤9.32 unfavorable the outcome of the disease. Table 2 presents the expression coefficients of the ESR1 gene in surgical biopsies in patients with a favorable and unfavorable outcome of the disease.
Для доказательства прогностической ценности гена ESR1 приводится 2 выписки из историй болезни.To prove the prognostic value of the ESR1 gene, 2 extracts from medical records are given.
1) Больная С. 61 года госпитализирована в марте 2013 г. в онкогинекологическое отделение РНИОИ с верифицированным диагнозом рак тела матки после биопсии эндометрия по месту жительства. Морфологическое заключение о наличии эндометриоидной аденокарциномы было подтверждено при пересмотре в РНИОИ.1) Patient S., 61 years old, was hospitalized in March 2013 at the Oncogynecology Department of the RNII with a verified diagnosis of cancer of the uterus after an endometrial biopsy at the place of residence. The morphological conclusion about the presence of endometrioid adenocarcinoma was confirmed by revision at RNII.
КESR1 в биоптате у данной пациентки составил 9,30.The ESR1 in the biopsy of this patient was 9.30.
На этапе догоспитального обследования при комбинированном сонографическом исследовании гениталий и органов брюшной полости, малого таза было обнаружено минимальное распространение процесса в пределах полости матки, без перехода на цервикальный канал. В зоне срединного М-эха обнаружились участки повышенной эхогенности с толщиной эндометрия до 5-6 мм. В тазовых и парааортальных лимфатических узлах при СРКТ признаков метастатического поражения не выявлено, что позволило предположить до операции стадию T1NxM0. Сопутствующее гинекологическое заболевание - мелкоузловая миома матки. Рак эндометрия у больной развился на фоне метаболического синдрома в менопаузе более 7 лет. 16.03.2013 г. больной было выполнено хирургическое вмешательство согласно стандарту лечения: нервосберегающая пангистерэктомия, тазовая и селективная парааортальная лимфаденэктомия. При макроскопической оценке в удаленной матке была обнаружена полиповидная экзофитная опухоль, распространяющаяся на всю полость матки, исключая цервикальный канал. Послеоперационное течение - без особенностей. Морфологический анализ после операции №9060-58 обнаружил в полости матки эндометриоидную аденокарциному G2 с инвазией в миометрий на глубину 2 мм при толщине стенки матки 2,5 см; в удаленных лимфоузлах и по линии резекции влагалища признаков опухолевого роста не обнаружено. Таким образом, степень распространения процесса, согласно классификации TNM соответствовала T1aN0M0. Учитывая общую площадь поражения полости матки карциномой эндометрия и умеренную степень дифференцировки опухоли, в апреле-мае 2010 г. больная получила курс адъювантной сочетанно-лучевой терапии: ТА=40 Гр, ТВ=40 Гр и эндовагинальную γ-терапию в дозе 40 Гр. В октябре 2013 г. при очередном диспансерном осмотре в культе влагалища у больной был обнаружен рецидив, подтвержденный цитологически (ц.а. №34721-23 аденокарцинома). В этой связи больной было проведено 6 курсов полиохимиотерапии по схеме САР. (циклофосфан-адриамицин-цисплатин). На фоне проведения последнего курса в марте 2014 г. в правой паховой области у пациентки появился метастаз. Опухоль верифицирована (ц.а. №2943-44 - метастаз аденокарциномы). Больная консультирована в РОНЦ им. Н.Н. Блохина в апреле 2014 года, где во время обследования были обнаружены метастатические лимфоузлы в правой аксиллярной области, верифицированные при пункционной биопсии как аденокарцинома. В апреле 2014 года начата II линия полихимиотерапии по схеме AUC-7, которую больная не закончила из-за продолжающейся неконтролируемой генерализации с метастазами в легкие. Смерть больной наступила в мае 2014 года, через 15 месяцев после стандартного радикального лечения.At the stage of pre-hospital examination with a combined sonographic examination of the genitals and organs of the abdominal cavity, pelvis, a minimal spread of the process was found within the uterine cavity, without switching to the cervical canal. In the middle M-echo zone, areas of increased echogenicity with an endometrial thickness of up to 5-6 mm were found. In the pelvic and paraaortic lymph nodes with SRKT, there were no signs of metastatic lesion, which suggested the stage T1NxM0 before surgery. Concomitant gynecological disease - small-node uterine fibroids. Endometrial cancer in the patient developed on the background of the metabolic syndrome in menopause for more than 7 years. 03.16.2013, the patient underwent surgery according to the standard of treatment: nerve-sparing panhisterectomy, pelvic and selective paraaortic lymphadenectomy. Macroscopic evaluation revealed a polypoid exophytic tumor spreading to the entire uterine cavity, excluding the cervical canal, in the removed uterus. Postoperative course - without features. Morphological analysis after surgery No. 9060-58 found in the uterine cavity endometrioid adenocarcinoma G2 with invasion of the myometrium to a depth of 2 mm with a uterine wall thickness of 2.5 cm; in the removed lymph nodes and along the line of vaginal resection, no signs of tumor growth were found. Thus, the extent of the process, according to the TNM classification, corresponded to T1aN0M0. Given the total area of the uterine cavity with endometrial carcinoma and a moderate degree of tumor differentiation, in April-May 2010 the patient received a course of adjuvant combined radiation therapy: TA = 40 Gy, TB = 40 Gy and endovaginal γ-therapy at a dose of 40 Gy. In October 2013, at the next dispensary examination, a relapse was confirmed in the patient's vaginal stump, which was confirmed cytologically (c.a. No. 34721-23 adenocarcinoma). In this regard, the patient underwent 6 courses of polychemotherapy according to the ATS scheme. (cyclophosphamide-adriamycin-cisplatin). Against the background of the last course in March 2014, the patient had metastasis in the right inguinal region. The tumor was verified (c.a. No. 2943-44 - metastasis of adenocarcinoma). The patient was consulted at the Russian Research Center. N.N. Blokhin in April 2014, where during the examination metastatic lymph nodes were found in the right axillary region, verified by a biopsy as an adenocarcinoma. In April 2014, the second line of chemotherapy was started according to the AUC-7 scheme, which the patient did not finish due to the ongoing uncontrolled generalization with metastases to the lungs. The patient died in May 2014, 15 months after the standard radical treatment.
* * ** * *
2) Больная Б. 63 лет, госпитализирована в онкогинекологическое отделение РНИОИ 27 ноября 2013 г. с верифицированным и подтвержденным при пересмотре в РНИОИ диагнозом: рак тела матки в глубокой менопаузе (г.а. №4597-99 - аденокарцинома). На догоспитальном этапе при сонографическом комбинированном исследовании была обнаружена матка без признаков миомы, нормальных размеров, с неравномерно утолщенным эндометрием до 6-8 мм, местами повышенной эхогенности в зоне срединного М-эха. При СРКТ признаков отдаленного метастазирования и поражения тазовых и парааортальных лимфоузлов не обнаружено. Сопутствующая соматическая патология - гипертоническая болезнь, сахарный диабет II типа, избыточный вес - признаки метаболического синдрома. 30 ноября 2013 г. больной выполнена стандартная операция: нервосберегающая пангистерэктомия, тазовая и селективная парааортальная лимфаденэктомия. Макроскопически преимущественно в области дна и верхней половины полости матки обнаружена экзофитная опухоль с инфильтрацией в миометрий и очагами деструкции. Послеоперационный период - без осложнений. Морфологический анализ №73365-72-G2 эндометриоидная аденокарцинома с инвазией 1/2 стенки матки.2) Patient B., 63 years old, was admitted to the gynecological and oncology department of the RNII on November 27, 2013 with the diagnosis verified and confirmed during the review at the RNII: cancer of the uterus in deep menopause (a.a. No. 4597-99 - adenocarcinoma). At the prehospital stage, with a sonographic combined study, a uterus was found without signs of fibroids, normal sizes, with an unevenly thickened endometrium up to 6-8 mm, in places of increased echogenicity in the area of the median M-echo. With SKRT, signs of distant metastasis and damage to the pelvic and paraaortic lymph nodes were not found. Concomitant somatic pathology - hypertension, type II diabetes mellitus, overweight - signs of metabolic syndrome. On November 30, 2013, the patient underwent a standard operation: nerve-sparing panhisterectomy, pelvic and selective paraaortic lymphadenectomy. Macroscopically, an exophytic tumor with infiltration into the myometrium and foci of destruction was found mainly in the bottom and upper half of the uterine cavity. The postoperative period is without complications. Morphological analysis No. 73365-72-G2 endometrioid adenocarcinoma with an invasion of 1/2 of the uterine wall.
КESR1 в биоптате у данной пациентки составил 0,72.The ESR1 in the biopsy of this patient was 0.72.
В лимфатических узлах и по линии резекции влагалища признаков опухолевого роста не обнаружено, что позволило определить степень распространения процесса, как T1bN0M0. Согласно стандарту комбинированного лечения больная получила курс адъювантной сочетано-лучевой терапии общей СОД: ТА=50 Гр, ТВ=40, FP и эндовагинально 40 Гр.No signs of tumor growth were found in the lymph nodes and along the line of vaginal resection, which allowed us to determine the degree of spread of the process as T1bN0M0. According to the standard of combined treatment, the patient received a course of adjuvant combined radiation therapy of total SOD: TA = 50 Gy, TB = 40, FP and endovaginally 40 Gy.
Больная наблюдается по апрель 2015 г. без признаков рецидива и метастазов.The patient is observed until April 2015 with no signs of relapse and metastases.
Предлагаемым способом было осуществлено прогнозирование выживаемости 25 пациенток с диагностированным раком тела матки.The proposed method was used to predict the survival of 25 patients with diagnosed uterine cancer.
Технико-экономическая эффективность изобретения. «Способ прогнозирования выживаемости больных раком тела матки на основании уровня экспрессии гена ESR1» позволяет с высокой точностью прогнозировать исход такого заболевания, как рак тела матки. Заявляемый способ является экономически оправданным для уточнения особенностей течения заболевания и дает возможность скорректировать тактику лечения, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, универсален, его осуществление возможно с операционными биоптатами, способ занимает не более 10 часов.Technical and economic efficiency of the invention. “A method for predicting the survival of patients with cancer of the uterus based on the level of expression of the ESR1 gene” allows us to accurately predict the outcome of a disease such as cancer of the uterus. The inventive method is economically justified to clarify the features of the course of the disease and makes it possible to adjust the tactics of treatment, carried out in a standard laboratory of molecular biology (PCR), without the use of special expensive equipment; has high sensitivity and specificity, universal, its implementation is possible with operational biopsy samples, the method takes no more than 10 hours.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015146517A RU2611352C1 (en) | 2015-10-28 | 2015-10-28 | Method for prediction of endometrial cancer patients survival on the basis of the esr1 gene expression level |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015146517A RU2611352C1 (en) | 2015-10-28 | 2015-10-28 | Method for prediction of endometrial cancer patients survival on the basis of the esr1 gene expression level |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2611352C1 true RU2611352C1 (en) | 2017-02-21 |
Family
ID=58458916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015146517A RU2611352C1 (en) | 2015-10-28 | 2015-10-28 | Method for prediction of endometrial cancer patients survival on the basis of the esr1 gene expression level |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2611352C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2661599C1 (en) * | 2017-09-14 | 2018-07-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Test-system for prediction of relapse development in patients with uterine corpus cancer based on expression level of the esr1 gene |
| RU2675236C1 (en) * | 2018-02-22 | 2018-12-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for predicting development of metastases in patients with breast cancer |
| RU2784775C1 (en) * | 2022-03-30 | 2022-11-29 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for predicting early recurrence of clear cell carcinoma of the uterine body |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2250077C2 (en) * | 2002-12-05 | 2005-04-20 | Ростовский научно-исследовательский онкологический институт | Method for predicting relapse development at uterine body cancer |
| RU2299690C1 (en) * | 2006-02-08 | 2007-05-27 | ФГУ Центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ФГУ ЦНИРРИ) | Method for predicting survival rate in patients with endometrioid cancer of uterine body |
-
2015
- 2015-10-28 RU RU2015146517A patent/RU2611352C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2250077C2 (en) * | 2002-12-05 | 2005-04-20 | Ростовский научно-исследовательский онкологический институт | Method for predicting relapse development at uterine body cancer |
| RU2299690C1 (en) * | 2006-02-08 | 2007-05-27 | ФГУ Центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ФГУ ЦНИРРИ) | Method for predicting survival rate in patients with endometrioid cancer of uterine body |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LIVAK K.J. et al. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 Dec; 25(4): 402-408 [Найдено 05.05.2016] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://www.gene-quantification.net/livak-2001.pdf. * |
| RU 2250077 C2, 20.04.2005 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2661599C1 (en) * | 2017-09-14 | 2018-07-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Test-system for prediction of relapse development in patients with uterine corpus cancer based on expression level of the esr1 gene |
| RU2675236C1 (en) * | 2018-02-22 | 2018-12-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for predicting development of metastases in patients with breast cancer |
| RU2784775C1 (en) * | 2022-03-30 | 2022-11-29 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for predicting early recurrence of clear cell carcinoma of the uterine body |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | FOXO1 is a tumor suppressor in cervical cancer | |
| Montagnana et al. | Aberrant MicroRNA expression in patients with endometrial cancer | |
| Elnagdy et al. | TFF1 and TFF3 mRNAs are higher in blood from breast cancer patients with metastatic disease than those without | |
| JP2019528081A (en) | MicroRNA as a biomarker for endometriosis | |
| Zheng et al. | Expression and clinical implications of homeobox gene Six1 in cervical cancer cell lines and cervical epithelial tissues | |
| Piastowska-Ciesielska et al. | Analysis of the expression of angiotensin II type 1 receptor and VEGF in endometrial adenocarcinoma with different clinicopathological characteristics | |
| TW201217786A (en) | Methods and kits for the diagnosis of prostate cancer | |
| Alrehaili et al. | Clinical significance of plasma MMP‐2 and MMP‐9 levels as biomarkers for tumor expression in breast cancer patients in Egypt | |
| Frycz et al. | Decreased expression of ten-eleven translocation 1 protein is associated with some clinicopathological features in gastric cancer | |
| Wei et al. | IMP3 expression is associated with poor survival in cervical squamous cell carcinoma | |
| Zhao et al. | Expression profiling of cyclin B1 and D1 in cervical carcinoma | |
| Yang et al. | Expression pattern of androgen receptor and AR-V7 in androgen-deprivation therapy–naïve salivary duct carcinomas | |
| RU2611352C1 (en) | Method for prediction of endometrial cancer patients survival on the basis of the esr1 gene expression level | |
| RU2605302C1 (en) | Method of recurrent endometrial cancer prediction based on pten and cyp1b1 genes expression level | |
| Kalender et al. | Association between the Thr431Asn polymorphism of the ROCK2 gene and risk of developing metastases of breast cancer | |
| RU2675236C1 (en) | Method for predicting development of metastases in patients with breast cancer | |
| WO2023088099A1 (en) | Use of fam83a, kpna2, krt6a and ldha in combination as biomarker for lung adenocarcinoma | |
| ES2863926T3 (en) | Indolamine-2,3-dioxygenase assay for the diagnosis and prognosis of prostate cancer | |
| Braný et al. | Different methylation levels in the KLF4, ATF3 and DLEC1 genes in the myometrium and in corpus uteri mesenchymal tumours as assessed by MS-HRM | |
| RU2569154C1 (en) | Differential diagnostic technique for individual's thyroid new growths | |
| TW201217785A (en) | Methods and kits for the diagnosis of prostate cancer | |
| RU2661599C1 (en) | Test-system for prediction of relapse development in patients with uterine corpus cancer based on expression level of the esr1 gene | |
| RU2698895C1 (en) | Method for prediction of developing metastases in uterine cancer patients based on analysis of magea1, mageb2 and prame1 gene expression | |
| EA010571B1 (en) | Method for diagnosis of non-small cell carcinoma of lung and a kit therefor | |
| KR20190121578A (en) | Biomarkers for diagnosis of prostate cancer and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171029 |